JPS58201988A - 永久培養可能な動物及びヒトの細胞系を得る方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は永久培養可能な動物及びヒトの細胞系管製造す
る方法及びこうして得た細胞系を細胞産生物の取得のた
めに使用することに関する。

従来から、科学的及び実際的理由から、正常な動物又は
ヒトの組織どは無関係に、ヒト及び動物の細胞を永久的
に培養する努力がなされている。このことは、従来は、
満足のいくように成功しておらず、僅かな特別な場合に
のみ、特定の血液細胞において永久培養可能性が達成で
きただけである。

所定の抗原−結合特異性を有するモノクローン性抗体を
製造するためには、いわゆるハイブリドーマ法（Ｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａ−１ｅｃｈｎｉｋ　）　ｆ使用する１こと
は公知である。このケーラー（Ｋｉｉｈｌｅｒ）及びミ
ルスタイン（Ｍｉｌａｔｅｌｎ）により開発された方法
（Ｃｏｎｔｌｎｕｏｕｓ　ｃｕｌｔｕｒｅｏｆ　Ｆｕｓ
ｅｄ　ｃｅｌｌｓｍｒｃｒｅ＋ｉｎｇ　ａｎｔｉｈｏｄ
ｙ　ｏｆ　ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ　５ｐｅｅｉｆｉｃｉ
　−１ｙ　　、　　Ｎａｔｕｒｅ　　２　５　６．　　
４　９　５　〜４　９　７　　頁。

１９７５年、参照）を用いると１個々の抗体（ｋＫ）形
成性の細胞を潜在的「不死」にし、任意に増′殖させる
ことができる。

ＡＫ−章生性細胞（Ｂ　−１７ンパ球）と悪性変性した
細＠（骨髄腫）との融合により、双方の片親の特性（抗
体を産生ずる能力及び永久的生長する能力）を共に有し
ている細胞ハイブリッドを得心ことができる。この新用
語「ハイブリドーマ」とは、ハイブリッド細胞（五旦回
−１ｐＨ＋＝）と骨髄腫（Ｍｙｅｌｏｍａ）との融合を
意味する造語である。

この方法の特殊性を理解し易くするために。

抗体（免疫グロブリン＊Ｉｇ）の構造及び合成のいくつ
かの基本を示す。Ｉｇ−分子は２本の同定容易（Ｌ）な
鎖及び２本の同定困難ＣＨ）な鎖から成っている。各々
のＨ−及びＬ−鎖は遺伝的及び機能的に異なる断片に分
けられている。抗体のＩｆ原結合部位（ｃｏｍｈｉｎｌ
ｎｇ　５ｉｔｅｓ）は、高度の配列−異種性（５ｅｒ１
ｕｅｎｔ−Ｈｅｔ　ｅｒｏｇｅｎ　ｉ　ｔｏｓｉ　ｔ　
）　Ｙｒ有する。いわゆる可変＄　（ｖａｒｉａｂｌｅ
　ｒｅｇｉｏｎ）内に形成されているう多様なアミノ酸
交換によシ、その形において、多数の抗原に対して複雑
である三次元的構造の大きなレパートリ−が得られる。

咄乳動物は１０６〜１０７個の稽々の抗原−結合部位を
形成できることは認められている。

産生 抗体は、７３１７７Ａ球の合成奉寺物である。

幹細胞からのＢ−細胞の個体発生の間に、Ｌ−鎖に関し
てもＨ−鎖に関しても、多く入手可能なｒＥｆ変部置部
遺伝子１比較的少ない固定部遺伝子の１つとが組合わさ
れる。遺伝子会合が行なわれると直ちに、当該Ｂ−細胞
はその上に固定され、ｌ伊の特有の型の抗体分子を形成
し、この固定は、その娘細胞にそれを遺伝する。抗原刺
激なしに、このＢ−細胞は貫生ずることなしに硬化し、
静止状態になる。これは僅かな免疫グロブリンのみを生
成し、かつ分泌するが、その細胞膜内で堅固に固着した
抗体を有し、これは旧確に１分泌された抗体と同様な抗
原−結合部位を有する。抗原が組織内に入ると、これは
一連の複雑な細胞作用でＢ−細胞を刺激する。

その膜−免疫グロビリンが抗原と特異的に反応するＢ−
細胞は、分裂し１分化して、抗体産生細胞（プラスマ細
胞）になろ娘細胞のクローンを形成する。Ｂ−細胞クロ
ーンは同じ構造及び同じ抗原結合部位を有する抗体を形
成するので、この種のクローンの産生物をモノクローン
性抗体（ｍｏｎｏｋｌｏｎａｒ　Ａｎｔ　ｉｋＭｒｐｅ
ｒ　）ど称する。複雑に構成され友抗原例えば蛋白質、
微生物又は細胞は、多くの種々の抗体作用部位〔デテル
ミナント（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）　、エビトーゾ（
Ｅｐｉｔｏｐｅ））を有し、整合的に多くの種々のＢ−
細胞を刺激し１分裂し、クローンを形成する。従って、
その大きさ、電荷、特異性及び親和性に間して具な勺、
免疫血清中に連合して現われる多数の抗体が形成される
。特定のデテルミナントに対して向けられた免疫応答も
通例多クローン性である。マウスは、１個の単純ハプテ
ン即ち単離されたデテルミナントに対して１０３個まで
の種々の抗体を形成することができることば公知である
。この事実は、不可能でないにしても、再現可能な方法
で特定の抗原に対する抗血清を得ることが極めて困難で
あることを説明している。

