JPS61502627A - モノクロ−ナル抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗体およびその用途 本発明は、モノクローナル抗体およびそ°の用途に関する。

発明の背景 プロテウス属（Ｐ　ｒｏｔｅｕｓ）は、チンセル・マイクロバイオロジー（Ｚｉ ｎｓｓｅｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１７版、７３１−２に記載されてい る。プロプ６ス属の微生物は土壌、水、汚物中に存在し、ヒトの消化官のみなら ず、動物質を腐敗させる。プレーナー（Ｂ　ｒｅｎｎｅｒ）の分類法によれば、 プロテウス属に属する臨床的に重要な２つの菌種、プロテウス・ミラビリス（Ｐ ｒｏｔｅｕｓ　ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ）およびプロテウス・ブルガリス（Ｐ　ｒｏ ｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）が認められている。第３の菌種、プロテウス・ミ キソファシエンス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｙＸｏｆａｃｉｅｎｓ）は、マイマイガ の幼虫からのみ分離されている。抗原抗体反応が極めて特異的であるので、これ により、その他の表現型の基準に基いて区別できない上記した様な細菌種の株間 の違いを認識することができた。

地域社会または病院での獲得性尿路感染症を引き起す、ヒトに於けるプロテウス 属感染症の大部分は、Ｐ、ミラビリスによる。創傷感染、・肺炎および敗血症も 引き起こすことがある。

尿路感染症以外にも、プロテウス属は血流感染であるグラム陰性性敗血症の原因 になることが知られている。これは、現代の医療センターで見られる主要な感染 症疾患の１つである。これは一過性で自己限定性であることらあるが、重篤なグ ラム陰性性の敗面症は緊急医療を必要とするものである。

現在、グラム陰性性敗血症の検査は、血液および尿の培養を作成したり、場合に より、その他の手段によって行われている。血液培養検査は、費用がかかるばか りでなく、煩わしいものである。この検査は、結果が出るまで１日かかり、数日 かかることも多い。ヒトの血液は性質が複雑であり、多数の検査試薬と非特異的 に反応する傾向があるので熟練した検査技術が必要である。

現在、尿路感染症に於いて、−次スクリーニングとして微生物の存在を調べる顕 微鏡検査が行われている。この顕微鏡検査は、グラム陰性菌とうしを区別するこ とはできない。従って、二次検査として、尿試料から分離した微生物を同定する ために尿培養を行なう。診断が遅れ、治療の開始が遅れると、重篤な合併症を引 き起こすことになりかねない。

従って、尿路感染症またはグラム陰性性敗血症において、プロテウス属を極めて 正確に検出する現在の方法は、高価につく多数の熟練技術者と労働時間を費し、 結果を出すのに１日、あるいは数日もかかることが多いという点で満足できるも のではない。

モノクローナル抗体の製造は、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシュタイン （Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）によって初めて報告された、今ではよく知られている手段 である［ヨーロピアン・ツヤ−ナル・オブ・イムノロジー（Ｅ　ｕｒ。

Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．）６（１９７５）２９２　コ。ハイブリドーマを作成する 一般的な技術、およびその結果得られるモノクローナル抗体についてはよく知ら れているが、特定の抗原に対する特異的モノクローナル抗体を製造することは、 主として特定のハイブリドーマを作成するのに必要なｌくリエーションおよび特 異性の程度のために、難しいことであることがわ本発明は、プロテウス属の抗原 および／または微生物が試料中に存在するかどうかを正確に、かつ迅速に診断す るために使用される新規なモノクローナル抗体を提供するものである。

簡潔に述べると、本発明はプロテウス属の抗原、特にプロテウス・ミラビリスお よびプロテウス・ブルガリスの抗原に特異的なモノクローナル抗体、およびプロ テウス属に属するいずれかの菌種の抗原と広く交叉反応するモノクローナル抗体 に関するものである。

本発明はまた、プロテウス属、あるいはその特定の菌種、の上記の抗原の１つに 対するモノクローナル抗体であって、適当な標識（ラベル）、！：結合した、プ ロテウス属の抗原の存在を診断するために使用される標識されたモノクローナル 抗体を提供するものである。この標識は、例えば放射性同位元素、酵素、蛍光性 化合物、化学的発光性化合物、生物的発光性化合物、強磁性の原子または粒子な どとすることができる。

