JPS61502630A - モノクロ−ナル抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗体およびその用途 本発明は、モノクローナル抗体およびその用途に関する。

発明の背景 ニドワードシェラ属（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）は、チンセル・マイクロバイ オロジー（Ｚｉｎｓｓｅｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１７版、７３２−３ に記載されている。ニドワードシェラ・タルク（Ｅｄ★ａｒｄｓｉｅｌｌａ　ｔ ａｒｄａ）は、ニドワードシェラ族に分類される最もよく知られた種である。以 前は、これはアサフサ（Ａ　５ａｋｕｓａ）およびバーソロミｘ　−（Ｂ　ａｒ ｔｂｏｌｏｍｅｖ）微生物群に分類されていた。動物源、主として冷血動物類か らの分離が多数報告されている。ヒトに於いては、ニドワードシェラ属による感 染症はまれであるが、この微生物は創傷感染症、敗血症および脳膜炎がら分離さ れている。この微生物はまた、胃腸炎の場合のヒトの糞便からも分離されている 。

ニドワードシェラは、細菌性下痢、グラム陰性敗血症、および尿路感染症の原因 となることが知られている。細菌性の下痢は普通のことであるが、腸から液が失 われるという重篤な状態になることも多く、多くの場合脱水を引き起こし、場合 により死に至ることもある。

下痢以外にも、ニドワードシェラは血流感染であるグラム陰性性敗血症の原因に なることが知られている。これは、現代の医療センターでみられる主要な感染性 疾徂の１っである。これは一過性で自己限定性であることもあるが、重篤なグラ ム陰性性の敗血症は緊急医療を必要とするものである。

ニドワードシェラ感染症の現在に於ける診断と治療は、感染部位によって異なる 。米国およびヨーロッパに於いては、毎年数百方性の細菌性下痢が起こっており 、その内、数百万人が医者にかかり、病院を訪れている。この成人病は自己限定 的な疾叡であるので、多くの人は治療をめない。治療をめる人については、現在 、下痢の細菌学的診断は糞便の培養により行なわれている。この方法は一般に病 院でのみ行なわれており、時間がかかり、１〜３日間を必要とする。この間、機 台が治療される場合には、経済的な負担があり、不適切な治療による弊害にさら される可能性がある。しかし、らし治療しなければ、信者は試験結果が出て、治 療が開始されるまで衰微状態の危険にさらされることになる。

現在、グラム陰性性敗血症の検査は、血液および尿の培養を作成したり、場合に より、その他の手段によって行われている。血液培養検査は、費用がかかるばか りでなく、煩わしいものである。この検査は、結果が出るまで１日かかり、数日 かかることも多い。ヒトの血液は性質が複雑であり、多数の検査試薬と非特異的 に反応する傾向があるので熟練した検査技術が必要である。

現在、尿路感染症に於いて、−次スクリーニングとして微生物の存在を調べる顕 微鏡検査が行われている。この顕微鏡検査は、グラム陰性菌どうしを区別するこ とはできない。従って、二次検査として、尿試料から分離した微生物を同定する ために尿培養を行なう。診断が遅れ、治療の開始が遅れると、重篤な合併症を引 き起こすことになりかねない。

従って、尿路感染症または下痢において、ニドワードシェラ属を極めて正確に検 出する現在の方法は、高価につく多藪の熟練技術者と労働時間を費し、結果を出 すのに１日、あるいは数日もかかることが多いという点で満足できるものではな い。

モノクローナル抗体の製造は、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシュタイン （Ｍ　ｉ　ｌ５ｔｅｉｎ）によって初めて報告された、今ではよく知られている 手段である［ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）　６（１９７５）２９２　］。ハハイブリドマを作成 する一般的な技術、およびその結果得られるモノクローナル抗体についてはよく 知られているが、特定の抗原に対する特異的モノクローナル抗体を製造すること は、主として特定のハイブリドーマを作成するのに必要なバリエーションおよび 特異性の程度のために、難しいことであることがわ本発明は、ニドワードシェラ 属の抗原および／または微生物が試料中に存在するかどうかを正確に、かつ迅速 に診断するために使用される新規なモノクローナル抗体を提供するものである。

簡潔に述べると、本発明はニドワードシェラ属の抗原、特にニドワードシェラ・ タルク（Ｂｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ　ｔａｒｄａ）、ニドワードシェラ・ホシナ エ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ　ｈｏｓｈｉｎａｅ）およびニドワードシェラ・ イクタヌリ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ　１ｃｔａｎｕｒｉ）の抗原に特異的な モノクローナル抗体、およびニドワードシェラ属に属するいずれかの菌種の抗原 と広く交叉反応するモノクローナル抗体に関するものである。

