JPS60203186A - ヒト−ヒトハイブリド−マ - Google Patents
ヒト−ヒトハイブリド−マInfo
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- JPS60203186A JPS60203186A JP59060061A JP6006184A JPS60203186A JP S60203186 A JPS60203186 A JP S60203186A JP 59060061 A JP59060061 A JP 59060061A JP 6006184 A JP6006184 A JP 6006184A JP S60203186 A JPS60203186 A JP S60203186A
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- Japan
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- cells
- human
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- ouabain
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1282—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Clostridium (G)
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
本発明は、新規なヒト−ヒトハイブリトーマに関する。
更にＨＩＰ シ＜は、本発明は抗破傷風抗体産生能を有
するヒト−ヒトハイブリドーマに関する。
するヒト−ヒトハイブリドーマに関する。
本発明に係るヒト−ヒトハイブリドーマ傷風菌に対する
モノクローナル抗体の生産に利用でき、しかも、その細
胞系がヒト由来のものであることから、当該ハイブリド
ーマによって産生される抗体は、抗原性に関する問題が
ない点において治療上大きな効果をもたらす発明である
。
モノクローナル抗体の生産に利用でき、しかも、その細
胞系がヒト由来のものであることから、当該ハイブリド
ーマによって産生される抗体は、抗原性に関する問題が
ない点において治療上大きな効果をもたらす発明である
。
破傷風抗体は破傷風菌による感染を受けた人に投与する
ごとにより、破傷風の発症を防止する効果のあることが
判っている。また、破傷Ｄ；（発症の防止と共に破傷風
抗体の投与により感染を未然に防ぐことも次第に明らか
になっており、医学的に貢献度の高いものとして期待さ
れている。
ごとにより、破傷風の発症を防止する効果のあることが
判っている。また、破傷Ｄ；（発症の防止と共に破傷風
抗体の投与により感染を未然に防ぐことも次第に明らか
になっており、医学的に貢献度の高いものとして期待さ
れている。
ところで、一般に抗体にはポリクローナル抗体とモノク
ローナル抗体の二種１ｊがあるが、最近は増殖性を有゛
する癌化リンパ様細胞系を用いてモノクローナル抗体を
製造する技術が注目を集めている。このモノクローナル
抗体は、−関の抗＋ｙ決定基に対してのみ反応する単一
の抗体であるが、その生産方法としては、現在、細胞融
合法と形質転換法がある。どもらも増殖性と抗体産生能
を同時に兼ね備えた細胞をａＭするもので、前者は免疫
された供給者のＢ細胞を１゛１髄１１１１胞と１ｎνｉ
ｔｒｏで融合させる方法であり、後者は免疫した供給打
のＢ細胞をＥｐｓＬｅｉｎ Ｂａｒｒウィルス等の向リ
ンパ性ウィルスに感染させて増殖可能な形に変換させる
方法である。
ローナル抗体の二種１ｊがあるが、最近は増殖性を有゛
する癌化リンパ様細胞系を用いてモノクローナル抗体を
製造する技術が注目を集めている。このモノクローナル
抗体は、−関の抗＋ｙ決定基に対してのみ反応する単一
の抗体であるが、その生産方法としては、現在、細胞融
合法と形質転換法がある。どもらも増殖性と抗体産生能
を同時に兼ね備えた細胞をａＭするもので、前者は免疫
された供給者のＢ細胞を１゛１髄１１１１胞と１ｎνｉ
ｔｒｏで融合させる方法であり、後者は免疫した供給打
のＢ細胞をＥｐｓＬｅｉｎ Ｂａｒｒウィルス等の向リ
ンパ性ウィルスに感染させて増殖可能な形に変換させる
方法である。
これらの製造方法は未だ未熟であり、その抗体産生量の
改善、毒素である抗原を使用することに対する安全対策
、夾雑抗原の精製の困難性の克服などの未解決の問題点
も多く、実用化には多くの困ｆｆ１１ｔがある。即ち、
細胞融合法を用いた場合は、融合効率の低さと、全リン
パ球の中に存在する抗破傷風抗体産生細胞の割合の低さ
により、満足のいく抗体産生ハイブリドーマは得られて
いない。
改善、毒素である抗原を使用することに対する安全対策
、夾雑抗原の精製の困難性の克服などの未解決の問題点
も多く、実用化には多くの困ｆｆ１１ｔがある。即ち、
細胞融合法を用いた場合は、融合効率の低さと、全リン
パ球の中に存在する抗破傷風抗体産生細胞の割合の低さ
により、満足のいく抗体産生ハイブリドーマは得られて
