JPS62500586A - モノクロ−ナル抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 モノクローナル抗体およびその用途 発明の背景 分析および診断の分野で最近関心を集めているのは、尿、血液、水、ミルク等の 標本中に抗原や種が存在しているか否かを調べるのにモノクローナル抗体を使用 することである。

より詳細に述べると、標本中にクロストリジウム（ＣＩｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）が 存在するか否かを手早く診断するのに、クロストリジウムの抗原やクロストリジ ウム種に特異的なモノクローナル抗体を使用するのが好ましい。

クロストリジウム種は何種類かに分類されている。代表的なものニハ、クロスト リジウム・ボツリヌム（ＣＩｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロ ストリジウム・ベルフリンゲンス（Ｃ、ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリ ジウム・テタニ（Ｃ，ｔｅｔａｎ＋）およびクロストリジウム・ディフィシレ（ Ｃ，ｄｉｆＮｃｉｌｅ）がある。

通常、これらの病原性クロストリジウムは天然の土壌棲息菌であり、わずかしか 、または全く、侵入力を有しておらず、これらの菌に起因する病気は、これらが 産生ずる種々の毒性の強いタンパク質または外毒素による。クロストリジウム・ テタニによって起こる破傷風、およびガス壊痕は、傷からの感染によって起こる 。即ち、組織の損傷によって謙気性環境が広がり、その結果、これらの微生物の 局所的生育およびこれらの微生物による毒素生成が起こる。現在、破傷風は、破 傷風トキソイド（類毒素）を使用して幼時に免疫しておくことによって予防され る。しかしながら、破傷風を明確に診断するために組織中のクロストリジウム・ テタニを検出することは、世界のある地域では依然として非常に有用である。

クロストリジウム・ボツリヌムによって起こるポツリヌス中毒症およびクロスト リジウム・ベルフリンゲンスによって起こるその他の一連のタイプのクロストリ ジウム性食中毒は、通常、これらの微生物が生育して毒素を生成した食物を摂取 することが原因である。

従って、食品工業および公衆衛生工業に於いて、迅速な診断法があれば、食物の 毒素汚染を検出するのに使用されている現在のかなりやっかいな方法にとってか わるであろう。モノクローナル抗体は、クロストリジウムの抗原またはクロスト リジウムの毒素の抗原に特異的に結合し得るので、診断と治療の為の多くの機会 が与えられる。

この様な特異性は、適切な、そして正確な分析および／または診断に非常に重要 な要件であり、特に、迅速な治療を必要とする疾病の診断には特に重要な要件で ある。

抗原性物質の存在を調べる為に、アイソトープを使用した、あるいは使用しない 各種の免疫検定法が、モノクローナル抗体との関連で用いられている。現在、モ ノクローナル抗体について最も普及している方法は、凝集、免疫蛍光、化学発光 または蛍光免疫検定、免疫電子顕微鏡、放射分析系、放射免疫検定、および酵素 −結合免疫検定である。その他の方法として、動物発光、蛍光偏光、および光子 計数免疫検定がある。

酵素−結合免疫検定法（Ｅ　Ｉ　Ａ）を使用する場合、この検定法で機能し得る 酵素、例えばアルカリホスファターゼを、モノクローナル抗体と結合、またはコ ンジュゲートさせる必要かある。

この酵素−結合モノクローナル抗体を、既知の酵素−結合免疫検定検定法に使用 し、抗原性物質の存在を調べることができる。

特定の抗原を同定したら、その感染微生物の血清型を決めることができ、素早く 、そして効率的に疾病を治癒するための適切な治療を開始することかできる。

モノクローナル抗体の製造は、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシュタイン （Ｍ　１ｌｓｔｅｉｎ）によって初めて報告された、今ではよく知られている手 段である〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、　）６．２９２（１９７５））。ハイブリドーマを作成する一般的 な技術、およびその結果書られるモノクローナル抗体についてはよく知られてい るが、特定の抗原に対する特異的モノクローナル抗体を製造することは、主とし て特定のハイブリドーマを作成するのに必要なバリエーションおよび特異性の程 度のために、難しいことであることがわかっている。

発明の要約 本発明は、クロストリジウムの抗原および／または微生物が試料中に存在するか どうかを正確に、かつ迅速に診断するために使用される新規なモノクローナル抗 体を提供するものである。

簡潔に述べると、本発明はクロストリジウムの抗原または種、特にクロストリジ ウム・ボツリヌムの抗原または種、クロストリジウム・ベルフリンゲンス、クロ ストリジウム・テタニおよびクロストリジウム・ディフィンレの抗原または種、 クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ベルフリンゲンス、クロス トリジウム・テタニおよびクロストリジウム・ディフィシレの毒素の抗原または 抗原群に特異的なモノクローナル抗体、およびクロストリジウムに属するいずれ かの菌種の抗原と広く交叉反応するモノクローナル抗体に関するものである。