本発明はまた、ニドワードシェラ属、あるいはその特定の菌種、の上記の抗原の １つに対するモノクローナル抗体であって、適当な標識（ラベル）と結合した、 ニドワードシェラ属の抗原の存在を診断するために標識は、例えば放射性同位元 素、酵素、蛍光性化合物、化学的発光性化合物、生物的発光性化合物、強磁性の 原子または粒子などとすることができる。

本発明はまた、適当な免疫検定法により、標識されたモノクローナル抗体を検体 と接触させることからなる、検体中のニドワードシェラ属抗原または微生物の存 在を診断する方法を提供するものである。

更に、本発明はニドワードシェラ属の抗原に対するモノクローナル抗体と担体ま たは希釈剤を含有している治療用組成物、およびある種のニドワードシェラ属の 抗原に対する少なくとも１種の標識されたモノクローナル抗体を含有しているキ ットを提供するものである。

詳細な説明 本発明に係る抗体は、特定のニドワードシェラ属の抗原で免疫した哺乳動物の膵 臓細胞を、適当な骨髄腫セルラ°イン、好ましくはＮ５Ｏ（非クローン化）、Ｐ ３Ｎ５　ｌ−Ａｇ　４／ｌまたはＳｐ　２１０Ａｇ　１４と融合させることによ り製造される。得られた生産物を標準的なＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテ リンおよびチミジン）培地中で培養する。特定のモノクローナル抗体をスクリー ニングテストするには、以下に記述する免疫検定技術を利用する。

免疫される膵臓細胞は、霊長動物、ヒト、げつ肉類（例えばマウス、ラット、ウ サギなど）、牛、羊、犬などのものであってよいが、本発明では、マウスのもの について述べることにする。まず、選択した特定のニドワードシェラ抗原をマウ スに注射し、通常約１１週間かけて免疫する。常套の検定法により、マウスが抗 原に対して十分な抗体を産生じたことがわかったら、適当なニドワードシェラ抗 原をブースター注射し、マウスを殺して免疫された膵臓を摘出する。次いで、こ の免疫された膵臓細胞と適当な骨髄腫セルラインを使って融合を行なうことがで きる。

特定のニドワードシェラ抗原が存在すると正の反応を示す抗体を産生ずる融合細 胞を取り出し、標準的な方法でクローンする。クローンから得たモノクローナル 抗体を標帛的な抗原に対して試験し、特定のニドワードシェラ抗原に対する特異 性をを有するか否かを調べる。特定のニドワードシェラ抗原またはニドワードシ ェラ種に対して特異的であるモノクローナル抗体を選択し、適当な標識と結合さ せる。

標識のための、そしてその後の大量生産に必要な十分量の抗体は、バッチ式また は連続的組織培養、あるいはマウスの様な哺乳動物でのインビボでの培養などの 既知の方法で生産される。

モノクローナル抗体は、先に例示した様な各種の標識剤で標識することができる 。本発明では、酵素で標識したモノクローナル抗体を使用する例について述べる 。標識剤として使用される酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、グルコ ースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびウレアーゼなど が挙げられる。

酵素との結合は、スタフィロコブカル・プロティンＡ法、グルタルアルデヒド法 、ベンゾキノン法または過ヨウ素酸法などの既知の方法で行なうことができる。

標識されたモノクローナル抗体ができたら、通常の各種の免疫検定法の１つを使 って試験を行なう。選択すべき特定の方法は、モノクローナル抗体および選択し た標識により異なる。現在のところ、廉価であること、試薬が安定であり、安全 であり、感度の良いこと、および操作が簡単であることから酵素免疫検定が好ま しい。１つの例は酵素−結合免疫吸着検定（Ｅ　Ｉ　Ａ）である。ＥＴＡは、デ ザインが放射分析と類似している固相検定法である。しかしＥＴＡでは、免疫グ ロブリンマーカーとして放射活性同位元素の代りに、酵素を使用する。

蛍光免疫検定は、抗原または抗体を蛍光プローブで標識することに基づいている 。標識されていない抗原および特異抗体を、蛍光で標識した同一の抗原ど混合す る。標識された抗原と標識されていない抗原の両者が抗体の結合サイトを競い合 う。抗体に結合した標識化抗原の量は、非標識化抗原の濃度に依存し、従って、 その濃度の測定値を表わす。この特定のタイプの蛍光免疫検定の例には、酵素− 結合蛍光免疫検定の様な不均一系、基質−標識化蛍光免疫検定の様な均−系があ る。最も適切な蛍光プローブであって、最も広く使用されているものの１つｉｔ フルオレセインである。フルオレセインは、散乱がかなり干渉されやすいことが あるが、特定の検定に使用されるプローブの最適の蛍光メーターを使用すること により感度を上げることができ、散乱の効果を最小限にすることができる。