本発明はまた、適当な免疫検定法により、標識されたモノクローナル抗体を検体 と接触させることからなる、検体中のプロテウス属抗原または微生物の存在を診 断する方法を提供するものである。

更に、本発明はプロテウス属の抗原に対するモノクローナル抗体と担体または希 釈剤を含有している治療用組成物、およびある種のプロテウス属の抗原に対する 少なくとも１種の標識されたモノクローナル抗体を含有しているキットを提供す るものである。

詳細な説明 本発明に係る抗体は、特定のプロテウス属の抗原で免疫した哺乳動物の牌臓細胞 を、適当な骨髄腫セルライン、好ましくはＮ５Ｏ（非クローン化）、Ｐ３Ｎ５１ −Ａｇ４／ｌまたはＳｐ　２１０Ａｇ　１４と融合させることにより製造される 。得られた生産物を標準的なＨＡＴ（ヒボキサンチン、アミノプテリンおよびチ ミジン）培地中で培養する′。特定のモノクローナル抗体をスクリーニングテス トするには、以下に記述する免疫検定技術を利用する。

免疫される牌臓細胞は、霊長動物、ヒト、げつ肉類（例えばマウス、ラット、ウ サギなど）、牛、羊、犬などのものであってよいが、本発明では、マウスのもの について述べることにする。まず、選択した特定のプロテウス抗原をマウスに注 射し、通常約１１週間かけて免疫する。常わかったら、適当なプロテウス抗原を ブースター注射し、マウスを殺して免疫された牌臓を摘出する。次いで、こめ免 疫された牌臓細胞と適当な骨髄腫セルラインを使って融合を行なうことができる 。

特定のプロテウス抗原が存在すると正の反応を示す抗体を産生ずる融合細胞を取 り出し、標準的な方法でクローンする。クローンから得たモノクローナル抗体を 標準的な抗原に対して試験し、特定のプロテウス抗原に対する特異性をを有する か否かを調べる。特定のプロテウス抗原またはプロテウス種に対して特異的であ るモノクローナル抗体を選択し、適当な標識と結合させる。

標識のための、そしてその後の大量生産に必要な十分量の抗体は、ノ（ツチ式ま たは連続的組織培養、あるいはマウスの様な哺乳動物でのインビボでの培養など の既知の方法で生産される。

モノクローナル抗体は、先に例示した様な各種の標識剤で標識することができる 。本発明では、酵素で標識したモノクローナル抗体を使用する例について述べる 。標識剤として使用される酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、グルコ ースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびウレアーゼなど が挙げられる。

酵素との結合は、スタフィロコッカル・プロティンＡ法、グルタルアルデヒド法 、ベンゾキノン法または過ヨウ素酸法などの既知の方法で行なうことができる。

標識されたモノクローナル抗体ができたら、通常の各種の免疫検定法の１つを使 って試験を行なう。選択すべき特定の方法は、モノクローナル抗体および選択し た標識により異なる。現在のところ、廉価であること、試薬が安定であり、安全 であり、感度の良いこと、および操作が簡単であることから酵素免疫検定が好ま しい。１つの例は酵素−結合免疫吸着検定（ＥＩＡ）である。ＥＩＡは、デザイ ンが放射分析と類似している固相検定法である。しかしＥＩＡでは、免疫グロブ リンマーカーとして放射活性同位元素の代りに、酵素を使用する。

蛍光免疫検定は、抗原または抗体を蛍光プローブで標識することに基づいている 。標識されていない抗原および特異抗体を、蛍光で標識した同一の抗原と混合す る。標識された抗原と標識されていない抗原の両者が抗体の結合サイトを競い合 う。抗体に結合した標識化抗原の量は、非標識化抗原の濃度に依存し、従って、 その濃度の測定値を表わす。この特定のタイプの蛍光免疫検定の例には、酵素− 結合蛍光免疫検定の様な不均一系、基質−標識化蛍光免疫検定の様な均−系があ る。最も適切な蛍光プローブであって、最も広く使用されているものの１つはフ ルオレセインである。フルオレセインは、散乱がかなり干渉されやすいことがあ るが、特定の検定に使用されるプローブの最適の蛍光メーターを使用することに より感度を上げることができ、散乱の効果を最小限にすることができる。

