JPH052318B2 - - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
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Description
本発明は細胞ランイン（Cell lines）および抗
体生産におけるその利用に関する。 特定の親細胞ラインから細胞融合技術によつて
誘導される細胞ラインから抗体を生産することが
最近注目されるようになつた。この方法はいくつ
かのマウス骨髄腫細胞ラインのうちの１種を親細
胞ラインとして使用しており、該親細胞ラインは
免疫化されたマウスまたはラツトからの細胞と融
合して雑種骨髄腫（hybrid myeloma）を与え、
該骨髄腫は増殖して免疫化に用いた免疫原
（immunogen）に対する抗体を生産する。この方
法の特有の利点は、非精製免疫原を用いて高度に
特異的な抗体を生産するのに使用できることであ
る。この方法は免疫学において重要な新しい手段
を提供するものであつたが、人手し得る親細胞ラ
インの性質から生ずる一定の制限を現在まで受け
てきている。 本発明の目的は、単クローン性（monoclonal）
抗体を調製するために現在人手し得るマウス骨髄
腫細胞ラインよりも一定の利点を有する新規な細
胞ラインを提供することである。 即ち本発明は、コレクイスオーン・ナスイオナ
ール・ドウ・クルトウール・ドウ・ミクロオーガ
ニスム〔Collection Nationale de Cultures de
microorganismes（C.N.C.M）〕に１−078番で寄
託された細胞の特質を有するラツト骨髄腫細胞ラ
インに関する。 本発明の細胞ラインはマウス骨髄腫細胞ライン
に比べていくつかの利点を有する。抗体を生産す
るための雑種細胞ラインの生体内培養は、生体外
組織培養法に比べて一定の利点を有しており、例
えば培地に比べて動物血清中で得られる１mlあた
りの抗体が非常に高準位であるということも利点
に含まれる。生体内培養にラツトを使用すること
はマウスを使用することよりもいくつかの点で好
ましい。例えば血清や腹水流体（ascitic fluid）
の収量は多く、同産群（litters）も一般に多く、
またラツトはマウスに比べて抗原刺激に対してよ
り良く応答する。さらにラツトは単クローン性の
異種抗マウス抗体および同種抗ラツト抗体の生産
に必要であるが、本発明者らは免疫化されたラツ
トからの細胞とマウス骨髄腫親細胞ラインとを組
合せて生産される雑種細胞がマウスとラツトのど
ちらにおいても容易には培養されないことを見い
出した。さらにまた、本発明による細胞ラインは
一定の異種融合、例えばラビツトまたはヒトの細
胞の異種融合にも利点を有する。 ラツト骨髄腫細胞ラインは文献に記載されてい
るが、本発明者らは単クローン性抗体の生産にお
いて該細胞ラインを親細胞ラインとして使用する
ことが全く不適当であることを見い出した。ま
た、本発明による細胞ラインを生産するためには
該細胞ラインを淘汰および／または突然変異の広
範囲な過程に付す必要があつた。本発明による細
胞ライン調製の出発点はラツト骨髄腫腫瘍S210
の８−アザグアニン耐性変異株210.RCY3.Aglで
あつた〔コトン（Cotton）およびミルスタイン
（Milstein）、ネイチヤー（Nature）、1973年、第
244巻、第42頁〕。この変異株について最初に正常
または免疫化したラツトの脾臓と融合する能力が
あるかどうか試験したところ期待はずれの結果と
なつた。それにもかかわらず、この細胞を軟性寒
天培地内で２回二次クローン化させ
（subcloned）、その後の研究のためにクローンY3
−Ag1.2.3を最終的に選択して107個の細胞バツチ
を試験したところリバータント（revertants）を
与えなかつた。このクローンの融合効率は最初は
なお満足すべきものではなかつたのでスピナーフ
ラスコ内で連続的に増殖させ、経時的な融合効率
を試験した。低い細胞密度および高い細胞密度の
両段階を含めて、本発明による良好な融合特性を
示す細胞ラインを得たのは５ケ月後であつた。
Y3−Ag1.2.3として特定されることの細胞ライン
の保存ストツクはMRCの分子生物学研究所に保
管されている。さらにこの細胞ラインは1979年１
月９日にパリにあるハスツウール研究所のC.N.
C.M.に寄託されており、該寄託物はC.N.C.M1−
078番で特定されている。本発明による細胞ライ
ン親ライン210.RCY3.Aglと同様な一般的形態を
有しており、親ラインよりも一般により良い増殖
特性で群がつて増殖する傾向のある非球状細胞を
含んでいる。さらに、親ラインのように８−アザ
グアニンに耐性があり、S210で命名されるカツ
パコード型の独特な軽鎖を生産して分泌し、ヒポ
キサンチン／アミノプテリン／チミジン
（HAT）培地内では死滅する。この細胞ライン
はもちろん別の特性を有していて、細胞104〜106
個あたり一般に１の範囲にある良好な効率でラツ
トの脾臓細胞と連続的に融合する。ラツトの細胞
ライン１−078番の細胞は外観上はマウスのP3−
X63−Ag8骨髄腫細胞に比べてより小さく、その
増殖の初期段階は顕微鏡下ではそれほど明瞭では
ない。（このことは１−078番細胞から誘導される
雑種細胞のある腫のものに対しては真実である
が、すべてに対してそうであるわけではない。）
軟性寒天培地内でのラツト細胞ラインのクローン
化能（clonability）は良好で、該ラインとそのラ
ツト−ラツト雑種は、マウスラインとそのマウス
−マウス雑種がきつちりした（tight）クローン
を与えるのに比べて一般にどちらかと言えば瀰漫
性クローン（diffuse clones）を与える。 １−078番細胞は液体窒素中に保存してもよく、
また種々の形態の栄養培地内で増殖させてもよ
い。従つて本発明は、C.N.C.M.に１−078番とし
て栄養培地内に入れて寄託されている細胞の特性
を有するラツト骨髄腫細胞ラインを含む細胞培養
系にも及ぶものである。このような細胞培養系は
生体外のものが便利であり、その培地は本質的に
は合成培地であるが、血清のような天然源から得
られる成分を含んでいてもよい。このような培地
としては、イーグルの最低必須培地（Eagle′s
minimum essential medium）〔例えば、ギブ
コ・ピオカルト・リミテツド（Gibco Biocult
Ltd.）（ペイズリ、スコツトランド）から人手で
きる〕を10％またはそれ以下の胎児段階の子牛
（foetal calf）血清または熱で不活性化したウマ
血清のような血清補液（serum supplement）ま
たは血清を含まないイスコブ（Ｉ scove）改質
培地を用して改質したドルベツコ（Dulbecco）
改質培地が例示される。このような培地で増殖さ
れた細胞は別の培地、例えば胎児段階の子牛血清
を含んだRPMI1640や当該分野の文献に記載され
ている細胞培養に一般に使用されている種々の培
地内で短期間の適応で増殖することができる。 本発明による細胞ラインは単クローン性抗体の
調製に使用することができる雑種細胞ラインの生
産に特に有用である。親細胞ラインからの雑種細
胞ラインの生産法には脾臓または免疫原に感作さ
れた他の免疫細胞を細胞ラインの細胞と融合させ
ることが含まれる。感作された免疫細胞は種々の
ソース（sources）から取り出してもよいが、ラ
ツト細胞を用いるマウス等の他のホスト（host）