蛍光分極（ボーラリゼーション）においては、標識された試料が分極光により励 起するので、放射光の分極の程度を測定する。抗原が抗体に結合すると、そのロ ーテーションが低下し、分極の程度が増大する。しかし現時点では、その感度は マイクロモル／リットルの範囲に限定されており、生物学的試料中の抗原につい ては、上限がナノモル／リットルの範囲である。

発光は、電子が高エネルギー状態から基底状態に転移することにより、原子や分 子によって光が放射されることである。化学的発光および生物学的発光の両者に 於いて、化学反応の自由エネルギーにより、電子励起状態の中間体や生成物を生 成するのに必要なエネルギーが与えられる。

次いで衰微して基底状態に戻る時に光か放射される。生物学的発光は、生物系に みられる化学的発光の特別の形態に与えられた名称であり、ここでは、触媒作用 を有するタンパク質または酵素、例えばルシフェラーゼが発光反応の効率を増大 させる。最もよく知られた化学的発光物質はルミノールである。

本発明の１つの目的は、特定のニドワードシェラ抗原またはニドワードシェラ種 に対する１種またはそれ以上のモノクローナル抗体、および薬理学的に許容し得 る担体または希釈剤を含有する治療用組成物を提供するものである。この様な組 成物は、なんらかのニドワードシェラ感染に苦しんでいるヒトおよび／または動 物を治療するのに使用することができ、治療に有効な量が使用される。この量は 、処置を受けるヒトおよび感染の程度に応じて著しく変わる。

各種検体中に抗原、抗原類またはニドワードシェラ種が存在するかどうかを診断 するために使用される診断用キットに、１種またはそれ以上のモノクローナル抗 体を組み合せて入れてもよい。ニドワードシェラ属のみを同定し得る広い交叉反 応性のモノクローナル抗体を使ってもよく、また、他の細菌属あるいはニドワー ドシェラ種および／または他の細菌を同定することができる抗体を含んでいるキ ットの一部として用いることらできる。

過去に於いては、検体の望ましくない交叉反応（例えば尿と抗血清）のために、 迅速なキットを開発することは困難であった。モノクローナル抗体を使用するこ とによって、この様な問題が解決され、診断用の非常に特異的な、そして迅速な 試験ができる様になった。例えば、ひどい下痢や下痢性疾患が起る頻度は非常に 高く、この様なキットの市場の大きさを予想することが困難であるが、「当日」 検査は、少なくとも糞便培養と同じ頻度で使用されると期待できる。開発途上国 では、下痢の頻度が高く、また重篤であり、その他の関連する病気もあるので、 この様な検査は大いに利用されるものと思われる。

更に、キットは尿中のグラム陰性細菌を迅速に検査するために、病理検査室で使 用されることもあろうし、外来患者にも使用される。また、ニドワードシェラま たはその他のグラム陰性性敗血症の診断のために、患者から採取した血液試料中 にニドワードシェラの抗原および／またはニドワードシェラ種、およびその他の グラム陰性細菌を同定するために、この様な抗原や微生物に対する、コンジュゲ ートあるいは標識化し・たモノクローナル抗体をキットにして使用することがで きる。モノクローナル検査法は、従来の検査法より正確さが高いという点で、従 来法より進んだ方法である。薯当日」に結果力咄るのて＠咎にとって好都合であ り、早い、正確な診断の結果、治療を改善でき、かつ、検査を管理するのに必要 な労働時間や人件費を減少させる。

このキットは単独で販売されてもよいし、あるいはまた、ニドワードシェラの菌 種や血清型を検出するために、関連検査室に売り込まれる、相容性のある免疫検 定試薬類の包括的な商品の１部に含ませてもよい。

本発明の好ましい態様の１つは、特定のニドワードシェラ抗原またはニドワード シェラ種に対する少なくとも１種の標識されたモノクローナル抗体と、適当な染 色剤、対比染色剤または試薬を含んでいる診断用キットである。その他のキット としては、ニドワードシェラ抗原の少なくとも１種の対照試料および／または特 定の試料中の特定のエドワードンエラ微生物の存在を検出する交叉反応性の標識 されたモノクローナル抗体を含んでいるキットがある。