蛍光分極（ボーラリゼーション）においては、標識された試料が分極光により励 起するので、放射光の分極の程度を測定する。抗原が抗体に結合すると、そ°の ローテーションが低下し、分極の程度が増大する。しかし現時点では、その感度 はマイクロモル／リットルの範囲に限定されており、生物学的試料中の抗原につ いては、上限がナノモル／リットルの範囲である。

発光は、電子が高エネルギー状態から基底状態に転移することにより、原子や分 子によって光が放射されることである。化学的発光および生物学的発光の両者に 於いて、化学反応の自由エネルギーにより、電子励起状態の中間体や生成物を生 成するのに必要なエネルギーが与えられる。

次いで衰微して基底状態に戻る時に光が放射される。生物学的発光は、生物系に みられる化学的発光の特別の形態に与えられた名称であり、ここでは、触媒作用 を有するタンパク質または酵素、例えばルシフェラーゼが発光反応の効率を増大 させる。最もよく知られた化学的発光物質はルミノールである。

本発明の１つの目的は、特定のプロテウス抗原またはプロテウス種に対する１種 またはそれ以上のモノクローナル抗体、および薬理学的に許容し得る担体または 希釈剤を含有する治療用組成物を提供するものである。この様な組成物は、なん らかのプロテウス感染に苦しんでいるヒトおよび／または動物を治療するのに使 用することができ、治療に有効な世が使用される。この量は、処置を受けるヒト および感染の程度に応じて昔しく変わる。

各種検体中に抗原、抗原類またはプロテウス種が存在するかどうかを診断するた めに使用される診断用キットに、１種またはそれ以上のモノクローナル抗体を組 み合せて入れてもよい。プロテウス属のみを同定し得る広い交叉反応性のモノク ローナル抗体を使ってもよく、また、他の細菌属あるいはプロテウス種および／ または他の細菌を同定することができる抗体を含んでいるキットの一部として用 いることもできる。

過去に於いては、検体の望ましくない交叉反応（例えば尿と抗血清）のために、 迅速なキットを開発することは困難であった。モノクローナル抗体を使用するこ とによって、この様な問題が解決され、診断用の非常に特異的な、そして迅速な 試験ができる様になった。例えば、ひどい下痢や下痢性疾患が起る頻度は非常に 高く、この様なキットの市場の大きさを予想することが困難であるが、「当日」 検査は、少なくとも糞便培養と同じ頻度で使用されると期待できる。開発途上国 では、下痢の頻度が高く、また重篤であり、その他の関連する病気もあるので、 この様な検査は大いに利用されるものと思われる。

更に、キットは尿中のグラム陰性細菌を迅速に検査するために、病理検査室で使 用されることもあろうし、外来患者にも使用される。また、プロテウスまたはそ の他のグラム陰性性敗血症の診断のために、患者から採取した血液試料中にプロ テウスの抗原および／またはプロテウス種、およびその他のグラム陰性細菌を同 定するために、この様な抗原や微生物に対する、コンツユゲートあるいは標識化 したモノクローナル抗体をキットにして使用することができる。モノクローナル 検査法は、従来の検査法より正確さが高いという点で、従来法より進んだ方法で ある。「当日」に結果が出るので患者にとって好都合であり、早い、正確な診断 の結果、治療を改善でき、かつ、検査を管理するのに必要な労働時間や人件費を 減少させる。

このキットは単独で販売されてもよいし、あるいはまた、プロテウスの菌種や血 清型を検出するために、関連検査室に売り込まれる、相容性のある免疫検定試薬 類の包括的な商品の１部に含ませてもよい。

本発明の好ましい態様の１つは、特定のプロテウス抗原またはプロテウス種に対 する少なくとも１種の標識されたモノクローナル抗体と、適当な染色剤、対比染 色剤または試薬を含んでいる診断用キットである。

その他のキットとしては、プロテウス抗原の少なくとも１種の対照試料および／ または特定の試料中の特定のプロテウス微生物の存在を検出する交叉反応性の標 識されたモノクローナル抗体を含んでいるキットがあプロテウス属の抗原の存在 を検出するモノクローナル診断法は、水源、食物源および食品加工操作を定期的 に検査するのにも使うことかできる。

