JPS6239999B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は永久培養可能な動物及びヒトの細胞系
を製造する方法に関する。従来から、科学的及び
実際的理由から、正常な動物又はヒトの組織とは
無関係に、ヒト及び動物の細胞を永久的に培養す
る努力がなされている。このことは、従来は、満
足のいくように成功しておらず、僅かな特別な場
合にのみ、特定の血液細胞において永久培養可能
性が達成できただけである。 所定の抗原−結合特異性を有するモノクローン
性抗体を製造するためには、いわゆるハイブリド
ーマ法（Hybridoma−Technik）を使用すること
は公知である。このケーラー（Ｋｏ¨hler）及びミ
ルスタイン（Milstein）により開発された方法
（Continuous culture of fused cells secreting
antibody of predefined specificity、Nature
256、495〜497頁、1975年、参照）を用いると、
個々の抗体（AK）形成性の細胞を潜在的に「不
死」にし、任意に増殖させることができる。 AK−産生性細胞（Ｂ−リンパ球）と悪性変性
した細胞（骨髄腫）との融合により、双方の片親
の特性（抗体を産生する能力及び永久的生長する
能力）を共に有している細胞ハイブリツドを得る
ことができる。この新用語「ハイブリドーマ」と
は、ハイブリツド細胞（Hybridzelle）と骨髄腫
（Myeloma）との融合を意味する造語である。 この方法の特殊性を理解し易くするために、抗
体（免疫グロブリン、Ig）の構造及び合成のいく
つかの基本を示す。Ig−分子は２本の軽い(L)鎖及
び２本の重い(H)鎖から成つている。各々のＨ−及
びＬ−鎖は遺伝的及び機能的に異なる断片に分け
られている。抗体の抗原結合部位（combining
sites）は、高度の配列−異種性（Sequenz−
Heterogenita¨t）を有する、いわゆる可変部
（variable region）内に形成されている。多様な
アミノ酸交換により、その形において、多数の抗
原に対して複雑である三次元的構造の大きなレパ
ートリーが得られる。哺乳動物は10⁶〜10⁷個の
種々の抗原−結合部位を形成できることは認めら
れている。 抗体は、Ｂ−リンパ球の合成産生物である。幹
細胞からのＢ−細胞の個体発生の間に、Ｌ−鎖に
関してもＨ−鎖に関しても、多く入手可能な可変
部遺伝子１つと比較的少ない固定部遺伝子の１つ
とが組合わされる。遺伝子会合が行なわれると直
ちに、当該Ｂ−細胞はその上に固定され、１個の
特有の型の抗体分子を形成し、この固定は、その
娘細胞にそれを遺伝する。抗原刺激なしに、この
Ｂ−細胞は貫生することなしに硬化し、静止状態
になる。これは僅かな免疫グロブリンのみを生成
し、かつ分泌するが、その細胞膜内で堅固に固着
した抗体を有し、これは正確に、分泌された抗体
と同様な抗原−結合部位を有する。抗原が組織内
に入ると、これは一連の複雑な細胞作用でＢ−細
胞を刺激する。 その膜−免疫グロブリンが抗原と特異的に反応
するＢ−細胞は、分裂し、分化して、抗体産生細
胞（プラズマ細胞）になる娘細胞のクローンを形
成する。Ｂ−細胞クローンは同じ構造及び同じ抗
原結合部位を有する抗体を形成するので、この種
のクローンの産生物をモノクローン性抗体
（monoklonar Antikｏ¨rper）と称する。複雑に構
成された抗原例えば蛋白質、微生物又は細胞は、
多くの種々の抗体作用部位〔デテルミナント
（Determinant）、エピトープ（Epitope）〕を有
し、整合的に多くの種々のＢ−細胞を刺激し、分
裂し、クローンを形成する。従つて、その大き
さ、電荷、特異性及び親和性に関して異なり、免
疫血清中に連合して現われる多数の抗体が形成さ
れる。特定のデテルミナントに対して向けられた
免疫応答も通例多クローン性である。マウスは、
１個の単純ハプテン即ち単離されたデテルミナン
トに対して10³個までの種々の抗体を形成するこ
とができることは公知である。この事実は、不可
能でないにしても、再現可能な方法で特定の抗原
に対する抗血清を得ることが極めて困難であるこ
とを説明している。従つて、数年来、その方法で
均一なモノクローン性抗体を得るための、与えら
れた別々のＢ−細胞をクローン的に拡大せる１つ
の方法が試みられた。天然の前駆体は、悪性疾患
として従来からマウス、ラツテ及びヒトに公知で
あつた骨髄腫もしくは形質細胞腫である。Ｂ−細
胞が悪性に変性し、無制限に増殖すると骨髄腫が
生じ、この際娘細胞のクローンは多量の均一な抗
体を産生する。特定の内部交配−マウス種におい
て、骨髄腫は化学的操作により誘機されうる。し
かしながら、過免疫化及び骨髄腫誘起の組合せに
より、公知の抗原結合特異性を有するモノクロー
ン性抗体を生じさせるすべての実験は成功してい
ない。絶えず、許験管内で培養可能であり、ハイ
ブリドーマ法の基本となつている骨髄腫細胞系を
得るこの努力がなされていた。ミルスタイン
（milstein）及びケーラー（Ｋｏ¨hler）による基本
思想は、免疫化された動物からの正常のＢ−細胞
に培養可能で永久生長する骨髄腫を融合すること
によりハイブリツド細胞を得ることであつた。 彼等の最初の実験では、骨髄腫細胞を羊−赤血
球で免疫化されたマウスの脾臓からのリンパ球と
融合させた。彼等は10個の生存性ハイブリツドを
得、それから、羊−赤血球に対する特異性を有す
る２個の抗体を生じた。この抗体−再生性ハイブ
リツドは、それが連続的に培養液中で生長し、そ
れを同種のマウスに移植すると腫瘍を形成する点
で、骨髄腫と類似している。更にこのハイブリツ
ド細胞が骨髄腫と同様に、液体窒素中で貯蔵さ
れ、長時間にわたり生存可能に保存できること
は、実際上極めて重要であつた。 ハイブリドーマー製造の技術 マウスを、抗体を用いる慣用の抗血清製造法に
より免疫化し、通例、数週間中断して繰り返す。
融合の直前にマウスを殺し、その脾臓を無菌条件
下に切除する。脾臓嚢を切り取り、脾臓を注意深
く押し出す。脾臓リンパ球（約10⁸細胞）を、細
胞培養媒体内に懸濁させ、骨髄腫細胞と１：１〜
10：１の割合で混合する。この細胞混合物を遠心
により、試験管内の培地上に気密に詰め、液状の
上澄みの除去の後に融合培地〔30〜50％のポリエ
チレン−グリコール−溶液又は懸濁され、不活性
化されたセンダイ−ウイルス（Sendai−
Virus）〕で処理する。融合培地の洗出の後に、
１ml当り約10⁶細胞の細胞密度を有する細胞混合
物を無菌の培養容器（スポツトプレート）に移
し、CO₂−吹き込んだインキユベーター
（Inkubator）中で培養する。融合の２〜４週後
に、ハイブリドーマクローンの生長が顕微鏡で認
められる。この時点から、培養液上澄みは、所望
の特異性を有する抗体の存在に関して検査でき
る。このために、マイクログラム以下の領域で、
抗体を立証できる分析法（RIA、ELISA、免疫螢
光）が必要である。次いで、陽性の部分培養液か
らの細胞をクローン化し、即ち単細胞培養を刺激
する。単離されたクローン（これは真性抗体を形
成する）を拡げ、腫瘍誘起のために、プリスタン
（Pristan）−前処理された同種マウスの腹腔内に
注射する。この接種の後６〜20日に、この腫瘍の
開始時に、血液又は有利に腹腔（腹水）から均一
な抗体を得ることができる（マウス１匹当り、モ
ノクローン性抗体50〜150mgの収量）。 融合の後に、ハイブリツドと融合されなかつた
細胞との非常に不均質な混合物が存在する。マウ
ス−脾臓細胞10⁸個の使用時に、最大10³個の生存
可能なハイブリドーマー細胞を算出できる。この
ハイブリツド細胞はそれが増殖する前に一定の始
動時間を必要とするので（但し、融合しなかつた
骨髄腫は直ちに生長する）、選択法は、少ないハ
イブリドーマの生残を確保すべきである。ハイブ
リドーマ法における標準選択法は、いわゆる
HAT−選択培地〔Littlefield、J.W：Selection
of hybrids from matings of fibroblasts in
vitro and their presumed recombinants.