いない。
また、形質転換法を用いる場合、非常に高いＵ（Ｃ率で
株化細胞は得られるが、クローニング効率が数％と非常
に低いのが弱点である。
株化細胞は得られるが、クローニング効率が数％と非常
に低いのが弱点である。
また、生産される抗体の抗原性につい°この問題は、ヒ
トと免疫反応を起こさない動物の細胞系を用いることに
よって解決されるが、一般的にはヒト由来の細胞系を用
いることにより安全性が保たれることが判っている。し
かし、この場合も抗体産生能および増殖性について必ず
しも満足な結果が得られるまでには至っていない。
トと免疫反応を起こさない動物の細胞系を用いることに
よって解決されるが、一般的にはヒト由来の細胞系を用
いることにより安全性が保たれることが判っている。し
かし、この場合も抗体産生能および増殖性について必ず
しも満足な結果が得られるまでには至っていない。
本発明者らは、完全でかつ大量生産可能な抗破傷風抗体
産生細胞系の確立の一環として、抗原性の問題のないヒ
ト−ヒトハイブリトーマについて鋭怠研究を重ねた結果
、上述したような抗体生産に係わる諸問題を克服する手
段として、新規な親細胞であるＨＡＴ（ヒボキサンチン
・アミノプテリン・チミジン）感受性ウアバイン耐性を
有するヒト由来ミエローマ細胞とＥｐｓｔｅｉｎ Ｂａ
ｒｒウィルス等の向リンパ性ウィルスによって形質転換
させたヒト由来抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞とを細胞融合
させることにより、増殖性が高く、しかも抗原性の問題
もないヒト−ヒトハイブリトーマがｉｎられることを見
いだし、本発明を完成した。
産生細胞系の確立の一環として、抗原性の問題のないヒ
ト−ヒトハイブリトーマについて鋭怠研究を重ねた結果
、上述したような抗体生産に係わる諸問題を克服する手
段として、新規な親細胞であるＨＡＴ（ヒボキサンチン
・アミノプテリン・チミジン）感受性ウアバイン耐性を
有するヒト由来ミエローマ細胞とＥｐｓｔｅｉｎ Ｂａ
ｒｒウィルス等の向リンパ性ウィルスによって形質転換
させたヒト由来抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞とを細胞融合
させることにより、増殖性が高く、しかも抗原性の問題
もないヒト−ヒトハイブリトーマがｉｎられることを見
いだし、本発明を完成した。
本発明は、増殖性に優れ、抗原性の問題もない抗破傷風
抗体産生のためのヒト−ヒトハイブリトーマを提供する
ことを目的とするものであり、ヒト由来ＨＡＴ感受性ウ
アバイン耐性ミエローマ細胞と、向リンパ性ウィルスに
よって形質転換されたヒト由来抗破傷風抗体産生性Ｂ細
胞とを融合させて得られたヒト−ヒトハイブリドーマに
関する。
抗体産生のためのヒト−ヒトハイブリトーマを提供する
ことを目的とするものであり、ヒト由来ＨＡＴ感受性ウ
アバイン耐性ミエローマ細胞と、向リンパ性ウィルスに
よって形質転換されたヒト由来抗破傷風抗体産生性Ｂ細
胞とを融合させて得られたヒト−ヒトハイブリドーマに
関する。
本発明におＬノる細胞融合は、増殖性を持った細胞と抗
体産生性を持った細胞とによって行われる。
体産生性を持った細胞とによって行われる。
本発明において、抗体産生性Ｉ！ｕ＋胞として向リンパ
性ウィルスによって形質転換されたヒ１〜由来抗破傷風
抗体産生性Ｂ細胞を用いる。
性ウィルスによって形質転換されたヒ１〜由来抗破傷風
抗体産生性Ｂ細胞を用いる。
当該Ｂ細胞は自体既知の手段によって調製され、その調
製法としては、たとえは次の如き方法が例示される。
製法としては、たとえは次の如き方法が例示される。
当該Ｂ細胞を得るだめの破傷風抗原は、破傷風菌が生成
する分子量７〜８万、等重点５．１の蛋白毒素であり、
菌体外毒素であり、通常、市販の無毒化トキソイド、破
傷風菌を培巷後、培養府を精製したもの等が用いられる
。こうして得られる破傷風抗原の抗原性を高めておくた
めに、蛋白変性剤の存在下、加熱処理を施すことも可能
である。
する分子量７〜８万、等重点５．１の蛋白毒素であり、
菌体外毒素であり、通常、市販の無毒化トキソイド、破
傷風菌を培巷後、培養府を精製したもの等が用いられる
。こうして得られる破傷風抗原の抗原性を高めておくた
めに、蛋白変性剤の存在下、加熱処理を施すことも可能
である。
抗原はさらに免疫用に高度に精製しておくことが望まし
い。
い。
上記破傷風抗原によるＢ細胞の抗体産生の刺激は、ｉｎ
ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。１ｎ
ｖｉｖｏの場合は、公知の方法を用いればよく、例えば
破傷風抗原とフロイントの完全アンユハントの混合乳液
を作り、ヒトの皮肉に２〜３回接種し、最終免疫の数日
後、採血を行い、得られた血液から１３細胞を回収、積
盟することにより、所望のヒト由来抗破傷風抗体産生性
＋３Ｓ＋＋＋胞が得られる。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏの
場合は、■３細胞を先にヒｉ−生体外に取り出し、その