からの細胞を用いるよりも良い結果が得られる。
免疫細胞の感作は常態、即ち自然におこる免疫化
によつておこなわせてもよいが、直接免疫化
（direct immunisation）によつておこなうのが
好ましく、必要な免疫原をホスト動物へ投与す
る。融合の後、クローニングまたは二次クローニ
ング（sub−cloning）をおこなつて１種またはそ
れ以上の適当な雑種を選択するのが便利である。 適当な免疫細胞と細胞ラインの細胞とを融合す
るには一般に融合促進剤を含有する適当な培地内
で混合することが必要である。従つて本発明は、
C.N.C.M.に１−078番で寄託されている細胞の特
性を有する細胞を免疫細胞、例えばマウスまたは
特にラツトの脾臓細胞等を該細胞の融合促進剤と
共に栄養培地内で融合する系も含む。このような
培地は合成培地であるのが便利であるが、所望に
よつて天然ソースから得られる成分を含ませても
よい。しかしながらこのような可能性はこの場合
それほど見込みがなく、培地には血清が存在しな
いのが好ましい。このような培地としてはイーグ
ルの最小必須培地、該培地のドルベツコ改質培
地、RPMI1640、当該分野の文献に記載されてい
る細胞培養に通常使用される種々の他の培地が例
示される。種々の融合剤、例えばセンダイウイル
ス（Sendai virus）のようなウイルスを用いても
よいが、ポリエチレングリコール、例えば
PEG1500等が好ましい。これらの融合剤を用い
る細胞融合は文献に記載されていて、その実施例
に述べられているがその手引として次のことが指
摘されている。即ち約40〜約55％のポリエチレン
グリコールをしばしば使用し、その最適濃度は分
子量に依存し、例えばPEG1500の場合は約50％
であり、また所望によりジメチルスルホキシドを
ポリエチレングリコールに添加してもよい。雑種
細胞ラインの分離は、親細胞ラインに対しては毒
性はあるが雑種ラインに対しては一般に毒性のな
いHAT培地で元の培地をおきかえて補助するの
が便利である。 雑種細胞ラインおよび親細胞ラインを一定の条
件下で増殖させることによつて、これらの細胞に
類似した有用な特性を有する細胞ラインを誘導す
ることができ、本発明はこのような誘導ラインを
生産するための１−078番細胞ラインの利用法お
よび特に誘導親細胞ラインおよびそれから誘導さ
れる雑種にも及ぶものである。本発明によるラツ
ト骨髄腫細胞ライン１−078番およびこれから誘
導される雑種の大部分はカツパ鎖S210を含んで
いるが、雑種によつて生産される抗体にとつては
元の骨髄腫のイムノグロブリン鎖を含まないのが
有利である。特に重要な細胞群は、もはやS210
カツパ鎖で表わすことはできないが抗体分泌能を
保持する誘導親細胞ラインによつて提供され、こ
れらは長期培養またはより直接的な処理によつて
変種として生産される。 上述のように、所望の免疫原に感作された免疫
細胞は別の方法によつても人手できる。これらは
自然に発生する所望の型の免疫細胞を分離するこ
とによつて得てもよいし、当該分野の文献に記載
されている手順、即ち免疫原を適当ならばフロイ
ンド補薬のような補薬と共に連続的に動物に投与
した後脾臓または他の免疫細胞を採取することに
よつて人手してもよい。ヒトの免疫細胞を使用す
る場合には自然に発生する免疫細胞の利用が特に
重要であり、この場合免疫原の投与はそれほど注
目すべきものではなく、患者からの感染によつて
自然に生産される免疫細胞がより適当である。自
然な免疫細胞に関して特に重要な領域は自己抗体
（auto antibodies）の生産である。 本発明は、蛋白質、糖蛋白質、少糖類、多糖
類、リポ糖類、ハプテン等のような抗原、例えば
ペプチド、ニユーロ・トランスミツター（neuro
−transmitters）およびホルモン等を含む広範囲
な免疫原に対して感作された直接または自然に免
疫化された動物から免疫細胞に適用できる。表面
マーカー（surface merkers）でありかつ腫瘍物
（neo−plastic material）、特に固体状腫瘍から
誘導される免疫原はかなり重要であるが、本発明
は細菌性抗原やウイルス性抗原および原虫類や菌
類から誘導される免疫原に適用してもよい。 さらに本発明は、C.N.C.M.に１−078番で寄託
されている細胞の特性を有するラツト骨髄腫細胞
ラインと、免疫原に感作された例えばマウスまた
は特にラツトからの脾臓または他の免疫細胞との
雑種細胞を含む。 この雑種細胞は上述のように親細胞と同様の一
般的な型の培地内で増殖させてもよい。 単クローン性抗体の生産に対しては、この雑種
細胞をラツトに接種して固体状腫瘍または腹水腫
瘍を生産させる。適当な増殖期間後、動物を殺し
て抗体を分離するために当該分野の常套法によつ
て腹水および／または血清を採取する。このよう
な手順には免疫吸着剤や膜フイルターの使用を含
む沈殿、透析、クロマトグラフイーが含まれる。 従つて本発明は、上述のようにして雑種細胞を
ラツトに接種して固体状腫瘍または腹水腫瘍をラ
ツトの体内で増殖させた後、ラツトの血清または
腹水流体から抗体を分離させることを特徴とする
単クローン性抗体の生産法を含む。 このような体内での抗体生産は上述のように体
外生産に比べていくつかの特別な利点を有する
が、抗体に対しては化学的な性質よりも免疫学的
性質のいくつかの利用法があり、この場合は生体
内生産に起因する不純物の濃度よりも性質のため
に体外生産が好ましい。他の場合でも、この細胞
は生体内では増殖しないので生体外生産が必要と
なる。適当な組織培養手順例にはスピナー・コン
テナー（spinner containers）内の塊状増殖
（massiue growth）や当該分野で周知の集団培
養（massculture）法が含まれる。さらに、組織
培養は動物を使用する方法に比べ技術的に非常に
簡易化されるという利点が認められるが、この利
点は一般に収量が低いために実施規模を大きくす
る必要があるという点で相殺される。体内法によ
つて生産される抗体の場合に上述した方法と類似
の精製手順を一般に使用してもよい。 本発明は上述した雑種細胞を用いて調製した抗
体にも及ぶものである。この種の抗体は治療や特
に診断、および親和性クロマトグラフイーのよう
な手順において広範囲に適用できる。後述する
Fdフラグメントに注がれた抗マウスIgG単クロー
ン性抗体は単クローン性抗体生産雑種の一例であ
り、該雑種は間接結合アツセイ（indirect
binding assays）や他の中間手順において第２抗
体として適当な試剤を提供する。生産される他の
単クローン性抗体にはヒト由来（human origin）
の種々の腫瘍細胞に対する抗体が含まれ、該腫瘍
細胞にはヒトの細胞の亜集団が認められ、血液字
的診断に有効に利用されうる。他の利用法として
は蛋白質のような自然に生じる物質を精製するた
めの抗体の利用が例示される。 本発明による細胞ラインは抗体生産活性の回復
率が高いために特に価値があることが証明され
た。従つて一つの実験においては、細胞ラインと
免疫化されたラツトの脾臓細胞との融合によつて
得られた雑種について、元の骨髄腫とは異なつた
Igを分泌するその能力を分析した。この分析は分
泌物質のSDS−PAGE分析によつておこなつた。
12種の被試験培養物（すべて単クローン性とみら
れる）のうち11種がIg鎖を分泌し、わずかに１種
だけが元の骨髄腫とは異なつた鎖を分泌しなかつ
たので、試験した培養の90％以上が新しいイムノ
グロブリンを分泌したことになる。さらに、少な