従って、数年来、その方法で均一なモノクローン性抗体
を得る几めの、与えられ次側々のＢ−細胞をクローン的
に拡大させる１つの方法が試みられ念。天然の前駆体は
、悪性疾患として従来からマウス、ラッテ及びヒトに公
知であった骨髄腫もしくは形質細胞腫で遣る。■３−細
胞が悪性に変性し、無制限に増殖すると骨髄腫が生じ、
この際娘細胞のクローンは多量の均一な抗体を産生ずる
。特定の内部交配−マウス種において、骨髄腫は化学的
操作により誘起されうる。

しかしながら、過免疫化及び骨髄１１ｎ起の組合せによ
シ、公知の抗原結合時真性を有するモノクローン性抗体
を生じさせるすべての実験は成・功していない。絶えず
、試験管内で培養可能であり、ハイブリドーマ法の基本
どなっている骨髄種細胞系を得るこの努力ｉなされてい
た。ミルスタイン（ｍ１ｌｓｔｅｌｎ）及びケーラー（
Ｋ’ｏ　ｈ　ｌ　ｅ　ｒ　）による基本思想は、免疫化
された動物からの正常のＢ−細胞に培養可能で永久生長
する骨髄腫を融合することによりハイブリッド細胞を得
る球で免疫化きれ次マウスの膵臓からのリンパ球と融合
させ九。彼等は１０個の生存性ノ１イブリツｙｆ得、そ
れから、羊−赤血球に対する特異性を有する２個の抗体
を生じた。この抗体−再生性ハイブリッドは、それが連
続的に培養液中で生長し、それを同種のマウスに移植す
ると呻傷を形成する点で、骨髄１１・有と類似している
。更にこのハイブリッド細胞が骨髄腫と同様に、液体窒
業中で貯蔵され、長時間にわたり生存可能に保存できる
ことは、実際上啄めて重要であった。

ハイブリドーマ−製造の技術 マウス管、抗原を用いる慣用の抗血清製造法により免疫
化し、通例、数週間の中断して繰り返す。融合の直前に
マウスを殺し、その膵臓を無菌条件下に切除する。膵臓
嚢を切り暇り、牌髄を注意深く押し出す。牌臓リン・に
球（約１（）８細胞）を、細胞培養媒体内に懸濁させ、
骨髄腫細胞とｌ：１・〜１０：１の割合で混合する。こ
の細胞混合物を遠心により、試験管内の培地上に気密に
詰め、液状の上澄みの除去の後に融合培地〔３０〜５０
チのポリエチレン−グリコール−溶液又は懸濁され、不
活性化されたセンダイーウィルｘ　（５ｅｎｄａｉ−Ｖ
ｉｒｕｓ）　）で処理する。

軸合培地の洗出の後に、１−当り約１（）６細胞の細胞
密度を有する細胞混合物を無菌の培養容器（点滴板ンに
移し、００２−吹き込んだインキヱイーター（Ｉｎｋｕ
ｂａｔｏｒ）中で培養する。融合の２〜４週後に、ハイ
ブリドーマクロー／の生長が顕微使でＩｍ！！あられる
。この時点から、培弗液上澄みは、所望の特異性を有す
る抗体の存在に関して検査できる。このために、″ｆイ
クログラム以下の領域で、抗体を立証できる分析法（Ｒ
ＩＡ。

ＥＬＩ８Ａ、免疫螢光）が必嘴である。次いで、陽性の
部分培養液からの細胞をクローン化し、即ち単細胞培Ｉ
Ｉを刺激する。単離されたクローン（こねは真性抗体を
形成する）ｔ−拡げ、腫瘍誘起のために、ブリスタン（
Ｐｒ１ｓｔａｎ）−前処理された同種マウスの腹腔内に
注射する。この接種の後６〜２０日に、この腫瘍の開始
時に、血液又は有利に腹腔（腹水）から均一な抗体を得
ることができる（マウス１匹当り、モノクローン性抗体
５０〜１５０ｑの収量）。

融合の後に、ハイブリッドと融合されなかった細胞との
非常に不均質な混合物が存在する。

マウス−肺臓細胞ｌＯ８個の使用時に、ｅ大１（）３−
の生存可能なハイブリドーマ−細胞を算出で、きる。こ
のハイブリッド細胞はそれが増殖する前に一定の伸動時
間を必要とするので（但し。

融合しなかった骨髄腫は直ちに生長する）１選−択竺は
、少ないハイブリドーマの生残を確保すべきである。ハ
イブリドーマ法における標準選択法は、いわゆるＨＡＴ
−選択培地〔セ…１ｅｆｉｅ−１ｄ　、　Ｊ、　Ｗ：　
５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙｂｒｉｄｓ　ｆｒｏｍ
　ｒｒｖｔｉｎｇｓｏｆ　　ｆｉｈｒｏｂｌａｓｔｓ　
　ｉｎ　　ｖ目ｒｏ　　ａｎｄ　　ｔｈｅムｒｐｒｅｓ
ｕｍ−ｅｄ　　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｌ、８ｃｉｅｎｅ
ｅ　１　４　５．７０９〜７１０頁（１９６４年）参照
〕を基本とする。人は、アミノブチリ；／　（Ａｍｉｎ
ｏｐｔｅｒｌｎ）、　Ｄ　Ｎ　８−合成の主要経路をブ
ロックする葉醗−拮抗因を意味する。正常細胞は、これ
らに、培地中でチミジン（Ｔ）及びヒポキサンチ／（Ｈ
）が供給されるかぎり、チミジン−キナーゼ（ＴＫ）及
びヒポキサンチンーグアニンーホスホリゼシルートラン
スフエラーゼ（ＨｏｐａＴ）ｆｔ用いて、アミノプテリ
ン１１ 一ブロックを回避することができる。細胞にとわら２酵
素が欠けていれば、これらは、Ｉ（ＡＴ−培地中で生残
不可能である。従って、ハイブリドーマ−発生のために
ＴＫ−又はＨＧＰＲ，Ｔ−欠落している骨髄腫細胞の突
然変異体を使用する　これらの細胞は、こわらとその遺
伝子プールと共罠欠落酵５！をそのハイブリッド細胞中
に挿入する正常細胞と融合させる際にのみ、生残可能で
ある。肺臓の機合さゎながったリンパ球は、培養液中で
、自然に限ちれた寿命を有し、従って、ハイブリドーマ
のおそれはない。