まま、あるいは培養した後、破傷風抗原で刺激すること
によって行われる。破傷風抗原による生体外での刺激は
、例えば精製抗原の適量とＢ細胞とを３０〜４０℃で１
０〜５０時間接触させることによって行われ、一般的に
は培地中で行われる。Ｂ細胞の分離は、好適にはファイ
コール・コンレイの比重遠心法によって行われる。
ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。１ｎ
ｖｉｖｏの場合は、公知の方法を用いればよく、例えば
破傷風抗原とフロイントの完全アンユハントの混合乳液
を作り、ヒトの皮肉に２〜３回接種し、最終免疫の数日
後、採血を行い、得られた血液から１３細胞を回収、積
盟することにより、所望のヒト由来抗破傷風抗体産生性
＋３Ｓ＋＋＋胞が得られる。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏの
場合は、■３細胞を先にヒｉ−生体外に取り出し、その
まま、あるいは培養した後、破傷風抗原で刺激すること
によって行われる。破傷風抗原による生体外での刺激は
、例えば精製抗原の適量とＢ細胞とを３０〜４０℃で１
０〜５０時間接触させることによって行われ、一般的に
は培地中で行われる。Ｂ細胞の分離は、好適にはファイ
コール・コンレイの比重遠心法によって行われる。
かくして得られたＢ細胞は、向リンパ性ウィルスによっ
て増殖型に形質転換される。
て増殖型に形質転換される。
形質転換には、向リンパ性ウィルス、たとえばＥｐｓｔ
ｅｉｎ Ｂａｒｒウィルスが用いられる。当該ウィルス
は正常細胞を増殖型の１１１１胞に形ｆｆ１Ｉｆ転換さ
せるウィルスとして知られる（ Ｎａｔｕｒｅ ２６９
．４２（１４２２（１９７７） ） 、 Ｂ ９５−８
山来ＥｐｓＬｅｉｎ ｎａｒｒウィルス（マイコプラズ
マフリー Ｂ９５−８培地からの上清としてうる）を用
い、あらかしめ細胞転換可能量のウィルスを１！Ｊ製す
る。かくして調製されたウィルスをＢ細胞の培養系培地
に適量滴下し、好ましくは３７℃において５〜２０日間
接触させる。Ｂ細胞の培養は、例えば３７℃、５％牛脂
児血Ｆｔ中で行う。また、この培養は培地にグルタミン
を添加した培養培地中で行ってもよい。
ｅｉｎ Ｂａｒｒウィルスが用いられる。当該ウィルス
は正常細胞を増殖型の１１１１胞に形ｆｆ１Ｉｆ転換さ
せるウィルスとして知られる（ Ｎａｔｕｒｅ ２６９
．４２（１４２２（１９７７） ） 、 Ｂ ９５−８
山来ＥｐｓＬｅｉｎ ｎａｒｒウィルス（マイコプラズ
マフリー Ｂ９５−８培地からの上清としてうる）を用
い、あらかしめ細胞転換可能量のウィルスを１！Ｊ製す
る。かくして調製されたウィルスをＢ細胞の培養系培地
に適量滴下し、好ましくは３７℃において５〜２０日間
接触させる。Ｂ細胞の培養は、例えば３７℃、５％牛脂
児血Ｆｔ中で行う。また、この培養は培地にグルタミン
を添加した培養培地中で行ってもよい。
こうして形質転換により得られた増殖型Ｂ細胞を継代培
養し、この細胞から破傷風抗原に対する抗体を産生ずる
細胞を選別、濃縮する。
養し、この細胞から破傷風抗原に対する抗体を産生ずる
細胞を選別、濃縮する。
抗破傷風抗体を産生ずる細胞は、例えばＰ Ｉ−Ｉ Ａ
法、ＥＩＡ法、ＲＸＡ法、ＥＬＩＳＡ法等により追跡さ
れる。
法、ＥＩＡ法、ＲＸＡ法、ＥＬＩＳＡ法等により追跡さ
れる。
本発明に関して、増殖性をもつ細胞としてヒト出来ＨＡ
Ｔ 感受性ウアバイン耐性ミエローマ細胞が用いられ
る。当該ヒ１−山来ＨＡ ｉ”感受性ウアバイン耐性ミ
エローマ細胞は、公知の方法により調製され得る。例え
ば、ヒ１−由来ＨＡＴ感受性ミエローマ細胞を培養する
際に、培地中のウアバイン濃度を長時間にわたり上昇さ
せていくことにより、自然発生的なウアバイン耐性細胞
が得られる。この操作により、細胞が木来有していた性
Ｗ＜＋１ＡＴ感受性、融合効率、増殖性など）に影響を
及ぼさずにウアバイン耐性というマーカー機能を持たせ
ることができ、選択が容易になる。
Ｔ 感受性ウアバイン耐性ミエローマ細胞が用いられ
る。当該ヒ１−山来ＨＡ ｉ”感受性ウアバイン耐性ミ
エローマ細胞は、公知の方法により調製され得る。例え
ば、ヒ１−由来ＨＡＴ感受性ミエローマ細胞を培養する
際に、培地中のウアバイン濃度を長時間にわたり上昇さ
せていくことにより、自然発生的なウアバイン耐性細胞
が得られる。この操作により、細胞が木来有していた性
Ｗ＜＋１ＡＴ感受性、融合効率、増殖性など）に影響を
及ぼさずにウアバイン耐性というマーカー機能を持たせ
ることができ、選択が容易になる。
こうして得られた形質転換により増殖性を有するヒト由
来抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞とヒ１〜山来ＨＡ Ｔ感受
性ウアバイン耐性ミエローマ細胞とを用いて細胞融合を
行う。細胞融合は自体既知の手段にて行われるが、その
−例は増殖性を持った細胞と抗体を産生じている前記Ｂ
細胞とをポリエチレングリコールの存在下で反応せしめ
る。混合比は増殖性細胞１個に対して、ｒ３細胞１−１
０ Ｉｌｌが適当である。
来抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞とヒ１〜山来ＨＡ Ｔ感受
性ウアバイン耐性ミエローマ細胞とを用いて細胞融合を
行う。細胞融合は自体既知の手段にて行われるが、その
−例は増殖性を持った細胞と抗体を産生じている前記Ｂ
細胞とをポリエチレングリコールの存在下で反応せしめ
る。混合比は増殖性細胞１個に対して、ｒ３細胞１−１
０ Ｉｌｌが適当である。
こうして得られた融合細胞は、１１八Ｔ→−ウアバイン
添加培地により選択されるが、それは以下のような根拠
に基づく。ＨＡ Ｔ感受性とは、培地中にＨＡ Ｔが存
在すると細胞が成育あるいは増殖できない性質をさし、
ウアバイン耐性とは高濃度のウアバイン存在下でも細胞
が増殖可能となることである。又、ウアバイン耐性細胞
と正常細胞とを融合させたものはウアバイン耐性となる
ことが知られている。従って、ヒト由来＋１ Ａ Ｔ感
受性ウアバイン白１性ミエローマ細胞とヒト由来抗破傷
風抗体産生性Ｂ細胞（このＢ細胞はＩｆ Ａ Ｔ感受性
、ウアバイン耐性ともにない）を融合させた場合、培地
中に１１八′１′士ウアバインが存在していれば、融合
しなかったミエローマ細胞ばＨＡ ”ｒ感受性のために
、また融合しなかった１３細胞もウアバイン耐性ではな
いために増殖できない。しかし、融合できた細胞はウア
バイン耐性のために増殖可能となる。こうして融合細胞
のみを選別することができる。
添加培地により選択されるが、それは以下のような根拠
に基づく。ＨＡ Ｔ感受性とは、培地中にＨＡ Ｔが存
在すると細胞が成育あるいは増殖できない性質をさし、
ウアバイン耐性とは高濃度のウアバイン存在下でも細胞
が増殖可能となることである。又、ウアバイン耐性細胞
と正常細胞とを融合させたものはウアバイン耐性となる
ことが知られている。従って、ヒト由来＋１ Ａ Ｔ感
受性ウアバイン白１性ミエローマ細胞とヒト由来抗破傷
風抗体産生性Ｂ細胞（このＢ細胞はＩｆ Ａ Ｔ感受性
、ウアバイン耐性ともにない）を融合させた場合、培地
中に１１八′１′士ウアバインが存在していれば、融合
しなかったミエローマ細胞ばＨＡ ”ｒ感受性のために
、また融合しなかった１３細胞もウアバイン耐性ではな
いために増殖できない。しかし、融合できた細胞はウア
バイン耐性のために増殖可能となる。こうして融合細胞
のみを選別することができる。
さらに、目的とする抗破傷風抗体を産生じている細胞を
公知の方法によりスクリーニングおよびクローニングし
て、抗破傷風抗体産生ヒト−ヒトハイブリトーマを得る
。
公知の方法によりスクリーニングおよびクローニングし
て、抗破傷風抗体産生ヒト−ヒトハイブリトーマを得る
。
こうして得られたハイブリドーマはヒト由来であるため
、ハイブリドーマが産生じた抗体のヒトに対する抗原性
についても問題はなく、また単にヒト由来ミエローマ細
胞とヒト由来抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞を細胞融合さ・
Ｕたもの、あるいはヒト由来抗破傷風抗体産生性■３細
胞をＩＥｐｓＬｅｉｎ Ｂａｒｒウィルスで形質転換さ
−Ｉただののものに比べ（、抗体産生能および特に増殖
性に優れた抗体産生ｊ■！胞を得ることができる。
、ハイブリドーマが産生じた抗体のヒトに対する抗原性
についても問題はなく、また単にヒト由来ミエローマ細
胞とヒト由来抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞を細胞融合さ・
Ｕたもの、あるいはヒト由来抗破傷風抗体産生性■３細
胞をＩＥｐｓＬｅｉｎ Ｂａｒｒウィルスで形質転換さ
−Ｉただののものに比べ（、抗体産生能および特に増殖
性に優れた抗体産生ｊ■！胞を得ることができる。
このハイブリドーマを成育培地で増殖させることにより
、モノクローナル抗体を連続的に産生せしめて、次いで
培地から抗体を回収することができる。
、モノクローナル抗体を連続的に産生せしめて、次いで
培地から抗体を回収することができる。
以下に本発明を実施例によって説明するが、本発明はこ
れらに限定されない。
れらに限定されない。
実施例１
健康な大人の志願者各々にテクヌストキソイト（０，５
ｍ１）のブースター（補助注射）免疫法を行った。この
注射から約４Ｂ１を初ｌ」として一定の時間間隔で採血
した。この末梢血液からファイコール・コンレイ比重遠
心法によりリンパ球を単離した後、Ｅ−ロゼソト形成に
よりＴ細胞を除いてＢ細胞のみを得た。このＢ細胞はＲ
ＰＭＩ １６４０＋ １５％ウシ胎児血清＋２ｍＭグル
タミンの培地で培養しておく （細胞濃度ｌＸ１０Ｇ（
囚／ ｍ Ｉ ）。一方、Ｂ９５−８細胞（マーモセッ
トリンパ球株化細胞）をＲｆ’Ｍｌ １６４０４２０％
ウシ胎児血ｌｎ培養液で培養し、数日後、培養上清を分
取したものをＥｐｓｔｃｉｎＢ ａ ｒ ｒウィルス液
として用いた（濃度１（＋５転換用Ｓｔ ／ ｍ ｌ）
。上述したＢ細胞培養培地１ｍｌにＥｐ−ｓｔｅｉｎ
Ｒａ’ｒｒウィルス液０．２ｍｌを加え、感染させて、
培＃？ｐｉ、（ＲＰＭ１１６４０＋２０％ウシ胎児血ｒ