この様に、本発明は、標準的な抗原の存在を調べるにめの標識したモノクローナ ル抗体の使用について記載しているが、本発明は、尿、血液、糞便、水およびミ ルクなどの検体が特定のプロテウス抗原を含んでいるかどうかを調べることによ り、抗原の存在を診断するという多くの応用面を持っている。更に詳しくいうと 、本発明は公衆の衛生および安全の診断補助に利用することができ、水や食品の 様な検体の汚染の有無について検査することができる。

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、これらの実施例は例示を 目的とするものであって、本発明を制限するためのらのではない。

本発明のモノクローナル抗体は、ケーラーとミルシュタイン（前掲）の方法に従 って調製した。

実施例に於いて、 ＡＰＩ＝アナリテイカル・プロファイル・インデックス［エールスト（Ａｙｅｒ ｓＬ）研究所リファレンスコＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　＝デュルベツコの改良イーグル培 地ＥＣ９＝ウシ胎仔血清 ％Ｔ＝１ｃｍ光路長で測定したワクチン濃度ＰＢＳ＝燐酸緩衝生理食塩水 プロテウス・ミラビリスをナショナル・コレクション・才ブ・タイプ・カルチャ ーから得（ＮＣＴＣ受は入れ番号６０）、標準的な標準タイプ直情に対して検査 してそのタイプを確認した。より詳しく述べると、親液物質（リオファイル）か ら抗原を除き、血液寒天上で増殖させ、適当な抗血清を用いて、通常の生化学試 験（ＡＰＩ）および凝集試験により検査し、その同一性および純度を確認した。

次いで細胞をＤＭＥＭに移し、増殖させ、収穫して抗原供給源として使用した。

微生物をホルモール食塩水に入れて遠心をくり返すことにより洗浄し、ホルモー ル食塩水に再＠濁した。

Ｂ、動物の免疫 ｇｔｉ！した抗原を６匹のＢａ１ｂ／ｃマウスに注射した。上記の如く調製し４ 、煮沸して死滅させたプロテウス・ミラビリスを、１週間に１回、３週間腹腔内 に注射しく８０％Ｔワクチン０．０５ｍ、Ｍ）、次いで！週間に１回、３週間静 脈注射し、更に１力月後に静脈注射を行なった。最後の注射から約６８目にマウ スから採血し、血清を検査して抗体を検定した。

この血清の力価測定に使用した常套の方法は、酵素−結合免疫吸着検定法であっ た。このやり方でマウスが抗体産生を示したので（通常、正の力価が少なくとも １０，０００）、融合供与動物として１匹を還び、牌臓切除の３日前に静脈から ブースタ注射した（８０％ワクチン０．０２ｍ児）。

Ｃ１細胞融合 １択された供与マウスを殺し、７０％のエチルアルコールに浸漬して表面滅菌し た。次いで、牌臓を摘出し、３０％のＦｅ２を加えたＤＭＥＭ約２．　５　Ｊ、 に浸漬した。次ぎに、全ての細胞が膜から離れるまでＬＵＸホモノナイズ管で牌 臓を穏やかにホモジナイズした後、細胞を３％ＦＣ８ＤＭＥＭＳ　ｍｌ中で洗浄 した。次いで、細胞残骸を沈殿させて、牌臓細胞懸濁液を１０＋ｎ４の遠沈管に 入れた。次ぎにこの残骸を３％ＦＣ３ＤＭＥＭ５　ｍ克中で再び洗浄した。その 後、３％ＦＣ９ＤＭＥＭ使用した骨髄腫セルラインは、ＭＲＣラボラトリ−・オ ブ・モレキュラー・バイオロジー（ＭＲＣＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ケンブリッジ、イングランドから入手したＮ ５Ｏ（非クローン化）である。

π・髄腫細胞は、対数増殖期にあり、速く分裂していたものである。各セルライ ンを、３％ＦＣＳを含有している組織培養培地Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍで洗浄した。

次いで、相当量の骨髄腫細胞を取り出すと同時に稗臓細胞を取り出しく室温、６ ００９で７分間）、得られた各ベレットを個別に３％ＦＣ９ＤＭＥＭｌＯｍｉ、 に再懸濁した。骨髄腫細胞を数えるために懸濁液０．１ｍ４をｆ　ｔＪｌに希釈 し、位相差顕微鏡の付いた血球計算器を使用した。