ハイブリドーマ−製造時には次の問題が生じる： １、）（ＡＴ−培地−選択 融合しなかった骨髄腫細胞の生長の選択的抑制は、前記
のように、ハイブリドーマ−クローンを得るための主要
な前提である。このＨＡＴ−選択は、しかしながら、正
常の、欠落してない細胞に対しても、細胞の分裂能及び
生残能に悪影響管及ばず極めて非生理学的な方法である
。特にヒトのリンパ球においては、ＨＡＴ−培地の成分
を濃度に応じて。

ＨＧ　Ｐ　Ｉ’ＬＴ−陰性細胞を確実に殺し、これと反
対［ｆ（ＧＰＲＴ−陽性細胞を生存させるように艮ｌす
ることは極めて困難である。

使用リンパ球及び骨髄５腫細胞の数との間７の混合割合
及び増加可能なハイブリッドの収率は１次の数で示され
る：典形的な融合〕々ラッチ中マウス−リン・ぞ球１０
８個の装入時に。

−ノが一般に非 常に良好が結果に当てはまる。マウスの膵臓内−では（
そわら、−が繰り返し、（過剰）免疫化されていても）
１０４〜１ｏ　儒の細胞のみが。

免疫原に対する抗体管形成する（　Ｊｅｒｎｅ−ＰＩ　
−５ｑｕｅ　−Ｔｅｃｈｎｉｋ　、Ｎ、　Ｖ、及びＮ０
ＲＤＩＮ、Ａ、Ａ、：５ｃｉｅｎｃｅ　１４０．　４０
５頁（１９６３年）参照〕ので、純粋に偶然制限された
ハイブリドーマ−形成では、所望の抗体−特典性を有す
るクローンでのみ予期することができるように。

クロー／１０〜１０個を引き出すことができるべきであ
る。ヒトのハイブリッドーの製造時には、この混合割合
はなお着るしく、融合１回当り、ハイブリッド−クロー
ン４〜１゜個が得らりる際に良好な結果として通用する
。

２　染色体−損失 効果的融會の後に、新たに生じたハイブリッド細胞は、
自然に当初から存在する染色体・量の約２倍を有して完
成さｉ′１イはずである。

実際の経験が示しているように、ハイブリッド細胞は、
染、包体を失な〜う傾向を有する。各々の細胞７分裂時
に、染色体の非生理学的過剰量では、こわらが、一様に
２ｍの娘細胞に分配さねない危険性がある。障めて僅か
に生じ、従って過剰生産では１留しない娘細胞は他に比
べて選択利点を有し、培養液中の優先細胞になる。しか
しながら、免疫グロブリンの合成は、ハイブリッド細胞
の生存能にとっては重要ではなく、過剰合成能（Ｌｕｘ
ｕｓ−８ｙｎｔｈｅ　−ｓｅ　−Ｌｅｉｓｔｕｎｇ　）
　ｆ示している。従って、ハイブリドーマ−クローン中
の非プロプユーザー変形（Ｎｏｎ＝Ｐｒｏｄｕｃｅｒ−
Ｖａｒｉａｎｔｅｎ）の現象が屡々現わわ、クローンの
産生能を確保するためには、軽費のかかる再−クローン
化法（Ｒｅ−Ｋｌｏｎｉｅｒｕｎｇｓ−ｍｅβｎａｈｍ
ｅｒ＋　）が必要である。染色体を失なう傾向は１種間
−ハイブリッドの際に特に顕著である。

３、　ハイブリッド免疫グロブリン 骨髄腫細胞は悪性Ｂ−細胞であり、それ自体免疫グロブ
リンを形成する（未知の抗原結合特墨性を有する）。こ
の能力は、骨髄腫細胞を正常のＢ−細胞と同様にハイブ
リドーマ中に入わる。Ｉｇ−分子の種々の連鎖音別々に
合成し、後に一緒にしてはじめて完全な抗体にされるの
で、１個のハイブリドーマ−細胞（この中で２種の異な
るＬ−及びＨ−鎖が合成される）中に、偶然制限された
１０の種々の組合せが生じ、そのうち、所♀の真性抗体
は全ＬＩｇ−量のｈ６のみに達する。従って、多大の経
費を用いて、そわ自体Ｈ−又はＬ−鎖を形成しないマウ
ス−骨髄種−細胞−突然変異体が開発された。しかしな
がらヒトのリン、４１球の融合のためには、従来は、類
似の充分に開発された骨髄腫系は供給されていない。