くとも80％が本発明による細胞ラインを含んでい
た。この値はケーラー（Kohler）とミルスタイ
ン（Milsltein）の報文〔ヨーロピアン・ジヤー
ナル・オブ・イムノロジー（European Journal
of Immunology）、1976年、第６巻、第511頁〕
に記載されているマウス系に対して得られた値よ
りも高い。該報文の値はめつたに50％を越えるこ
とはなく、全体的には一般に40〜60％である。 本発明を以下の実施例によつて説明する。 実施例 実施例で使用したDMM−10％FCSは以下の成
分を混合して調製した。 ドルベツコMEM500ml〔グルコース4500mg／
、焦性ブドウ酸ナトリウム含有せず。ギブコー
ビオカルト（Gibco−Biocult）カタログNo.320−
1965〕 焦性ブドウ酸ナトリウムMEM100ｍM5ml（ギ
ブコービオカルトカタログNo.320−1360） ペニシリン／ストレプトマイシン10ml（5000ユ
ニツトペニシリン／5000mcgストレプトマイシ
ン／ml。ギブコービオカルトカタログNo.600−
5070） 子牛の胎児血清50ml〔異なつたバツチから分離
された血清。セラ−ラブ（Sera−Lab）カタログ
No.５−000−1a〕 DMM−HSおよび培地Ｄはそれぞれ子牛の胎
児血清のかわりにウマ血清を用いるか、これを省
略する以外は同様にして調製した。 実施例 １ ラツト骨髄腫細胞ラインの１−078の調製 新しいガラス瓶に入つた凍結細胞210、RCY3
−Ag.1をイーグルの最低必須培地−熱で失活さ
せた10％ウマ血清（HS）で補充したドルベツコ
改質、倍地（DMM）を含有するプラスチツク瓶
内でCO210％−空気90％の雰囲気下37℃のもとで
増殖した。３週間増殖後、対数増殖期の細胞500
個をHS10％および寒天0.25％含有するDMM2ml
中に37℃で懸濁し、この懸濁液をHS10％および
寒天0.5％を含有するDMM15ml（直径９cmの組
織培養ペトリ皿上に凝固させたもの）上に注ぎか
ける。CO2を７％含有し水蒸気で飽和した空気雰
囲気下37℃で２週間細胞を培養した。最も早く増
殖した20のクローンを選び取つて培養皿に移し、
８−アザグアニンに対する耐性およびS210軽鎖
の生産分泌能について試験した。これに基づき、
１つのクローン（Y3−Ag.1.2）を選び、上記の
手順を繰り返し二次クローン（Y3−Ag.1.2.3）を
分離した。 この二次クローンを培養フラスコ内において
DMM（HS10％で補充）上37℃で増殖させ、よく
増殖させた後（１週間）、同一の培地を含有し
CO210％−空気90％の雰囲気の１スピナーフラ
スコ内に移す。スピナーフラスコ内で３ケ月間連
続増殖させた後、培養物（culture）10mlを培養
瓶に入れ、10％FCS（子牛の胎児血清）で補充し
たDMMを用いて培地を２週間かけてゆつくりと
取替える。培養物をスピナーフラスコに移し、細
胞密度が非常に低い段階（約104細胞／ml）から
高い段階（約１×106〜２×106細胞／ml）に至る
種々の増殖期を含めさらに２ケ月間連続的に細胞
を増殖させる。細胞の融合効率をこの過程の種々
の段階で試験した。肉眼で識別できる改良は増殖
の最後の月に認められた。 37℃のフラスコ内での５ケ月間の増殖段階にお
いて、各々２×106〜５×106個の細胞を含有する
いくつかの試料を取り出し、10％ジメチルスルホ
キシド（DMSO）および90％FCSの存在下にお
いて温度勾配約1゜／２分間で凍結させた。これら
の細胞はC.N.C.M.に１−078番で寄託された。 最良の融合は少なくとも２週間対数的に増殖さ
せた培養物を用いておこなわれた。使用するに
は、原試料の細胞または新たに凍結保存した試料
の細胞を急激に溶解させてから10％FCSを含有す
るDMMを用いて10mlまで希釈し、遠心分離機に
かけ、次いで10％FCSを含有するDMM10ml中に
再懸濁させた後、上記基準に従つて上述のように
して培養フラスコ内で増殖させる。６ケ月間増殖
させた培養物は融合効率の低下を示さず、その改
良さえ示すが、誘導のない細胞ラインを保存する
ためには連続増殖よりも液体窒素下で貯蔵する。 実施例 ２ 細胞ライン１−078番と、マウスIgGで超免疫
化したラツトの脾臓細胞との雑種の生産 DA種族のラツトに３週間間隔で完全フロイン
ド補助液中のマウスIgG100μｇを５本のフツトパ
ツド（footpad）注射をうつて免疫化し、補助液
を含まない塩水中の同量のIgGを融合の４日前に
静脈注射して追加免疫化をおこなつた。このラツ
トの脾臓細胞をはじめに子牛の胎児血清（FCS）
２％含有するドルベツコ燐酸塩緩衝塩水（PBS）
中で融合用に調製した。次いでこの細胞を血清補
充液を含まないドルベツコ改質培地（培地Ｄ）で
洗浄し、108個の脾臓細胞を培地Ｄに懸濁した細
胞ライン１−078番の細胞５×107個と混合する。
混合物を50mlプラスチツク製円錐形管中600ｇで
７分間遠心分離機にかけて、次いで上澄みを除去
し、細胞ペレツトを管底部を静かにたたいて粉砕
した。その後の操作は約37℃でおこなつた。50％
ポリエチレングリコール（PEG）1500（調製した
ばかりの試料または暗所に保存した試料）の培地
Ｄ溶液（フエノールレツドによるPHは7.6−7.8）
0.8ml含有する１mlピペツトを用い１分間かけて
該溶液を細胞に静かに添加して細胞を懸濁させ
た。この懸濁液を37℃で１分間保つた後、培地Ｄ
を１分間かけて添加した。さらに培地D20mlを５
分間かけて添加した後、細胞を遠心分離機にか
け、FCS20％含有するドルベツコ改質培地
（DMM）中に静かに再懸濁した。この懸濁液を
リンブロ（Linbro）BCL−5041トレーのくぼみ
（２ml）48個に分配した。24時間後、培地の半分
をHAT含有培地〔リトルフイールド
（Littlefield）、サイエンス（Science）、1964年、
第145巻、709頁〕で取替えた。この操作を次の２
日間およびその後は２日おきに繰り返した。 13〜15日後くぼみ内に急激な増殖がみられ、好
結果の雑種クローンを示した。二次培養のわずか
に６試料が雑種増殖を示した。各雑種培養に使用
した培地は次の手順により、羊の赤血球
（SRBC）に特異性の異なつたマウスの単クロー
ン性抗体で感作されたSRBCの間接的血球凝集反
応によつて試験した。即ち、SRBC2.5×108個を
凝集をふせぐために抗SRBC雑種骨髄腫（ケーラ
ーおよびミルスタイン、ヨーロピアン・ジヤーナ
ル・オブ・イムノロジー、1976年、第６巻、511
頁）の培養上澄み液５mlで希釈し室温で培養して
被覆した。被覆SRBCを遠心分離機にかけて沈降
させ、ペレツトをPBS2.5ml中に再懸濁した。部
分標本25μをＶ形底のマイクロ滴定トレー中に
分配し、雑種培養物の上澄み液を各くぼみに滴下
した。１時間培養後、プレートを200ｇで４分間
遠心分離機にかけ、次いで45゜傾斜させ30〜60分
間保持した。この方法において１種の培養物
（YA2／40）を取り出した。該培養物はSRBCを
Sp3（IgG1）で被覆したときは明らかに陽性であ
り、Sp2（IgG2b）またはSp1（IgM）で被覆した
ときは陰性であつた。この陽性雑種は軟性寒天培
地ではクローン化した。８つの別々のクローンを
選び取つた。これらのクローンはすべてSp3で被
覆したSRBCを用いる試験では陽性であつた。８
つのクローンの各々に対して、そのクローンから
分泌された抗体を、14C−リジンで細胞を24時間培