牌臓細胞を数えるために、懸濁液０．　１　ＩＩＩＪ！をメチルバイオレット− クエン酸溶液でｌ　ｍｆｌに希釈し、血球計算器および光学顕微鏡を使用して染 色されている細胞核を数えた。

次ぎに、牌臓細胞１．３ｘｌＯ’個を骨髄腫細胞８ｘｌＯ’個に混合し、この混 合物を、グルコースに富む血清不含のＤＭＥＭで洗浄して遠心し、液体を全て除 去した。得られた細胞ペレットを３７℃の水浴に入れた。１分間で、５０％（ｖ ／　ｖ）のへベス（Ｈｅｐｅｓ）含有生理的食塩水中ポリエチレングリコールｌ 　５００（ＰＥＧ）溶液（ｐＨ約７．５）１　ｍ、ｌを加え、この混合物を約１ ．５分間穏やかに攪拌する。次いで、血清不含の組織培養培地ＤＭＥＭ　１０　 ｒａｉ、を徐々に加え、次に、この培養培地を加えて５０ｍ１にし、遠心して上 清を全て除去した後、細胞ペレットを１８重量％のＦｅ２を含有しているＤＭＥ Ｍ　１０　ｌｌｌ１ｌに再懸濁した。

混合物１０μＬを標準マルチウェル組織培養プレートの４８０ウエルそれぞれに 入れた。各ウェルは、標準ＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリンおよび チミジン）１．Ｏｍｆｌおよび５Ｘ１０’マクロフアージ／ウエルの濃度でＢａ Ｊｉｊｂ／ｃマクロファージの支持細胞層を含んでいる。

ウェルを静置し、温度約１００％、９％のＣＯ７〜Ｏ７中、３７°Ｃで培養した 。ウェルは、５〜ｌＯ日後に通常の倒立顕微鏡法を使用して増殖を調べた。阻害 ＨＡＴ培地で増殖が起こっているウェルにおいて、下記の通常の酵素免疫検定ス クリーニング法を使用して特定のモノクロナール抗体に対するスクリーニングテ ストを行なった。融合の約１０−１４日後、少なくとも１個のウェルに抗原に対 する十分な抗体が産生された。

Ｄ、クローニング 抗原に対する抗体を産生じたウェルから細胞を取り出し、標準寒天法（２回）お よび制限希釈法を使用してクローン化した。

寒天法では、等容量の２１き強度のＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ、および添加剤を含んでいろ 滅菌した再蒸留水中の１．２％寒天で新たに調製した保存溶液を４５０Ｃに維持 した。次ぎに、この溶液（ＩＯＪ）を１ｏａｎのペトリ皿に入れて基底層を形成 させた。等容量の寒天および１８％のＦｅ２−ＤＭＥＭに入れた細胞を基底層の 上に平らに積層した。細胞を７〜９％のＣｏ１．９５％のＲ＋−１下、３７°Ｃ で約ｌＯ日間増殖させた。生育し得る分離したコロニーを寒天表面から取って、 ３８％のＦＣＳ〜ＤＭＥＭを入れた９６−ウェル微量滴定トレイの内６０ウェル に入れた。更に増殖させた後、上清を、特異抗体について、標準酵素免疫吸着検 定によって検定した。

制限希釈法では、１８％のＦ　ＣＤＭＥＭ＋Ｂａｆｆ１ｂ／ｃのマウスマクロフ ァージで細胞懸濁液を希釈して、９６−ウェル微量滴定プレートに１細胞／ウエ ルおよびＩ／２細胞／ウェルとなる様にした。プレートを、半融合になるまで９ ５％ＲＨ１７〜９％ＣＯを下、３７℃で７〜１４日間インキュベートした。次い で、上清を特異抗体に対して標準酵素免疫吸着検定法で検定した。

Ｅ、モノクローナルの選別 クローンからのモノクローナル抗体を、免疫に於いて調製された抗原への結合、 およびプロテウス種や、別の抗原を有している類似した属の試験バッテリーにお ける特異性について標準的な方法でスクリーニングした。具体的には、〇−血清 型微生物の代表的な選択菌、即ちブロヴイデンンア（Ｐ　ｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ）、ンゲラ（Ｓ　ｈｉｇｅｌ　ｌａ）　、セラティア（Ｓ　ｅｒｒａｔ　ｉａ） およびサルモネラ（Ｓ　ａｌｍｏｎｅｌｌａ）を含んでいる微量滴定プレートの グリッドを調製し、煮沸した後、母細胞の〇−血清型グループの特異性を調べる ためのテンプレートとして使用した。前記のＥＴＡ免疫検定法を使用した。