Science145、709〜710頁（1964年）参照〕を基本
とする。Ａは、アミノプテリン
（Aminopterin）、DNS−合成の主要経路をブロツ
クする葉酸−拮抗因を意味する。正常細胞は、こ
れらに、培地中でチミジン（Ｔ）及びヒポキサン
チン(H)が供給されるかぎり、チミジン−キナーゼ
（TK）及びヒポキサンチン−グアニン−ホスホ
リボシル−トランスフエラーゼ（HGPRT）を用
いて、アミノプテリン−ブロツクを回避すること
ができる。細胞にこれら２酵素が欠けていれば、
これらは、HAT−培地中で生残不可能である。
従つて、ハイブリドーマー発生のためにTK−又
はHGPRT−欠落している骨髄腫細胞の突然変異
体を使用する。これらの細胞は、これらとその遺
伝子プールと共に欠落酵素をそのハイブリツド細
胞中に挿入する正常細胞と融合させる際にのみ、
生残可能である。脾臓の融合されなかつたリンパ
球は、培養液中で、自然に限られた寿命を有し、
従つて、ハイブリドーマのおそれはない。 ハイブリドーマー製造時には次の問題が生じ
る： １ HAT−培地−選択 融合しなかつた骨髄腫細胞の生長の選択的抑
制は、前記のように、ハイブリドーマークロー
ンを得るための主要な前提である。このHAT
−選択は、しかしながら、正常の、欠落してな
い細胞に対しても、細胞の分裂能及び生残能に
悪影響を及ぼす極めて非生理学的な方法であ
る。特にヒトのリンパ球においては、HAT−
培地の成分を濃度に応じて、HGPRT−陰性細
胞を確実に殺し、これと反対にHGPRT−陽性
細胞を生存させるように調節することは極めて
困難である。 使用リンパ球及び骨髄腫細胞の数との間の混
合割合及び増加可能なハイブリツドの収率は、
次の数で示される：典型的な融合バツチ中のマ
ウス−リンパ球10⁸個の装入時に、500ハイブリ
ドーマークローンが一般に非常に良好な結果に
当てはまる。マウスの脾臓内では（それらが繰
り返し、（過剰）免疫化されていても）10⁴〜
10³個の細胞のみが、免疫原に対する抗体を形
成する〔Jerne−Plaque−Technik、N.V.及び
NORDIN、A.A.：Science140、405頁（1963
年）参照〕ので、純粋に偶然制限されたハイブ
リドーマー形成では、所望の抗体−特異性を有
するクローンでのみ予期することができるよう
に、クロトーン10³〜10⁴個を引き出すことがで
きるべきである。ヒトのハイブリドーマーの製
造時には、この混合割合はなお著るしく、融合
１回当り、ハイブリツド−クロトーン４〜10個
が得られる際に良好な結果として通例する。 ２ 染色体−損失 効果的融合の後に、新たに生じたハイブリツ
ド細胞は、自然に当初から存在する染色体量の
約２倍を有して完成されるはずである。実際の
経験が示しているように、ハイブリツド細胞
は、染色体を失なう傾向を有する。各々の細胞
分裂時に、染色体の非生理学的過剰量では、こ
れらが、一様に２個の娘細胞に分配されない危
険性がある。極めて僅かに生じ、従つて過剰生
産では滞留しない娘細胞は他に比べて選択利点
を有し、培養液中の優先細胞になる。しかしな
がら、免疫グロブリンの合成は、ハイブリツド
細胞の生存能にとつては重要ではなく、過剰合
成能（Luxus−Synthese−Leistung）を示して
いる。従つて、ハイブリドーマークローン中の
非プロデユーサー変形（Non−Producer−
Varianten）の現象が屡々現われ、クローンの
産生能を確保するためには、経費のかかる再−
クローン化法（Re−Klonierungs−maβ
nahmen）が必要である。染色体を失なう傾向
は、種間−ハイブリツドの際に特に顕著であ
る。 ３ ハイブリツド免疫グロブリン 骨髄腫細胞は悪性Ｂ−細胞であり、それ自体
免疫グロブリンを形成する（未知の抗原結合特
異性を有する）。この能力は、骨髄腫細胞を正
常のＢ−細胞と同様にハイブリドーマ中に入
る。Ig−分子の種々の連鎖を別々に合成し、後
に一緒にしてはじめて完全な抗体にされるの
で、１個のハイブリドーマー細胞（この中で２
種の異なるＬ−及びＨ−鎖が合成される）中
に、偶然制限された10の種々の組合せが生じ、
そのうち、所望の真性抗体は全−Ig−量の1/16
のみに達する。従つて、多大の経費を用いて、
それ自体Ｈ−又はＬ−鎖を形成しないマウス−
骨髄腫−細胞−突然変異体が開発された。しか
しながらヒトのリンパ球の融合のためには、従
来は、類似の充分に開発された骨髄腫系は供給
されていない。 なお不利な問題は、ハイブリドーマー法に対す
る変形において存在する： １ ウイルスによるＢ−リンパ球の不滅化 正常の供給者のヒトのＢ−リンパ球をエプス
タイン−バール−ウイルス（Epstein−Barr−
Virus；EBV）の感染により悪性に形質転換す
ることができる。EBV−感染されたリンパ芽
球細胞を連続的に、試験管内で培養し、クロー
ン化することができる。しかしながら、ハイブ
リドーマと比べて、EBV−リンパ芽球系は、
不充分な産生安定性で、1/10又はより少ない免
疫グロブリンを産生する。Ｂ−細胞は早い分化
期にEBVで固定され、従つて、過度に屡々、
非常に僅かな量でIgMを産生するクローンが得
られる。 同様に、マウス−Ｂ−リンパ球をアベルソン
−マウス−白血球−ウイルス（Abelson−Ｍａ¨
use−Leukａ¨mie−Virus；MuLV）により形質
転換することができる。ここでも、リンパ球は
不都合に早い分化期で固定され、抗体性は悪
い。 ２ 形質転換されなかつたＢ−リンパ球の長時間
培養 最新の文献〔Spredni.B、等によるLongterm
culture and cloning of nontransformed
human Ｂ−Lymphocytes、J.Exp.Med.154、
1500〜1516頁（1981年）、Howard、M.等によ
るLong−therm culture of normal mouse Ｂ
−Lymphocytes Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.〕
は、Ｂ−リンパ球を、形質転換せずに、特別な
培養条件（永久分裂促進刺激；リンホカイン−
調節された培地等）により永久的に培養し、ク
ローン化する可能性を示している。モノクロー
ン性抗体の通常の製造のために、この方法は、
現在までのところ、確実にはなお好適ではな
い。 従つて、従来の技術水準を次にまとめて記載す
ることができる： 正常の供給者のＢ−リンパ球は、人工的に不滅
化することができる。ハイブリドーマー法では、
培養液中で無制限に増殖しうる生きている骨髄腫
細胞（これは抗原刺激性Ｂ−リンパ球と融合され
る）を使用する。細胞−細胞−融合により生じる
ハイブリツド細胞を、HAT−選択により単離
し、単細胞培養の構想によりクローン化する。所
望の特異性を有する抗体を形成するハイブリドー
マークローンをモノクローン性抗体の大量生産の
ために増殖させる。しかしながら、このHAT−
選択から、染色体損失及びハイブリツド免疫グロ
ブリンによる著るしい欠点が生じる。 もう１つの他の方法で、Ｂ−リンパ球は、特別
なウイルスの感染により悪性に形質転換され、抗
体合成の保持下に永久に生長する細胞に変えられ
る。しかしながら、これらは周知の弱い抗体産生
体である。 従つて、所定の抗原−結合特異性を有するモノ
クローン性抗体の大量生産に関して、このハイブ
リドーマ法は、現在、その変形法よりも優れてい
る。 しかしながら、このハイブリドーマ法も重大な
欠点を有する。その最も重要な欠点は、一方で、
この方法は、HAT−敏感な融合成分に限られ、
他方で僅かな種類の細胞即ちリンパ球及び神経細
胞に限られていることにある。本発明は、この欠
点を排除し、永久に培養可能な動物及びヒトの細
胞系を製造する新規の有利な方法を得ることを課
題としている。 この課題は、本発明により、正常な動物及びヒ
トの細胞と、試験管内で培養可能にする生物学的
成分との融合により、永久培養可能な動物及びヒ
トの細胞系を得る方法により解決され、この方法
は、正常の動物及びヒトの細胞を、物質転換され
た細胞の単独では増殖不能な細胞フラグメントと
融合させ、培養液中で選択物質なしに培養するこ
とよりなる。 本発明のこの方法において重要なことは、融合
に使用されるフラグメントが、なお増殖可能な細
胞をまつたく含まず、単独ではもはや増殖できな
いことである。 意外にも、物質転換された細胞と非悪性細胞か
らの正常細胞質との融合により、悪性が消失され
ることが公知（Shay.W.J.等によるSupression
of tumorigenicity in Cybrids.J.Supramol.St.
Cell.Biochem.16、75〜82（1981年）参照）であ
つたにもかかわらず、本発明の方法では、変性さ
れなかつた成分、即ち正常細胞の大過剰で存在す
る細胞質分は、変性された細胞の悪性特性を消失
させず、従つて永久生長の能力を失わせない。同
様に、骨髄腫細胞質が共にこのハイブリツド内に
挿入されない場合には、細胞核が、変性された細
胞の単離された核、例えば骨髄腫核と一緒になつ
て、共通のゲノムになるか否かは予測できること
ではなかつた。 この融合は、公知方法で、融合因子物質特にポ
リエチレングリコール又はセンダイ−ウイルス
（Sendai−Virus）の存在で行なうのが有利であ
る。それというのも、これによつて、ハイブリド
ーマ法におけると同様に、融合収率を高める作用
をするからである。他の融合因子物質は当業者に
とつて公知であり、同様に使用可能である。 形質転換された細胞例えば骨髄腫細胞のフラグ
メントの取得は、公知方法で行なうことができ
る。細胞壁を溶解により又は機械的に破断するの
が有利である。場合によつては遠心により、該フ
ラクシヨンを細胞質フラクシヨンから分離させ、
これらのフラクシヨンを単独で使用することがで
きる。この溶解を、細胞をグリセリン中で膨潤さ
せ、引続き、グリセリン不含の緩衝液中に入れる
ことにより行なうのが特に有利である。こうし
て、細胞膜が破裂する。もう１つの有利な方法
は、細胞をサイトカラシンＢ（Cytochalasin
Ｂ：市場で入手されうる抗生物質）で処理するこ
とにより、核質体と細胞質体を製造することより
なる。この方法は、Biochem.Biophys.Res.