Ｎ）中、０．５％Ｃ０２下で３週間静置培養し、細胞の
増殖を行った。増殖した細胞から抗体産生細胞を回収す
るために、限界希釈培養法を用い、ＥＬＩＳＡ法でチェ
ックしながら抗破傷風抗体産生性の継代培養細胞を得た
。
ｍ１）のブースター（補助注射）免疫法を行った。この
注射から約４Ｂ１を初ｌ」として一定の時間間隔で採血
した。この末梢血液からファイコール・コンレイ比重遠
心法によりリンパ球を単離した後、Ｅ−ロゼソト形成に
よりＴ細胞を除いてＢ細胞のみを得た。このＢ細胞はＲ
ＰＭＩ １６４０＋ １５％ウシ胎児血清＋２ｍＭグル
タミンの培地で培養しておく （細胞濃度ｌＸ１０Ｇ（
囚／ ｍ Ｉ ）。一方、Ｂ９５−８細胞（マーモセッ
トリンパ球株化細胞）をＲｆ’Ｍｌ １６４０４２０％
ウシ胎児血ｌｎ培養液で培養し、数日後、培養上清を分
取したものをＥｐｓｔｃｉｎＢ ａ ｒ ｒウィルス液
として用いた（濃度１（＋５転換用Ｓｔ ／ ｍ ｌ）
。上述したＢ細胞培養培地１ｍｌにＥｐ−ｓｔｅｉｎ
Ｒａ’ｒｒウィルス液０．２ｍｌを加え、感染させて、
培＃？ｐｉ、（ＲＰＭ１１６４０＋２０％ウシ胎児血ｒ
Ｎ）中、０．５％Ｃ０２下で３週間静置培養し、細胞の
増殖を行った。増殖した細胞から抗体産生細胞を回収す
るために、限界希釈培養法を用い、ＥＬＩＳＡ法でチェ
ックしながら抗破傷風抗体産生性の継代培養細胞を得た
。
一方、ヒト由来ＨＡ Ｔ感受性ウアバイン耐性ミエロー
マ細胞は以下の方法により調製した。
マ細胞は以下の方法により調製した。
対数増殖期のヒト由来ＨＡ Ｔ感受性ミエローマ細胞を
細胞数８個／ｍｌとなるように培地（１７Ｉ’Ｍ１１６
４０＋ １０％ウシ胎児血清）で希釈し、ｗｅｌｌマイ
クロプレートを用いて１００ Ｐ４ ／ ｗｅｔ １で
分注し、ｗｅ１１当たりの郭Ｉ胞数を０．８ｆ固とした
。これを３７℃、５％ｃｏ２で約２週間培養した。その
後、３０〜４０％のクローニングＱＪ率で細胞の増殖が
みられ、そのうちもっとも増殖性の良い細胞を約１０６
ｆｔ？ｉ１／ｍｌの細胞密度に調整した培養液に１０−
”Ｍのウアバインを加えた培地で培養した。同様の培地
交換を２〜３度繰り返し、最後は１０−”Ｍのウアバイ
ンを加えて培養した。その後、ウアバインを除いて培養
を行い、ごく少数の生存した細胞を増殖させた。約１０
日後、増殖してきた細胞を遠心洗浄し、１０−ＧＭのウ
アバインを含む培地に１０５個／ｍｌとなるように細胞
を浮遊させ、ｗｅ１１マイクロプレートに１００ ）Ｊ
／ｗｅｌｌとなるように分注した。これを−週間に２回
の培地交換で約１ケ月培養し、１０（Ｍのウアバイン存
在下でも増殖する細胞を得た。
細胞数８個／ｍｌとなるように培地（１７Ｉ’Ｍ１１６
４０＋ １０％ウシ胎児血清）で希釈し、ｗｅｌｌマイ
クロプレートを用いて１００ Ｐ４ ／ ｗｅｔ １で
分注し、ｗｅ１１当たりの郭Ｉ胞数を０．８ｆ固とした
。これを３７℃、５％ｃｏ２で約２週間培養した。その
後、３０〜４０％のクローニングＱＪ率で細胞の増殖が
みられ、そのうちもっとも増殖性の良い細胞を約１０６
ｆｔ？ｉ１／ｍｌの細胞密度に調整した培養液に１０−
”Ｍのウアバインを加えた培地で培養した。同様の培地
交換を２〜３度繰り返し、最後は１０−”Ｍのウアバイ
ンを加えて培養した。その後、ウアバインを除いて培養
を行い、ごく少数の生存した細胞を増殖させた。約１０
日後、増殖してきた細胞を遠心洗浄し、１０−ＧＭのウ
アバインを含む培地に１０５個／ｍｌとなるように細胞
を浮遊させ、ｗｅ１１マイクロプレートに１００ ）Ｊ
／ｗｅｌｌとなるように分注した。これを−週間に２回
の培地交換で約１ケ月培養し、１０（Ｍのウアバイン存
在下でも増殖する細胞を得た。
；ｌ、 ＋７） ＨＡ Ｔ 感受＋１ウアバイン耐性ミ
エローマｈａｔ胞１．５Ｘ１０Ｇ個と上述の継代培養細
胞３Ｘ１０６（囚と７昆和し、５０％ポリエチレングリ
コール（ＰＥ Ｇ １５００． Ｂ Ｄ Ｈ［） ０．
３ ｍｌを加え、３７℃で２分間、細胞融合を行わせた
。細胞を遠心洗浄した後、ＲＰ旧１６４０ ＋ Ｉ Ｏ
％ウシ胎児血清培養液で細胞数をＩ Ｘ １０６（ｌＩ
ｉＩ／ｍｌに調整し、ｗｅ１１？イクロプレートにｌ
００ ｐａ／ ｔｖａｌｌで分注した。ＨＡ Ｔ ＋ウ
アバイン選択培地〔ヒボキサンチン１３．６１ｍ（Ｈ／
７！、アミノプテリン０．１８ｍＨ／ Ｉ！ 、チミジ
ン３゜８８ｍｇ／ｎ、ウアバイン０．５Ｘ１０ＣＭ（全
て最終濃度）〕は、Ｉ） Ｅ Ｇ処理後、２４時間後に
加えて２週間培養した。
エローマｈａｔ胞１．５Ｘ１０Ｇ個と上述の継代培養細
胞３Ｘ１０６（囚と７昆和し、５０％ポリエチレングリ
コール（ＰＥ Ｇ １５００． Ｂ Ｄ Ｈ［） ０．
３ ｍｌを加え、３７℃で２分間、細胞融合を行わせた
。細胞を遠心洗浄した後、ＲＰ旧１６４０ ＋ Ｉ Ｏ
％ウシ胎児血清培養液で細胞数をＩ Ｘ １０６（ｌＩ
ｉＩ／ｍｌに調整し、ｗｅ１１？イクロプレートにｌ
００ ｐａ／ ｔｖａｌｌで分注した。ＨＡ Ｔ ＋ウ
アバイン選択培地〔ヒボキサンチン１３．６１ｍ（Ｈ／
７！、アミノプテリン０．１８ｍＨ／ Ｉ！ 、チミジ
ン３゜８８ｍｇ／ｎ、ウアバイン０．５Ｘ１０ＣＭ（全
て最終濃度）〕は、Ｉ） Ｅ Ｇ処理後、２４時間後に