なお不利な問題は、ハイブリドーマ−法に対する変形に
おいて存在する： １、　ウィルスによるＢ、−ランスぐ球の不滅ｒヒ正常
の供給者のヒトのＢ−リンＡ球をニブ１スタイン−パー
ル−ウィルス（ｇｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ−Ｖｉｒｕｓ
；　ＥＢＶ）の感染によシ悪性にトラ７ノスフオームす
ることができ”るっＥＢＶ−感染すわたリン・ぞ芽球細
胞を連続的に、試験管内で培養し、クローン化すること
ができる。しかしながら、ハイブリドーマと比べて、Ｅ
ＢＶ−リンＡ芽球系は、不１充分な産生安牢性で。

乙。又はよ多少ない免障グロブリンを産生ずる。、Ｂ−
細胞は早い分化期にＢＢＶで固定され、従って、過度に
屡々、非常に僅かな量でＩｇＭｔ産生ずるクローンが得
られる。

同様に、マウス−Ｂ−リンツク球ヲアペルソンーマウス
ー白血病−ウィルス（Ａｈｅｌｓｏｎ−−Ｍ’＋’ｎａ
ｅ−Ｌｅｕ−に’ａｍｉｅ−Ｖｊｒｕｓ：ＭｕＬＶ）Ｋ
よシトランスフオームすることができる。ここでも、リ
ンノソ球は不都合に早い分化期で固定さね、抗体産生は
悪い。

２８、トランス７オームさねなかったＢ−り７７３球の
長時間培養 最新の文献Ｃ８ｐｒｅｄｎ　ｉ　、　Ｂ、等によるＬｏ
ｎｇ　−ｔｅｒｍｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｃｌｏｎｌｎｇ
ｏｆｎｏｎｔｒａｎｓｆｏｒ−ｍｅｄ　ｈｕｍｓｎ　Ｂ
−Ｌｙｍｐｈｏｅｙｔｅｓ％Ｊ、　ｇｘｐ、　Ｍｅｄ。

１５４．１５００〜１５１６頁（１９８１年）。

Ｈｏｖｒｍｒｄ４　Ｍ、等によるＬａｎｇ−１ｈｅｒｍ
　ｃｕｌｔｕｒｅ。

ｏｆ　ｎｏｒｍａｌ　ｍｏｕｓｅ　Ｂ−Ｌｙｍｐｈｏｃ
ｙｔｅｓ　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　８ｃｉ、　１１．８．　Ａ、　）は、Ｂ−
ランスぞ球を。

トランス７オーメー７ヨンせずに、特別な培養条件（永
久分裂促進刺激；リンホカイン−調節された培地等）に
より永久的に培養し、クローン化する可能性を示してい
る。モノクローン性抗体の通常の製造のために、この方
法は、現在までのところ、確実にはなお好適−ではない
。

従って、従来の技術水準を次にまとめて記載することが
できる二 正常の供給者のＢ　−０７２球は、人工的に不滅化する
こふができる。ハイブリドーマー法では、培養液中で無
制−に増殖しうる生色ている骨髄；暉細胞（こねは抗原
刺激性Ｂ−リンパ球と融合される）ｔ−使用する。細胞
−細胞−融合に、より生じるハイブリ）ド細胞’ｉ、Ｈ
’ＡＴ−選択により巣離し、単細胞培養の構想によ一す
クローン化する。所望の特異性を有する抗体管形成する
ハイブリドーマ−クローンをモノクローン性抗体の大量
生産のために増−させる。しかしながら、この）ＩＡＴ
−選択から、染色体損失及びハイブリッド免疫グロブリ
ンにより著るしい欠点が生じる。

もう１つの他の方法で、Ｂ−リンＡ球は、特別なウィル
スの感染により悪性にト、ランスフォーメートされ、抗
体゛合成の保持下に永久に生長する細胞に変えられる。

しかしながう、こわらは周知の−い抗体産生体である。

従って、所定の抗原−結合特異性を有する゛モノクロー
ン性抗体の大量生産に関して、このノ・イブリドーマ法
は、現在−その変形法よシも優わている しかしながら、このハイブリドーマ法も重大な欠点を有
する。その最屯重要な欠点は、一方で、この方法は、Ｈ
ＡＴ−敏感な融合成分に限られ、他方で僅かな種類の細
胞即ちリンツク球及び神経細胞に限られていることにあ
る。本発明は、この欠点を排除し、永久に培養可能な動
物及びヒトの細胞系を製造する新規の有利な方法を得る
ことｆ、課題としている。

この課題を１本発明により、正常な動物及びヒトの細胞
と、試験管内で培養能に作用する生物学的成分との１合
によシ、永久培養可能な動物及びヒトの細胞系を得る゛
方法により解決され。

この方法は、正常の動物及びヒトの細胞を、単独では増
殖不能な細胞フラグメントを用いてトランスフォーメー
トした細胞と融合させ、培養液中で選択物質なしに培養
゛□することよりなる。

本発明のこの方法において重要なことは、融合に使用さ
れるフラグメントが、なお増殖可能な細胞をまったく含
まず、単独ではもはや増殖できないことである。

意外にも、この発明の方法で、変性さねなかった成分の
即ち正常細胞細胞質分の超過は、変性された細胞の悪性
特性を消失させず、従って、トランスフォーメートされ
た細胞と非悪性細胞からの正常細胞質との融合によシ、
悪性が解消されることが全知（８ｈａｙ、　Ｗ、　Ｊ、
等による８ｕｐｒ−ｅ＊５ｉｏｎ　　ｏｆ　　ｔｕｍｏ
ｒｌｇｅｎｉｃｉｔｙ　　ｉｎ　　０ｙｈｒｉｄｓ、Ｊ
。