本発明はまた、クロストリジウム、あるいはその特定の菌種、またはその毒素の 上記の抗原の１つに対するモノクローナル抗体であって、適当な標識（ラベル） と結合した、クロストリジウムの抗原の存在を診断するために使用される標識さ れたモノクローナル抗体を提供するものである。この標識は、例えば放射性同位 元素、酵素、蛍光性化合物、化学的発光性化合物、生物的発光性化合物、強磁性 の原子または粒子などとすることができる。

本発明はまた、適当な免疫検定法により、標識されたモノクローナル抗体を検体 と接触させることからなる、検体中のクロストリジウム抗原または微生物、また は毒素の存在を診断する方法を提供するしのである。

更に、本発明はクロストリジウム属の抗原または毒素に対するモノクローナル抗 体と担体または希釈剤を倉荷している治療用組成物、おにびある種のクロストリ ジウムの抗原または毒素に対する少なくとら１種の（票識されたモノクローナル 抗体を含有しているキットを提供するものである。

詳細な説明 本発明に係る抗体は、特定のクロストリジウムの抗原で免疫した哺乳動物の膵臓 細胞を、適当な骨髄腫セルライン、好ましくはＮ５Ｏ（非クローン化）、Ｐ３Ｎ ５ｌ−Ａｇ　４／ｌまたはＳｐ２１０Ａｇ１４と融合さＵ・ることにより製造さ れる。得られた生産物を標準的なＨＡ　Ｔ　（ヒボキサンチン、アミノプテリン およびチミジン）培地中で培養する。特定のモノクローナル抗体をスクリーニン グテストするには、以下に記述する免疫検定技術を利用する。

免疫される膵臓細胞は、霊長動物、ヒト、げっ肉類（例えばマウス、う・ノド、 ウサギなど）、牛、羊、犬などのものであってよいが、本発明では、マウスのも のについて述べることにする。まず、通常約１１週間の間選択した特定のクロス トリジウム抗原をマウスに注射する。常套の検定法により、マウスが抗原に対し て十分な抗体を産生じたことがわかったら、適当なりロストリジウム抗原をブー スター注射し、マウスを殺して免疫された膵臓を摘出する。次いで、この免疫さ れＬ膵臓細胞と適当な骨髄腫セルラインを使って融合を行なうことができる。

特定のクロストリジウム抗原が存在すると正の反応を示す抗体を産生ずる融合細 胞を取り出し、標準的な方法でクローンする。クローンから得たモノクローナル 抗体を標準的な抗原に対して試験し、特定のクロストリジウム抗原に対する特異 性を有するか否かを調べる。特定のクロストリジウム抗原、クロストリジウム種 または毒素に対して特異的であるモノクローナル抗体を選択し、適当な標識と結 合さける。

標識のための、そしてその後の大工生産に必要な十分ｍの抗体は、バッチ式また は連続的組織培養、あるいはマウスの様な哺乳動物でのインビボでの培養などの 既知の方法で生産されろ。

モノクローナル抗体は、各種の標識剤、例えば酵素、蛍光化合物、発光化合物、 放射活性化合物、強磁性ラベルなどで標識することができる。本発明では、酵素 で標識したモノクローナル抗体を使用する例について述へる。標識剤として使用 されろ酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、 ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびウレアーゼなどが挙げられる。

酵素との結合は、メタフィロコツカルプロティンＡ法、グルタルアルデヒド法、 ベンゾキノン法または過ヨウ素酸法などの通常の既知の方法のいずれかで行なう ことができる。

標識されたモノクローナル抗体ができたら、通常の各種の免疫検定法の１つを使 って試験を行なう。選択すべき特定の方法は、モノクローナル抗体および選択し た標識により異なる。現在のところ、廉価であること、試薬が安定であり、安全 であり、感度の良いこと、および操作が簡単であることから酵素免疫検定が好ま しい。１つの例は酵素−結合免疫吸着検定（ＥＩＡ、）である。ＥＩＡは、デザ インが放射分析と類似している固相検定法である。しかしＥＩＡでは、免疫グロ ブリンマーカーとして放射活性同位元素の代わりに、酵素を使用する。