加えて２週間培養した。
その結果、４３ｗＣ目中２０ｉＪｅｌｌに細胞の増殖が
見られたので、これらの培養上清中Ｑ抗破傷風抗体活性
をＥＬＩＳＡ法で測定し、抗体産生の有無を調べた（ス
クリーニング）。抗体産生の鈍かった＋２ｗｅｌｌにつ
いて細胞培養液をＲＰＭＩ １６４０＋１０％ウシ胎児
血清培養液で希釈して８１１ｔ＋’ｌ ／ ｍ ｌに調
整し、ｗｅ１１マイクロプレートにｌ Ｑ Ｏｐ６／ｗ
ｅ１１で分注し、ｗａ１１当たりの細胞数を０．８個と
した（限界希釈培養法）。３７℃、５％ｃｏ２下で培養
し、クローニングを行った。抗体産生をＥ Ｌ Ｉ Ｓ
Ａ法によりチェックして選別し、株化ヒト−ヒ１−ハ
イブリトーマを得た。〔なお、ＩＬＬ Ｉ Ｓ Ａ法で
はパーオキシダーゼ標識抗ヒト１ｇΔｌ−１ｇ（Ｊ ４
−１ ｇＭヤギ抗体（ＫＰＬ社盟）を用いた。〕こうし
て１４７られた株化ヒト−ヒ１−ハイブリト−マは、増
殖性および抗体産生能について両親細胞の性質をよく受
け継いでおり、従来の方法による細胞融合体、形質転換
体に比べｒ（ｆれていることが判明した。
見られたので、これらの培養上清中Ｑ抗破傷風抗体活性
をＥＬＩＳＡ法で測定し、抗体産生の有無を調べた（ス
クリーニング）。抗体産生の鈍かった＋２ｗｅｌｌにつ
いて細胞培養液をＲＰＭＩ １６４０＋１０％ウシ胎児
血清培養液で希釈して８１１ｔ＋’ｌ ／ ｍ ｌに調
整し、ｗｅ１１マイクロプレートにｌ Ｑ Ｏｐ６／ｗ
ｅ１１で分注し、ｗａ１１当たりの細胞数を０．８個と
した（限界希釈培養法）。３７℃、５％ｃｏ２下で培養
し、クローニングを行った。抗体産生をＥ Ｌ Ｉ Ｓ
Ａ法によりチェックして選別し、株化ヒト−ヒ１−ハ
イブリトーマを得た。〔なお、ＩＬＬ Ｉ Ｓ Ａ法で
はパーオキシダーゼ標識抗ヒト１ｇΔｌ−１ｇ（Ｊ ４
−１ ｇＭヤギ抗体（ＫＰＬ社盟）を用いた。〕こうし
て１４７られた株化ヒト−ヒ１−ハイブリト−マは、増
殖性および抗体産生能について両親細胞の性質をよく受
け継いでおり、従来の方法による細胞融合体、形質転換
体に比べｒ（ｆれていることが判明した。
実験例１
実施例１によりＣＩられた２系列のハイブリト−マ（Ｉ
ＯＣ，１０１））において、その染色体数を調べた（第
１表）。なお、表中の値はその染色体をもつ細胞数を示
す。
ＯＣ，１０１））において、その染色体数を調べた（第
１表）。なお、表中の値はその染色体をもつ細胞数を示
す。
第１表に示したようにハイブリトーマはその！ＪＬ細胞
であるＢ細胞、ミエローマ細胞（染色体数Ｊ（に４６）
より数本から３０本多い染色体を自していることが判っ
た。即ち、染色体に変異が起こ−。
であるＢ細胞、ミエローマ細胞（染色体数Ｊ（に４６）
より数本から３０本多い染色体を自していることが判っ
た。即ち、染色体に変異が起こ−。
ていることが確認されたわけで、当該ｉｎ＋胞が親３１
１１胞とは異なるハイブリトーマであることが染色体数
からも示唆された。
１１胞とは異なるハイブリトーマであることが染色体数
からも示唆された。
実験例２
実施例１により得られた株化ヒト−ヒトハイブリドーマ
の性質を調べ、その結果を第２表に示した。「ハイブリ
ドーマ生成率」は、親イ１１１胞ｌＸｌ０”個当たり出
現するハイブリトーマの数で示した。
の性質を調べ、その結果を第２表に示した。「ハイブリ
ドーマ生成率」は、親イ１１１胞ｌＸｌ０”個当たり出
現するハイブリトーマの数で示した。
「クローニング効率」は、増殖性を示す指標として用い
たが、出現ハイブリドーマ中、増殖可能なハイブリドー
マの確率を示した。また、対照として親細胞であるヒト
ミエローマ細胞およびヒト抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞、
ミエローマ細胞とＢ細胞の細胞融合体、Ｂ細胞のＥｐｓ
ｔｅｉｎ Ｂａｒｒウィルスによる形質転換体を用いた
。
たが、出現ハイブリドーマ中、増殖可能なハイブリドー
マの確率を示した。また、対照として親細胞であるヒト
ミエローマ細胞およびヒト抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞、
ミエローマ細胞とＢ細胞の細胞融合体、Ｂ細胞のＥｐｓ
ｔｅｉｎ Ｂａｒｒウィルスによる形質転換体を用いた
。
第２表に示したように本発明の株化しトーヒトハイブリ
ドーマは、発現率も良く、また増殖性も備わった極めて
効率の良い抗破傷風抗体産生細胞となりうろことが判明
した。また、本発明ハイブリドーマは、ヒト由来である
ため抗原性に関する問題もないものである。
ドーマは、発現率も良く、また増殖性も備わった極めて
効率の良い抗破傷風抗体産生細胞となりうろことが判明
した。また、本発明ハイブリドーマは、ヒト由来である
ため抗原性に関する問題もないものである。
手Ｕｔネｉｌｉ正書（自発）
昭和５９年８月２３日
特許庁長官 殿
昭和５９年特許願第６００６１号
２、発明の名称
ヒト−ヒトハイブリトーマ
３、補正をする者
事件との関係 特許出願人
氏名（名称） 株式会社 ミトリ＋字
４、代理人 ■５４１
住 所 大阪ｒｌｉ東区平野町４丁目５３番地３ニュー