Ｆ　抗体産生 モノクローナル抗体−産生セルラインの細胞をバッチ式組織培養で増殖させた。

対数期の中間相で増殖させるために１０％のＦｅ２　ＤＭＥＭを１！容量まで使 用し、次いで、最大量の抗体が産生される様に培養物を過増殖させた。次ぎに、 培養物を１２００９で約１ｏ分間遠心して細胞を除いた後、抗体に富んだ上清を 集めた。

この液体を、抗体の存在および濃度を調べるために前記のように滴定した後、精 製した。精製は、培養上清ｌ！に１．０Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８，２）１００　 ｍｌを加えることからなるプロティンＡ−セファロース法で、上清を使用するこ とによって行なった。トリスで緩衝された上清を、予め０，１Ｍ）リス緩衝液（ ｐＨ８，２）で平衡化された１　ｍｌのプロティンＡ−セファロースカラムにｌ 　ｍａｌ１分の流速で流した。次いで、カラムをＯ，１Ｍトリス緩衝液４ｏｆｆ ｌｉ、で洗浄した。モノクローナル抗体をクエン酸緩衝液（０，１Ｍクエン酸ナ トリウム、ｐＨ３，５）で溶離して十分量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９，０）に 入れ、直ちにＪ）Ｈを約７゜５に上げた。この溶出液を４℃でＰＢＳ（ｐＨ７， ４）で透析した後、−２０℃で保存した。

Ｇ、酵素−モノクローナル結合 次ぎに、前記のようにして調製およびスクリーンされたプロテウス・ミラビリス 抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を、適当な酵素、即ちこの場合は高度 に精製されたアルカリフォスファターゼに結合させる。これは、ペンゾキノンコ ンノユゲーション法によって行なう。

アルカリフォスファターゼ（シグマタイプＶ−１１−Ｔ（Ｓ　ｉｇｍａ　Ｔｙｐ ｅ　Ｖｌｌ−Ｔ））２４ｍｇを、ｆｆ、２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６ ，０）２Ｘ５００Ｊに対して＋４℃で透析した。パラ−ベンゾキノン１８ｍｇを 温Ａ　Ｒ−１−タンール０．６　ｍａｌに溶解し、透析されたアルカリフォスフ ァターゼに加えた。このベンゾキノン／アルカリフすスファターゼ混合物を暗所 、室温で１時間放置した。その後、予め０．１５Ｍの塩化ナトリウムで平衡化さ れたファルマンア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）Ｐ　Ｄ　−１０（セファデックスＧ− ２５Ｍ）カラムでゲルＩ遇することによって未反応のベンゾキノンおよび反応副 生成物を除去し、緩衝液を交換した。このようにして調製されたベンゾキノン− 活性化アルカリフォスファターゼは、抗体ｌ、５ｍｇのコンジュゲ−トを６回行 なうのに十分である。モノクローナル抗体を、０．１５Ｍ塩化ナトリウム２ｘ５ ００ｍ、ｅに対して＋４℃で透析した。透析された抗体をベンゾキノン−活性化 アルカリフォスファターゼ８ｍｇに加え、直ちに十分量の１Ｍ重炭酸ナトリウム を加えて終濃度０゜１Ｍにした。このコンジュゲーション混合物を暗所、＋４℃ で４８時間放置した。次ぎに、十分量の１Ｍリシンを加えて終濃度０．１Ｍにし た。

暗所、室温で２時間放置後、このコンジュゲートをＰＢＳ＋０．０２％アジ化ナ トリウム２ｘｌＯＯＯｄに対して＋４℃で透析した。等容量のグリセロールを加 えた。フンシュゲートをｏ、２２μｍメンプラン・フィルターで滅菌胛過し、滅 菌されたコハク色のバイヤルに入れ、＋４℃で保存した。