Comm.63、669〜674頁（1975年）から公知であ
る。この方法では、なお細胞膜で包囲されている
細胞核のみに、一方で核質体及び同様に他方で膜
で包囲された核のない細胞質いわゆる細胞質体を
生じる１種の細胞分裂が行なわれる。双方は、本
発明の範囲内で、同様に、溶解によるか又は機械
的に得られる細胞フラグメントもしくは核又は細
胞質フラクシヨン（これはもはや細胞膜で包囲さ
れていない）と同様に、融合に好適であることが
明らかである。機械的崩壊は、当業者により公知
の方法で行なうことができ、この方法は説明を必
要としない。 細胞フラグメントは新鮮な状態でその製造の直
後に又はその後にはじめて融合に使用され−この
際、後者の場合には、凍結乾燥状態での保存が有
効である。 形質転換された細胞とは、試験管内でかつ生体
内で正常の生長規則機構にもはや従がわないもの
と解される。この例は、悪性変性した細胞例えば
癌細胞、ウイルス感染（例えばエプスタイン−バ
ール−ウイルス）により変性された細胞及び発癌
物質で変えられた細胞である。 本発明の方法のために細胞フラクシヨンを使用
する場合には、これは完全に純粋である必要はな
いが、無傷の増殖可能な細胞を含有していてはな
らない。 本発明の主要特徴は、得られるハイブリツド
が、変性され、試験管内で培養可能な非ハイブリ
ツド細胞の競争にさらされず、従つて、その生長
がHAT−選択物質によつても抑制されないこと
にある。これによつて、ハイブリツド上への
HAT−選択培地の非常に不利な影響は除かれ、
永久培養可能な細胞の収率及び生存能の決定的改
良が得られる。 更に本発明によれば、ハイブリツド形成のため
に、変性された細胞としてHAT−敏感な細胞を
使用することはもはや前提ではない。HAT−敏
感性を有せず、慣用のハイブリドーマー法には使
用できないが本発明の範囲では融合用のフラグメ
ントの製造のために使用できる永久生長の細胞系
が存在する。 細胞をサイトカラシンＢ（CytochalasinB：菌
−代謝物質）により処理し、その核を極端な膨出
で押し出す。重力（例えば遠心）の影響下で、薄
い結合体は容易に破壊する。これにより、核のな
い細胞体（細胞質体）及び細胞膜と細い細胞質縁
部で包囲されている核（核質体及びミニ細胞）が
生じる。核質体も細胞質体も増殖性ではないが、
それらの特異的な機能は数時間〜数日間にわたり
保持される。核押し出しは、比較的高いサイトカ
ラシン−Ｂ−濃度を必要とし、この結合が破壊し
ないがぎり、完全に可逆性である。 低いサイトカラシン−Ｂ−濃度は、核突出なし
に有糸分裂による細胞分裂を抑制する。非粘着性
細胞を得るための細胞質体／核質体製造のための
標準法は、ウイグラー（Wigler）、M.H.及びワイ
ンスタイン（Weinstein）、I.B.によるプレパラテ
イブ・メソツド・フオア・オブテイニング・エヌ
クリエーテツド・ママリアン・セルズ
（Preparative method for obtaining enucleated
mammaliam cells）Biochem.Biophys.Res.
Comm.63、669〜674頁（1975年）に記載されて
いる。 更に、前記のＢ−リンパ球だけでなく、他の従
来試験されていない動物及びヒトのすべての細胞
も本発明により、不滅化（Immortalisieren）す
ることができる（実施例６〜８参照）。従つて、
例えばＴ−リンパ球（細胞媒介免疫の担体及び免
疫系の調節細胞）、内皮細胞（ヒトの臍静脈から
の壁細胞）及び黒色腫細胞（冷凍保存された腫瘍
転移物質から単離）等の種々の型の細胞を、本発
明の方法により永久生長体に変えること（不滅
化）ができた。 従つて、本発明による方法は、任意の動物及び
ヒトの細胞を培養可能とし、こうして、細胞産生
物例えば抗体、凝固因子、酵素及びその他の細胞
により合成される物質を試験管内で製造する問題
をも解決可能とする。同様に本発明による培養
は、化学物質の検査用の実験動物を著るしく不必
要とすることを可能とする。 本発明方法で製造された永久培養可能な細胞系
を、細胞産生物例えばモノクローン性抗体、凝固
因子、リンフオカイン、酵素及びその他の蛋白質
又は他の物質群に属する細胞産生物を得るために
使用することができる。 殊に、この実施形を、永久培養可能なＢ−リン
パ球の使用の際にはモノクローン性抗体の製造の
ために、永久培養可能な内皮細胞、黒色腫細胞、
肝臓細胞、腎臓細胞及び類似物を使用する際には
凝固因子の取得のために、永久培養可能なＴ−リ
ンパ球＋Ｂ−リンパ球及び／又はマクロフアージ
の使用の際にはリンフオカインの取得のために、
永久培養可能な腺細胞の場合には腺から分泌され
る物質例えばホルモン及び類似物の取得のため
に、使用することができる。本発明による不滅化
のために使用される動物細胞の種類に応じて、重
要なすべての細胞産生物を得ることができること
は明らかであるので、ここではそれを詳述する必
要はない。 しかしながら、細胞産生物の取得は、原料細胞
の産生物長ち同種の細胞産生物に限らない。本発
明により得られる永久培養可能な細胞は、その出
発細胞からは形成されない即ち異種の、かつその
遺伝子情報が遺伝子組換えの方法ではじめて、永
久ハイブリツド細胞（即ち異種である）に挿入さ
れる細胞産生物の表出にも使用できる。異種細胞
産生物を永久ハイブリツド細胞により製造するこ
とは、例えば形質転換により作用されうる。従つ
て、実験は、本発明による永久細胞内にベクター
を用いてDNAを導入することができ、従つて、
導入したDNAによりコードされた産生物の表出
のために使用できることが明らかにしている。 本発明による永久培養可能な細胞は、更に、前
記のように、作用物質の検査対象としても使用で
きる。更に、本発明により得られる不滅化された
ハイブリツド細胞を遺伝子情報源（これは所望の
細胞産生物の発現をコードする）として、ハイブ
リツド細胞の遺伝子情報を有する成分即ちそのゲ
ノム、ゲノム分又はRNAを得て、遺伝子組換え
法により形質転換して適当な微生物にし、後者か
ら所望の細胞産生物を得るように、使用すること
もできる。 本発明の使用の変形によれば、細胞産生物例え
ばモノクローン性抗体及び他の細胞物質の製造
は、次のように、即ち、生じたハイブリツド細胞
を、細胞産生物形成もしくは物質合成のために直
接、培養せずに、そのゲノム又はゲノム分又は
RNAを遺伝子組換え法で形質転換して適当な微
生物にし、後者をモノクローン性抗体又は細胞物
質の取得のために培養することによつても行なう
ことができる。本発明のこの実施形では、ハイブ
リツド細胞のゲノムを当業者にとつてそのために
公知の方法で単離し、適当なベクター（このため
に、市場で入手しうるベクターを使用することが
でき）を用い、このために開発された標準法によ
り、形質転換して適当な微生物にする。 次に、形質転換された微生物を常法で培養し、
所望の細胞産生物をこれから得る。微生物として
は有利に、遺伝子組換に有効なＥ・コリー菌株の
１種を使用するのが有利である。 次に実施例につき本発明を詳述する。 ここで、次の略字及び商品名を用いる。 AK 抗体 Ig 免疫グロブリン Ｈ−もしくはＬ−鎖 Ig−分子の重い−もしくは
軽い蛋白質 プリスタン（pristan） ２・６・10・14−テト
ラメチルペンタデカン HAT−選択培地 ヒポキサンチン、アミノプテ
リン、チミジンを含有する培地 TK チミジン−キナーゼ HGPRT ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリ
ボシル−トランスフエラーゼ EBV エプスタイン−バール−ウイルス MuLV アベルソン−マウス−白血病ウイルス CB サイトカラシンＢ（抗生物質、
ALDRICHBIOCHEMICALS Milwaukee
USA） DMSO ジメチルスルホキシド DMEM デユルベツコス・ミニマル・エセンシ
ヤル培地（Dulbecco′s Minimal Essential
Medium） FKS 牛胎児血清 フイコル（Ficoll） 蔗糖ポリマー
（PHAMACIA） PEG ポリエチレングリコール PBS 燐酸塩緩衝食塩水 POD ペルオキシダーゼ ABTS ２・2′−アジノ−ジ（３−エチルベンゾ
チアゾリン−６−スルホン酸）のアンモニウム
塩 EBSS エールズ・バランスド・塩溶液（Barl′s
Balanced Salt Solution） RPMI1640 ローズウエル・パーク・メモリー・
インステイチユート（Rosewell Park Memory
Institute）の培地 トリス（Tris） トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン PBL 末稍血液−リンパ球 MNC 単核細胞（リンパ球、単核白血球） hTSH ヒトの甲状腺刺激ホルモン β−TSH ヒトの甲状腺刺激ホルモンのβ−鎖 FA フロインドのアジユバンス（Frend′sches
Adjuvans） CFA 完全なフロイドのアジユバンス IFA 不完全なフロイドのアジユバンス） メトセル（Methocel）1500 メチルセルロース
（FLUKA） CMV 細胞質膜嚢 FITC−コバスフエレス（Covaspheres） 球形
のフルオレツセインイソチオシアネート
（COVALENT TECHNICALS、Ann Arbor.