養することによつて内部標識した。次いで上澄み
液をケーラーおよびミルスタインの報文（前記文
献）に記載のように、全還元後のソジウムドデシ
ルスルフエートポリアクリルアミド（10％）ゲル
電気泳動法（SDS−PAGE）および等電的集束法
（IEF）を用いて分析した。すべてのクローンは
同一とみられ、分子量約50000の重鎖を示し、単
結合が軽鎖帯に存在する（親細胞ラインは重鎖帯
を欠いている）。予期した２種の軽鎖（骨髄腫親
軽鎖および抗体特異性軽鎖）は証明できなかつた
が、これはこれらの軽鎖が類似の可動性を保持す
るためと考えられる。８つのクローンのうちの３
つは再びクローン化し、純度を確実にしかつ安定
性を高めた。二次クローンのうちの１つ
〔YA2／40H（LK）〕を選び以下に述べるように
その特性についての特別な試験に供した。 雑種細胞ランインYA2／40H（LK）の特性
〔3H−Lys〕で内部標識化した抗体YA2／40を、
異なつたクラスの抗SRBC抗体で被覆した細胞と
結合させると、雑種には３種のIgM骨髄腫ではな
く、数種のマウスIgGが認められた。Spl（IgM）
で被覆した細胞と係合させると、未被覆細胞と結
合したバツクグランドと同じ値が得られたが、
Sp3（IgG1）およびSp2（IgG2）で被覆した細胞と
結合させるとそれぞれバツクグラウンドの4.9倍
および35倍の値が得られた。この差はSp2および
Sp3によつて認められる抗原サイトの数と関連づ
けられる（Sp1によつて認められる抗原サイトの
数はSp2とSp3の中間の値である）。 Sp2で被覆することは〔3H〕YA2／40H（LK）
の結合アツセイに対しては敏感な手順である。こ
の結合を抑制することによつて特異性試験をおこ
なつた。これらの試験から、雑種にはIgGのサブ
クラスγ1およびγ2からの蛋白質が認められるこ
とが確認された。IgMによる抑制は少なくとも50
倍は効果は劣るが、蛋白質濃度が高いとある程度
の抑制がみられた。これは調製試料中のIgG不純
物によると考えられる。MOPC21、その変種IF1
（CH3領域を欠く）およびIF2（CH1領域を欠く）、
およびMOPC21（CH2およびCH3領域を欠く）の
Ｆ（ab′）2フラグメントを用いた抑制試験から、
IgC1の抗原決定因子（antigenic determinant）
はCH1領域にあることが確認された。 種特異性試験においては、単クローン性抗体
YA2／40はヒト、ウマまたはラツトの血清に対
して完全に陰性であるが、ラビツトの血清に対し
てはある程度の交差反応を示した。他方、該抗体
はモルモツトの血清とは全く効果的に交差結合し
た。IgGの異なつた種間の交差反応のこのパター
ンは、モルモツトおよび異なつたマウスのサブク
ラス（ヒト、ウマおよびラツトとは完全に異な
る）における局部構造の類似性が抗原決定因子に
含まれることを示す。 実施例 ３ 細胞ライン１−078番と、AOラツトの細胞で
免疫化されたDAラツトからの脾臓細胞との雑
種の生産 実施例２においてマウスIgGによる免疫化につ
いて述べた手順と同様の手順により、DA種のラ
ツトをAOラツトの細胞で免疫化した。このラツ
トの脾臓細胞を実施例２において述べた手順と同
様の手順を用いて細胞ライン１−078番と融合さ
せた。培養物を96個のセルに分配し、選択培養内
で４週間増殖させる。種々の培養物の雑種を、
SDS−PAGE分析法を用い親の骨髄腫と異なるIg
を分泌する能力によつて分析した。得られた結果
を以下の表−１に示す。
体生産におけるその利用に関する。 特定の親細胞ラインから細胞融合技術によつて
誘導される細胞ラインから抗体を生産することが
最近注目されるようになつた。この方法はいくつ
かのマウス骨髄腫細胞ラインのうちの１種を親細
胞ラインとして使用しており、該親細胞ラインは
免疫化されたマウスまたはラツトからの細胞と融
合して雑種骨髄腫（hybrid myeloma）を与え、
該骨髄腫は増殖して免疫化に用いた免疫原
（immunogen）に対する抗体を生産する。この方
法の特有の利点は、非精製免疫原を用いて高度に
特異的な抗体を生産するのに使用できることであ
る。この方法は免疫学において重要な新しい手段
を提供するものであつたが、人手し得る親細胞ラ
インの性質から生ずる一定の制限を現在まで受け
てきている。 本発明の目的は、単クローン性（monoclonal）
抗体を調製するために現在人手し得るマウス骨髄
腫細胞ラインよりも一定の利点を有する新規な細
胞ラインを提供することである。 即ち本発明は、コレクイスオーン・ナスイオナ
ール・ドウ・クルトウール・ドウ・ミクロオーガ
ニスム〔Collection Nationale de Cultures de
microorganismes（C.N.C.M）〕に１−078番で寄
託された細胞の特質を有するラツト骨髄腫細胞ラ
インに関する。 本発明の細胞ラインはマウス骨髄腫細胞ライン
に比べていくつかの利点を有する。抗体を生産す
るための雑種細胞ラインの生体内培養は、生体外
組織培養法に比べて一定の利点を有しており、例
えば培地に比べて動物血清中で得られる１mlあた
りの抗体が非常に高準位であるということも利点
に含まれる。生体内培養にラツトを使用すること
はマウスを使用することよりもいくつかの点で好
ましい。例えば血清や腹水流体（ascitic fluid）
の収量は多く、同産群（litters）も一般に多く、
またラツトはマウスに比べて抗原刺激に対してよ
り良く応答する。さらにラツトは単クローン性の
異種抗マウス抗体および同種抗ラツト抗体の生産
に必要であるが、本発明者らは免疫化されたラツ
トからの細胞とマウス骨髄腫親細胞ラインとを組
合せて生産される雑種細胞がマウスとラツトのど
ちらにおいても容易には培養されないことを見い
出した。さらにまた、本発明による細胞ラインは
一定の異種融合、例えばラビツトまたはヒトの細
胞の異種融合にも利点を有する。 ラツト骨髄腫細胞ラインは文献に記載されてい
るが、本発明者らは単クローン性抗体の生産にお
いて該細胞ラインを親細胞ラインとして使用する
ことが全く不適当であることを見い出した。ま
た、本発明による細胞ラインを生産するためには
該細胞ラインを淘汰および／または突然変異の広
範囲な過程に付す必要があつた。本発明による細
胞ライン調製の出発点はラツト骨髄腫腫瘍S210
の８−アザグアニン耐性変異株210.RCY3.Aglで
あつた〔コトン（Cotton）およびミルスタイン
（Milstein）、ネイチヤー（Nature）、1973年、第
244巻、第42頁〕。この変異株について最初に正常
または免疫化したラツトの脾臓と融合する能力が
あるかどうか試験したところ期待はずれの結果と
なつた。それにもかかわらず、この細胞を軟性寒
天培地内で２回二次クローン化させ
（subcloned）、その後の研究のためにクローンY3
−Ag1.2.3を最終的に選択して107個の細胞バツチ
を試験したところリバータント（revertants）を
与えなかつた。このクローンの融合効率は最初は
なお満足すべきものではなかつたのでスピナーフ
ラスコ内で連続的に増殖させ、経時的な融合効率
を試験した。低い細胞密度および高い細胞密度の
両段階を含めて、本発明による良好な融合特性を
示す細胞ラインを得たのは５ケ月後であつた。
Y3−Ag1.2.3として特定されることの細胞ライン
の保存ストツクはMRCの分子生物学研究所に保
管されている。さらにこの細胞ラインは1979年１
月９日にパリにあるハスツウール研究所のC.N.