８ｕｐｒｍｍｏ１．８１．０ｅ１１．　Ｒｉｏｃｈｅｍ
、　１６　、７５〜８２（１９８１年）参照）であるに
もかかわらず、永久生長の能力全排除する。同様に、骨
髄腫細胞質をハイブリッドに挿入しない場合に、細胞核
ｔＶ性された細胞の単離された核を有する細胞核が例え
ば骨髄臘核と一緒になって共通のゲノムになるか否かは
予測できることではなかった１、この融合は、８知方法
で、融合因子物質特に１ｈ ポリエチレングリコール又はセンダイーウィルス（５ｅ
ｎｄｓ　ｉ　−Ｖｉ　ｒｕｓ　）の存在で行なうのが有
利である。それというのも、こねによって、ノ・イブリ
ドーマ法におけると同様に、融合収率を高める作用をす
るからである。他の融合因子物質は当業者にとって全知
であ〕、同様に使用可能である。

トランスフォーメートされた細胞例えば骨髄腫細胞の７
ラグメントの暇得は、全知方法で行なうことができる。

細胞−を溶解にによシ又は機械的に破断するのが有利で
ある。場合によっては遠心により、核７ラクシヨン管細
胞質フラクションから分離させ、これらの７ラクシヨン
を単独で使用することが・できる、この分解管。

細胞管グリセリン中で膨潤させ、引続き、グリセリンネ
含の緩衝液中に入れることによシ行なうのが特に有利で
ある。こうして、細胞膜が破裂する。もう１つの有利な
方法は、細胞を号イトカラシフ　Ｂ　（０ｙｔｏｃｈｓ
ｌａｉｉｎ　Ｂ　：市場で入手されうる抗生物質）で処
理することにより、核質体と細胞質体を製造することよ
シなる。Ｃの方法は、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｌｏｐｈ
ｙｓ、Ｒｅｓ、　Ｏｏ＋ｎｍ、　　６３　。

６６９〜６７４頁（１９７５年）から会知である。

この方法では、なお細胞膜で包囲されていゐ細胞核のみ
に、一方で核質体及び同様に他方で膜で包囲され九核の
ない細胞、質いわゆる細胞質体を生じる１種の細胞分裂
が行なわれる。双方は、本発明の範囲内で、同様に、溶
解によるか又は機械的に得られる細胞フラグメントもし
くは核又は細胞質７．ラクション（こねはもはや細胞膜
で包囲さねていない）と同様に、＠合に好適であること
が明らかである。機械的崩壊は、当業者により全知の方
法で行なうことができ、この方法は説明を必要としない
。

細胞フラグメントは新鮮な状態でその製造の直後に又は
その後にはじめて融合に使用さね−この際、後者の場合
には、凍結乾燥状態での保存が有効上ある。

トランスフォーメートされた細胞とは、試験管内でかつ
生体内で正常の生長規則機構にもはや従がわないものと
堺される。仁の例は、悪性変性した細胞例えば癌細胞、
ウィルス感染（例えばエブスタインーノ々−ルーウィル
ス）Ｋよシ変性された細胞及び発癌物質で変えれた細胞
である。

本発明の方法のために細胞フラクションを使用する場合
には、こねは完全に純粋である必要はないが、無傷の増
殖可能な細胞を含有していてはならない。

本発明の主要特徴は、得られるハイブリッドが、変性さ
れ、試験管内で培養可能な非ハイブリッド細胞の競争に
さらされず、従って、その生長がＩ（ＡＴ−選択物質に
よっても抑制されないことにある。これによって、ハイ
ブリッド上へのＨＡＴ−選択培地の非常に不利な影響は
除かれ、永久培養可能な細胞の収率及び生存能の決定的
改良が得゛′・ら−ねる。

更に本発明によれば、）・イブリッド形成のために、変
性された細胞としてＨＡＴ−敏感な細胞上使用すること
はもはや前提ではない。）（ＡＴ−敏感性を有せず、慣
用の）１イブリド−マー法には使用できないが本発明の
範囲では融合用のフラグメントの製造のために使用でき
る永久生長性の細胞系が存在する。

細胞管サイトカラシ：／　Ｂ　（（ｌｙｔｏｃｈａｌａ
ｍｉｎＢ　：菌−代謝物質）に°よシ起因させ、その核
を極端な膨出で押し出す。重力（例えば遠心）の影響下
で、薄い結合体は容易に破壊する。こｔｌにより、核の
ない細胞体（細胞質体）及び細胞膜と細い細胞質＊ｉで
包囲されている核（核個体及びミニ細胞）が生じる。核
り休も細胞質体も増殖性ではないが、それらの特異的な
機能は数時間〜数日間にわたり保持される。核押し出し
は。

比較的高いサイトカラシン−Ｂ−濃度全必要とし、この
結合が破壊しないかぎシ、完全に可逆性である。

低いサイトカラシン−Ｂ−濃度は、核突出なしの有糸分
裂による細胞分裂を抑制する。非粘着性細胞を得るため
の細胞質体／核質体製造のための―亀法は、ウィグラー
（Ｗｉｇｌｅｒ　）　、　Ｍ、　Ｈ。