蛍光免疫検定は、抗原または抗体を蛍光プローブで標識することに基づいている 。標識されていない抗原および特異抗体を、蛍光で標識した同一の抗原と混合す る。標識された抗原と標識されていない抗原の両者が抗体の結合サイトを競い合 う。抗体に結合した標識化抗原の量は、非標識化抗原の濃度に依存し、従って、 その濃度の測定値を表わす。この特定のタイプの蛍光免疫検定の例には、酵素− 結合蛍光免疫検定の様な不均一系、基質−標識化蛍光免疫検定の様な均−系かあ る。最も適切な蛍光プローブであって、最も広く使用されているものの１つはフ ルオレセインである。フルオレセインは、散乱がかなり干渉されやすいことがあ るが、特定の検定に使用されるプローブの最適の蛍光メーターを使用することに より感度を上げることができ、散乱の効果を最小限にすることができる。

蛍光分極（ボーラリゼーション）においては、標識された試料が分極光により励 起するので、放射光の分極の程度を測定する。抗原が抗体に結合すると、そのロ ーテーンヨンが低下し、分極の程度が増大する。蛍光分極は簡単、迅速、正確で ある。しかし現時点では、その感度はマイクロモル／リットルの範囲に限定され ており、生物学的試料中の抗原については、上限かナノモル／リットルの範囲で ある。

発光は、電子か高エネルギー状態から基底状態に転移することにより、原子や分 子によって光が放射されることである。化学的発光および生物学的発光の両者に 於いて、化学反応の自由エネルギーにより、電子励起状態の中間体や生成物を生 成するのに必要なエネルギーが与えられろ。次いて衰微して基底状態に戻る時に 光が放射される。生物学的発光は、生物系にみられる化学的発光の特別の形態に 与えられた名称であり、ここでは、触媒作用を有するタンパク質または酵素、例 えばルンフェラーゼが発光反応の効率を増大させる。

最乙よく知られた化学的発光物質はルミノールである。

本発明の１つの目的は、特定のクロストリジウム抗原、クロストリジウム種また は毒素に対する１種またはそれ以上のモノクローナル抗体、および薬理学的に許 容し得る担体または乃釈剤を含何する治療用組成物を提供するものである。この 様な組成物は、なんらかのクロストリジウム感染に苦しんでいるヒトおよび／ま たは動物を治療するのに使用することができ、治療に有効な量が使用される。

この虫は、処置を受けるヒトおよび感染の程度に応じて著しく変わる。

各種検体中にクロストリジウムの抗原、クロストリジウム種または毒素が存在す るかどうかを診断するために使用される診断用キットに、１種またはそれ以上の モノクローナル抗体を組み合せることができろ。クロストリジウム属のみを同定 し得る広い交叉反応性のモノクローナル抗体を使ってもよく、また、他の細菌属 あるいはクロストリジウム種および／または他の毒素類を同定することができろ 抗体を含んでいるキットの一部として用いることもできる。

過去に於いては、検体と抗血清との望ましくない交叉反応のために、迅速なキッ トを開発することは困難であった。モノクローナル抗体を使用することによって 、この様な問題が解決され、診断用の非常に特異的な、そして迅速な試験ができ る様になった。迅速で正確なキットは現在の試験法にとって代わり、あるいは普 及し、正確な抗体を使った早期の直接治療を可能とするであろう。多数の抗生物 質や高価なそして危険な抗生物質を避けることは、患者の、そして病院の節約と なろう。更に、キットは外来似者に使用することができる。現在、即日結果が得 られる迅速試験がないので、治療の開始が遅れることがあり、Φ者がらっと重篤 な症状を呈するに至ったり、病気の患者にもっと費用のかかる治療を施す必要が 生じたりすることかある。１〜２時間以内に結果の出る試験があれば、患者にと って非常に都合の良いものとなろう。

このキットは単独で販売されてもよいし、あるいはまた、クロストリジウムの菌 種や血清型を検出するために、関連検査室に売り込まれる、相容性のある免疫検 定試薬類の包括的な商品の１部に含ませてもよい。

本発明の好ましい態様の１つは、特定のクロストリジウム抗原、毒素また種に対 する少なくとも１種の標識されたモノクローナル抗体と、適当な染色剤、対比染 色剤または試薬を含んでいる診断用キットである。その他のキットとしては、ク ロストリジウム抗原の少なくとも１種の対照試料および／または特定の試料中の 特定のクロストリンウム微生物または毒素の存在を検出する交叉反応性の標識さ れたモノクローナル抗体を含んでいるキットがある。このキットで検出される特 定の抗原は、クロストリジウム・ボツリヌム、クロス（・リノウム・ベルフリン ゲンス、クロストリジウム・テタニおよびクロストリジウム・ディフィシレの抗 原、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ベルフリンゲンス、ク ロストリジウム・テタニおよびクロストリジウム・ディフィルの毒素の抗原およ び抗原群が挙げられる。