エドワードンエラ属の抗原の存在を検出するモノクローナル診断法は、水源、食 物源および食品加工操作を定期的に検査するのにも使うことができる。この様に 、本発明は、標準的な抗原の存在を調べるための標識（、たモノクローナル抗体 の使用について記載しているが、本発明は、尿、血液、糞便、水およびミルクな どの検体が特定のニドワードシェラ抗原を含んでいるかどうかを調べることによ り、抗原の存在を診断するという多くの応用面を持っている。更に詳しくいうと 、本発明は公衆の衛生および安全の診断補助に利用することができ、水や食品の 様な検体の汚染の有無について検査することができる。

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、これらの実施例は例示を 目的とするものであって、本発明を制限するためのらのではない。

本発明のモノクローナル抗体は、ケーラーとミルンユタイン（前掲）の方法に従 って調製した。

実施例に於いて、 ＡＰＩ＝アナリテイカル・プロファイル・インデックス［エールスト（Ａｙｅｒ ｓｔ）研究所リファレンス］Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　＝デュルベッコの改良イーグル培 地ＥＣ５＝ウシ胎仔血清 ％Ｔ＝１ｃｍ光路長で測定したワクチン濃度ＰＢＳ＝燐酸緩衝生理食塩水 抗原ＯＣＩを持っているニドワードシェラ・タルクをナショナル・コレクション ・オブ・タイプ・カルチャーから得（ＮＣＴＣ受は入れ番号１０３９６）、標準 的な標準タイプ血清に対して検査してそのタイプを確認した。より詳しく述べる と、親液物質（リオファイル）からニドワードシェラ・タルク′を除き、血液寒 天上で増殖させ、適当な抗血清を用いて、通常の生化学試験（ＡＰＩ）および凝 集試験により検査し、その同一性および純度を確認した。次いで細胞をＤＭＥＭ に移し、増殖させ、収穫して抗原供給源として使用した。微生物をホルモール食 塩水に入れて遠心をくり返すことにより洗浄し、ホルモール食塩水に再懸濁した 。

Ｂ、動物の免疫 調製した抗原を６匹のＢａ１ｂ／ｃマウスに注射した。上記の如く調製し、煮沸 して死滅させたニドワードシェラ・タルクを、１週間に１回、３週間腹腔内に注 射しく８０％Ｔワクチン０．０５　ｍｌ）、次いで１週間に１回、５週間静脈注 射した。最後の注射から約６日日にマウスから採血し、血清を検査して抗体を検 定した。この血清の力価測定に使用した常套の方法は、酵素−結合免疫吸着検定 法であった。このやり方でマウスが抗体産生を示したので（通常、正の力価が少 なくとも１０，０００）、融合供与動物として１匹を選び、膵臓切除の３日前に 静脈からブースタ注射した（８０％ワクチン０．０５　ｍｌ）。

Ｃ１細胞融合 選択された供与マウスを殺し、７０％のエチルアルコールに浸漬して表面滅菌し た。次いで、脛臓を摘出し、３０％のＥＣ９を加えたＤＭＥＭ約２．　５　ｍｆ ｌに浸漬した。次ぎに、全ての細胞が膜から離れるまでＬＵＸホモジナイズ管で 脛臓を穏やかにホモジナイズした後、細胞を３％ＦＣＳ　ＤＭＥＭ５　ｎ＋４中 で洗浄した。次いで、細胞残骸を沈殿させて、膵臓細胞懸濁液を１０ｍ、Ｍの遠 沈管に入れた。次ぎにこの残骸を３％ＥＣ６ＤＭＥＭ５　Ｊ中で再び洗浄した。

その後、３％ＦＣＳ　ＤＭＥＭに入れて懸濁液を５０ｍ、Ｍにする。

使用した骨髄腫セルラインは、ＭＲＣラボラトリ−・才ブ・モレキュラー・バイ オロジー（ＭＲＣＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ ｏｇｙ）、ケンブリッジ、イングランドから入手したＮ５Ｏ（非クローン化）で ある。

骨髄腫細胞は、対数増殖期にあり、速く分裂していたものである。各セルライン を、３％ＥＣ９を含有している組織培養培地ＤＭＥＭで洗浄する。

次いで、相当量の骨髄腫細胞を取り出すと同時に脛臓細胞を取り出しく室温、６ ００９で７分間）、得られた各ベレットを個別に３％ＦＣＳ　ＤＭＥＭＩＯｍＲ ，に再懸濁する。骨髄腫細胞を数えるために懸濁液０．　１Ｊをｌ　ｔｎｆｌに 希釈し、位相差顕微鏡の付いた血球計算器を使用して計数した。脛臓細胞を数え るために、懸濁液０．１ｍ、２をメチルノくイオレットークエン酸溶液でｌ　ｍ Ｌに希釈し、血球計算器および光学顕微鏡を使用して染色されている細胞核を数 えた。