ライフ平野町４０６号 電話（０６） ２２７−１１５６ 明細占の１発明の６１４細な説明ｊの欄６．７ｉｎ正の
内容 （１）明細書第２頁、第ｉ７行の「骨髄細胞」を「骨髄
腫細胞」に訂正する。
ライフ平野町４０６号 電話（０６） ２２７−１１５６ 明細占の１発明の６１４細な説明ｊの欄６．７ｉｎ正の
内容 （１）明細書第２頁、第ｉ７行の「骨髄細胞」を「骨髄
腫細胞」に訂正する。
（２）同書第１２頁、第１行のｒｗｃｌｌＪの前に１９
６」を加入する。
６」を加入する。
（３）同書第１２頁、第１４行のｒｗｅｌｌＪの前に１
９６」を加入する。
９６」を加入する。
（４）同書第１３頁、第５行の「ｗｅｌｌ、Ｉの前に「
９６」を加入する。
９６」を加入する。
（５）同書第１３頁、第１８行のｒｗｅｌｌマイクロプ
レー１・」の前に「９６」を加入する。
レー１・」の前に「９６」を加入する。
以上
Claims (1)
- ヒ１用１１来１（Ａ Ｔ感受性ウアバイン耐性ミエロー
マ細胞と、向リンパ性ウィルスによって形質転換された
ヒト由来抗破傷風抗体産生性Ｂ細胞とを融合させてなる
ことを特徴とするヒト−ヒトハイブリドーマ。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59060061A JPS60203186A (ja) | 1984-03-28 | 1984-03-28 | ヒト−ヒトハイブリド−マ |
| DE8585302070T DE3574601D1 (de) | 1984-03-28 | 1985-03-26 | Antitetanus-antikoerper herstellender human-human-hybridoma und verfahren zu seiner herstellung. |
| ES541574A ES8702791A1 (es) | 1984-03-28 | 1985-03-26 | Un metodo para producir una hidrioma de ser humano.ser humano productor de anticuerpos antitetanicos. |
| KR1019850001983A KR850006705A (ko) | 1984-03-28 | 1985-03-26 | 항파상풍항체 생산 인체-인체 하이브리도마의 제조방법 |
| EP85302070A EP0157574B1 (en) | 1984-03-28 | 1985-03-26 | Antitetanic antibody producing human-human hybridoma and method of producing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59060061A JPS60203186A (ja) | 1984-03-28 | 1984-03-28 | ヒト−ヒトハイブリド−マ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60203186A true JPS60203186A (ja) | 1985-10-14 |
Family
ID=13131190
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59060061A Pending JPS60203186A (ja) | 1984-03-28 | 1984-03-28 | ヒト−ヒトハイブリド−マ |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0157574B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60203186A (ja) |
| KR (1) | KR850006705A (ja) |
| DE (1) | DE3574601D1 (ja) |
| ES (1) | ES8702791A1 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62155083A (ja) * | 1985-12-28 | 1987-07-10 | Hagiwara Yoshihide | 新規なヒトｂセル・リンパ芽球細胞変異株、そのヒト／ヒト・ハイブリド−マ及びその生産する抗体 |
| WO1990011350A1 (fr) * | 1989-03-20 | 1990-10-04 | Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. | Anticorps monoclonal humain reagissant avec le pseudomonas aeruginosa, cellule produisant cet anticorps, procede de production et preparation pharmaceutique |