クロス１、リジウムの抗原の存在を検出するモノクローナル診断法は、水源、食 物源および食品加工操作を定期的に検査するのにも使うことができる。この様に 、本発明は、標準的な抗原の存在を調べるための標識したモノクローナル抗体の 使用について記載しているが、本発明は、尿、血液、糞便、水およびミルクなど の検体が特定のクロストリジウム抗原を含んでいるかどうかを調べることにより 、抗原の存在を診断するという多くの応用面を持っている。更に詳しくいうと、 本発明は公衆の衛生および安全の診断補助に利用することができ、水や食品の様 な検体の汚染の有無について検査することができろ。

以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、これらの実施例は例示を 目的とするものであって、本発明を制限するためのものではない。

実施例に於いて、 ＡＰＩ−アナリテイカル・プロファイル・インデックス〔エールスト（Ａｙｅｒ ｓｔ）研究所リファレンス〕ＤＭＥＭ−デュルベツコの改良イーグル培地ＥＣ８ −ラン胎仔血清 ＰＢＳ−燐酸緩衝生理食塩水 ％Ｔ＝１ｃｚ光路長で測定したワクチン濃度本発明のモノクローナル抗体は、ケ ーラーとミルシュタイン（ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー、６ 　２９２（＋９７５））の方法に従って調製した。

抗原（クロストリジウム・ボツリヌム）を得（試料はナショナル・コレクション ・オブ・タイプ・カルチャーから得られる）、標準的な微生物同定の為の生化学 的手法を用いて同定する（ＡＰＩプロファイルを使用）。親液物質（リオファイ ル）からこの抗原を除き、血液寒天」二て増Ｍさせ、ＡＰ【で検査してその同定 を行ない、純度を確認１する。次いで細菌をＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍに移して増殖させる 。インキユベーノリンした後、この細胞を１時間１００℃に保ち、遠心して収穫 し、食塩水に入れて３回洗争し、１％ポルモール食塩水に再懸濁する。

Ｂ、動物の免疫 調製した抗原をＢａ１ｂ／ｃマウスに注射する。上記の如く調製したワクチンを 腹腔内および／または静脈内に注射する（８０％Ｔワクヂン０．０５ｘ（り。最 後の注射から約６８目にマウスから採血し、血清を検査して抗体を検定する。こ の血清の力価測定に使用する常套の方法は、酵素−結合免疫吸着検定法である。

このやり方でマウスが抗体産生を示したら（通常、正の力価が少なくとも１０， ０００）、融合供与動物として１匹を選び、膵臓切除の３８萌に静脈からブース タ注射する（８０％ワクチン０．０２Ｊｌ（り。

以」岨姐逸合 常法ニより、ブースタ注射の３日後に免疫マウスから肝臓細胞をとり出す。まず 、選択されｆこ供Ｉ与マウスを殺し、７０％のエヂルアルコールに浸漬して表面 滅菌する。次いで、膵臓を摘出し、３０％のＦ’Ｃ９を加えたＤＭ　ＥＭ約２， ５ｉｆ２に浸漬する。次に、全ての細胞が膜から離れるまでＬＵＸホモジナイズ 管で膵臓を穏やかにホモジナイズした後、細胞を３％ＦＣ９ＤＭＥＭ５πＱ中で 洗浄する。

次いで、細胞残骸を沈澱させて、膵臓細胞懸蜀液をＩＯｍＱの遠沈管に入れる。

次にこの残骸を３％ＰＣ９ＤＭＥＭ５ｍ（中で再び洗浄する。その後、３％ＦＣ ３ＤＭＥＭに入れて懸濁液を５０ｚＱにする。

使用した骨髄腫（ミエローマ）セルラインは、ＭＲＣラボラトリ−・オブ・モレ キュラー・バイオロジー（Ｍ　ＲＣＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆＭｏｌｅｃｕ ｌａｒ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ）、ケンブリッジ、イングランドから入手したＮ５Ｏ （非クローン化）である。骨髄腫細胞は、対数増殖期にあり、速く分裂していた ちのである。各セルラインを、組織培養培地として、３％ＦＣ９を含有している ＤＭ　ＥＭで洗浄する。

次いで、相当量の骨髄腫細胞を取り出すと同時に膵臓細胞を取り出しく室温、６ ００ｇで７分間）、得られた各ペレットを個別に３％ＦＣＳ　ＤＭＥＭｌＯｍ１ ２に再懸濁する。骨髄腫細胞を数えるために懸濁液０．Ｉｉ＆を１ｍｃに希釈し 、位相差顕微鏡の付いた血球計算器を使用する。膵臓細胞を数えるために、＠濁 液０．１πＱをメチルバイオレット−クエン酸溶液でＩＲｌ）に希釈し、血球計 算器および光学顕微鏡を使用して染色されている細胞核を数える。

