JPS62500868A - モノクロ−ナル抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗体およびその用途 発明の背景 分析および診断の分野で最近関心を集めているのは、尿、血液、水、ミルク等の 標本中に抗原や種が存在しているか否かを調べるのにモノクローナル抗体を使用 することである。

より詳細に述べると、標本中にトリコモナス（Ｔ　ｒｉｃｈｏ＋ｍｏｎａｓ）が 存在するか否かを手早く診断するのに、トリコモナスの抗原やトリコモナス種に 特異的なモノクローナル抗体を使用するのが好ましい。

トリコモナス種は何種類かに分類されている。代表的なものには、トリコモナス ・ホミニス（Ｔ　ｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ　ｈｏｍｉｎｉｓ）およびトリコモナス ・バギナリス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ　ｖａｇｉｎａｌｉｓ）がある。

トリコモナス症は、激しい局所的症状を引き起こす、男性および女性の非常によ くみられる生殖器感染症である。通常の診断法は顕微鏡の使用によるしのであり 、医師の診断室また（よ診療所において、この仕事はしばしば多くの労働力が必 要である。トリコモナスを示唆する臨床上の症状（生殖器の痒疹、激しい痛み、 刺激および／または分泌物）は一般的なしのであるので、トリコモナスを特定す るための迅速な診断上の試験があれば、非常に広く使用されるであろう。モノク ローナル抗体は、トリコモナスの抗原に特異的に結合し得るので、診断と治療の 為の多くの機会が与えられる。この様な特異性は、適切な、そして正確な分析お よび／または診断に非常に重要な要件であり、特に、迅速な治療を必要とする疾 病の診断には特に重要な要件である。

抗原性物質の存在を調べる為に、アイソトープを使用した、あるいは使用しない 各種の免疫検定法が、モノクローナル抗体との関連で用いられている。現在、モ ノクローナル抗体について最も普及している方法は、凝集、免疫蛍光、化学発光 または蛍光免疫検定、免疫電子顕微鏡、放射分析系、放射免疫検定、および酵素 −結合免疫検定である。その他の方法として、動物発光、蛍光偏光、および光子 計数免疫検定がある。

酵素−結合免疫検定法（Ｅ　Ｉ　Ａ）を使用する場合、この検定法で機能し得る 酵素、例えばアルカリホスファターゼを、モノクローナル抗体と結合、またはコ ンジュゲートさせる必要がある。

この酵素−結合モノクローナル抗体を、既知の酵素−結合免疫吸着検定法に使用 し、抗原性物質の存在を調べることができる。

特定の抗原を同定したら、その感染微生物の血清型を決めることができ、素早く 、そして効率的に疾病を治癒するための適切な治療を開始することができる。

モノクローナル抗体の製造は、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシュタイン （Ｍ　１ｌｓｔｅｉｎ）によって初めて報告された、今ではよく知られている手 段である〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、　）６．２９２（＋　９７５））。ハイブリドーマを作成する一般 的な技術、およびその結果得られるモノクローナル抗体についてはよく知られて いるが、特定の抗原に対する特異的モノクローナル抗体を製造することは、主と して特定のハイブリド−マを作成するのに必要なバリエーションおよび特冗性の 程度のために、難しいことであることがわかっている。

発明の要約 本発明は、トリコモナスの抗原および／または微生物が試料中に存在するかどう かを正確に、かつ迅速に診断するために使用される新規なモノクローナル抗体を 提供するものである。

簡潔に述べると、本発明はトリコモナスの抗原または種、特にトリコモナス・ホ ミニス（トリコモナス・ホミニスＬ　ＩＩ、ＩＩＩまたは■と命名）およびトリ コモナス・バギナリスの抗原または種およびトリコモナスに属するいずれかの菌 種の抗原と広く交叉反応するモノクローナル抗体に関するものである。

本発明はまた、トリコモナス、あるいはその特定の菌種の上記の抗原の１つに対 するモノクローナル抗体であって、適当な標識（ラベル）と結合した、トリコモ ナスの抗原の存在を診断するために使用される標識されたモノクローナル抗体を 提供するものである。この標識は、例えば放射性同位元素、酵素、蛍光性化合物 、化学的発光性化合物、生物的発光性化ご物、強磁性の卯子または粒子などとす ることができる。