Mich.U.S.A.） EAZ エールリツヒ腹水細胞（ATCC；
CCL77） 例 １ Ａ ラインP3×63Ag8.653ATCC No−CRL−
1580のマウス骨髄腫細胞からの核質体及び細胞
質体の製造〔Wingler.M.H及びWeinstein.I.B.
によるＡ preparative method for obtaining
enucleated mammalin cells.Biochem.
Biophys.Res.Comm.63669〜674頁（1975年）
に記載の方法参照〕。 A.1 材 料 サイトカラシンＢ（CB.Aldrich
Biochemicals.Milwaukee.USA）をジメチル
スルホキシド（DMSO Merck）中に溶かし
（２mg／ml）、基本溶液として４℃で貯蔵し
た。 フイコル−400（pharmacia；蔗糖ポリマ
ー）を再蒸溜水中に溶かし（１ｇ／ml）、オ
ートクレーブ処理し、50％基本溶液として−
20℃で貯蔵した。 １倍−及び２倍濃度のデユルベツコス・ミ
ニマム・エセンシヤル培地（DMEM）、牛胎
児血清（FKS）、Ｌ−グルタミン（200ｍモ
ル／）、ベーリンガー・マンハイムのスト
レプトマイシン−ペニシリン。硝酸セルロー
ス管をUV−照射により滅菌した。 骨髄腫細胞系Ag8.653ATCC CRL−
1580：この系は、ケールニイ（Kearney）、
J.F.等による、ア・ニユー・マウス・ミエロ
ーマ・セル・ライン・ザツト・ハツト・ロス
ト・イムノグロブリン・エクスプレツシヨ
ン・バツト・パーミツト・ザ・コンスツラク
シヨン・オブ・アンチボデイセクリーテイン
グ・ハイブリツド・セル・ラインズ（Ａ
new mouse myeloma cell line that hat
lost immunoglobulin expression but
permits the construction of
antibodysecreting hybrid cel lines）J.
Immunol.1231548〜1550頁（1979年）に記載
されている。これはアザグアニン抵抗性であ
り、HAT−敏感で、Ｈ−もＬ−Ig−鎖も合
成しない。これをDMEM＋15％FKS＋グル
タミン＋ペニシリン−ストレプトマイシン＋
ピルベート（＝DMEM−完全培地）中、37
℃で、７％CO₂−雰囲気中に保持する。 A.2 方 法 脱核：Ag8.653−細胞８×10⁷を10³upMで
５分間遠心分離し、12.5％フイコル−DMEM
−CB−DMSO−溶液12ml中に、細胞塊不含
の懸濁液が得られるまでの長時間再懸濁させ
た。細胞懸濁液各３mlを、予め４時間、12時
間前に調製されたフイコル−勾配溶液上に積
層し、フイコル不含のDMEM−CB−DMSO
−溶液２mlをその上に積層した。この勾配溶
液を有する試験管を超遠心機中、25000upM
（31℃）で60分間遠心分離した。 この遠心終了後に、肉眼視可能なフラクシ
ヨン（バンド）を長いカニユーレを有する注
射器を用いて、上から別々に集め、培地（添
加物不含のDMEM）各20ml中で稀釈し、遠
心により沈殿させ、新しいDMEM中に再懸
濁させる。 次の４フラクシヨンが得られた： (a) 細胞−デブリス（フイコル０〜12.5％の
間の範囲で）、 (b) 核のない細胞質（フイコル15〜16％の範
囲内で） (c) 認識可能なプラズマ縁不含の核及び約２
％の核不含細胞（フイコル17〜25％の範囲
で） (d) 試験管底部の沈殿物としての、核を有
し、良好に認識可能なプラズマ縁を有する
形態学的規準で無傷の細胞及びプラズマ縁
を有しない僅かな核 細胞計測の結果、Ag8.653−細胞８×10⁷
から(b)内に細胞質体1.25×10⁶個、(c)内に核
質体４×10⁶個及び(d)内に推定上無傷の細胞
1.1×10⁷個が含有されていた。 Ｂ マウス脾臓細胞と実験Ａからの単離された骨
髄腫−核質体、−細胞質体及び−沈地細胞との
融合 B.1 材 料 融合剤：ポリエチレングリコール（PEG
−4000）20ｇをオートクレーブ中で融解さ
せ、56℃まで劣却し、この温度でDMEM20
mlと混合した。 HAT選択培地：OMEM−完全培地に、ア
ミノプテリン（４×10^-7M）、チミジン（１
×10^-4M）及びポキサンチン（3.1×10^-5M）
を加えた。 培養容器：コスター社（Firma Coster、
Cambridge.Mass.USA）の組織培養クラス
ター（Tissue Culture Cluster）24及びクラ
スター96。 B.2 方法 融合：実験Ａで調製されたフラクシヨン
(b)、(c)及び(d)を、別々のバツチ中で脾臓細胞
と10：１の割合で混合し、遠心により沈殿さ
せた。上澄み液を注意深く除去した。この沈
殿上に、50％PEG−溶液0.8ml（37℃で、一
様に１分間にわたり分配し、絶えず緩るく振
動しながら）を加え、次いでDMEM5ml（室
温で、一様に５分間にわたり）を加えた。更
にDMEM20mlの添加の後に、細胞を沈殿さ
せ、新しいDMEM−完全培地（５ml）中に
再懸濁させ、フイーダー（Feeder）細胞で
塗布された24コスタースポツト（24erCoster
−Ｔｕ¨pfel）組織培養容器各10個以上に分配
した。個々の培養物に１、２、３、５、７、
10、13日目にDMEM−完全培地を与え。 フイーダー細胞〔（腹空−マクロフアー
ジ）：融合の前日に同系交配マウス
（Balb／ｃ）を伸張により殺した。無菌条件
下でPBS4〜５mlを腹空腔内に注入し、１分
後に再び吸引した。洗出した細胞をDMEM
中で洗浄し、完全培地中に１ml当り細胞２×
10⁵個の密度で懸濁させ、24コースタースポ
ツト（Coster Ｔｕ¨pfel）上に、0.5ml宛分配
させた。 脾臓細胞：Balb／ｃ−マウスから、無菌
条件下で融合の直前に脾臓を剔出し、その細
胞をDMEM中に懸濁させた。細胞集塊物及
び組織片をガーゼを用いて去した。 有効融合及び永久成長の尺度を示す免疫グ
ロブリン産出の検査をELISA−テストで実
施する。 マウス−免疫グロブリン上のELISA：マ
イクロ滴定プレートに羊のマウス−Ig−抗体
（IgG−フラクシヨン；スポツト１個当り0.9
％NaCl−溶液10μｇ／ml；抗体溶液150μ
）を塗布した。融合物の培養上澄み各100
μを、この塗布されたスポツト上に点滴
し、室温で１時間インキユベートした。上澄
みの吸引除去及び２回洗浄の後に、このスポ
ツトに抗−マウス−Ig−POD−接合体−溶
液（前記と同じ抗体；オランダガラシ−ペル
オキシダーゼと共有結合）100μを装入
し、室温で１時間インキユベートした。３回
洗浄の後に、スポツト１個当り基質溶液
（ABTB）100μを点滴し、発色を光学的に
測定した。 B.3 結 果 Ａにより調製された細胞質体、核質体及び
沈殿フラクシヨンを、平行的に、Balb／ｃ
−マウスの脾臓細胞と融合させ、培養スポツ
ト各々10個上に融合物の培養液１mlを分配さ
せた。培養分各５個にはHAT−添加物を与
えず（プレート）、各５個にはHAT−添加
物を与えた（プレート）。 融合後（n.F）21日までは、HAT−媒体な
しで、沈殿フラクシヨン（無傷の細胞）の融
合物を有するプレート上のスポツト4A、
4B、4C、3C及び3Dは例外として、どのスポ
ツト中でもリンパ系細胞の生長は、肉眼的に
も顕微鏡でも検出できなかつた。これら（沈
殿フラクシヨン）のスポツト中では、融合後
（n.F.）５日で既に迅速に生長したコロニー
が認識可能であつた。融合後８日目に、これ
らスポツト中にHAT−培地を加えると、４
日以内にすべての可視のコロニーは死滅し
た。 融合後27日目から、HAT−不含のプレー
ト上で核質体融合物及び細胞質体融合物
は、まず、まばらに成長し、次にこれら殆ど
すべてのスポツト中でコロニーが見え、これ
らは、大きな球状の透明な非粘着性で生長す
る細胞より成つていた。融合後65日目に、
−3B、−1A、−4Aを例外としてすべて
のスポツトにリンパ系細胞の複数のコロニー
が付いていた。以上のことをまとめると、次
のように表示することができる：

【表】 この表から、従来の技術水準による融合時
には、まず急速な細胞成長を認めることがで
きるが、これは、最大15日成長するだけであ
る（HAT−添加後、15日までに死滅）。 これに反して、本発明により製造された融
合細胞は非常にゆつくり成長し（27日からは
じめて明白な成長）、これは更に成長し、な
お65日後にもなお著しい生長が認められる。
従つて、本願発明では、永久に成長する融合
細胞を得ることができた。細胞成長の引続く
検査では、これら細胞は200日もしくは300日
後にもなお成長は低下しなかつた。 融合後65日目に行なつた培養上澄みのマウ
ス−Igの含分に関する検査で、次の第１表に
まとめて示したように、前記のコロニーの付