C.M.に寄託されており、該寄託物はC.N.C.M1−
078番で特定されている。本発明による細胞ライ
ン親ライン210.RCY3.Aglと同様な一般的形態を
有しており、親ラインよりも一般により良い増殖
特性で群がつて増殖する傾向のある非球状細胞を
含んでいる。さらに、親ラインのように８−アザ
グアニンに耐性があり、S210で命名されるカツ
パコード型の独特な軽鎖を生産して分泌し、ヒポ
キサンチン／アミノプテリン／チミジン
（HAT）培地内では死滅する。この細胞ライン
はもちろん別の特性を有していて、細胞104〜106
個あたり一般に１の範囲にある良好な効率でラツ
トの脾臓細胞と連続的に融合する。ラツトの細胞
ライン１−078番の細胞は外観上はマウスのP3−
X63−Ag8骨髄腫細胞に比べてより小さく、その
増殖の初期段階は顕微鏡下ではそれほど明瞭では
ない。（このことは１−078番細胞から誘導される
雑種細胞のある腫のものに対しては真実である
が、すべてに対してそうであるわけではない。）
軟性寒天培地内でのラツト細胞ラインのクローン
化能（clonability）は良好で、該ラインとそのラ
ツト−ラツト雑種は、マウスラインとそのマウス
−マウス雑種がきつちりした（tight）クローン
を与えるのに比べて一般にどちらかと言えば瀰漫
性クローン（diffuse clones）を与える。 １−078番細胞は液体窒素中に保存してもよく、
また種々の形態の栄養培地内で増殖させてもよ
い。従つて本発明は、C.N.C.M.に１−078番とし
て栄養培地内に入れて寄託されている細胞の特性
を有するラツト骨髄腫細胞ラインを含む細胞培養
系にも及ぶものである。このような細胞培養系は
生体外のものが便利であり、その培地は本質的に
は合成培地であるが、血清のような天然源から得
られる成分を含んでいてもよい。このような培地
としては、イーグルの最低必須培地（Eagle′s
minimum essential medium）〔例えば、ギブ
コ・ピオカルト・リミテツド（Gibco Biocult
Ltd.）（ペイズリ、スコツトランド）から人手で
きる〕を10％またはそれ以下の胎児段階の子牛
（foetal calf）血清または熱で不活性化したウマ
血清のような血清補液（serum supplement）ま
たは血清を含まないイスコブ（Ｉ scove）改質
培地を用して改質したドルベツコ（Dulbecco）
改質培地が例示される。このような培地で増殖さ
れた細胞は別の培地、例えば胎児段階の子牛血清
を含んだRPMI1640や当該分野の文献に記載され
ている細胞培養に一般に使用されている種々の培
地内で短期間の適応で増殖することができる。 本発明による細胞ラインは単クローン性抗体の
調製に使用することができる雑種細胞ラインの生
産に特に有用である。親細胞ラインからの雑種細
胞ラインの生産法には脾臓または免疫原に感作さ
れた他の免疫細胞を細胞ラインの細胞と融合させ
ることが含まれる。感作された免疫細胞は種々の
ソース（sources）から取り出してもよいが、ラ
ツト細胞を用いるマウス等の他のホスト（host）
からの細胞を用いるよりも良い結果が得られる。
免疫細胞の感作は常態、即ち自然におこる免疫化
によつておこなわせてもよいが、直接免疫化
（direct immunisation）によつておこなうのが
好ましく、必要な免疫原をホスト動物へ投与す
る。融合の後、クローニングまたは二次クローニ
ング（sub−cloning）をおこなつて１種またはそ
れ以上の適当な雑種を選択するのが便利である。 適当な免疫細胞と細胞ラインの細胞とを融合す
るには一般に融合促進剤を含有する適当な培地内
で混合することが必要である。従つて本発明は、
C.N.C.M.に１−078番で寄託されている細胞の特
性を有する細胞を免疫細胞、例えばマウスまたは
特にラツトの脾臓細胞等を該細胞の融合促進剤と
共に栄養培地内で融合する系も含む。このような
培地は合成培地であるのが便利であるが、所望に
よつて天然ソースから得られる成分を含ませても
よい。しかしながらこのような可能性はこの場合
それほど見込みがなく、培地には血清が存在しな
いのが好ましい。このような培地としてはイーグ
ルの最小必須培地、該培地のドルベツコ改質培
地、RPMI1640、当該分野の文献に記載されてい
る細胞培養に通常使用される種々の他の培地が例
示される。種々の融合剤、例えばセンダイウイル
ス（Sendai virus）のようなウイルスを用いても
よいが、ポリエチレングリコール、例えば
PEG1500等が好ましい。これらの融合剤を用い
る細胞融合は文献に記載されていて、その実施例
に述べられているがその手引として次のことが指
摘されている。即ち約40〜約55％のポリエチレン
グリコールをしばしば使用し、その最適濃度は分
子量に依存し、例えばPEG1500の場合は約50％
であり、また所望によりジメチルスルホキシドを
ポリエチレングリコールに添加してもよい。雑種
細胞ラインの分離は、親細胞ラインに対しては毒
性はあるが雑種ラインに対しては一般に毒性のな
いHAT培地で元の培地をおきかえて補助するの
が便利である。 雑種細胞ラインおよび親細胞ラインを一定の条
件下で増殖させることによつて、これらの細胞に
類似した有用な特性を有する細胞ラインを誘導す
ることができ、本発明はこのような誘導ラインを
生産するための１−078番細胞ラインの利用法お
よび特に誘導親細胞ラインおよびそれから誘導さ
れる雑種にも及ぶものである。本発明によるラツ
ト骨髄腫細胞ライン１−078番およびこれから誘
導される雑種の大部分はカツパ鎖S210を含んで
いるが、雑種によつて生産される抗体にとつては
元の骨髄腫のイムノグロブリン鎖を含まないのが
有利である。特に重要な細胞群は、もはやS210
カツパ鎖で表わすことはできないが抗体分泌能を
保持する誘導親細胞ラインによつて提供され、こ
れらは長期培養またはより直接的な処理によつて
変種として生産される。 上述のように、所望の免疫原に感作された免疫
細胞は別の方法によつても人手できる。これらは
自然に発生する所望の型の免疫細胞を分離するこ
とによつて得てもよいし、当該分野の文献に記載
されている手順、即ち免疫原を適当ならばフロイ
ンド補薬のような補薬と共に連続的に動物に投与
した後脾臓または他の免疫細胞を採取することに
よつて人手してもよい。ヒトの免疫細胞を使用す
る場合には自然に発生する免疫細胞の利用が特に
重要であり、この場合免疫原の投与はそれほど注
目すべきものではなく、患者からの感染によつて
自然に生産される免疫細胞がより適当である。自
然な免疫細胞に関して特に重要な領域は自己抗体
（auto antibodies）の生産である。 本発明は、蛋白質、糖蛋白質、少糖類、多糖
類、リポ糖類、ハプテン等のような抗原、例えば
ペプチド、ニユーロ・トランスミツター（neuro
−transmitters）およびホルモン等を含む広範囲
な免疫原に対して感作された直接または自然に免
疫化された動物から免疫細胞に適用できる。表面
マーカー（surface merkers）でありかつ腫瘍物
（neo−plastic material）、特に固体状腫瘍から
誘導される免疫原はかなり重要であるが、本発明
は細菌性抗原やウイルス性抗原および原虫類や菌
類から誘導される免疫原に適用してもよい。 さらに本発明は、C.N.C.M.に１−078番で寄託
されている細胞の特性を有するラツト骨髄腫細胞
ラインと、免疫原に感作された例えばマウスまた
は特にラツトからの脾臓または他の免疫細胞との
雑種細胞を含む。 この雑種細胞は上述のように親細胞と同様の一
般的な型の培地内で増殖させてもよい。 単クローン性抗体の生産に対しては、この雑種
細胞をラツトに接種して固体状腫瘍または腹水腫
瘍を生産させる。適当な増殖期間後、動物を殺し
て抗体を分離するために当該分野の常套法によつ
て腹水および／または血清を採取する。このよう
な手順には免疫吸着剤や膜フイルターの使用を含
む沈殿、透析、クロマトグラフイーが含まれる。 従つて本発明は、上述のようにして雑種細胞を
ラツトに接種して固体状腫瘍または腹水腫瘍をラ
ツトの体内で増殖させた後、ラツトの血清または
腹水流体から抗体を分離させることを特徴とする
単クローン性抗体の生産法を含む。 このような体内での抗体生産は上述のように体