本発明はまた、適当な免疫検定法により、標識されたモノクローナル抗体を検体 と接触さｔ！るごとからなる、検体中のトリコモナス抗原または微生物の存在を 診断する方法を提供するものである。

更に、本発明はトリコモナス属の抗原に対１″るモノクローナル抗体と担体また は希釈剤を含有している治療用組成物、およびある種のトリコモナスの抗原に対 する少なくとも１種の標識されたモノクローナル抗体を含有しているキットを提 供するものである。

詳梃ケ説服 本発明に係る抗体は、特定のトリコモナスの抗原で免疫した咄乳動物の評臓細胞 を、適当な骨髄腫セルライン、好まし、くはＮ５Ｏ（非クローン化）、Ｐ３Ｎ５ １−ｉ＼ｇ　４／１またはＳｐ２１０Ａｇｌ　４と融合させることにより製造さ れる。得られた生産物を標準的なＨＡＴ（ヒボキサンチン、アミノプテリンおよ びチミジン）培地中で培養する。特定のモノクローナル抗体をスクリーニングテ ストするには、以下に記述する免疫検定技術を利用する。

免疫される稗臓細胞は、霊長動物、ヒト、げつ肉類（例えばマウス、ラット、ウ サギなど）、牛、羊、犬などのものであってよいが、本発明では、マウスのもの について述べることにする。まず、通常約１１週間の間選択した特定のトリコモ ナス抗原をマウスに注射する。常套の検定法により、７ウスが抗原に対して十分 な抗体を産生じたことがわかったら、適当なトリコモナス抗原をブースター注射 し、マウスを殺して免疫された牌臓を摘出する。次いで、この免疫された牌臓細 胞と適当な骨髄腫セルラインを使って融合を行なうことができる。

特定のトリコモナス抗原が存在すると正の反応を示す抗体を産生ずる融合細胞を 取り出し、標準的な方法でクローンする。クローンから得たモノクローナル抗体 を標■的な抗原に対して試験し、特定のトリコモナス抗原に対する特異性を有す るか否かを調べる。特定のトリコモナス抗原またはトリコモナス種に対して特異 的であるモノクローナル抗体を選択し、適当な標識と結合させる。

標識のための、そしてその後の大蝦生産に必要な十分虫の抗体は、バッチ式また は連続的組織倍長、あるいはマウスの様な晴乳動物でのインビボでの培養などの 既知の方法で生産される。

モノクローナル抗体は、各種の標識剤、例えば酵素、蛍光化合物、発光化合物、 放射活性化合物、強磁性ラベルなどで標識することができる。本発明では、酵素 で標識ｌまたモノクローナル抗体を使用する例について述べる。標識剤として使 用される酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ 、ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびウレアーゼなどが挙げられる。

酵素との結合は、スケフィロコツカルプロティンＡ法、グルタルアルデヒド法、 ベンゾキノン法または過ヨウ素酸法などの通常の既知の方法のいずれかで行なう ことかできる。

標識されたモノクローナル抗体ができたら、通常の各種の免疫検定法の１つを使 って試験を行なう。選択すべき特定の方法は、モノクローナル抗体および選択し た標識により異なる。現在のところ、廉価であること、試薬が安定であり、安全 であり、感度の良いこと、および操作が簡単であることから酵素免疫検定が好ま しい。１つの例は酵素−結合免疫吸着検定（ＥＩＡ）である。ＥｒＡは、デザイ ンが放射分析と類似している固相検定法である。しかしＥＩＡでは、免疫グロブ リンマーカーとして放射活性同位元素の代わりに、酵素を使用する。

蛍光免疫検定は、抗原または抗体を蛍光プローブで標識することに基づいている 。標識されていない抗原および特異抗体を、蛍光で標識した同一の抗原と混合す る。標識された抗原と標識されていない抗原の両者が抗体の結合サイトを競い合 う。抗体に結合した標識化抗原の量は、非標識化抗原の濃度に依存し、従って、 その濃度の測定値を表わす。この特定のタイプの蛍光免疫検定の例には、酵素− 結合蛍光免疫検定の様な不均一系、基質−標識化蛍光免疫検定の様な均−系があ る。最も適切な蛍光プローブであって、最も広く使用されているものの１つはフ ルオレセインである。フルオレセインは、散乱がかなり干渉されやすいことがあ るが、特定の検定に使用されるプローブの最適の蛍光メーターを使用することに より感度を上げろことができ、散乱の効果を最小限にすることができる。