次ぎに、脛臓細胞６Ｘ１０’個を骨髄腫細胞５ｘｌＯ’個に混合し、この混合物 を、グルコースに富む血清不含のＤＭＥＭで洗浄して遠心・シ、液体を全て除去 する。得られた細胞ペレットを３７°Ｃの水浴に入れた。

１分間で、５０％（ｗ／ｖ）のヘベス（Ｈｅｐｅｓ）含有生理的食塩水中ポリエ チレングリコールｌ　５００（ＰＥＧ）溶液（ｐＨ約７．５）Ｉ　Ｊを加え、こ の混合物を約１．５分間穏やかに攪拌する。次いで、血清不含の組織培養培地Ｄ ＭＥＭＩ　ＯＪを徐々に加え、次に、この培養培地を加えて５０　Ｊにし、遠心 して上清を全て除去した後、細胞ペレットを１８重量％のＦＣＳを全灯している ＤＭＥＭＩＯｎ４に再懸濁する。

混合物１０μえを標準マルチウェル組織培養プレートの４８０ウエルそれぞれに 入れる。各ウェルは、標準ＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリンおよび チミジン）１．０　Ｊおよび５ＸｌＯ’マクロフアージ／ウエルの濃度でＢ　ａ 　ｆｌ　ｂ　／　ｃマクロファージの支持細胞層を含んでいる。

ウェルを静置し、温度約１００％、９％の００２−空気中、３７℃で培養する。

ウェルは、５〜ｌＯ日後に通常の倒立顕微鏡法を使用して増殖を調べる。阻害Ｈ ＡＴ培地で増殖が起こっているウェルにおいて、下記の通常の酵素免疫検定スク リーニング法を使用して特定のモノクロナール抗体に対するスクリーニングテス トを行なう。融合の約１０〜１４日後、少な（とも１個のウェルにニドワードシ ェラ・タルクに対する十分な抗体が産生される。

ニドワードシェラ・タルク抗原に対する抗体を産生じたウェルから細胞を取り出 し、標準的な希釈法を使用してクローン化した。寒天法を使用してもよい。クロ ーンを酵素免疫検定法で検定して抗体産生を調べた。

陽性クローンを再クローンしてもよい。

Ｅ　モノクローナルの選別 クローンからのモノクローナル抗体を、免疫に於いて調製されたニドワードシェ ラ・タルクＮＣＴＣＩ　０３９６への結合、およびエドワードノエラ種や、別の 抗原を有している類似した属の試験バッテリー（シおける特異性について標準的 な方法でスクリーニングした。具体的には、代表的な選択菌を含んでいる微量滴 定プレートのグリッドを調製し、煮沸した後、分群の特異性を調べるためのテン プレートとして使用した。前記のＥＩＡ免疫検定法を使用してもよい。

Ｆ、抗体産生 通常、２種類の方法の内、少なくとも１つを産生（および精製）のために使用す る。

方法Ａでは、６匹のＢａ１ｂ／Ｃマウスを予めブリスタンで処理し、ニドワード シェラ・タルク抗原に対して特異的な、モノクローナル抗体細胞１０７個を腹腔 内に注射する。次いで、マウスが適当な段階に到達した後、即ちマウスは体液で 膨満したが、それでもなお生存している段階で腹水症体液を集める。次いで細胞 を１２００９で約１０分間遠心し、細胞を除去し、抗体に富む腹水症体液を集め る。

前記のようにして、この体液を滴定して抗体の存在および量を確認し、精製する 。

精製は、プロティンへ−セファロース法、または硫酸アンモニウムＺＤＥＡＥ法 を使用して行なうことができる。

より詳述すれば、プロティンへ−セファロース法においては、約１０ｍＱの腹水 症体液をガラスウールで濾過し、３０．０００９で１０分間遠心する。次いで、 この腹水症体液を２倍量の冷却リン酸塩緩衝液（０，１Ｍのリン酸ナトリウム、 ｐＨ８，２）で希釈し、この希釈体液を、予めリン酸塩緩衝液で平衡化しておい た２酎のプロティンＡ−セファロースカラムにかける。カラムをリン酸塩緩衝液 ４０ｘＱで洗浄し、モノクローナル抗体をクエン酸塩緩衝液（０，１Ｍクエン酸 ナト１！ウム、ｐＨ３，５）で溶出して十分量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ９，０ ）中に入れ、ｌ）Ｈを直ちに約７．５まで上げる。