いていなかつたスポツトを除いてすべての培
養分内のELISAテストで、陽性〜強い陽性
値が得られた：

【表】

【表】 スポツト−培養プレート及びの結果を
示している前記の表中で、各々のマス目は
各々のスポツト（凹み）を表わし、その中の
各数値（ミリ吸光度）は、マウス免疫グロブ
リン存在の尺度を表わす。太い線は、それぞ
れ種々のフラグメント型の５個の融合物の培
養上澄が与えられたスポツトの範囲（例えば
１の所は細胞質体−融合物）を区切つてい
る。ここで１及び２で示されている所には本
発明による融合物（フラグメント＋正常細
胞）が与えられ、３の所には無傷細胞＋正常
細胞の融合物（従来の技術水準）が与えられ
ている。 (a) 核質体とマウス脾臓細胞との融合によ
り、試験管内で増殖可能な免疫グロブリン
−分泌細胞を生じた。悪性成分の細胞質の
小部分のみをこのハイブリツド中に導入し
ても、永久生長のこの特徴を消失すること
はできなかつた。 (b) 核質体を用いて得たハイブリツド細胞
は、マウス−免疫グロブリンをハイブリド
ーマー定量的に合成しかつ分泌させた。従
つて、Ag8.653の細胞質分の欠如は、核質
体−脾臓−ハイブリツドの産生性及び分泌
性に悪影響を及ぼさなかつた。 (c) 細胞質体と脾臓細胞との融合から、同様
に試験管内で増殖し、抗体を分泌する細胞
クローンが明らかになつた。この特別な意
想外の現象に対する満足しうる説明は現在
の所、得られていない。 例 ２ グリセリン−溶解による細胞断片化及びヒト血
液リンパ球との融合 材 料 エールズ・バランスド・ソルト・ソリユーシン
（EBSS）、培地APMI1640、ベーリンガー・マン
ハイムの牛胎児血清（FKS）、セルパ（Serva
Heiderberg）の８−アザグアニン（８−Ag）、デ
イフコ（Difco、Fa.Hedinger KG、Stuttgart）
の寒天（Bacto−Agar 1614）。ヒト・プラズマサ
イトームー系（human plasmacytom−Linie）
HSSULTAN ATCC CRL−1484を、冷凍保存し
た（kryoprａ¨serviertes）細胞材料としてATCC
−処方に従つて融かし、培養液中に入れる。 Prcc.Acad.Sci.USA71 2679〜2683頁（1974
年）に記載の方法により、HSスルターン細胞
（HS Sultan Zellen）８×10⁷個をRPMI1640−完
全培地（８×Ag20μＭ含有）100ml中で48時間培
養した。生残細胞を８−Ag不含のRPMI1640−完
全培地10ml中に入れ、10日間にわたり増殖させ
た。次のこの細胞を軟−寒天−プレート
（COFFINO、P.等によるPro.Natl.Acad.Sci.USA
68 219〜223頁（1971年））（RPMI1640−完全培
地＋８−Ag20μＭから製造した）上に播種（ペ
トリシヤーレ１個当り約500細胞）し、CO₂−イ
ンキユベータ中で温置した。９日後に、単離した
生長性のコロニーを無菌下にこの寒天表面から取
り、RPMI1640＋８−Ag中で増殖させた。約20時
間の２倍の時間で生長した１クローン（HS−
SULTAN−8Ag−R1と称す）を次の実験に使用
した。このHS−R1細胞はHAT−敏感であり、
HAT−培地（RPMI1640−完全培地＋ヒポキサン
チン0.1mlＭ、アミノプテリン400nM、チミジン
31μＭ）１ml当り１〜５×10⁵の密度で培養した
細胞は、増殖せず、７日間以内に完全に死滅し
た。 ヒトリンパ球（未稍血液：PBLから）：静脈血
300mlを、無菌下に、ヘパリン溶液（2U／血液
ml）中に集め、単核細胞（MNC：リンパ球、単
核白血球）のフラクシヨンを標準法で単離した。
MNC3×10⁸をRPMI1640＋10％FKS100ml中に懸
濁させ、単核白血球の分離のために、培養器中、
37℃で５％CO₂雰囲気中で24時間インキユベート
した。 方 法 HS−R1の断片化：細胞をJett、M.等の方法
（Jett、M.等；Isolation and characte−rization
of plasma membrans and intact nuclei from
lymphoid cells.J.Biol.Chem.252、2134〜2142
（1977年）参照）で、グリセリン塗布し、10ｍＭ
トリス−HCl−緩衝液中でインキユベートするこ
とにより溶解させた。核を200ｇ（10分、４℃）
での遠心により膜嚢から分離し、これ自体は5000
ｇ（40分、４℃）での遠心により沈殿された。 融 合： 729HS−R1−核約１×10⁸個をヒト−リンパ球
と共にRPMI1640中に、１：１の割合で懸濁さ
せ、例１、B.2に記載と同様に、PEGを用いて融
合させた。 HS−R1−細胞約１×10⁸個からの膜嚢の沈殿
に、ヒト−リンパ球１×10⁷個の懸濁液を重積さ
せPEGを用いて融合させた。 対照バツチ中にRPMI1640−完全培地（HAT不
含）HS−R1−核約２×10⁷個を入れ、24コスター
スポツト４個中、CO₂−インキユベータ中で培養
液中に入れた。 融合物及び対照−培養液のすべてを、フイーダ
ー細胞としてのマウス−腹腔−マクロフアージ上
で例１の記載と同様に培養した。 培養液上澄み中のヒト−Igの検出：マイクロ滴
定ELISAは例１、B2の記載と同様であつた。 塗布のために、免疫吸着性の精製した羊の抗ヒ
ト−Igを用いた。同じAK−調製物を抗−ヒト−
Ig−POD−接合体の製造のために使用した。羊
−AKはすべてのヒトIg−群と反応し、牛−又は
マウスIgとの交叉反応は示さなかつた。 結 果 グリセリン−トリス−HCl−溶解による断片
化：この処理によりHS−R1−細胞は、核含有フ
ラクシヨン（これは200ｇで沈殿した）と核不含
の細胞質−膜−嚢−フラクシヨン（5000ｇで沈殿
可能であつた）とに分かれた。顕微鏡下では、前
記双方のフラクシヨンのどちらかの中にも、無傷
のHS−R1−細胞は認められなかつた。核は多か
れ少なかれ、不規則に限られた細胞質片で包囲さ
れていた。計測によると、核収率は85％であつ
た。嚢−フラクシヨンは少量のデブリス
（Debris）と共に多量の0.5〜２μの大きさの嚢を
有し、認識可能の核成分を有しなかつた。 RPMI−完全培地（HAT不含）中の核２×10⁷
個の培養では、12週間の観察時間で、HS−R1−
細胞の生長はなかつた。 融合物の培養：核−リンパ球及び細胞質嚢−リ
ンパ球−融合物を96コスタースポツトもしくは24
コスタースポツトの10個の上に分配させ、HAT
−添加物含有する又は含有しない各半分を、マウ
ス−マクロフアージ上でインキユベートした。融
合後第２週目からリンパ系細胞のコロニーが認め
られ、これは連続的に増加した。 ヒト免疫グロブリンの産生：融合後21日目に培
養液上澄み（19日目に完全な培地交替を行なつ
た）をヒト免疫グロブリンの含分に関して検査し
た。結果を第2a及び第2b表に示す。

【表】

【表】

【表】 ０〜99の吸光値を陰性〜凝陽性とし、 100〜200の値を陽性とし、 ＞200の値を強い陽性とすると、 核融合により得られた培養液に対して次の分配
が得られた：

【表】 この表は第2a表の結果を統計的にまとめたもの
である。 この結果から次のことを知ることができる： 溶解フラクシヨンを用いて製造される融合物
は、HAT−選択なしに培養することができる。
この方法はサイトカラシン−Ｂ−押出しによるよ
りも非常に作業経費がかからず、融合可能な材料
を高収率で生じる。核−及び細胞質−膜−フラク
シヨンの明確な分離は、この２つのいずれの方法
でも達成されない。主として核物質を有するフラ
クシヨンも、主として細胞質膜嚢を含有するフラ
クシヨンも、血液からのヒトリンパ球との融合の
後に、試験管内で増殖可能なAK−産生性の細胞
−クローンを生じる。 HAT−添加物を含有する核−リンパ球−ハイ
ブリツドとHAT−添加物を含有しない核リンパ
球−ハイブリツドとの平行バツチは、選択培地の
陰性作用を示している：HATを含有すると、１
次培養液の23％はIg−陰性であり、40％だけが強
陽性であり、HAT不含では、70％以上が強陽性
であり、４％だけがIg−陰性である。 例 ３ 免疫化されたマウスの脾臓細胞と天然の及び断
片化された骨髄腫AG8.653との融合 材 料 ヒトの甲状腺刺激ホルモン（hTSH）及びその
単離されたβ−鎖（β−HTSH）をベーリンガ
ー・マンハイムから入手した。デイフコ
（Difco）の完全又は不完全なフロインドのアジユ
ハンス（CFA、IFA）、フルカ・ウント・FITC
−コバスフエレス・フオン・コバレント・Hech.
Co.（Fluka und FITC−Covaspheres von
Covaleut Tech.Co.、Ann.Arbor.Michigan.