及びワインスタイン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）、　１．　
Ｂ、によるプレノぞラテイブ・メソッド・フォア・オブ
テイニング・エヌクリエーテツド・ママリアン・セル　
ｉ：　（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　　ｍｅｔｈｏｄ　　
ｆｏｒ　　ｏｂｔａｉｎｉｎｇ　　ｅｎ−ｕｃｌｅａｔ
ｅｄ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　　ｃｅｌｌｓ）Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｂｆｏｐｈｙａ。

Ｒｅ＠、Ｏｏｍｍ、　６３．６６９〜６７４頁（１９７
５年）に記載されている。

更に、前記のＢ−リンノぐ球だけでなく、他の従来試験
されていない動物及びヒトのすべての細胞も本発明によ
り、不滅化（Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｓｉｅｒ　−ｅｎ）す
ることができる（実施例６〜８参照）。

従って、例えばＴ　＋　１７ンノぞ球（細胞媒介免疫の
担体及び免疫系の調節細胞）、内皮細胞（ヒトの謄静脈
からの壁細胞）及び黒色腫細胞（冷凍保存された腫瘍転
移物質から単離）等の種々の型の細胞を１本発明の方法
によシ永久生長体に変えること（不滅化）ができた。

従って、本発明による方法は、任意の動物及びヒトの細
胞を培養可能とし、こうして、細胞産生物例えば抗体、
凝固因子、酵素及びその他の細胞により合成される物質
を試験管内で製造する間１１をも解決可能とする。同様
に本発明による培養は、化学物質の検゛査用の実験動物
を著るしく不必要とすることを可能とする。

本発明のもう１つの目的は１本発明方法で“製造された
永久培養可能な細胞系を、細胞産生物例えばモノクロー
ン性抗体、凝固因子、リンフオカイン、酵雲及びその°
他の蛋白質又は他の物＃群に属する細胞産生物を得るた
めに使用することでもある。

殊に、本発明の”こ□の実施形を、永久培養可能なり一
すンノぐ球の使用の際にはモノクローン性内 抗体の製造のために、永久培養可能な内皮細胞。

黒色腫細胞、肝味細胞、腎臓細胞及び類似物を使用する
際には凝゛固因子の取得のために、永久培養可能なＴ−
リンパ球子ＲＩＪ・ン、ｅ球及び／又はマクロファージ
の使用の際にはリンフ才力インの取得のために、永久培
養可能な腺細胞の場合には腺から分泌される物質例えば
ホルモン及び類似物の＠２得のために、使用する仁とか
できる。本発明による不滅化のために使用される動物細
胞の種類に応じて１重要なすべての細胞産生物を得るこ
とができることは明らかで゛あるので、ここではそわを
詳述する必要はない。

しかしながら、細胞産生物の暇得は、原料細胞の産生番
物即ち同種の細胞産生物に限らない。

本発明によシ得らねる永久培養可能な細胞は。

その出発細胞からは形成さねない′即ち異穫の。

かつその遺伝子情報が遺伝子組換えの方法ではじめて、
永久ハイブリッド細胞（即ち異種である）’＜ｍ″人さ
れる細胞産生物の表出にも゛使用でき芯。一種細胞産生
物を永久ハイブリッド細胞により製造することは、例え
ばトランスフォーメーションにより作用されうる。従っ
て、実験は１本発明による永久細胞内にベクターを用い
てＤＮＡ？導入することができ、従って、導入したＤ’
　Ｎ’　Ａによシコードされた産生物の表出のために使
用できることが明らかにしている。

本発明による永久培養可能な細胞は、更に、前記のよう
に１作用物質の検査対象としても使用できる。更に、本
発明により得られる不滅化さねたハイブリッド細胞を遺
伝子情報１ｊｌｌｌ（こねは所望の細胞産生物の発現を
コードする）として、ハイブリッド細胞の遺伝子情報を
有する成分即ちそのゲノム、ゲノム分又けＲＮＡを得て
。

遺伝子組換え法により形質転換して適当な微生物にし、
後者から所望の細胞産生物を得るように、使用すること
もできる。

・　本発明の使用の変形によゎば、細胞産生物例えばモ
ノクローン性抗体及び他の細胞物質の製造は１次のよう
に、即ち、ヰしたハイブリッド細胞を、細胞産生物形成
もしくけ物質合成のために直接、培養せずに、そのゲノ
ム又はゲノム分又はＲＮＡを遺伝子組換え法で形質転換
して適当な微生物にし、後者をモノクローン性抗体又は
細胞物質の暇得のために培養することによっても行なう
ことができる。本発明のこの実施形では、ハイブリッド
細胞のゲノムを当業者にとってそのために公知の方法で
単離し、適当なベクター（このために、市場で入手しう
るベクターを使用することができ）ｔ−用い、このため
に開発された標準法により、形質転換して適当な微生物
にする。