Ｈ，モノクローナル抗体コンツユゲート試験試験には酵素免疫検定法を使用した 。この検定法は、標準ポリヒニルクロリド微量滴定Ｉ・レーのウェルを抗原て被 覆した後、モノクローナル抗体酵素フンツユゲートを加え、次いで、酵素基質、 パラー二トロフェノールフ埼スフエートを加えることからなる。

この試験で、このモノクローナル抗体は、プロテウス・ミラヒリス抗原に対して 特異的であることがわかった。このモノクローナル抗体を試験した結果、１ｇＧ ３クラスに属することもわかった。

必要であれば、抗体が抗原に結合する特異的なエビトビツク部位も調べることが できる。尿、血液、糞便、水または乳のような診断用検体が抗原を含んでいるか どうかを調べるために、同じ酵素免疫検定法を使用することもできる。この場合 、まず抗体をプレートに結合させる。

実施例２ プロテウス・ブルガリスの抗原に特異的なモノクローナル抗体コンジュゲートを 調製するに当たり、以下の相違点を除いては実施例１と同じ方法を使用する。

プロテウス・ブルガリスは、ナショナル・コレクション・オブ・タイプ曽カルチ ャーズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ ｕｒｅｓ）から入手した（ＮＣＴＣ取得Ｎｏ、４１７５）。動物を免疫する工程 においては、腹腔内注射を毎週１回、３週間行ない、静脈内注射を更に３週間行 なう。

細胞融合工程では、牌臓細胞ｔｘｔｏ’個を骨髄腫細胞６Ｘ１０７個と混合した 。クローニングは、１つの寒天性工程を使用した。

この例では、モノクローナル抗体が得られ、プロテウス・ブルガリスの抗原に対 して特異的であることがわかった。このサブクラスはＴｇＧ２ａであった。

寒籠皿主 プロテウス属の多数のまたは全ての種の抗原と広く交叉反応をするモノクロルナ ル抗体を調製するに当たり、ナショナル・コレクション・才ブ・タイプ・カルチ ャーズから入手した別のプロテウスを使用することを除いては、実施例１と同じ 方法を使用することができる。

本発明方法を用いる試験方法は、以下の利点によって現在の試験法よりも優れて いる：（ｉ）精度が高い；　（ｉｉ）即日、１，２時間以内に結果が得られる： 　（ｉｉｉ）検査室での操作を管理するために必要な熟練した研究者の数を減少 させることができ、労働コストが下がる；（ｉｖ）試験に関して使用される労働 時間および空間を減少させることができ、総経費を下げることになる：（Ｖ）迅 速かつ正確な診断に基づいたより良い治療を行うことができる。

本発明は、特定の好ましい態様について述べたものであるが、本発明の範囲をこ こに挙げた特定の形に限定するものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に定 義された本発明の思想および範囲に含まれる変法、改良法および均等法を包含す るものである。