蛍光分極（ボーラリゼーション）においては、標識された試料が分極光により励 起するので、放射光の分極の程度を測定する。抗原が抗体に結合すると、そのロ ーテーションが低下し、分極の程度が増大する。蛍光分極は簡単、迅速、正確で ある。しかし現時点では、その感度はマイクロモル／リットルの範囲に限定され ており、生物学的試料中の抗原については、上限がナノモル／リットルの範囲で ある。

発光は、電子が高エネルギー状態から基底状態に転移することにより、原子や分 子によって光が放射されることである。化学的発光および生物学的発光の両者に 於いて、化学反応の自由エネルギーにより、電子励起状態の中間体や生成物を生 成するのに必要なエネルギーが与えられる。次いで衰微して基底状態に戻る時に 光が放射される。生物学的発光は、生物系にみられる化学的発光の特別の形態に 与えられた名称であり、ここでは、触媒作用を有するタンパク質または酵素、例 えばルシフェラーゼが発光反応の効率を増大させる。

最もよく知られた化学的発光物質はルミノールである。

本発明の１つの目的は、特定のトリコモナス抗原またはトリコモナス種に対する １種またはそれ以上のモノクローナル抗体、および薬理学的に許容し得る担体ま たは希釈剤を含有する治療用組成物を堤供するものである。この様な組成物は、 なんらかのトリコモナス感染に苦しんでいるヒトおよび／または動物を治療する のに使用することができ、治療に有効な量が使用される。この量は、処置を受け るヒトおよび感染の程度に応じて著しく変わる。

各種検体中にトリコモナスの抗原またはトリコモナス種が存在するかどうかを診 断するために使用される診断用キットに、１ＦＩｉまたはそれ以上のモノクロー ナル抗体を組み合せることができる。トリコモナス属のみを同定し得る広い交叉 反応性のモノクローナル抗体を使ってもよく、また、他の細菌属あるいはトリコ モナス種および／または他の菌類を同定することができる抗体を含んでいるキッ トの一部として用いることらできる。

過去に於いては、検体と抗血清との望ましくない交叉反応のために、迅速なキッ トを開発することは困難であった。モノクローナル抗体を使用することによって 、この様な問題が解決され、診断用の非常に特異的な、そして迅速な試験ができ る様になった。迅速で正確なキットは現在の試験法にとって代わり、あるいは普 及し、正確な抗体を使った早期の直接治療を可能とするであろう。多数の抗生物 質や高価なそして危険な抗生物質を避けることは、患者の、そして病院の節約と なろう。更に、キットは外来患者に使用することができる。現在、即日結果が得 られる迅速試験がないので、治療の開始が遅れることがあり、患者がもっと重篤 な症状を呈するに至ったり、病気の患者にもっと費用のかかる治療を施す必要が 生じたりすることがある。１〜２時間以内に結果の出る試験があれば、患者にと って非常に都合の良いものとなろう。

このキットは単独で販売されてもよいし、あるいはまた、トリコモナスの菌種や 血清型を検出するために、関連検査室に売り込まれる、相容性のある免疫検定試 薬類の包括的な商品の１部に含ませてもよい。

本発明の好ましい態様の１つは、特定のトリコモナス抗原または種に対する少な くとも１種の標識されたモノクローナル抗体と、適当な染色剤、対比染色剤また は試薬を含んでいる診断用キットである。その他のキットとしては、トリコモナ ス抗原の少なくともｔｉの対照試料および／または特定の試料中の特定のトリコ モナス微生物の存在を検出する交叉反応性の標識されたモノクローナル抗体を含 んでいるキットがある。このキットで検出される特定の抗原は、トリコモナス・ ホミニス（トリコモナス・ホミニスＬ　ｎ、ＩＩＩまたは■とら呼ばれる）およ びトリコモナス・バギナリスの抗原群が挙げられる。