次に、ｌＸＩＯ３の膵臓細胞と６ＸＩＯ７の骨髄腫細胞を混合し、この混合物を 、グルコースに富む血清不含のＤＭＥＭで洗浄して遠心し、液体を全て除去する 。得られた細胞ベレットを３７℃の水浴に入れる。５０　（ｗ／ｖ）のヘペス（ Ｈｅｐｅｓ）含有生理的食塩水中ポリエチレングリコール］　５００（ＰＥＧ） 溶液（ｐＨ約７．５）１肩Ｑを加え、この混合物を約１．５分間穏やかに攪拌す る。次いで、血清不含の組織培養培地ＤＭＥＭＩＯπＱを徐々に加え、次に、こ の培養培地を加えて５０Ｒｉ！にし、遠心して上清を全て除去した後、細胞ベレ ットを１８重量％のＦＣＳを含有しているＤＭＥＭ　Ｉ　ＣＪｒｔｔＱに再懸濁 する。

混合物１０１１Ｑを標皇マルチウェル組織培養プレートの４８０ウエルそれぞれ に入れる。各ウェルは、標＊　ＨＡ　Ｔ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリン およびチミジン）１．Ｏｍｇおよび５Ｘ１０’マクロフアージ、／ウェルの濃度 てＢａ１ｂ／ｃマクロフアージの支持細胞層を含んでいる。

ウェルを静置し、温度約１００％、９％のｃｏ、−空気中、３７℃で培養する。

ウェルは、５〜１０日後に通常の倒立顕微鏡法を使用して増殖を調べる。阻害Ｈ Ａ、　Ｔ培地で増殖が起こっているウェルにおいて、下記の通常の酵素免疫検定 スクリーニング法を使用して特定のモノクローナル抗体に対するスクリーニング テストを行なう。

融合の約１０〜１４日後、少なくとも１個のウェルに抗原に対する十分な抗体が 産生される。

Ｄ、クローニング 抗原に対する抗体を産生したウェルがら細胞を取り出し、標準寒天法または希釈 法を使用してクローン化する。

クローンを酵素免疫検定し、抗体産生を調べてもよい。

Ｅ、モノクローナルｑ星肌 クローンからのモノクローナル抗体を、免疫に於て調製された抗原への結合、お よび種々の抗原を持っているクラスの試験バッテリーにおける特異性について標 桑的な方法でスクリーニングする。具体的には、微生物の代表的な選択菌を含ん でいる微量滴定プレートのグリッドを調製し、煮沸した後、母集団の特異性を調 べるためのテンプレートとして使用する。前記のＥＴＡ免疫検定法を使用して（ １）Ｂａｌｂ／Ｃマウス（６匹）をプリスタンでプライム（初回抗原刺激）し、 次いで抗原に特異的なモノクローナル抗体の細胞１０７個を腹腔内に注射する。

適当な時期に達したら、即ち、このマウスが体液で膨〆１ぬし、それでもなお生 存している時に、腹水症体液を採取する。この体液を１２’ＯＪで約１０分間遠 心し、細胞を除去し、抗体に富む腹水を集める。この液体を前記の如く滴定し、 抗体の存在およびその濃度をきめ、精製する。

プロティンＡ−セファロース法で精製を行なう。詳しく述べると、腹水をガラス ウールで濾過し、３０，０００ｇで１０分間遠心する。

次いでこの腹水を、その２倍容貴のリン酸緩衝液（０，１Ｍリン酸ナトリウム） で希釈する。この希釈した腹水を、予めリン酸緩衝液で平衡化しておいたプロテ ィンＡ−セファロースの２酎カラムに入れる。カラムを４０１１Ｑのリン酸緩衝 液で洗浄し、モノクローナル抗体をクエン酸緩衝液（０１Ｍクエン酸ナトリウム 、ｐＨ３，５）で溶離し、十分量のＩＭトリス緩衝液（ｐ＋−＋９．０）に入れ て直ちにｐＨを約７５に上げる。この溶出液を、＋４℃で２Ｘ１０００ｚＣＰＢ Ｓて透析する。

（２）クロストリジウム・ボッリヌムに特異的なモノクローナル抗体産生糸の細 胞を、バッチ組織培養で増殖させる。１０％ＦＣＳを添加してＤＭＥＭを使って （ＩＣ容量まで）、中対数期での増殖を支持する。培養を過増殖させ、最大値の 抗体を産生さ仕る。次いで培養を１２００ｙで約１０分間遠心する。細胞／細胞 残骸を捨て、抗原に富んだ上清を集める。

前記した如くして液を滴定し、抗体の存在を確認して濃度を決め、バッチ式イオ ン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈澱法およびカラＪ２イオン交換 （あるいはプロティンＡ−セファロースであってもよい）クロマトグラフィーを 組み合せて精製する。