外生産に比べていくつかの特別な利点を有する
が、抗体に対しては化学的な性質よりも免疫学的
性質のいくつかの利用法があり、この場合は生体
内生産に起因する不純物の濃度よりも性質のため
に体外生産が好ましい。他の場合でも、この細胞
は生体内では増殖しないので生体外生産が必要と
なる。適当な組織培養手順例にはスピナー・コン
テナー（spinner containers）内の塊状増殖
（massiue growth）や当該分野で周知の集団培
養（massculture）法が含まれる。さらに、組織
培養は動物を使用する方法に比べ技術的に非常に
簡易化されるという利点が認められるが、この利
点は一般に収量が低いために実施規模を大きくす
る必要があるという点で相殺される。体内法によ
つて生産される抗体の場合に上述した方法と類似
の精製手順を一般に使用してもよい。 本発明は上述した雑種細胞を用いて調製した抗
体にも及ぶものである。この種の抗体は治療や特
に診断、および親和性クロマトグラフイーのよう
な手順において広範囲に適用できる。後述する
Fdフラグメントに注がれた抗マウスIgG単クロー
ン性抗体は単クローン性抗体生産雑種の一例であ
り、該雑種は間接結合アツセイ（indirect
binding assays）や他の中間手順において第２抗
体として適当な試剤を提供する。生産される他の
単クローン性抗体にはヒト由来（human origin）
の種々の腫瘍細胞に対する抗体が含まれ、該腫瘍
細胞にはヒトの細胞の亜集団が認められ、血液字
的診断に有効に利用されうる。他の利用法として
は蛋白質のような自然に生じる物質を精製するた
めの抗体の利用が例示される。 本発明による細胞ラインは抗体生産活性の回復
率が高いために特に価値があることが証明され
た。従つて一つの実験においては、細胞ラインと
免疫化されたラツトの脾臓細胞との融合によつて
得られた雑種について、元の骨髄腫とは異なつた
Igを分泌するその能力を分析した。この分析は分
泌物質のSDS−PAGE分析によつておこなつた。
12種の被試験培養物（すべて単クローン性とみら
れる）のうち11種がIg鎖を分泌し、わずかに１種
だけが元の骨髄腫とは異なつた鎖を分泌しなかつ
たので、試験した培養の90％以上が新しいイムノ
グロブリンを分泌したことになる。さらに、少な
くとも80％が本発明による細胞ラインを含んでい
た。この値はケーラー（Kohler）とミルスタイ
ン（Milsltein）の報文〔ヨーロピアン・ジヤー
ナル・オブ・イムノロジー（European Journal
of Immunology）、1976年、第６巻、第511頁〕
に記載されているマウス系に対して得られた値よ
りも高い。該報文の値はめつたに50％を越えるこ
とはなく、全体的には一般に40〜60％である。 本発明を以下の実施例によつて説明する。 実施例 実施例で使用したDMM−10％FCSは以下の成
分を混合して調製した。 ドルベツコMEM500ml〔グルコース4500mg／
、焦性ブドウ酸ナトリウム含有せず。ギブコー
ビオカルト（Gibco−Biocult）カタログNo.320−
1965〕 焦性ブドウ酸ナトリウムMEM100ｍM5ml（ギ
ブコービオカルトカタログNo.320−1360） ペニシリン／ストレプトマイシン10ml（5000ユ
ニツトペニシリン／5000mcgストレプトマイシ
ン／ml。ギブコービオカルトカタログNo.600−
5070） 子牛の胎児血清50ml〔異なつたバツチから分離
された血清。セラ−ラブ（Sera−Lab）カタログ
No.５−000−1a〕 DMM−HSおよび培地Ｄはそれぞれ子牛の胎
児血清のかわりにウマ血清を用いるか、これを省
略する以外は同様にして調製した。 実施例 １ ラツト骨髄腫細胞ラインの１−078の調製 新しいガラス瓶に入つた凍結細胞210、RCY3
−Ag.1をイーグルの最低必須培地−熱で失活さ
せた10％ウマ血清（HS）で補充したドルベツコ
改質、倍地（DMM）を含有するプラスチツク瓶
内でCO210％−空気90％の雰囲気下37℃のもとで
増殖した。３週間増殖後、対数増殖期の細胞500
個をHS10％および寒天0.25％含有するDMM2ml
中に37℃で懸濁し、この懸濁液をHS10％および
寒天0.5％を含有するDMM15ml（直径９cmの組
織培養ペトリ皿上に凝固させたもの）上に注ぎか
ける。CO2を７％含有し水蒸気で飽和した空気雰
囲気下37℃で２週間細胞を培養した。最も早く増
殖した20のクローンを選び取つて培養皿に移し、
８−アザグアニンに対する耐性およびS210軽鎖
の生産分泌能について試験した。これに基づき、
１つのクローン（Y3−Ag.1.2）を選び、上記の
手順を繰り返し二次クローン（Y3−Ag.1.2.3）を
分離した。 この二次クローンを培養フラスコ内において
DMM（HS10％で補充）上37℃で増殖させ、よく
増殖させた後（１週間）、同一の培地を含有し
CO210％−空気90％の雰囲気の１スピナーフラ
スコ内に移す。スピナーフラスコ内で３ケ月間連
続増殖させた後、培養物（culture）10mlを培養
瓶に入れ、10％FCS（子牛の胎児血清）で補充し
たDMMを用いて培地を２週間かけてゆつくりと
取替える。培養物をスピナーフラスコに移し、細
胞密度が非常に低い段階（約104細胞／ml）から
高い段階（約１×106〜２×106細胞／ml）に至る
種々の増殖期を含めさらに２ケ月間連続的に細胞
を増殖させる。細胞の融合効率をこの過程の種々
の段階で試験した。肉眼で識別できる改良は増殖
の最後の月に認められた。 37℃のフラスコ内での５ケ月間の増殖段階にお
いて、各々２×106〜５×106個の細胞を含有する
いくつかの試料を取り出し、10％ジメチルスルホ
キシド（DMSO）および90％FCSの存在下にお
いて温度勾配約1゜／２分間で凍結させた。これら
の細胞はC.N.C.M.に１−078番で寄託された。 最良の融合は少なくとも２週間対数的に増殖さ
せた培養物を用いておこなわれた。使用するに
は、原試料の細胞または新たに凍結保存した試料
の細胞を急激に溶解させてから10％FCSを含有す
るDMMを用いて10mlまで希釈し、遠心分離機に
かけ、次いで10％FCSを含有するDMM10ml中に
再懸濁させた後、上記基準に従つて上述のように
して培養フラスコ内で増殖させる。６ケ月間増殖
させた培養物は融合効率の低下を示さず、その改
良さえ示すが、誘導のない細胞ラインを保存する
ためには連続増殖よりも液体窒素下で貯蔵する。 実施例 ２ 細胞ライン１−078番と、マウスIgGで超免疫
化したラツトの脾臓細胞との雑種の生産 DA種族のラツトに３週間間隔で完全フロイン
ド補助液中のマウスIgG100μｇを５本のフツトパ
ツド（footpad）注射をうつて免疫化し、補助液
を含まない塩水中の同量のIgGを融合の４日前に
静脈注射して追加免疫化をおこなつた。このラツ
トの脾臓細胞をはじめに子牛の胎児血清（FCS）
２％含有するドルベツコ燐酸塩緩衝塩水（PBS）
中で融合用に調製した。次いでこの細胞を血清補
充液を含まないドルベツコ改質培地（培地Ｄ）で
洗浄し、108個の脾臓細胞を培地Ｄに懸濁した細
胞ライン１−078番の細胞５×107個と混合する。
混合物を50mlプラスチツク製円錐形管中600ｇで
７分間遠心分離機にかけて、次いで上澄みを除去
し、細胞ペレツトを管底部を静かにたたいて粉砕
した。その後の操作は約37℃でおこなつた。50％
ポリエチレングリコール（PEG）1500（調製した
ばかりの試料または暗所に保存した試料）の培地
Ｄ溶液（フエノールレツドによるPHは7.6−7.8）
0.8ml含有する１mlピペツトを用い１分間かけて
該溶液を細胞に静かに添加して細胞を懸濁させ
た。この懸濁液を37℃で１分間保つた後、培地Ｄ
を１分間かけて添加した。さらに培地D20mlを５
分間かけて添加した後、細胞を遠心分離機にか
け、FCS20％含有するドルベツコ改質培地
（DMM）中に静かに再懸濁した。この懸濁液を
リンブロ（Linbro）BCL−5041トレーのくぼみ
（２ml）48個に分配した。24時間後、培地の半分
をHAT含有培地〔リトルフイールド
（Littlefield）、サイエンス（Science）、1964年、
第145巻、709頁〕で取替えた。この操作を次の２
日間およびその後は２日おきに繰り返した。 13〜15日後くぼみ内に急激な増殖がみられ、好