トリコモナスの抗原の存在を検出するモノクローナル診断法は、水源、食物源お よび食品加工操作を定期的に検査するのにも使うことができる。この様に、本発 明は、標準的な抗原の存在を調べるための標識したモノクローナル抗体の使用に ついて記載しているが、本発明は、尿、血液、糞便、水およびミルクなどの検体 が特定のトリコモナス抗原を含んでいるかどうかを調べることにより、抗原の存 在を診断するという多くの応用面を持っている。更に詳しくいうと、本発明は公 衆の衛生および安全の診断補助に利用することができ、水や食品の様な検体の汚 染の有無について検査することができる。

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、これらの実施例は例示を 目的とするものであって、本発明を制限するためのものではない。

実施例に於いて、 ＡＰＩ＝アナリテイカル・ブａファイル・インデックス〔エールスト（Ａ　ｙｅ ｒｓｔ）研究所リファレンス〕ＤＭＥＭ−デュルベッコの改良イーグル培地ＥＣ ８＝−ウシ胎仔血漬 ＰＢＳ＝燐酸緩衝生理食塩水 ％Ｔ＝Ｉｃｘ光路長で測定したワクチン濃文本発明のモノクローナル抗体は、ケ ーラーとミルシュタイン（ヨ７５））の方法に従って調製した。

食塩水に懸蜀したトリコモナス・バギナリスの微生物をｌ３ａｌｂ／ｃマウスに 注射する。この抗原は公衆衛生研究所（Ｐｕｂｌｉｃ　’ＨｅａｌｔｈＬ　ａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｓ　ｅｒｖｉｃｅ）から入手する。ワクチンをマウスに筋肉的 注射しく０．０５ｍＱ、８０％ワクチンＸＣＦ　Ａ中）、３ｉ！間後に腹腔内投 与しくＣＦＡ中）、更に３週間後に静脈内投与（ＰＢＳ中）する。

最後の注射から約６日目にマウスから採血し、血清を検査して抗体を検定する。

この血清の力価測定に使用する常套の方法は、酵素−結合免疫吸着検定法である 。このやり方でマウスが抗体産生を示し１＝ら（通常、正の力価が少なくとら１ ０．ＯＯ’０）、融合供与動物として１匹を選び、膵臓切除の３日前に静脈から ブースタ注射する（８０％ワクチン０．０２ｉ＆）。

Ｂ、細胞融合 常法により、ブースタ注射の３日後に免疫マウスから膵臓細胞をとり出す。まず 、選択された供与マウスを段し、７０％のエチルアルコールに浸漬して表面滅菌 する。次いで、膵臓を摘出し、３０％のＦｅ２を加えたＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ約２．５ ｘＱ１．：浸漬する。次に、全ての細胞か膜から離れるまで１．　ＩＪ　Ｘホモ ジナイズ管で膵臓を穏やかにホモジナイズした後、細胞を３％Ｆ　ＣＳ　Ｄ　Ｍ 　Ｅ　Ｍ　５　ｍ（ｌ中で洗浄する。

次いで、細胞残骸を沈澱さＵｏて、胛臓細抱懸閲液を１ｏｚＱの遠沈管゛に入れ る。次にこの残骸を３％ＦＣ５ＤＭＥＭ５１Ｉｃ、中で再び洗浄する。その後、 ３％ＦＣＳ　Ｄ〜ＩＥＭに入れてＱ濁液を５０１にする。

使用した骨髄腫（ミエローマ）セルラインは、ＭＲＣラボラトリ−・オブ・モレ キュラー・バイオロジー（Ｍ　ＲＣＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆＭｏｌｅｃｕ ｌａｒ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ）、ケンブリッジ、イングランドから入手したＮ５Ｏ （非クローン化）である。骨髄腫細胞は、対数増殖期にあり、速く分裂していた 乙のである。各セルラインを、組織陪従培地として、３％ＦＣ８を含灯している １〕＼・Ｉ　Ｅ　Ｍで洗浄する。