次に、形質転換された微生物を常法で培苛し。

所望の細胞産生物をこれから得る。微生物としては有利
に、遺伝子組換に有効なＥ・コリー菌株の１種を使用す
るのが有利である。

次に実施例に、つき本発明を詳述する。

ここで１次の略字及び商品名を用いる。

ＡＫ　　　　　　　　抗体 Ｉｇ　　　　　　　　　免疫グロブリンＨ−もしくはＬ
−鎖　Ｉｇ−分子の腫い−もしくは軽い蛋白質鎖 プリスタン（ｐｒｉｓｔａｎ）　　２　、６　、１０　
＋　１４−テトラメチルペンタデカン ＨＡＴ−選択培地　　ヒデキサンチン１、アミノプテリ
ン。チミジンを含有す る培地 ＴＫ　　　−チミジン−キナーゼ ）ＩＧＰｌ’ＬＴ　　　　　　ヒボキサンチンーグアニ
ンーホスホリヂシルートラン スフエラーゼ ＥＢＶ　　　　　　　エプスタインーノ々−ルーウィル
ス ＭｕＬＶ　　　　　　　アベルソンーマウスー白血病ウ
ィルス ＯＢ　　　　　　　　サイトカラシンＢ（抗生物質、Ａ
ＬＤＲＩＯＨＢ、１１００Ｈ −Ｅ　Ｉ　ＯＡＬ　８．　Ｍｉ　１ｗａｕｋｅｃＴＪ　
８　Ａ　） ＤＭ８０　　　　　　　ジメチルスルホキシドＤＭ　Ｂ
Ｍ　　　　　　　デュル４ツコスＯミニマルーエセンシ
ャル培地（Ｄｕｌｈｅｃ− ・　　　　　　ｃｏ’！Ｉ　Ｍｉｎｉｍａｌ　　Ｅｓｓ
ｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ　） ＦＫ８　　　　　　　牛胎児血清 フィニル（Ｆｌｃｏｌｌ）　　　蔗糖ポリマー　（Ｐ　
ＨＡ　Ｍ　Ａ　ＯＩＡ）ＰＢＧ　　　　　　　ポリエチ
レングリコールＰＢ８　　　　　　　燐酸塩緩衝食塩水
ＰＯＤ　　　　　　　ペルオキシダーゼＡＢＴ８　　　
　　　２　、２’−アジノージ（３，−エチルベンゾチ
ア・ゾリン− ６−スルホ、ン酸）のアンモ ニウム塩 ＥＢＳ　Ｓ　　　　　　　エールズのバランスド−塩溶
液（Ｅａｒｌ’ｓ　Ｂａ１ａｎｃｅｄＳａｌｔ　８ｏ１
ｕｔｉｏｎ　） Ｒ，ＰＭ１１６４０　　　　ローズウェル拳パーク・メ
モリー魯インステイチュー ト　　（Ｒ，ｏｍｅｗｅｌｌ　　ｐａｒｋ　　Ｍｅｍｏ
ｒｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　）の培地 トリス（Ｔｒｉｓ）　　　　トリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン ＰＢＬ　　　　　　　　末梢血液−リンノぞ球ＭＮＯ単
核細胞（リンノ９球、単核 白血球） ｈＴ８Ｈヒトの甲状腺刺激ホルモン β−〒ＳＨヒトの甲状腺刺激ホルモン のβ−鎖 ＦＡ　　　　　　　　フロイントのアジュノ々ンス（Ｆ
ｒｅｕｎ’ｄ’５ｃｈｅａ　Ａｄｊｕｖｓｎｓ　）（’
！ＦＡ　　　　　　　完全’ｌフロイドのアジュノセン
ス ＩＦＡ　　　　　　　不完全な７０イドのアジュノ９ン
ス メトセル（Ｍｅ１ｈｏｃｅ＋）　　メチルセルロース（
ＦＬＴＪＫＡ）５００ ０ＭＶ　　　　　　　細胞質膜前 ＦＩＴＯ−コノ々スフエ レス（Ｏｏｖａｓｐｈｅｒｅ＠）球形のラルオレツセイ
ンインチオシアネート（００ＶＡ− ＬＥＮＴ　ＴＥＯＨＮＩＯＡＬ８　、　ＡｎｎＡｒｈｏ
ｒ、Ｍｉｃｈ、　ＴＬ　Ｓ、　Ａ、　）ＥＡＺ　　　　
　　　エールリッヒ腹水細胞（ＡＴＯＯ；０ＯＬ７７） 例１ 人、ラインＰ　３　Ｘ　６３　Ａｇ　８．６５３ＡＴＯ
ＯＮｏ　−０ＲＬ−１５８０のマウス骨髄腫細胞からの
核質体及び細胞質体の製造［：　Ｗｉｎｇｌｅｒ、Ｍ、
　Ｈ及びＷｅｌｎｓｔｅｉｎ、　１．　Ｂ、　’による
Ａ　ｐｒｅｐａｒａ目ｖｅｍｅ−ｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｏ
ｂｔａｉｎｉｎｇｅｎｕｃｌｅａｔｅｄ　ｍａｒ＋ｗｎ
ａｌ’１ｎｃｅｌ　Ｉｇ、　Ｂｉ　ｏｃｈｅｍ、　Ｂｌ
ｏｐｈｙｓ、　Ｒ，ｅｓ、　Ｏｏｍｍ、　６’　３６６
９〜６７４頁（１９７５年）に記載の方法参照〕Ａ、１
材料サイトカラシンＢ　（ＯＢ、　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｂ
ｉ　−ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍ目ｗａｕｋｅｅ、　Ｔ
Ｊ　８　Ａ　）をジメチルスルホキシド（ＤＭ８０　　
Ｍｅｒｃｋ）中に溶かしく２■７ｍｐ）＊基本溶液とし
て４℃で貯蔵した。

フィコルー４００　（ｐｈａｒｙｙｌａｃｉａ；蔗糖ポ
リマー）ｆ：再蒸溜水中に溶かしＣ１ｔ／−）％オート
クレーブ処理し、５０チ基本溶液として一２０℃で貯蔵
した。