更に詳しく述べると、培養上清１０．に、００５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４，５）Ｈ！、および予めＯ，１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐｌ４５　、　Ｏ） 中で平衡化しておいたＳＰ−セファデックス４０１１Ｃを加える。この懸濁液を 、＋４℃で１時間攪拌する。ＳＰ−セファデックスを沈降させ、」二清をデカン トする。このＳＰ−セファデックスをカラムにつめ、Ｏ，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ ５、０）６０ｎ（ｌで洗浄し、同じ緩衝液→−ＩＭ塩化ナトリウム６０ｘＣで溶 離する。溶出液を＋４°Ｃで攪拌し、同容量の飽和硫酸アンモニウムをゆっくり と加えろ。この懸詞液を更に３０分間攪拌する。次いでｔ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏｇで １０分間遠心して沈澱を集める。この沈澱を最少量の冷すン酸／ＥＤＴＡＩ衝液 （２０ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７゜５、＋００２％アジ 化ナトリウムＸＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ−セルロースクロマ）・グラフィーの場合）、ま たはリン酸緩衝液（０，１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８，２＋０．０２％アジ化 すｌ・リウム）（プロティンＡ−セファロースタロマドグラフィーの場合）に溶 解する。溶解した沈澱を２Ｘ１００ＯｍＱの溶解緩衝液に対して＋４℃で透析し 、既述した要領で適当なりロマトグラフィーを行なう。

Ｇ、酵素−モノクローナル抗体 上で調製した、抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を酵素、即ち高純度の アルカリホスファターゼと結合させる。１段階グルタルアルデヒド法またはベン ゾキノン・コンジュゲート法を用いる。

１段階グルタルアルデヒド法では、モノクローナル抗体３１ｇ（約１ｍＱの溶液 中）をアルカリホスファターゼ（シグマ　タイプ■−Ｔ）を用い、ＰＢＳ（ｐＨ ７，４）ｔ　０００村に対して２回、４℃で透析する。透析の後、容量をＰＢＳ で２．５ｘＱにし、ＰＢＳ中の２０％グルタルアルデヒド溶液２５μＱを加える 。このコンジュゲーション混合物を室温で１．５時間放置する。次いで、グルタ ルアルデヒドを、予めＰＢＳで平衡化しておいた、ファーマシアＰＨ−１０（セ ファデックスＧ−２５Ｍ）カラムでゲル濾過して除去する。このコンジュゲート 体をＰＢＳ３．５ｍ（で溶出し、次いでこのコンジュゲート体を１−リス緩衝液 〔５０ｍＭトリス、１ｍＭ塩化マグネシウム（ｐｌ−１８，０）、＋０．０２％ アジ化すトリウム）２ｘ２０００ｍＱに対して、４°Ｃで透析する。この透析コ ンジュゲート体に、トリス緩衝液の１０％ＢＳＡ溶液を１／ｌＯ容量加える。次 いで、このコンジュゲ−１・体を、０２２μｍのメンブランフィルタ−で滅菌濾 過し、滅菌した褐色バイアルに入れ、４℃で保存する。

実施例２ 実施例１とほぼ同様の操作を行なった。抗原は、バーミンガム大学から供給され たクロストリジウム・ディフィンレの毒素Ａであった。免疫に際し、調製したト キシンをポリクローナル抗体で中和し、フロイントの完全アジュバントと共に、 ２回、１週間の間隔をあけて皮下投与により免疫した。次いで、２週問および１ 週間の間隔をあけて、ＰＢＳ＋中和された毒素を２回腹腔内投与し、更に１週間 後に毒素を静脈内にチャレンジした。その３日後に融合を行なった。

クローニングには制限希釈法を用いた。

実施例１の一般的方法に従い、クロストリジウム属の全ての種の抗原と広く交叉 反応するモノクローナル抗体を製造する。

本発明方法を用いる試験方法は、以下の利点によって現在の試験法よりも優れて いる：（Ｉ）精度が高い＋（ｉｉ）即日、１．２時間以内に結果が得られる：　 （ｉｉｉ　）検査室での操作を管理するために必要な熟練した研究者の数を減少 させることができ、労働コストが下がる；（ｉｖ）試験に関して使用される労働 時間および空間を減少させることができ、総経費を下げることになる；（Ｖ）迅 速かつ正確な診断に基づいたより良い治療を行うことができる。

本発明は、特定の好ましい態様について述べたものであるが、本発明の範囲をこ こに挙げた特定の形に限定するものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に定 義された本発明の思想および範囲に含まれる変法、改良法および均等法を包含す るものである。