この溶出液を４℃の２　Ｘ　１０００ｘＱＰＢＳ中で透析する。

硫酸アンモニウム／ＤＥＡＥ法では、約ＬＯＲ（ｌの腹水症体液をガラスウール で濾過し、３０，０００ｇで１０分間遠心する。次いで、この腹水症体液を４℃ で攪拌し、等容量の冷却飽和硫酸アンモニウムを徐々に加える。添加終了後、さ らに３０分間混合物を攪拌する。沈澱を、１０゜０００９で１０分間遠心して集 める。この沈澱を、最少量の冷却リン酸塩／Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ緩衝液［２０ｍＭリ ン酸ナトリウム、１０ｍＭのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（＋）Ｈ７，５）＋０．０２％ア ジ化ナトリウム］に溶解する。この溶液を、同一緩衝液２Ｘ１０００ｘ１２に対 して、４℃で透析する。透析し、再溶解した沈澱を３０．０００９で１０分間遠 心し、予めリン酸塩／ＥＤＴＡＩＪ衝液で平衡化しておいた１ＯｘＱのＤＥＡＥ −セルロースカラムにかける。モノクローナル抗体をリン酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液 で溶出させる。

方法Ｂでは、ニドワードシェラ・タルク抗原に特異的なモノクローナル抗体産生 セルラインをバッチ式組成培養で増殖させる。ｌＯ％ＦＣ８を添加したＤ　Ｍ　 Ｅ　Ｍを使用して、ＩＱ量になるまで、対数期の中間相で増殖させる。培養物を 過増殖させて、最大量の抗体を産生させる。次いで、この培養物を１２００９で 約１０分間遠心する。細胞／細胞残渣を除去し、抗体に富む上澄み液を集める。

前記のようにして、この液体を滴定して抗体の存在および量を確認し、精製する 。精製は、バッチ式イオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈澱、お よびカラムイオン交換クロマトグラフィーまたはプロティンＡ−セファロースク ロマトグラフィーのどちらか、を組み合わせて行なうことができる。

さらに詳述すると、培養物の上澄み液Ｉｇに、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ４，５）ＩＱおよび予め０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５。

０）で平衡化しておいたＳＰ−セファデックス４０ｘＱを加える。この懸濁液を ４℃で１時間攪拌する。このＳＰ−セファデックスをカラムに詰め、Ｏ，１Ｍ酢 酸塩緩衝液（ｐｌ（５、０）６０　ｍＱで洗浄し、１Ｍ塩化ナトリウムを加えた 同一緩衝液６０肩Ｑで溶出する。溶出液を４℃で攪拌し、等容量の飽和硫酸アン モニウムを徐々に加える。この懸濁液をさらに３０分間攪拌する。次いで、１０ ．０００９で１０分間遠心して沈澱を集める。

ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィー用の冷却リン酸塩／ＥＤＴＡＩ衝液［２ ０ｍＭリン酸ナトリウム、ｌｏｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７，５）、＋０゜０２％ア ジ化ナトリウム］またはプロティンへ−セファロースクロマトグラフィー用のリ ン酸塩緩衝ｔｉ、［ｏ　、　１　Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８，２）、＋００２ ％アジ化ナトリウム］のいずれかの最少容量に、沈澱を溶解する。この溶解した 沈澱を、溶解緩衝液２ｘ１０００ａ＋（に対して、４℃で透析し、前記の方法Ａ のようにして適宜クロマトグラフィーを行なう。

Ｇ、酵素−モノクローナル抗体 次に、前記のようにして調製しく方法Ｂ）、選別したエドワードンエラ・タルダ 抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を、適当な酵素、すなわちここでは高 純度のアルカリホスファターゼに結合する。これは、既知の方法のいずれか、た とえば一段階グルグルアルデヒド法またはペンゾキノンコンジュゲーンヨン法に よって行なうことができる。

グルタルアルデヒド法では、モノクローナル抗体（溶液約ｌｌＱ中に３所）を、 アルカリホスファターゼ（シグマタイプ■−Ｔ）１０ｍｇと共に、リン酸塩緩衝 食塩水（Ｉ）Ｈ？、４、ＰＢＳ）に対して、４’Ｃで透析する。透析の後、容量 をＰＢＳで２　、５　ｔｒＱにし、ＰＢＳの２０％グルグルアルデヒド溶液２５ μＱを加える。このコンジュゲーンヨン混合物を室温で１゜５時間放置する。次 いで、グルタルアルデヒドを、予めＰＢＳで平衡化しておいた、ファーマシアＰ Ｄ−１０（セファデックスＧ−２５Ｍ）カラムでゲルシ濾過して除去する。この コンジュゲート体をＰＢＳ３．５ｘＱで溶出し、次いでトリス緩衝液［５０ｍＭ トリス、１１１１Ｍ塩化マグネシウム（ｐＨ８，０）、＋０．０２％アジ化ナト リウム］２ｘ２０００峠に対して、４℃で透析する。この透析コンジュゲート体 に、トリス緩衝液のｌＯ％ＢＳＡ溶液をＩ／Ｉ　Ｏ容量加える。次いで、このコ ンジュゲート体を、０゜２２μ夏のメンブランフィルタ−で滅菌シ戸遇し、滅菌 した褐色バイアルに入れ、４°Ｃで保存する。