USA）のメトセル（Methocel）1500。 方 法 免疫化：Balb／ｃ−マウスをβhTSH（CFA中
40μｇ、腹膜内）で１次的に免疫化し（１日）、
196日目にhTSH（IFA中50μ、腹膜内）で、266
日目にアジユバンス不含のhHSH（腹膜内）で、
かつ294日目にhTSH（静脈内）で促進させた。
（geboostert）。 免疫化されたマウスの１匹から、最後の促進剤
免疫化の後３日目に、例1B.2の記載と同様に脾臓
細胞（約１×10⁸）を得、各々の半分を２の融合の
ために用いた。 融合１：脾臓細胞５×10⁷個及びAg8.653−細
胞１×10⁷個を例1B.2の記載と同様に混合し、融
合させ、かつ24コスタースポツトの48個中でマウ
ス−マクロフアージと共にHAT−含有のDMEM
−完全培地中で培養した。 融合２：Ag8.653−細胞１×10⁷個を例２の記
載と同様に、グリセリンと10ｍＭトリス−HCl−
緩衝液での段階的処置により溶解させた。細胞質
−膜嚢−（CMV−）フラクシヨンをペレツト化し
た（5000ｇ、40分、４℃）。核融合物を脾臓細胞
７×10⁷個と混合し、遠心によりCMV−沈殿物上
に積層し、PEGを用い標準法で、例１、B.2に記
載と同様にして融合させた。この融合物を
DMEM−完全培地Ｋで、マクロフアージを有す
る24コースタースポツトの24個に分配し、かつ
HAT−添加物なしで培養した。 ハイブリツド細胞の抗原特異的標織化及びクロ
ーン化：（FITC−）コバスフエレンスを製造業
者に一般的な処方に従つて、hTSHで共有的に塗
布し（TSH−CS）、５％ナトリウムアジド溶液中
で貯蔵した。PARK、D.R.等によるProc.Natl.
Acad.Sci.USA76、1982〜1966（1979年）に記載
の方法で、細胞を塗布されたコバスフエレスによ
り標織付けし、サイトフルオログラフ
（Cytofluorograph）を用いて、大きな螢光陽性細
胞を、個々にスポツト中及び96コースタープレー
ト中で貯蔵熟成させた。このスポツトは24時間前
に、DMEM−完全培地中のマウス−マクロフア
ージで塗布した。 TSH−特異抗体用のELISA：塗布、培養液上
澄みのインキユベーシヨン、基質−反応及び読み
取りは、例１、B.2と同様に行なう。抗マウス−
Ig−PODの代りに、TSH−POD−接合体を用い
た。陽性対照として、hTSH−過免疫化されたマ
ウスの血清を10^-3稀釈して使用し、陰性対照とし
て、非類縁抗原に対して抗体（マウス−抗ジゴキ
シン）を形成するクローンを用いた。 結 果 融合１（無傷のAg8.653−細胞と）からの培養
液中にも、融合２（Ag8.653−溶解−フラグメン
トと）からの培養液中にも、14日目に、すべての
スポツト中に大きなリンパ系細胞のコロニーが認
められた。培養上澄みを用いて14日目に実施した
TSH−特異抗体検出用のELISAは、第３表にま
とめた値を示した：すべての培養分で抗−TSH
が検出された。

【表】 15日目に非粘着性細胞を融合１及び２の個々の
スポツトから洗出させ、別個のバツチ中でTSH
−抗原−特異的に標織し（基本：ハイブリドーマ
は、一般にＢ−リンパ球と同様に、これにより合
成された抗体の１部を細胞膜中に係留担持し、外
向きの抗原−結合位置を有する）、この細胞ソル
ター（zellsorters）を用いてクローン化した。 例 ４ ヒトPBLと無傷の、かつ断片化されたAg3.653
−細胞との融合 材 料 不活性ヘパチチス−Ｂ−表面−抗原（HBsi；
Biotest）を血清蛋白質の免疫吸着により精製し
た。ヒトHB_s−抗体検出用ELISA：マイクロ滴定
プレートに精製HB_si（20μｇ／0.9％NaCl溶液
ml）を途布した。培養上澄みのインキユベーシヨ
ン、接合体−及び基質−反応及び読み取りは例
１、B.2の記載と同様である。抗−マウス−Ig−
PODの代りに、（羊−）抗−ヒト−Ig−PODを用
いた。 実 施 高い抗HB_s−価を有する供血者（Spender）の
HPBLを静脈血液200mlから、フイコル勾配−遠
心により単離した。Ｂ−リンパ球の増加のために
Ｔ−細胞を羊赤血球（標準法で）でロゼツト形成
させ、第２のフイコル勾配−遠心を用いて分離し
たロゼツト形成しない細胞（HPBL(B)）のフラク
シヨンを、RPMI1640＋10％オートローグプラズ
マ（autologen Plasma）中の細胞５×10⁷個の密
度で（30分／56℃−加熱不活化）、HB_si約10μｇ
と共にCO₂−インキユベーター中で培養した（培
地交換は12時間毎）。 融合１：前処理したHPBL(B)１×10⁷個を
Ag8.653 １×10⁷個と混合し、例１、B.2の記載と
同様に、PEGを用いて融合させた。この融合物
をRPMT1640＋10％ヒトプラズマ＋HAT中、24
コースタースポツトの４個中で培養した。 融合２：Ag8.653−細胞1.1×10⁸個をグリセリ
ン−溶解を用いて断片化した。A8.653−核１×
10⁷個とHPBL(B)１×10⁷個を混合し、膜−細胞質
−嚢の沈殿（Ag8.653細胞１×10⁸個より）上に
積層させた。PEGを用いる融合の後に、この融
合物を24コスタースポツトの４個中、RPMI1640
＋10％ヒトプラズマ（HAT−添加物不含）中で
インキユベートした。 結 果 融合１及び２のすべてのスポツト中で、３日目
から、非常に大きな粘着性細胞の著るしい生長が
始まつた。５日目に非粘着性細胞の主要量を注意
深く懸濁させ、１スポツト中の培養分を３分し、
その１つを元のスポツト中に残し、他の２つを24
コスタースポツトの新しい２スポツト上に分配さ
せた（例えばA1からB1及びC1に分配し、同様に
A2、A3及びA4も各々B2、C2、………B₃、C₃、
B₄、C₄に分配する）。 28日目に融合１では、A₂及びA₃中に小さなコ
ロニーが認められ、その他のスポツト中には粘着
性細胞のみが認められ、融合２では、C₃を除く
すべてのスポツト中で複数のコロニーの多量の生
長が認められた。35日目の培養上澄みを用いて実
施した、肝炎−Ｂ−抗原に対する特異性を有する
ヒト免疫グロブリンの検出用ELISAは、第４表
にまとめた結果を示した： 融合１（無傷のAg8.653−細胞、HAT−培地中
で培養）で、陽性の培養液は得られず、これに反
して、融合２（Ag8.653−フラグメント、通常培
地中で培養）の12培養物の５個で明瞭な抗HB_s−
陽性であつた。

【表】 例 ５ HPBLとヒトプラズマ細胞−系HS SULTANか
らのフラグメントとの融合 材 料 HS SULTANをATCCコードCRL−1484とし
て、冷凍保存された細胞物質から入手し、ATCC
−処方により氷解させ、培養液中に入れた。 実 施 HPBLを、例４に記載と同じスペンダーから同
様に後処理し、試験管中、HBsiで促進させた。 融合：HS SULTAN−細胞４×10⁷個をグリセ
リン−溶解を用いて断片化した。膜−細胞質−嚢
−フラクシヨンを5500ｇ（40分）で沈澱させ、
HS−SULTAN−核約４×10⁷個とHPBL(B)４×
10⁷個と混合物をこの上に積層した。PEG−融合
は例４の方法で行なつた。この融合物を24コスタ
ースポツト12個の上で、RPMI1640＋20％FKS＋
ピルベート＋インシユリン（Novo2U／ml）＋10
％非必須アミノ酸（BM）＋HAT−添加物不含の
１％メトセル1500中に播種した。 結 果 融合14目：大きな非粘着性リンパ系細胞コロニ
ーの生長。 例 ６ ヒトＴ−リンパ球の不滅化 6.1 材料及び方法 Ｔ−リンパ球を標準法で（羊赤血球を用い
るロゼツト化、フイコル勾配遠心）、リンパ
球全フラクシヨンから単離し、直ちに又は３
日培養の後に処理した。エールリツヒ腹水細
胞（ATCC；COL77）を10％ウマ血清含有
DMEM中で培養し、形質転換されたフラグ
メントのスペンダーとして用いた。この
EAZの断片化は、ジエツト（Jett）等による
方法（J.Biol.chem.252、2134〜2142頁
（1977年））で、グリセリン溶解を用いて実施
した。主として核物質を有するフラクシヨン
を遠心分離して捨てた。ミトコンドリアの多
い細胞質膜嚢フラクシヨン（CMV）を形質
転換のために使用した。Ｔ−リンパ球５×
10⁷個に過剰のPHA−レクチン（Difco）を施
与し、FAZからのCMV−フラクシヨンと混
合し、室温で20分インキユベートした。混合
物を遠心により沈澱させ、液体上澄みを完全
に除去し50％PEG−溶液１mlで代えた。１
分間の作用時間の後に、PEG−溶液をRPMI
−1640の培地の添加により稀釈し、遠心によ
り細胞を分離した。細胞を牛胎児血清
（FKS、BM）20％を含有するRPMI−培地中
に入れ、１ml−培養スポツト12個に分配さ
せ、37℃で５％CO₂雰囲気中で培養した。表
面特性に基づく細胞の同定は、羊赤血球(E)−
ロゼツト化（KAPLAN、M.E.等によるJ.