国際調査報告 ｌＩＩＩｍｆｉ＠Ｍａｌｌ−〇ｋｊ”’ｌｉｅ、ＰＣＴ／ＧＢ８５１００４７３ Ｉｎ市軒ＲＪｌｌａＩｎｌＡｍｌＣＩｌ１ｗ１１４Ｐ（−ゴー７ＧＢ８５１００ ４７３ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨ ＲＥＰＯＲＴ　０ＮｒＮＴＥＲＮＡＴ工０ＮＡＬＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＮｏ、 ＰＣＴ／ＧＢ８５１００４７３（ＳＡ１０９５５）τｂｅ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　 Ｐａｔｅｎｔ　０ｆｆｉｃｅ　ｉｓ　土ｎ　ｎｏ　ｗａｙ　１ｉａｂｌａ　ｆｏ ｒ　ｔｈａｓａｐａｒｔｉｃｕｌａｒｓ　ｗｈｉｃｈ　ａｒｅ　ｍｅｒｅｌｙ　 ｇｉｖｅｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｕｒｐｏｓｅ　ｏｆｉｎｆｏｒｍａセｉｏｎ、

Claims (57)

【特許請求の範囲】
1. １．クロストリジウムの抗原またはクロストリジウム種に特異的なモノクローナ ル抗体。
2. ２．クロストリジウム・ボツリヌムの抗原または抗原群に特異的な第１項に記載 の抗体。
3. ３．クロストリジウム・ボツリヌム毒素の抗原または抗原群に特異的な第１項に 記載の抗体。
4. ４．クロストリジウム・ボツリヌムの毒素に特異的な第１項に記載の抗体。
5. ５．クロストリジウム・ペルフリンゲンスの抗原または抗原群に特異的な第１項 に記載の抗体。
6. ６．クロストリジウム・ペルフリンゲンス毒素の抗原または抗原群に特異的な第 １項に記載の抗体。
7. ７．クロストリジウム・ペルフリンゲンスの毒素に特異的な第１項に記載の抗体 。
8. ８．クロストリジウム・テタニの抗原または抗原群に特異的な第１項に記載の抗 体。
9. ９．クロストリジウム・テタニの毒素の抗原または抗原群に特異的な第１項に記 載の抗体。
10. １０．クロストリジウム・テタニの毒素に特異的な第１項に記載の抗体。
11. １１．クロストリジウム・ディフィシレの抗原または抗原群に特異的な第１項に 記載の抗体。
12. １２．クロストリジウム・ディフィシレ毒素の抗原または抗原群に特異的な第１ 項に記載の抗体。
13. １３．クロストリジウム・ディフィシレの毒素に特異的な第１項に記載の抗体。
14. １４．クロストリジウム属の全ての種の抗原と広く交叉反応するモノクローナル 抗体。
15. １５．実質的に第１項〜第１４項のいずれかに記載のモノクローナル抗体と適当 な標識剤からなる標識されたモノクローナル抗体。
16. １６．標識剤が放射活性同位元素、酵素、蛍光性化合物、生物的発光性化合物、 化学的発光性化合物、または強磁性の原子または粒子から選ばれる群の１つであ る第１５項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
17. １７．標識剤がモノクローナル抗体とコンジュゲートし得るものであり、かつ、 酵素−結合免疫検定法に使用し得るものである第１６項に記載の標識されたモノ クローナル抗体。
18. １８．該酵素がアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシ ダーゼまたはペルオキシダーゼである第１７項に記載の標識されたモノクローナ ル抗体。
19. １９．該標識剤が免疫−蛍光免疫検定法、蛍光免疫検定法、酵素蛍光免疫検定、 蛍光分極免疫検定、光子計数免疫検定などに使用し得る蛍光性化合物またはプロ ーブである第１６項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
20. ２０．該蛍光性化合物またはプローブがフルオレセインである第１９項に記載の 標識されたモノクローナル抗体。
21. ２１．該標識剤が発光免疫検定または酵素−結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第１６項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
22. ２２．化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第２１項 に記載の標識されたモノクローナル抗体。
23. ２３．該標識剤が適当な生物学的発光免疫検定に使用し得る生物的発光性化合物 である第１６項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
24. ２４．生物的発光性化合物がルシフエラーゼまたはルシフエラーゼ誘導体である 第２３項に記載の標識されたモノクローナル抗体。
25. ２５．検体の少なくとも１部を、第１５項に記載の標識されたモノクローナル抗 体と、該標識剤に適した免疫検定法で接触させることからなる、該検体中のクロ ストリジウム抗原の存在を診断する方法。
26. ２６．適当に標識された免疫検定法が、免疫−蛍光免疫検定、蛍光免疫検定、免 疫−電子顕微鏡法、放射性検定法、酵素−結合免疫検定法、蛍光分極法、光子− 計数生物学的発光法または化学的発光免疫検定法から選ばれる第２５項に記載の 方法。
27. ２７．該標識刑が、酵素−結合免疫検定法に使用し得る酵素である第２６項に記 載の方法。