次いで、１］当噴の骨髄腫細胞を取り出十と同時に膵臓細胞を取り出しく室温、 ６００ｇで７分間）、得られた各ベレットを個別に３％ＦＣ５ＤＭＥＭ１０１１ １２に再懸祁する。骨髄腫細胞を数えるために懸濁液０．１ｉＣをｌｘ＆に希釈 し、位相差顕微鏡の付いた血球計算器を使用する。膵臓細胞を数えるために、懸 濁液０．１ｍ、（ｌをメチルバイオレット−クエン酸溶液でｌｘρに希釈し、血 球計算器および光学顕微鏡を使用して染色されている細胞核を数える。

次に、ｌＸｌ０’の膵臓細胞と６ＸＩＯ’の骨髄腫細胞を混合し、この混合物を 、グルコースに富む血清不含のＤＭＥＭで洗浄して遠心し、液体を全て除去する 。得られた細胞ペレットを３７℃の水浴に入れる。５０　（ｗ／　ｖ）のヘベス （Ｈｅｐｅｓ）含有生理的食塩水中ポリエチレングリコールＩ　５００（ＰＥＧ ）溶液（ｐＨ約７．５）Ｉ雇を加え、この混合物を約１．５分間穂やかに攪拌す る。次いで、血清不含の組織培養培地ＤＭＥＭ１０ｔｎＱを徐々に加え、次に、 この培養培地を加えて５０順にし、遠心して上清を全て除去した後、細胞ペレッ トを１８重量％のＦｅ２を含有しているＤＭ、ＥＭ１０ｍｉ７に再懸濁する。

混合物ｌＯμＱを標準マルチウェル組織培養プレートの４８０ウエルそれぞれに 入れる。各ウェルは、標準ＨＡ　Ｔ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリンおよ びチミジン）１．Ｏｚ（！および５ＸＩＯ’マクロフアージ／ウエルの濃度でＢ ａ１ｂ／ｃマクロフアージの支持細胞層を含んでいる。

ウェルを静置し、温度約１００％、９％のｃｏ、−空気中、３７℃で培養する。

ウェルは、５〜１０日後に通常の倒立顕＠鏡法を使用して増殖を調べる。阻害Ｈ ＡＴ培地で増殖が起こっているウェルにおいて、下記の通常の酵素免疫検定スク リーニング法を使用して特定のモノクローナル抗体に対するスクリーニングテス トを行なう。

融合の約１０〜１４日後、少なくと６１個のウェルに抗原に対する十分な抗体が 産生される。

Ｃ，クローニング 抗原に対する抗体を産生じたウェルから細胞を取り出し、希釈法を使用してクロ ーン化する。制限希釈に於いて、■８％ＰＣＳ−ＤＭＥＭ＋Ｂａ１ｂ／ｃマウス マクロファージへの細胞懸濁液の希釈を行なって９６ウエルのマイクロタイター プレートに１細胞／ウエルおよび生細胞／ウェルを完成した。半分成長になるま で、このプレートを３７Ｇ、９５％Ｒ１（，７−９％ＣＯ，で７〜１４日間イ日 間インキトベートその上ｌｉｖを、標準的酵素免疫吸着分析により、特異抗体に ついて分析した。

クローンを酵素免疫検定し、抗体産生を調べてらよい。

Ｄ、モノクローナルの選別 クローンからのモノクローナル抗体を、免疫に於て調製された抗原への結合、お よび種々の抗原を持っているクラスの試験バッテリーにおける特異性について標 準的な方法でスクリーニングする。具体的には、微生物の代表的な選択間を含ん でいる微量滴定プレートツクリッドを調製し、煮沸した後、母集団の特異性を調 べるためのテンプレートとして使用する。前記のＥｒＡ免疫検定法を使用しても よい。

Ｅ、抗体産生および精製（２方法） （１）Ｂａｌｂ／ｃマウス（６匹）をブリスタンでプライム（初回抗原刺激）し 、次いで抗原に特異的なモノクローナル抗体の細胞１０’個を腹腔内に注射する 。適当な時期に達したら、即ち、このマウスが体液で膨満し、それでもなお生存 している時に、腹水症体液を採取する。この体液を１２００ｇで約１０分間遠心 し、細胞を除去し、抗体に富む腹水を集める。この液体を前記の如く滴定し、抗 体の存在およびその濃度をきめ、精製する。