結果の雑種クローンを示した。二次培養のわずか
に６試料が雑種増殖を示した。各雑種培養に使用
した培地は次の手順により、羊の赤血球
（SRBC）に特異性の異なつたマウスの単クロー
ン性抗体で感作されたSRBCの間接的血球凝集反
応によつて試験した。即ち、SRBC2.5×108個を
凝集をふせぐために抗SRBC雑種骨髄腫（ケーラ
ーおよびミルスタイン、ヨーロピアン・ジヤーナ
ル・オブ・イムノロジー、1976年、第６巻、511
頁）の培養上澄み液５mlで希釈し室温で培養して
被覆した。被覆SRBCを遠心分離機にかけて沈降
させ、ペレツトをPBS2.5ml中に再懸濁した。部
分標本25μをＶ形底のマイクロ滴定トレー中に
分配し、雑種培養物の上澄み液を各くぼみに滴下
した。１時間培養後、プレートを200ｇで４分間
遠心分離機にかけ、次いで45゜傾斜させ30〜60分
間保持した。この方法において１種の培養物
（YA2／40）を取り出した。該培養物はSRBCを
Sp3（IgG1）で被覆したときは明らかに陽性であ
り、Sp2（IgG2b）またはSp1（IgM）で被覆した
ときは陰性であつた。この陽性雑種は軟性寒天培
地ではクローン化した。８つの別々のクローンを
選び取つた。これらのクローンはすべてSp3で被
覆したSRBCを用いる試験では陽性であつた。８
つのクローンの各々に対して、そのクローンから
分泌された抗体を、14C−リジンで細胞を24時間培
養することによつて内部標識した。次いで上澄み
液をケーラーおよびミルスタインの報文（前記文
献）に記載のように、全還元後のソジウムドデシ
ルスルフエートポリアクリルアミド（10％）ゲル
電気泳動法（SDS−PAGE）および等電的集束法
（IEF）を用いて分析した。すべてのクローンは
同一とみられ、分子量約50000の重鎖を示し、単
結合が軽鎖帯に存在する（親細胞ラインは重鎖帯
を欠いている）。予期した２種の軽鎖（骨髄腫親
軽鎖および抗体特異性軽鎖）は証明できなかつた
が、これはこれらの軽鎖が類似の可動性を保持す
るためと考えられる。８つのクローンのうちの３
つは再びクローン化し、純度を確実にしかつ安定
性を高めた。二次クローンのうちの１つ
〔YA2／40H（LK）〕を選び以下に述べるように
その特性についての特別な試験に供した。 雑種細胞ランインYA2／40H（LK）の特性
〔3H−Lys〕で内部標識化した抗体YA2／40を、
異なつたクラスの抗SRBC抗体で被覆した細胞と
結合させると、雑種には３種のIgM骨髄腫ではな
く、数種のマウスIgGが認められた。Spl（IgM）
で被覆した細胞と係合させると、未被覆細胞と結
合したバツクグランドと同じ値が得られたが、
Sp3（IgG1）およびSp2（IgG2）で被覆した細胞と
結合させるとそれぞれバツクグラウンドの4.9倍
および35倍の値が得られた。この差はSp2および
Sp3によつて認められる抗原サイトの数と関連づ
けられる（Sp1によつて認められる抗原サイトの
数はSp2とSp3の中間の値である）。 Sp2で被覆することは〔3H〕YA2／40H（LK）
の結合アツセイに対しては敏感な手順である。こ
の結合を抑制することによつて特異性試験をおこ
なつた。これらの試験から、雑種にはIgGのサブ
クラスγ1およびγ2からの蛋白質が認められるこ
とが確認された。IgMによる抑制は少なくとも50
倍は効果は劣るが、蛋白質濃度が高いとある程度
の抑制がみられた。これは調製試料中のIgG不純
物によると考えられる。MOPC21、その変種IF1
（CH3領域を欠く）およびIF2（CH1領域を欠く）、
およびMOPC21（CH2およびCH3領域を欠く）の
Ｆ（ab′）2フラグメントを用いた抑制試験から、
IgC1の抗原決定因子（antigenic determinant）
はCH1領域にあることが確認された。 種特異性試験においては、単クローン性抗体
YA2／40はヒト、ウマまたはラツトの血清に対
して完全に陰性であるが、ラビツトの血清に対し
てはある程度の交差反応を示した。他方、該抗体
はモルモツトの血清とは全く効果的に交差結合し
た。IgGの異なつた種間の交差反応のこのパター
ンは、モルモツトおよび異なつたマウスのサブク
ラス（ヒト、ウマおよびラツトとは完全に異な
る）における局部構造の類似性が抗原決定因子に
含まれることを示す。 実施例 ３ 細胞ライン１−078番と、AOラツトの細胞で
免疫化されたDAラツトからの脾臓細胞との雑
種の生産 実施例２においてマウスIgGによる免疫化につ
いて述べた手順と同様の手順により、DA種のラ
ツトをAOラツトの細胞で免疫化した。このラツ
トの脾臓細胞を実施例２において述べた手順と同
様の手順を用いて細胞ライン１−078番と融合さ
せた。培養物を96個のセルに分配し、選択培養内
で４週間増殖させる。種々の培養物の雑種を、
SDS−PAGE分析法を用い親の骨髄腫と異なるIg
を分泌する能力によつて分析した。得られた結果
を以下の表−１に示す。
【表】
【表】
実施例 ４
細胞ライン１−078番と種々の感作された脾臓
細胞 実施例２で述べた手順と同様の手順によつて
種々の雑種細胞ラインを生産し、骨髄細胞、腫瘍
物の細胞、補体細胞および薬剤を含む種々の対象
に対する抗体を生み出した。これらの雑種および
その調製の顕著な特徴を以下の表−２にまとめ
た。表−２において、種々の見出しはそれぞれ感
作脾臓細胞を作るのに用いた免疫化剤、活性増殖
を示す雑種の二次培養物数、免疫化剤に対して陽
性活性を示す二次培養物数、これらの二次培養物
から単離されたクローン数、および一般に使用し
た感作剤に相当するこれらのクローンの抗体対象
を示す。
細胞 実施例２で述べた手順と同様の手順によつて
種々の雑種細胞ラインを生産し、骨髄細胞、腫瘍
物の細胞、補体細胞および薬剤を含む種々の対象
に対する抗体を生み出した。これらの雑種および
その調製の顕著な特徴を以下の表−２にまとめ
た。表−２において、種々の見出しはそれぞれ感
作脾臓細胞を作るのに用いた免疫化剤、活性増殖
を示す雑種の二次培養物数、免疫化剤に対して陽
性活性を示す二次培養物数、これらの二次培養物
から単離されたクローン数、および一般に使用し
た感作剤に相当するこれらのクローンの抗体対象
を示す。
【表】
実施例 ５
マウスIgGに対する単クローン性抗体の体内生
産 (1) 実施例２で述べたようにして生産したYA／
40H（LK）細胞（５×107個）をF1（Lou×DA）
ラツトに皮下注射して固体腫瘍として増殖させ
た。約10日後、注射した場所に腫瘍が発現しは
じめた。この動物が苦痛の徴候を示しはじめた
ときに全麻痺後、動脈から完全に出血させて殺
した。集めた血液を37℃で30分間凝結させ、血
清を遠心分離によつて清澄した。血清収量は典
型的には１匹あたり５〜10mlであつた。該血清
には10〜15mg／mlのIgGが含有され〔ラジアル
免疫拡散法（radial immunodiffusion）によ
つて測定〕、該IgGは酢酸セルロース電気泳動
法において顕著な骨髄腫帯成分を生じさせた。 (2) 上記手順の変形として、腫瘍を腹水腫瘍とし
て増殖させ、抗体源として血液および腹水流体
を提供した。５×107個の細胞を腹膜内注射す
る約２週間前にプリスタン0.5mlを腹膜内注射
して腫瘍を生じさせた。動物が苦痛の徴候を示
しはじめたときに殺し、血液を補集して上記の
ように処理し、腹腔を切開した後、死亡動物か
ら腹水流体を取り出した。腹水流体の収量は典
型的には１匹あたり約10mlで、５〜10mg／mlの
IgGが含有されていた。 上記(1)および(2)で得られた血清および／または
腹水流体は用途に応じ当該分野の文献に記載され
ている周知の手順、例えば以下の実施例６記載の
手順によつて適当な純度までさらに精製してもよ
い。 実施例 ６ マウスIgGに対する単クローン性抗体の生体外
生産 実施例２で述べたようにして生産したYA2／
40H（LK）細胞を最小値の血清（５％あるいはそ
れ以下）の存在下に適応させて増殖させた。細胞
はいつたん適応すると、イーグルの最低必須培
地、および５％子牛胎児血清で補充したドルベツ
コ改質培地を含有する５スピナーフラスコ内で
CO210％−空気90％の雰囲気下において増殖し
た。この細胞を定常相(1)に達するまで増殖させ
た。この時点で懸濁液は１mlあたり10〜50μｇの