28. ２８．該酵素がアルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシ ダーゼまたはペルオキシダーゼから選ばれる第２７項記載の方法。
29. ２９．該標識剤が免疫−蛍光免疫検定法、蛍光免疫検定法、酵素蛍光免疫検定、 蛍光分極免疫検定、光子−計数免疫検定などに使用し得る蛍光性化合物またはプ ローブである第２６項に記載の方法。
30. ３０．該蛍光性化合物またはプローブがフルオレセインである第２９項に記載の 方法。
31. ３１．該標識剤が発光免疫検定または酵素−結合発光免疫検定に使用し得る化学 的発光性化合物である第２６項に記載の方法。
32. ３２．該化学的発光性化合物がルミノールまたはルミノール誘導体である第３１ 項に記載の方法。
33. ３３．該標識剤が生物学的発光免疫検定または酵素−結合生物学的免疫検定に使 用し得る生物学的発光性化合物である第２６項に記載の方法。
34. ３４．該生物的発光性化合物がルシフエラーゼまたはルシフエラーゼ誘導体であ る第３３項に記載の方法。
35. ３５．第１項〜第１４項の１種またはそれ以上の標識されたモノクローナル抗体 と薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
36. ３６．第１５項の１種またはそれ以上の標識されたモノクローナル抗体と薬学的 に許容し得る担体または希釈剤を含有する治療用組成物。
37. ３７．第１項〜第１４項のモノクローナル抗体の有効量を投与することからなる クロストリジウム感染症の治療方法。
38. ３８．第１項〜第１４項の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含有する、診 断用検体中のクロストリジウムの抗原またはクロストリジウム種の存在を診断す るためのキット。
39. ３９．該少なくとも１種の抗体が標識されている第３８項記載のキット。
40. ４０．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が蛍光性化合物で標識されている 第３９項記載のキット。
41. ４１．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が酵素で標識されている第３９項 記載のキット。
42. ４２．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が放射活性同位元素、化学的発光 性化合物、生物的発光性化合物、強磁性の原子または粒子からなる群の１っで標 識されている第３９項記載のキット。
43. ４３．対照として少なくとも１種の既知のクロストリジウム抗原を更に含有して なる第３９、４０、４１および４２項のいずれかに記載のキット。
44. ４４．クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ペルフリンゲンス、 クロストリジウム・テタニおよびクロストリジウムディフィシレの既知の抗原を 含有している第３９、４０、４１、４２および４３項のいずれかに記載のキット 。
45. ４５．クロストリジウムポツリヌム毒素、クロストリジウム・ペルフリンゲンス 泌素、クロストリジウム・テタニ毒素および／またはクロストリジウム・ディフ ィシレ毒素の抗原を含有している第３９、４０、４１、４２および４３項のいず れかに記載のキット。
46. ４６．クロストリジウム・ボツリヌムの抗原を含有している第３９、４０、４１ 、４２および４３項のいずれかに記載のキット。
47. ４７．クロストリジウム・ペルフリンゲンスの抗原を含有している第３９、４０ 、４１、４２および４３項のいずれかに記載のキット。
48. ４８．クロストリジウム・テタニの抗原を含有している第３９、４０、４１、４ ２および４３項のいずれかに記載のキット。
49. ４９．クロストリジウム・ディフィシレの抗原を含有している第３９、４０、４ １、４２および４３項のいずれかに記載のキット。
50. ５０．クロストリジウム・ボツリヌムの毒素の抗原を含有している第３９、４０ 、４１、４２および４３項のいずれかに記載のキット。
51. ５１．クロストリジウム・ペルフリンゲンスの毒素の抗原を含有している第３９ 、４０、４１、４２および４３項のいずれかに記載のキット。
52. ５２．クロストリジウム・テタニの毒素の抗原を含有している策３９、４０、４ １、４２および４３項のいずれかに記載のキット。
53. ５３．クロストリジウム・ディフィシレの毒素の抗原を含有している節３９、４ ０、４１、４２および４３項のいずれかに記載のキット。
54. ５４．第１項〜第１４項の少なくとも１種のモノクローナル抗体と対照を含んで なる、診断用検体中のクロストリジウムの抗原またはクロストリジウム種の存在 を診断するためのキット。
55. ５５．該少なくとも１種の抗原が標識されており、該対照が少なくとも１種の既 知のクロストリジウム抗原である第５４項に記載のキット。
56. ５６．第１項〜第１４項の少なくとも１種のモノクローナル抗体を含んでなる、 クロストリジウムの感染の存在を診断するためのキット。
57. ５７．該少なくとも１種のモノクローナル抗体が標識されている第５６項に記載 のキット。