ベンゾキノン法では、アルカリホスファターゼ（シグマタイプ■−Ｔ）２４ス９ を、０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）２　ｘ　５００ｘＱに対 して、４℃で透析する。バラ−ベンゾキノン１８＊９を温ＡＲエタノール０　、 ６　ｚＱに溶解し、透析したアルカリホスファターゼに加える。このベンゾキノ ン／アルカリホスファターゼ混合物を、室温の暗所で１時間放置する。次いで、 予め０．１５Ｍの塩化ナトリウムで平衡化しておいたファーマシアＰＤ−１０（ セファデックスＧ−２５Ｍ）カラムでゲル）２遇して、未反応のベンゾキノンお よび反応副生成物を除去し、緩衝液を交換する。このようにして調製した、ベン ゾキノンで活性化したアルカリホスファターゼは、３ｍｇ抗体コンジュゲーショ ンを３回行なうのに十分である。

モノクローナル抗体３１Ａ９を、０．１５Ｍ塩化ナトリウム２ｘ５００λＱに対 して、４°Ｃで透析する。透析した抗体を、ベンゾキノン活性化したアルカリホ スファターゼ８奸に加え、直ちに十分量の１Ｍ重炭酸ナトリウムを加えて最終濃 度０　、１．　Ｍにする。このコンジュゲーション混合物を、４°Ｃの暗所で４ ８時間放置する。次に、十分量の１Ｍリジンを加えて最終濃度０．１Ｍにする。

室温の暗所で２時間放置した後、このコンジュゲート体を、リン酸緩衝食塩水＋ ０．０２％アジ化ナトリウム２×１０１００Ｏに対して、４°Ｃで透析する。等 容量のグリセリンを加える。

このコンジュゲート体を、０．２２μｌのメンブランフィルタ−で滅菌？過し、 滅菌した褐色バイアルに入れ、４℃で保存する。

Ｈ，モノクローナル抗体コンジュゲート試験試験には酵素免疫検定法を使用する 。この検定法は、標準ポリビニルクロリド微量滴定トレーのウェルを抗原で被覆 した後、モノクローナル抗体酵素コンジュゲートを加え、次いで、酵素基質、パ ラ−ニトロフェニルフォスフェートを加えることからなる。

この試験で、エドヮードンエラ・タルダ抗原に対して特異的であることがわかっ たモノクローナル抗体を試験することができる。

必要であれば、抗体が抗原に結合する特異的なエビトビツク部位も調べることが できる。尿、血液、糞便、水または乳のような診断用検体が抗原を含んでいるか どうかを調べるために、同じ酵素免疫検定法を使用することもできる。この場合 、まず抗体をプレートに結合させる。

本発明方法を用いる試験方法は、以下の利点によって現在の試験法よりも優れて いる：（ｉ）精度が高い；　（ｉｉ）即日、！、２時間以内に結果が得られる； 　（ｉｉｉ）検査室での操作を管理するために必要な熟練した研究者の数を減少 させることができ、労働コストが下がる；（ｉｖ）試験に関して使用される労働 時間および空間を減少させることができ、総経費を下げることになる；（Ｖ）迅 速かつ正確な診断に基づいたより良い治療を行うことができる。

本発明は、特定の好ましい態様について述べたものであるが、本発明の範囲をこ こに挙げた特定の形に限定するものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に定 義された本発明の思想および範囲に含まれる変法、改良法および均等法を包含す るものである。

国ＶＡ調査報告 ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＥ！Ｅ　ＩＮＴΣＲＮＡτＺＯＮＡｊ、５ＥＡＲＣＨＲＥ ＰＯＲＴ　ＯＮ