プロティンＡ−セファロース法で精製を行なう。詳しく述べると、腹水をガラス ウールで濾過し、３　Ｑ、ＯＯＯｇで１０分間遠心する。

次いでこの腹水を、その２倍容量のリン酸緩衝液（０，１Ｍリン酸ナトリウム） で希釈する。この希釈した腹水を、予めリン酸緩衝液で平衡化しておいたプロテ ィンＡ−セファロースの２１！ａカラムに入れる。カラムを４０１のリン酸緩衝 液で洗浄し、モノクローナル抗体をクエン酸緩衝液（０，１Ｍクエン酸ナトリウ ム、ｐＨ３，５）で溶離し、十分量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＦＩ９．０）に入れ て直ちにｐＨを約７　、　５　Ｌ：上ケア１゜コノ溶出液を、＋４°Ｃテ２Ｘ　 Ｉ　０００ｊｌＱＩ’Ｉ３Ｓで透析する。

（２）トリコモナス・バギナリスに特異的なモノクローナル抗体産生糸の細胞を 、バッチ組織培養で増殖させる。１０％ＦＣＳを添加してＤＭＥＭを使って（Ｉ 　Ｑ８ｍまで）、中対数期での増殖を支持する。培養を過増殖させ、最大値の抗 体を産生させる。次いで培養を１２００９で約１０分間遠心する。細胞／細胞残 骸を捨て、抗原に富んだ上清を集める。

前記した如くして液を滴定し、抗体の存在を確認して濃度を決め、バッチ式イオ ン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈澱法およびカラムイオン交換（ あるいはプロティンＡ−セファロースであってらよい）クロマトグラフィーを組 み合せて精製する。

更に詳しく述べると、培養上清！ｃに、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐｌ −１４，５）Ｎ２、および予めＯ，１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐｉ（５，０） 中で平衡化しておいたＳＰ−セファデックス４０ｘＱを加える。この！！！澗液 を、＋４℃で１時間攪拌する。ＳＰ−セファデックスを沈降させ、上清をデカン トする。このＳＰ−セファデックスをカラムにつめ、Ｏ，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ ５，０）６０ｉｎ！で洗浄し、同じ緩衝液＋１Ｍ塩化ナトリウム６０ｉ２Ｑで溶 離する。溶出液を＋・１℃で攪拌し、同容ｔ１ｔの飽和硫酸アンモニウムをゆっ くりと加える。このｌ！濁液を更に３０分間攪拌する。次いで１０．０００９で １０分間逮８して沈澱を集める。この沈澱を最少用の冷すン酸／ＥＤＴＡＩ衝液 （２０ｍＭリン酸ナトリウム、Ｉ　ＯｍＭＥＤＴＡ、　ｐＨ７５、＋０．０２％ アジ化ナトリウムＸＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーの場合）、または リン酸緩衝ａ（０，１Ｍリン酸ナトリウム、ｐｌ−１８，２＋０．０２％アジ化 ナトリウム）（ブ（１ティンＡ−セファロースクロマトグラフィーの場合）に溶 解する。溶解した沈澱を２ｘ１０００ｍＣの溶解緩衝液に対して＋４℃で透析し 、既述した要領で適当なりロマトグラブイーを行なう。

憂−Ｌり」ジ−シーソに＋■な 上で調製した、抗原に対して特異的なモノクロ−＋ル抗体を酵素、即ち高純度の アルカリホスファターゼと結合さＵる。■段階グルタルアルデヒド法またはベン ゾキノン・コンジュゲート法を用いる。

１段階グルタルアルデヒド法では、モノクロ−ナル抗体３巧（約１ｍ＆の溶液中 ）をアルカリホスファターゼ（シグマ　タイプ■−Ｔ）を用い、ＰＢＳ（ｐＨ７ ，４）ｌ　０００ｍＱ、に対して２回、４℃で透析する。透析の後、容量をＰＢ Ｓで２．５ｉ（に（７、Ｉ’ＢＳ中の２０％グルタルアルデヒド溶液２５μｇを 加える。このコンジュゲーシヨン混り物を室温で１５時間放置する。次いで、グ ルタルアルデヒドを、予めＰ　１３　Ｓで毛衡化しておいた、ファーマンアＰＨ −１０（セファデックスＧ−２５Ｍ）カラムでゲル濾過して除去する。このコン ジュゲート体をＰＩ３５３．５．ｔ１２で溶出し、次いでこのコンツユゲート体 をトリス緩衝液（５０ｍＭトリス、１ｍＭ塩化マグネシウム（ｐＨ８，０）、＋ ０．０２％７９化ナト’Ｊウム）２ｘ２０００ｍｆ２１．：、対して、４℃で透 析する。この透析コンツユゲート体に、トリス緩衝液の１０％＋３８Ａ溶液を１ ／１０容債加える。次いで、このコンジュゲート体を、０．２２μｍのメンブラ ンフィルタ−で滅菌ｌｌ！過し、滅菌した褐色バイアルに入れ、・１°Ｃで保存 する。