国際調査報告 ＡＩＯεＸτ０葺正　１胴工ＲＮＡτｌ０ＮＡＬ　Ｓジ唄ＣＲだゴＯＲＴ　ＯＮ

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．プロテウスの抗原またはプロテウス種に特異的なモノクローナル抗体。
2. ２．プロテウス・ミラビリスの抗原または抗原群に特異的な第１項に記載の抗体 。
3. ３．プロテウス・ブルガリスの抗原または抗原群に特異的な第１項に記載の抗体 。
4. ４．プロテウス属の全ての種の抗原と広く交又反応するモノクローナル抗体。
5. ５．実質的に第１項〜第４項のモノクローナル抗体と適当な標識剤からなる標識 されたモノクローナル抗体。
6. ６．標識剤が放射活性同位元素、酵素、蛍光性化合物、生物的発光性化合物、化 学的発光性化合物、または強磁性の原子または粒子から選ばれる群の１つである 第５項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
7. ７．標識剤がモノクローナル抗体とコンジュゲートし得るものであり、かつ、酵 素一結合免疫検定法に使用し得るものである第６項に記載の標識されたモノクロ ーナル抗体。
8. ８．該酵素がアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダ ーゼまたはペルオキシダーゼである第７項に記載の標識されたモノクローナル抗 体。
9. ９．該標識剤が免疫−蛍光免疫検定法、蛍光免疫検定法、酵素蛍光免疫検定、蛍 光分極免疫検定、光子計数免疫検定などに使用し得る蛍光性化合物またはプロー ブである第６項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
10. １０．該蛍光性化合物またはプローブがフルオレセインである第９項に記載の標 識されたモノクローナル抗体。
11. １１．該標識剤が発光免疫検定または酵素−結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第６項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
12. １２．化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第１１項 に記載の標識されたモノクローナル抗体。
13. １３．該標識剤が適当な生物学的発光免疫検定に使用し得る生物的発光性化合物 である第６項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
14. １４．生物的発光性化合物がルシフェラーゼまたはルシフェラーゼ誘導体である 第１３項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
15. １５．検体の少なくとも１部を、第５項に記載の標識されたモノクローナル抗体 と、該標識剤に適した免疫検定法で接触させることからなる、該検体中のプロテ ウス抗原の存在を診断する方法。
16. １６．適当に標識された免疫検定法が、免疫−蛍光免疫検定、蛍光免疫検定、免 疫−電子顕微鏡法、放射性検定法、酵素−結合免疫検定法、蛍光分極法、光子− 計数生物学的発光法または化学的発光免疫検定法から選ばれる第１５項に記載の 方法。
17. １７．該標識剤が、酵素−結合免疫検定法に使用し得る酵素である第１６項に記 載の方法。
18. １８．該酵素がアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシ ダーゼまたはペルオキシダーゼから選ばれる第１７項記載の方法。
19. １９．該標識剤が免疫−蛍光免疫検定法、蛍光免疫検定法、酵素蛍光免疫検定、 蛍光分極免疫検定、光子−計数免疫検定などに使用し得る蛍光性化合物またはプ ローブである第１６項に記載の方法。
20. ２０．該蛍光性化合物またはプローブがフルオレセインである第１９項に記載の 方法。
21. ２１．該標識剤が発光免疫検定または酵素−結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第１６項に記載の方法。
22. ２２．該化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第２１ 項に記載の方法。
23. ２３．該標識剤が生物学的発光免疫検定または酵素−結合生物学的免疫検定に使 用し得る生物的発光性化合物である第１６項に記載の方法。
24. ２４．該生物的発光性化合物がルシフェラーゼまたはルシフェラーゼ誘導体であ る第２３項に記載の方法。
25. ２５．第１項〜第４項の１種またはそれ以上の標識されたモノクローナル抗体と 薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
26. ２６．第５項の１種またはそれ以上の標識されたモノクローナル抗体と薬学的に 許容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
27. ２７．第１項〜第４項のモノクローナル抗体の有効量を投与することからなるプ ロテウス感染症の治療方法。
28. ２８．第１項〜第４項の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含有する、診断 用検体中のプロテウスの抗原またはプロテウス積の存在を診断するためのキット 。
29. ２９．該少なくとも１種の抗体が標識されている第２８項記載のキット。
30. ３０．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が蛍光性化合物で標識されている 第２９項記載のキット。
31. ３１．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が酵素で標識されている第２９項 記載のキット。
32. ３２．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が放射活性同位元素、化学的発光 性化合物、生物的発光性化合物、強磁性の原子または粒子からなる群の１つで標 識されている第２９項記載のキット。
33. ３３．対照として少なくとも１種の既知のプロテウス抗原を更に含有してなる第 ２９、第３０、第３１および第３２項に記載のキット。
34. ３４．プロテウス・ミラビリスおよびプロテウス・ブルガリスの既知の抗原を含 有している第２９、第３０、第３１、第３２および第３３項に記載のキット。
35. ３５．プロテウス・ミラビリスの抗原を含有している第２９、第３０、第３１、 第３２および第３３項に記載のキット。
36. ３６．プロテウス・ブルガリスの抗原を含有している第２９、第３０、第３１、 第３２および第３３項に記載のキット。
37. ３７．第１項〜第４項の少なくとも１種のモノクローナル抗体と対照を含んでな る、診断用検体中のプロテウスの抗原またはプロテウス種の存在を診断するため のキット。
38. ３８．該少なくとも１種の抗原が標識されており、該対照が少なくとも１種の既 知のプロテウス抗原である第３７項に記載のキット。
39. ３９．第１項〜第４項の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含んでなる、グ ラム陰性細菌感染の存在を診断するためのキット。
40. ４０．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が標識されている第３９項に記載 のキット。