抗体を含有した。 抗体調製品(2)を精製するために、硫酸アンモニ
ウムを懸濁液に添加して50％を飽和させ、得られ
た沈殿物を補集した。沈殿物を最小量の燐酸塩緩
衝塩水で溶解させ、この溶液を同じ媒体に対して
透析して精製抗体を調製した。 (1) 上記手順の変形として、細胞を最小血清濃度
で対数段階において増殖させ、次いで血清は含
有しないが増殖添加物（growth additives）、
例えばイスコブによつて推奨されている添加物
を含有する媒体で直接希釈する。 (2) 上記手順のさらに別の変形として、精製過程
をDEAEクマトグラフイーまたは免疫吸着剤、
例えば抗ラツトイムノグロブリン等を使用して
おこなうか、あるいはこの過程を膜フイルター
の使用で置き替える。
産 (1) 実施例２で述べたようにして生産したYA／
40H（LK）細胞（５×107個）をF1（Lou×DA）
ラツトに皮下注射して固体腫瘍として増殖させ
た。約10日後、注射した場所に腫瘍が発現しは
じめた。この動物が苦痛の徴候を示しはじめた
ときに全麻痺後、動脈から完全に出血させて殺
した。集めた血液を37℃で30分間凝結させ、血
清を遠心分離によつて清澄した。血清収量は典
型的には１匹あたり５〜10mlであつた。該血清
には10〜15mg／mlのIgGが含有され〔ラジアル
免疫拡散法（radial immunodiffusion）によ
つて測定〕、該IgGは酢酸セルロース電気泳動
法において顕著な骨髄腫帯成分を生じさせた。 (2) 上記手順の変形として、腫瘍を腹水腫瘍とし
て増殖させ、抗体源として血液および腹水流体
を提供した。５×107個の細胞を腹膜内注射す
る約２週間前にプリスタン0.5mlを腹膜内注射
して腫瘍を生じさせた。動物が苦痛の徴候を示
しはじめたときに殺し、血液を補集して上記の
ように処理し、腹腔を切開した後、死亡動物か
ら腹水流体を取り出した。腹水流体の収量は典
型的には１匹あたり約10mlで、５〜10mg／mlの
IgGが含有されていた。 上記(1)および(2)で得られた血清および／または
腹水流体は用途に応じ当該分野の文献に記載され
ている周知の手順、例えば以下の実施例６記載の
手順によつて適当な純度までさらに精製してもよ
い。 実施例 ６ マウスIgGに対する単クローン性抗体の生体外
生産 実施例２で述べたようにして生産したYA2／
40H（LK）細胞を最小値の血清（５％あるいはそ
れ以下）の存在下に適応させて増殖させた。細胞
はいつたん適応すると、イーグルの最低必須培
地、および５％子牛胎児血清で補充したドルベツ
コ改質培地を含有する５スピナーフラスコ内で
CO210％−空気90％の雰囲気下において増殖し
た。この細胞を定常相(1)に達するまで増殖させ
た。この時点で懸濁液は１mlあたり10〜50μｇの
抗体を含有した。 抗体調製品(2)を精製するために、硫酸アンモニ
ウムを懸濁液に添加して50％を飽和させ、得られ
た沈殿物を補集した。沈殿物を最小量の燐酸塩緩
衝塩水で溶解させ、この溶液を同じ媒体に対して
透析して精製抗体を調製した。 (1) 上記手順の変形として、細胞を最小血清濃度
で対数段階において増殖させ、次いで血清は含
有しないが増殖添加物（growth additives）、
例えばイスコブによつて推奨されている添加物
を含有する媒体で直接希釈する。 (2) 上記手順のさらに別の変形として、精製過程
をDEAEクマトグラフイーまたは免疫吸着剤、
例えば抗ラツトイムノグロブリン等を使用して
おこなうか、あるいはこの過程を膜フイルター
の使用で置き替える。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン
培地内で死滅し、S210カツパーイムノグロブリ
ン鎖を発現する能力を有するラツト骨髄腫細胞ラ
インY3−Ag1.2.3と、免疫原で感作された免疫細
胞とを細胞融合させ、得られたヒポキサンチン／
アミノプテリン／チミジン（HAT）培地内で死
滅せず、S210カツパーイムノグロブリン鎖を発
現する能力を有する雑種細胞ラインを生体外もし
くは生体内の培地中で培養し、次いで該培地から
抗体を単離することを含む抗体の製造方法。 ２ 雑種細胞ラインがラツト骨髄腫細胞ライン
Y3−Ag1.2.3とマウスまたはラツトからの免疫細
胞とを細胞融合して得られる雑種細胞ラインであ
る第１項記載の方法。 ３ 免疫細胞が脾臓細胞である第２項記載の方
法。 ４ 雑種細胞ラインの細胞を、ラツトに該細胞ラ
インを接種することによつて培養して固体腫瘍ま
たは腹水腫瘍を発生させ、次いでラツトの血清ま
たは腹水流体から抗体を分離することを含む第１
項記載の方法。 ５ 免疫細胞が免疫原の投与によつて免疫原に感
作された動物から得られたものである第１項〜第
４項いずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB7900775 | 1979-01-09 | ||
| GB7900775 | 1979-01-09 |
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|---|---|---|---|
| JP123380A Division JPS55113722A (en) | 1979-01-09 | 1980-01-09 | Cell lines |
Related Child Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP4182190A Division JP2648419B2 (ja) | 1979-01-09 | 1992-07-09 | モノクローナル抗体混合物 |
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|---|---|
| JPH02227096A JPH02227096A (ja) | 1990-09-10 |
| JPH052318B2 true JPH052318B2 (ja) | 1993-01-12 |
Family
ID=10502406
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP123380A Granted JPS55113722A (en) | 1979-01-09 | 1980-01-09 | Cell lines |
| JP2015947A Granted JPH02227096A (ja) | 1979-01-09 | 1990-01-25 | 抗体およびその製法 |
| JP4182190A Expired - Lifetime JP2648419B2 (ja) | 1979-01-09 | 1992-07-09 | モノクローナル抗体混合物 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP123380A Granted JPS55113722A (en) | 1979-01-09 | 1980-01-09 | Cell lines |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4182190A Expired - Lifetime JP2648419B2 (ja) | 1979-01-09 | 1992-07-09 | モノクローナル抗体混合物 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0014519B1 (ja) |
| JP (3) | JPS55113722A (ja) |
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| AU (1) | AU542303B2 (ja) |
| CA (1) | CA1142466A (ja) |
| DE (1) | DE3062558D1 (ja) |
| DK (1) | DK169586B1 (ja) |
| GB (1) | GB2039948B (ja) |
| IE (1) | IE50418B1 (ja) |
| ZA (1) | ZA797020B (ja) |
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