害施例２ 実施例１の一般的方法に従い、トリコモナス属の全ての種の抗原と広く交叉反応 するモノクローナル抗体を製造する。

本発明方法を用いる試験方法は、以ＦＱ５刊点によって現在の試験法よりも漫れ ている４（１）精度が高い；（ｉｉ）即日、１．２時間以内に結果が得らねる； （ｉｉｉ）検査室での操作を管理１“る丸めに必要な熟練した研究者の数を減少 さ且ることかでき、労働コストか下がる；（ｉｖ）試験に関して使用される労働 時間および空間を減少さ口ることがてき、総経費を下げることになる。（Ｖ）迅 速かつ正確な診断に基づいたより良い治療を行うことができる。

本発明は、特定の好ま（５い態様について恥へた乙のであるが、本発明の範囲を ここに挙げた特定の形に限定４′るものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲 に定義された本発明の思想および範囲に含まれる変法、改良法および均等法を包 含オるらのである。

国際調査報告 ｌＡ１６Ｍ＋１１１ＩＩＩ６ＩＡ師１１ｃａｌｌ＠Ｎ’ｌａ、ｐｃ’ｒ／ｃａ８ ５１０Ｑ４７０＋ａ＋ｅｎｗ＋＋ｅｅ＊＋　１ｌｌｓ”！６１４６　ＭＬ　ＰＣ Ｔ／ＧＢ　ａｓ１００４７０ＡＮＮＥＸτ０ＴＡＥ二：ＮＴＥＲ４丁ＡＴ：ＯＮ Ａ、Ｌ５Ｚ、’ＲＣＨＲＥＤＯＲ’：コＯＮ