Immunol.Methods５、131頁（1974年））を
用い、かつ双方をＴ−細胞特異性抗体OKT
−３（Ortho；REINERZ、E.L.等によるJ.
Immunol.123、1312頁（1979年））もしくは
MAK ４−11（RIEBER、P.等による
Hybridoma１ 59頁（1881年））及び蛍光標
識抗−ヒト−免疫グロブリン（Ig.；Fa.
Dako社）の使用下における免疫蛍光を用い
る、Ｂ−細胞−典型膜−Igの検出のための標
準的方法により行なつた。 6.2 結果 最初の14日以内に、培養液中の細胞のほと
んどは死滅した。21日目から、細胞デブリス
中に小〜中程度の細胞のコロニーが認めら
れ、これは連続的に増殖した。すべてのスポ
ツト12個中でコロニーの生長が見出され、１
スポツト当り50個までのコロニーが見出され
た。30日目にこのコロニーを大きな培養容器
中に移し、更に増殖させた。細胞をその表面
マーカー（Marker）に基づき分析し、次の
結果を得た (a) Ｅ−ロゼツト−陽性 ＞95％ (b) OKT−３−陽性 ＞90％ (c) ４−11−陽性 ＞90％ (d) Igs−陽性 ＜５％ 6.3 評価 EAZ（永久マウス細胞系）からグリセリ
ン溶解により得ることのできるフラグメント
は、単離されたＴ−リンパ球とのPEG−融
合の後に、永久的に培養液中で生長する細胞
を生じ、これは表面特徴に基づき、明白にＴ
−リンパ球として同定可能である。 従つて、例６は、本発明の方法で細胞フラ
グメント（エールリツヒ腹水細胞）とヒト−
Ｔ−リンパ球との融合により、永久成長可能
なＴ−リンパ球の特性を有する融合物が得ら
れることを示している。 例 ７ ヒトの内皮細胞の不滅化 7.1 材料及び方法 すべての培養容器に細胞の播種の前にゼラ
チンを層状に装入した。この培地は、RPMI
−1640と20％FKS含有培地199（BM）との
１：１−混合物より成つた。ヒト内皮細胞を
ジヤツフエ（Jaffe）等による方法（J.Clin.
Invest.52、2745〜2756頁（1973年））で、コ
ラーゲナーゼー溶液（Gibco）を用いて、新
しい臍帯の静脈から得、形質転換の前に１次
培養液の添付により約14日間にわたり増殖さ
せた。形質転換のために、粘着性で生長する
内皮細胞をトリプシン−EDTA−溶液
（BM）を用いて溶解させ、6.1に記載と同様
に懸濁液中で、EAZからのCMV−フラクシ
ヨンと融合させた。このように処理した細胞
を75ml−培養容器１個当り５×10⁵個の細胞
密度で播種し、CO₂−インキユベーター中で
培養した。対照のために、それぞれ、CMV
−フラクシヨン不含の１次培養液からの内皮
細胞の小部分をPEG−溶液で処理し（偽融
合）、再培養した。細胞が、培養容器の底部
上で裂目のない細胞叢を形成したら直ちに、
これらをトリプシン−EDTA溶液を用いて溶
解させ、１：３の割合で、新しい培養容器に
移した（通過）。 7.2 結果 CMV−フラクシヨンと融合した内皮細胞
は、播種の後に20％〜30％の効率で付着し、
２〜３日以内に生長して集合細胞叢になつ
た。偽融合した細胞は、ほぼ同じ効率で付着
するがまつたく増殖せず（集合細胞叢を形成
せず）、約21日以内に完全に死滅した。未処
理の内皮細胞はすべて、第３通過で最大まで
増殖し、次に、生長を調節し培養容器の底か
ら団塊崩壊下に溶解し、分解した。異なる計
18臍帯からの内皮細胞を含有する８種の異な
るバツチ中で、CMV−処理した細胞は、問
題なく、10通過にわたり生長した。形質転換
された内皮細胞は、生存能及び分裂能を失な
うことなしに、液体窒素中で貯蔵できた。 7.3 評価 ヒト−臍内皮細胞は形質転換処理をせずに
は、本発明により第３通過にわたり培養でき
なかつたので、文献に記載の知識（例えば
Grimbrone.M.A.Progress in Haemostasis
and Thrombosis.3巻；Maciag.T.等によるJ.
Cell Biol.91、420〜426頁（1981年））は、確
認された。エールリツヒ腹水細胞からのミト
コンドリアの多いCMV−フラクシヨンとの
融合により、内皮細胞の培養特性は、これら
が限界の第３通過を越えて増殖可能であるよ
うに変化した（かつ第23通過時にも、疲労現
象を（Ermｕ¨ndungserscheinungen）示さな
かつた） 従つて、例７は、エールリツヒ腹水細胞か
らのフラグメントとヒト内皮細胞との融合に
より、ヒト内皮細胞の特性を有する永久成長
可能な融合生成粉が得られることを示してい
る。 例 ８ ヒト骨髄腫細胞の不滅化 8.1 材料及び方法 骨髄細胞含有組織を、股リンパ球転移部の
外科的切除により得、無菌条件下で小立方体
に切断し、融合するまで、液体窒素中に貯蔵
した。EAZからのCMV−フラクシヨンを6.1
に記載と同様にして製造した。 融合の前に、この骨髄腫細胞含有物質を解
凍させ、トリプシン−処理により単離細胞懸
濁液を製造した。大きな褐赤色骨髄腫細胞
を、フイコル−勾配遠心により付着リンパ球
を除き、6.1の記載と同様に、CMV−フラク
シヨンPEG−作用下に融合させた（骨髄腫
約４×10⁵とEAZ約１×10⁶からのCMV）。融
合調節のために、CMVなしにPEGで処理し
た骨髄腫細胞４×10⁵個を用いた。細胞を融
合の後に、スポツト１個当り細胞１×10⁵個
の密度でRPMI1640＋20％FKS中に播種し、
37℃で５％CO₂−雰囲気中で培養した。 8.2 結果 CMVと融合した骨髄腫の培養分４個すべ
てで、28日目から、典型的な色を有する細胞
のコロニーが半粘着性細胞塊の形で生長し、
これは連続的に増大した。偽融合した細胞の
対象−培養では、細胞増殖は起こらず、むし
ろ、８日目から、顆粒化が増化し、22日目に
は細胞破片のみが培養液中に存在した。 8.3 評価 冷凍保存した転移組織からのヒトの骨髄腫
細胞は、CMV−融合により試験管内で培養
−及び増殖可能な細胞に変えることができ
た。これに反して、同じ起源の偽融合した骨
髄腫細胞は、その他は同じ培養条件下で死滅
した。 例８は、エールリツヒ腹水細胞からのフラ
グメントとヒト骨髄腫細胞との融合により、
骨髄腫細胞の特性を有する永久成長融合生成
物が得られることを示している。 例 ９ 不滅化されたヒト内皮細胞中への真核性DNA
−ベクターの導入 9.1 ヒルト上澄（Hirt−Ｕ¨berstanden）の蘇生
（サウザン・ブロテイングSouthern
blotting）による細胞内の形質転換された物
質の検出。 9.1.1 材料 プラスミドＺ−PBR322／RchrβＧ−△
425B（Dierkes、P.等によるProc.Natl.
Acad.Sci.USA78、1411〜1415頁（1981
年））は、2.070塩基対（BP）ウサギ−β
−グロブリン−遺伝子フラグメント１個を
有する。 pBR322のCla−Pvu Ｉ−フラグメント
を、3.039BpHpa Ｉ−BamHI−フラグメ
ント〔これはSV40の先の遺伝子の全域及
び後の遺伝子の当初域を有する（Tooze、
J.（1980）の“DNA Tumor Vuoruses.”
J.Tooze.等による、第２版Cold Spring
Harbor Laboratory und B.Wieringa等に
よるCetus−UCLA Symposium on gene
regulation 1982）〕で換えた。このプラス
ミドを以後pBR322RβＧ SV40と称す
る。 9.1.2 方法 ヒト内皮細胞を、例７の記載と同様に不
滅化しかつ生長させた。細胞10⁶個当り、
pBR322RβＧ SV40 ６μｇ及び超音波
処理された犢胸腺４μｇを、燐酸カルシウ
ム沈澱法〔Graham.F.L.等によるVifology
52、456〜467頁（1973年）及びWigler.M.
等によるCell.14、725〜731頁（1978年）
参照〕の使用下にDNAトランスフエクシ
ヨンした。このトランスフエクシヨンの10
時間及び40時間後にヒルト上澄み（Hirt
Ｕ¨berstande）を作つた。（Hirt.B.J.Mol.
Biol.26、365〜369頁（1967年）参照）。 このヒルト上澄みを１％アガロースゲル
上で分離し、サウザン法〔Southern.E.M.
J.Mol.Biol.98 503〜517頁（1975年）参
照）でニトロセルロース紙上に移した。プ
ラスミドpBR322RβＧ SV40を32pでリ
グビイ（Rigby）等のニツク−トランスレ
ーシヨン法〔Rigby、P.W.等のJ.Mol.Biol.