| US5126259A (en) * | 1987-12-24 | 1992-06-30 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Human b. lymphoblastoid cell, hybridoma, antibody and production of antibody |
| JPH0833481A (ja) * | 1995-05-15 | 1996-02-06 | Hagiwara Yoshihide | ヒト／ヒト・ハイブリドーマ及びその生産する抗体 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8426464D0 (en) * | 1984-10-19 | 1984-11-28 | Technology Licence Co Ltd | Monoclonal antibodies |
| US5001065A (en) * | 1987-05-27 | 1991-03-19 | Cetus Corporation | Human cell line and triomas, antibodies, and transformants derived therefrom |
| JPH0249597A (ja) * | 1988-04-27 | 1990-02-19 | Kimiyoshi Tsuji | モノクローナル抗体及びその利用方法 |
| ES2119785T3 (es) * | 1992-03-23 | 1998-10-16 | Schweiz Serum & Impfinst | Anticuerpos monoclonales contra la toxina tetanica y composiciones farmaceuticas que los contienen. |
-
1984
- 1984-03-28 JP JP59060061A patent/JPS60203186A/ja active Pending
-
1985
- 1985-03-26 EP EP85302070A patent/EP0157574B1/en not_active Expired
- 1985-03-26 KR KR1019850001983A patent/KR850006705A/ko not_active Application Discontinuation
- 1985-03-26 DE DE8585302070T patent/DE3574601D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-26 ES ES541574A patent/ES8702791A1/es not_active Expired
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62155083A (ja) * | 1985-12-28 | 1987-07-10 | Hagiwara Yoshihide | 新規なヒトｂセル・リンパ芽球細胞変異株、そのヒト／ヒト・ハイブリド−マ及びその生産する抗体 |
| US5126259A (en) * | 1987-12-24 | 1992-06-30 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Human b. lymphoblastoid cell, hybridoma, antibody and production of antibody |
| WO1990011350A1 (fr) * | 1989-03-20 | 1990-10-04 | Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. | Anticorps monoclonal humain reagissant avec le pseudomonas aeruginosa, cellule produisant cet anticorps, procede de production et preparation pharmaceutique |
| JPH0833481A (ja) * | 1995-05-15 | 1996-02-06 | Hagiwara Yoshihide | ヒト／ヒト・ハイブリドーマ及びその生産する抗体 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0157574B1 (en) | 1989-12-06 |
| ES541574A0 (es) | 1987-01-16 |
| KR850006705A (ko) | 1985-10-16 |
| EP0157574A2 (en) | 1985-10-09 |
| EP0157574A3 (en) | 1986-06-18 |
| ES8702791A1 (es) | 1987-01-16 |
| DE3574601D1 (de) | 1990-01-11 |
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