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. １．トリコモナスの抗原またはトリコモナス種に特異的なモノクローナル抗体。
2. ２．トリコモナス・ホミニスの抗原または抗原群に特異的な第１項に記載の抗体 。
3. ３．トリコモナス・ホミニスＩの抗原または抗原群に特異的な第１項に記載の抗 体。
4. ４．トリコモナス・ホミニスＩＩの抗原または抗原群に特異的な第１項に記載の 抗体。
5. ５．トリコモナス・ホミニスＩＩＩの抗原または抗原群に特異的な第１項に記載 の抗体。
6. ６．トリコモナス・ホミニスＩＶの抗原または抗原群に特異的な第１項に記載の 抗体。
7. ７．トリコモナス・バギナリスの抗原または抗原群に特異的な第１項に記載の抗 体。
8. ８．トリコモナス属の全ての種の抗原と広く交叉反応するモノクローナル抗体。
9. ９．実質的に第１項〜第８項のいずれかに記載のモノクローナル抗体と適当な標 識剤からなる標識されたモノクローナル抗体。
10. １０．標識剤が放射活性同位元素、酵素、蛍光性化合物、生物的発光性化合物、 化学的発光性化合物、または強磁性の原子または粒子から選ばれる群の１つであ る第９項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
11. １１．標識剤がモノクローナル抗体とコンジュゲートし得るものであり、かつ、 酵素−結合免疫検定法に使用し得るものである第１０項に記載の標識されたモノ クローナル抗体。
12. １２．該酵素がアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシ ダーゼまたはペルオキシダーゼである第１１項に記載の標識されたモノクローナ ル抗体。
13. １３．該標識剤が免疫−蛍光免疫検定法、蛍光免疫検定法、酵素蛍光免疫検定、 蛍光分極免疫検定、光子計数免疫検定などに使用し得る蛍光性化合物またはプロ ーブである第１０項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
14. １４．該蛍光性化合物またはプローブがフルオレセインである第１３項に記載の 標識されたモノクローナル抗体。
15. １５．該標識剤が発光免疫検定または酵素−結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第１０項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
16. １６．化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第１５項 に記載の標識されたモノクローナル抗体。
17. １７．該標識剤が適当な生物学的発光免疫検定に使用し得る生物的発光性化合物 である第１０項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
18. １８．生物的発光性化合物がルシフエラーゼまたはルシフエラーゼ誘導体である 第１７項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
19. １９．検体の少なくとも１部を、第９項に記載の標識されたモノクローナル抗体 と、該標識剤に適した免疫検定法で接触させることからなる、該検体中のトリコ モナス抗原の存在を診断する方法。
20. ２０．適当に標識された免疫検定法が、免疫−蛍光免疫検定、蛍光免疫検定、免 疫−電子顕微鏡法、放射性検定法、酵素−結合免疫検定法、蛍光分極法、光子− 計数生物学的発光法または化学的発光免疫検定法から選ばれる第１９項に記載の 方法。
21. ２１．該標識剤が、酵素−結合免疫検定法に使用し得る酵素である第２０項に記 載の方法。
22. ２２．該酵素がアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシ ダーゼまたはペルオキシダーゼから選ばれる第２１項記載の方法。
23. ２３．該標識剤が免疫−蛍光免疫検定法、蛍光免疫検定法、酵素蛍光免疫検定、 蛍光分極免疫検定、光子−計数免疫検定などに使用し得る蛍光性化合物またはプ ローブである第２０項に記載の方法。
24. ２４．該蛍光性化合物またはプローブがフルオレセインである第２３項に記載の 方法。
25. ２５．該標識剤が発光免疫検定または酵素−結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第２０項に記載の方法。
26. ２６．該化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第２５ 項に記載の方法。
27. ２７．該標識剤が生物学的発光免疫検定または酵素−結合生物学的免疫検定に使 用し得る生物学的発光性化合物である第２０項に記載の方法。
28. ２８．該生物的発光性化合物がルシフエラーゼまたはルシフエラーゼ誘導体であ る第２７項に記載の方法。
29. ２９．第１項〜第８項の１種またはそれ以上の標識されたモノクローナル抗体と 薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
30. ３０．第９項の１種またはそれ以上の標識されたモノクローナル抗体と薬学的に 許容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
31. ３１．第１項〜第８項のモノクローナル抗体の有効量を投与することからなるト リコモナス感染症の治療方法。
32. ３２．第１項〜第８項の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含有する、診断 用検体中のトリコモナスの抗原またはトリコモナス種の存在を診断するためのキ ット。
33. ３３．該少なくとも１種の抗体が標識されている第３２項記載のキット。
34. ３４．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が蛍光性化合物で標識されている 第３３項記載のキット。
35. ３５．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が酵素で標識されている第３３項 記載のキット。
36. ３６．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が放射活性同位元素、化学的発光 性化合物、生物的発光性化合物、強磁性の原子または粒子からなる群の１つで標 識されている第３３項記載のキット。
37. ３７．対照として少なくとも１種の既知のトリコモナス抗原を更に含有してなる 第３３、３４、３５および３６項のいずれかに記載のキット。
38. ３８．トリコモナス・ホミニスおよび／またはトリコモナス・バギナリスの既知 の抗原を含有している第３３、３４、３５、３６および３７項のいずれかに記載 のキット。
39. ３９．トリコモナス・ホミニスの抗原を含有している第３３、３４、３５、３６ および３７項のいずれかに記載のキット。
40. ４０．トリコモナス・バギナリスの抗原を含有している第３３、３４、３５、３ ６および３７項のいずれかに記載のキット。
41. ４１．第１項〜第８項の少なくとも１種のモノクローナル抗体と対照を含んでな る、診断用検体中のトリコモナスの抗原またはトリコモナス種の存在を診断する ためのキット。
42. ４２．該少なくとも１種の抗原が標識されており、該対照が少なくとも１種の既 知のトリコモナス抗原である第４１項に記載のキット。
43. ４３．第１項〜第８項の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含んでなる、ト リコモナスの感染の存在を診断するためのキット。
44. ４４．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が標識されている第４３項に記載 のキット。