113、237〜251頁（1977年）参照〕で標識
し、伝達性DNAとニトロセルロースフイ
ルター上でハイブリダイゼーシヨンさせた
〔Maniatis、T.等によるMolecular
Cloning、Cold Spring Harbor
Laboratory（1982年）参照〕。このフイル
ターをレントゲンフイルム上で−70℃で露
光させた。 9.1.3 結果 プラスミドpBR322RβＧ SV40でトラ
ンスフエクシヨンされたヒト内皮細胞は、
そのアガロースゲル上で運動性に関して真
性プラスミドに相応する強いハイブリダイ
ゼーシヨン信号を示す。このトランスフエ
クシヨン40時間後の細胞のヒルト上澄みの
信号と、トランスフエクシヨン10時間後の
細胞の信号とを比較すると、ハイブリダイ
ゼーシヨン信号の強さは４〜５倍増加し
た。 導入されたプラスミドよりも小さい
DNA−種のハイブリダイゼーシヨンが同
様に観察された。 トランスフエクシヨンされずに不滅化さ
れたヒト内皮細胞中ではこの信号は測定不
能であつた。 HeLa−細胞をプラスミドpBR322RβＧ
SV40でトランスフエクシヨンすると、
ハイブリダイゼーシヨン信号の一様の強度
分配が認められた。 9.1.4 評価 プラスミドpBR322RβＧ SV40でトラ
ンスフエクシヨンされたヒトの不滅化上皮
細胞のヒルト−上澄み中で、DMB−ハイ
ブリダイゼーシヨンを ³²p−標識されて挿
入されたプラスミドで測定されるが、トラ
ンスフエクシヨンされていない細胞では測
定されない事実は、真核性細胞系中にベク
ターが導入されたことを立証している。ト
ランスフエクシヨンされた細胞でのハイブ
リダイゼーシヨン信号はトランスフエクシ
ヨンの40時間後に、トランスフエクシヨン
の10時間後のそれよりも４〜５倍の強さを
有することの観察は、トランスフエクシヨ
ンされたプラスミドが細胞内で複製された
ことを推測させる。 9.2 プラスミドpBR322RβＧ SV40でトランス
フエクシヨンされた不滅化されたヒト内皮細
胞中へのサウギ−β−グロブリン特異性転写
の立証。 9.2.1 材料 ヌクレアーゼSi.T₄ポリヌクレオチドキ
ナーゼ及び犢腸ホスフアターゼとして、ベ
ーリンガー・マンハイム（Ｂｏ¨hringer
Mannheim）社の市販製品を用いた。 9.2.2 方法 不滅化されたヒト上皮細胞を例9.1.2の
記載と同様に増殖させ、ウサギ−β−グロ
ブリン−遺伝子含有ベクターでトランスフ
エクシヨンした。このトランスフエクシヨ
ンの48時間後に細胞２×10⁶個を溶解さ
せ、RNAをLiCl−尿素−法（Affray.C.等
によるEur.J.Biochem.107、303〜314頁
（1980年）参照）で抽出した。 ウサギーβ−グロブリン特異性ハイブリ
ダイゼーシヨンゾンデの製造。 プラスミドpBR322RβＧ SV40をHae
を用いて崩壊させ、＋135から−75まで拡
がつたフラグメント〔Dierks.P.等による
Proc.Natl.Acad.Sci.USA78、1411〜1415
頁（1981年）及びVan Oyen.A.等による
Science206、337〜344頁参照〕を２％アガ
ロースゲル上で単離し、DEAE−セルロー
ス−クロマトグラフイにより更に精製した
〔Mu¨ller、W.等によるJ.Mol.Biol.124、343
〜358頁（1978年）参照〕。このフラグメン
トを、犢腸ホスフアターゼを用いて、かつ
³²P−デホスホル化し、γ− ³²P−ATP及
びT₄ポリヌクレオチドキナーゼで、文献
（Mantei.N.等によるGene10、１−８頁
（1980年））の記載と同様にして標識した。 ヌクレアーゼS₁記入 キナーゼで処理したフラグメントを、
Ｅ・コリ−ｔ−RNA（Ｂｏ¨hringer
Mannheim）10μｇと共にエタノールを通
して沈殿させ、NaCl0.4M／、EDTA1ｍ
Ａ／、パイプス（Pipes）−緩衝液（PH
6.4）40ｍＭ／及びホルムアミド80％よ
りなるもの100μ中に溶かした
（Mantei、N.等によるNature281、40〜46
頁（1979年）参照）。細胞RNA（＝25μ
ｇ）を真空乾燥させ、緩衝液中の前記のよ
うに溶かしたゾンデ（0.1pMol、
30000cpm）10μ中で変性させ、ガラス
毛細管中に封入し、48℃で16時間ハイブリ
ダイゼーシヨンさせた。対照実験では、こ
のゾンデをウサギ−β−グロブリンｍ−
RNA（Miles）とハイブリダイゼーシヨン
させた。試料はNaCl0.2M／、酢酸ナト
リウム緩衝液（PH4.5）50ｍＭ／、
ZnSO₄1ｍＭ／及びグリセリン0.5％より
なるもの100μで稀釈し、ヌクレアーゼ
S₁500単位と共に30℃で60分間インキユベ
ートした（Weaver、R.等によるNucl.
Acid.Res.７、1175〜1193（1979年）参
照〕 試料をフエノールで処理し、Ｅ・コリ−
ｔ−RNA10μｇと共にエタノールにより
沈殿させ、80％エタノールで（−70℃で20
分）洗浄し、真空乾燥させ、染料溶液（ブ
ロムフエノールブルー0.05％、キシロキサ
ノール0.05％、EDTA1ｍＭ／、ホルム
アミド90v／ｖ％）５μ中に溶かし、沸
騰水浴中で２分間加熱し、５％ポリアクリ
ルアミドゲル上の電気泳動にかけた（トリ
ス塩基89ｍＭ／、ホウ酸89ｍＭ／、
EDTA1ｍＭ／及び尿素7M／）。この
ゲルをフジ社（Firma Fuji）のレントゲ
ンフイルム及び補強スクリーンを用いて、
−70℃でオートラジオグラフ法にかけた。 9.2.3 結果 保護されたフラグメントの大きさは、寸
法マーカー（Groβenmarkern、 ³²P−標
識されたpBR322×Hinf1及びpBR322×
Hae）との比較により評価した。トラン
スフエクシヨンされていない細胞は、まつ
たくグロビン特異性ハイブリダイゼーシヨ
ン信号（再生されたハイブリダイゼーシヨ
ンゾンデ＝210Bpは例外）を示さなかつ
た。トランスフエクシヨンされ、不滅化さ
れたヒト上皮細胞から、大きさが80〜
90Bpで測定されたRNA保護された２個の
フラグメントを抽出した。この種の転写物
は、グロスフエルド（Grosveld）等によ
るネイチユア（Nature）295、120〜126頁
（1982年）及びワイルド（Weidle）U.等に
よるネイチユア（Nature）（1981年）によ
つても発見されており、内部の潜在的分割
位置の存在がウサギ−β−グロブリン−遺
伝子上に記載されている。ウサギ−β−グ
ロブリン遺伝子のキヤプ位置から得た転写
は確認できなかつた。比較実験でHeLa−
細胞をプラスミドpBR322R GS V40でト
ランスフエクシヨンした。正しく開始され
た転写物（135Bp保護）並びに内部の潜在
的分割位置の存在に基因する転写物
（Grosveld、G.等によるNature295、120〜
126頁（1982）及びWeidle、U.等による
Nature（1983年）参照）を、S₁−記入に
より測定した。 9.2.4 評価 ウサギ−β−グロブリン特異性転写物が
ウサギ−β−グロビン遺伝子を有する
SV40起源真核性ベクターを用いてトラン
スフエクシヨンさせた不滅化されたヒト上
皮細胞中で確認可能である事実は、この細
胞系が、再導入されたクローン化された遺
伝子の発現のための宿主系として好適であ
ることを示している。 例９は永久化された細胞が、挿入された
遺伝子（プラスミド）の宿主組織として好
適であり、挿入された遺伝子は転写され、
表出されることを示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 正常の動物及びヒトの細胞を試験管内での培
   養可能性にする生物学的成分と融合することによ
   り永久培養可能な動物及びヒトの細胞系を得る場
   合に、正常の動物及びヒトの細胞と、形質転換さ
   れた細胞の単独では増殖能力のない細胞フラグメ
   ントとを融合させ、選択物質不含の培地中で培養
   することを特徴とする、永久培養可能な動物及び
   ヒトの細胞系を得る方法。 ２ ポリエチレングリコール又はセンダイ−ウイ
   ルスの存在で融合を行なわせる、特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ３ サイトカラシンＢを用いる処理により得られ
   た形質転換された細胞の核質体又は細胞質体を用
   いる、特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の
   方法。 ４ 形質転換された細胞の溶解又は機械的崩壊に
   より得られた細胞フラグメント殊に核フラクシヨ
   ン又は細胞質フラクシヨンを用いる、特許請求の
   範囲第１項又は第２項記載の方法。 ５ 融合のために、ミトコンドリア含分の多い細
   胞質フラクシヨンを使用する、特許請求の範囲第
   １項又は第２項記載の方法。 ６ 形質転換された細胞として、骨髄腫細胞、エ
   プスタイン−バール−ウイルス接種した細胞又は
   腹水腫瘍細胞を使用する、特許請求の範囲第１項
   から第５項までのいずれか１項に記載の方法。