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．エドワードシエラの抗原またはエドワードシエラ種に特異的なモノクローナ ル抗体。
2. ２．エドワードシエラ・タルダの抗原に特異的な第１項に記載の抗体。
3. ３．エドワードシエラ属の全ての種の抗原と広く交又反応するモノクローナル抗 体。
4. ４．実質的に第１項〜第３項のモノクローナル抗体と適当な標識剤からなる標識 されたモノクローナル抗体。
5. ５．標識剤が放射活性同位元素、酵素、蛍光性化合物、生物的発光性化合物、化 学的発光性化合物、または強磁性の原子または粒子から選ばれる群の１つである 第４項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
6. ６．標識剤がモノクローナル抗体とコンジュゲートし得るものであり、かつ、酵 素−結合免疫検定法に使用し得るものである第５項に記載の標識されたモノクロ ーナル抗体。
7. ７．該酵素がアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダ ーゼまたはペルオキシダーゼである第６項に記載の標識されたモノクローナル抗 体。
8. ８．該標識剤が免疫−蛍光免疫検定法、蛍光免疫検定法、酵素蛍光免疫検定、蛍 光分極免疫検定、光子計数免疫検定などに使用し得る蛍光性化合物またはプロー ブである第５項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
9. ９．該蛍光性化合物またはプローブがフルオレセインである第８項に記載の標識 されたモノクローナル抗体。
10. １０．該標識剤が発光免疫検定または酵素−結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第５項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
11. １１．化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第１０項 に記載の標識されたモノクローナル抗体。
12. １２．該標識剤が適当な生物学的発光免疫検定に使用し得る生物的発光性化合物 である第５項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
13. １３．生物的発光性化合物がルシフェラーゼまたはルシフェラーゼ誘導体である 第１２項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
14. １４．検体の少なくとも１部を、第４項に記載の標識されたモノクローナル抗体 と、該標識剤に適した免疫検定法で接触させることからなる、該検体中のエドワ ードシエラ抗原の存在を診断する方法。
15. １５．適当に標識された免疫検定法が、免疫−蛍光免疫検定、蛍光免疫検定、免 疫−電子顕微鏡法、放射性検定法、酵素−結合免疫検定法、蛍光分極法、光子− 計数生物学的発光法または化学的発光免疫検定法から選ばれる第１４項に記載の 方法。
16. １６．該標識剤が、酵素−結合免疫検定法に使用し得る酵素である第１５項に記 載の方法。
17. １７．該酵素がアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシ ダーゼまたはペルオキシダーゼから選ばれる第１６項記載の方法。
18. １８．該標識剤が免疫−蛍光免疫検定法、蛍光免疫検定法、酵素蛍光免疫検定、 蛍光分極免疫検定、光子−計数免疫検定などに使用し得る蛍光性化合物またはプ ローブである第１５項に記載の方法。
19. １９．該蛍光性化合物またはプローブがフルオレセインである第１８項に記載の 方法。
20. ２０．該標識剤が発光免疫検定または酵素−結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第１５項に記載の方法。
21. ２１．該化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第２０ 項に記載の方法。
22. ２２．該標識剤が生物学的発光免疫検定または酵素−結合生物学的免疫検定に使 用し得る生物的発光性化合物である第１５項に記載の方法。
23. ２３．該生物的発光性化合物がルシフェラーゼまたはルシフェラーゼ誘導体であ る第２２項に記載の方法。
24. ２４．第１項〜第３項の１種またはそれ以上のモノクローナル抗体と薬学的に許 容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
25. ２５．第４項の１種またはそれ以上の標識されたモノクローナル抗体と薬学的に 許容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
26. ２６．第１項〜第３項のモノクローナル抗体の有効量を投与することからなるエ ドワードシエラ感染症の治療方法。
27. ２７．第１項〜第３項の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含有する、診断 用検体中のエドワードシエラの抗原またはエドワードシエラ種の存在を診断する ためのキット。
28. ２８．該少なくとも１種の抗体が標識されている第２７項記載のキット。
29. ２９．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が蛍光性化合物で標識されている 第２８項記載のキット。
30. ３０．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が酵素で標識されている第２８項 記載のキット。
31. ３１．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が放射活性同位元素、化学的発光 性化合物、生物的発光性化合物、強磁性の原子または粒子からなる群の１つで標 識されている第２８項記載のキット。
32. ３２．対照として少なくとも１種の既知のエドワードシエラ抗原を更に含有して なる第２８、第２９、第３０および第３１項に記載のキット。
33. ３３．エドワードシエラの既知の抗原を含有している第２８、第２９、第３０、 第３１および第３２項に記載のキット。
34. ３４．エドワードシエラ・タルダの抗原または抗原群を含有している第２８、第 ２９、第３０、第３１および第３２項に記載のキット。
35. ３５．第１項〜第３項の少なくとも１種のモノクローナル抗体と対照を含んでな る、診断用検体中のエドワードシエラの抗原またはエドワードシエラ種の存在を 診断するためのキット。
36. ３６．該少なくとも１種の抗原が標識されており、該対照が少なくとも１種の既 知のエドワードシエラ抗原である第３５項に記載のキット。
37. ３７．第１項〜第３項の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含んでなる、グ ラム陰性細菌感染の存在を診断するためのキット。
38. ３８．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が標識されている第３７項に記載 のキット。