１倍−及び２倍濃度のデュルペツコス・ミニマム・エセ
ンシャル培地（ＤＭＥＭ）、　牛胎児血清（ＦＫ８）、
Ｌ−グルタミン（２ｏｏｍモル／ｌ）、ベーリンガー・
マンノ・イムのストレフトマイシン−ペニシリン。硝酸
セルロース管ｆＴＩＶ−照射により滅菌した。

骨髄腫細胞系Ａｇ　８．６５３　ＡＴＯＯ０ＲＬ−１５
８０：この系は、ケールニイ（Ｋｅａｒｎｅｙ　）。

Ｊ、　Ｆ、等による。ア・ニュー・マウス・イエローマ
・セル・ライン・ザット・ノ１ット・ロスト・イムノグ
ロブリンｅエクスプレジョン・ノ々ット・ノミ−ミツト
・ザ・コンス〆ラクション・オブ・アンチゼデイセクリ
ーテイング・ハイブリッド・セル・ラインズ（Ａｎｅｗ
　ｍｏｕｓｅｍｙｐｌｏｍ＊　ｃｅ目１ｉｎｅ　ｔｈａ
ｔ　ｈａｔ　１ｏｓｔ　ｉｍｍｕｎ　−ｎｇｌｏｈｕｌ
ｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｈｕｔ　ｐｅｒｍｉｔｓ
　ｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｈ
ｏｄｙｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　ｈｙｂｒ　−＋ｉｄ　ｃｅ
ｌｌ　１ｉｎｅｓ　）　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ’１．１２
３　１５４８〜１５５０頁（１９７９年）に記載されて
いる。

こわはアザグアニン抵抗轟であり、ＨＡＴ−敏感で、Ｈ
−もＬ−Ｉｇ−鎖も合成しない。これをＤＭＥＭ＋］　
５チＦＫ８＋グルタミン＋ペニシリン−ストレプトマイ
シン＋ピル４−ト（＝ＤＭＥＭ−完全培地）中、３７℃
で、７％（’！　＜１２−雰囲気中に保持する。

Ａ、２方法説核：　Ａｇ　８．６５３−細胞８　Ｘ　１
０’ｔ’　１０’ｕｐＭで５分間遠心分離し’、１２．
５％フィコルーＤＭｇＭ−ＯＢ−ＤＭ８（１−溶液１２
−中に、細胞塊不含の懸濁液が得られるまでの長時間再
懸濁させた。細胞懸濁液各３ｍ１ｔ、予め４時間−，１
２時間前に調製されたフィコルー勾配溶液上に積層し、
フイコル不含のＤＭＥＭ−ＯＢ−Ｄ　Ｍ　８　（１−溶
液２−をその上に積層した。この勾配溶液を有する試験
管を超遠心機中。

２５０００１１９Ｍ　（３１℃）で６０分間遠心分離し
た。

この遠心終了後に、肉眼視可能なフラクション（）々ン
ド）ｔ−長い°カニユーレを有する注射器を用いて、上
から別々に集め、培地（添加物不含のＤＭＥＭ）各２０
−中で稀釈し、遠心によシ沈殿させ、新しいＤＭＥＭ中
に再懸濁させる。

次の４７ラクシヨンが得られた： ａ）細胞−デブリス（フィニルＯ〜１２．５％の間の範
囲で）、 ｂ）核のない細胞質（ソイコル１５〜１６１０範囲内で
） Ｃ）認識可能なプラズマ縁不含の核及び約２−の核不含
細胞（フィニル１７〜２５９ｇの範囲で） ｄ）試験管底部の沈殿物としての、核を有し。

良好に認識可能なプラズマ縁を有する形態学的規準で無
傷の細胞及びプラズマ縁を有しない僅かな核 ’ＩＩＩ　胸計測Ｏｆ／ｉＮ　果ｓ　Ａｇ　８−６５３
−　ＦＩＢ　胞８　Ｘ　１０　’からｂ）内に細施質体
１．２５Ｘ１０個、ｃ）内に核質体４Ｘ１０’個及びｄ
）内に推定上無傷の細胞１．ｌＸ１０’個が含有されて
いた。

Ｂ　マウス＊＠細胞と実＠Ａからの単離された骨髄腫−
核質体、−細胞軍体及び−沈殿細胞との軸合 ８．１　材料 融合剤：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−４０００）
２０Ｆをオートクレーブ中で姻解させ％　５６℃まで冷
却し、この温度でＤＭＥＭ２０　ｍｌと混合した。

）Ｉ　Ａ”Ｔ選択培地：ＯＭＥＭ−完全培地に、アミノ
プテリン（４Ｘ１０−７Ｍ）％チミジン（ＩＸＩＯＭ）
及びヒポキサンチン（：（、Ｉ　Ｘ１０−５Ｍ）ｔ−加
え都 培讐容器：コスター社（Ｆｉｒｍａ　０ｏｓｔｅｒ、Ｏ
ａｍ−ｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓａ、ＵＳＡ　）の組織培養
クラスター（Ｔｉｓｓｕｅ　０ｕｌｔｕｒｅ０１ｔ＋５
ｔｅｒ）　２４及びクラスター９６゜ ８．２互生 融合：実験人で調製されたフラクションｂ入Ｃ）及びｄ
）を、別々のノ々ツチ中で肺臓細胞と１０：１の割合で
混合し、遠心により沈殿させた上澄み液を注意深く除去
した　この沈殿上に。

５０４ＰＥＧ−溶液０．８ｄ（３７℃で、一様に１分間
にわたり分配し、絶えず緩るく振拳１、なから）を加え
、次いでＤＭＦＭ５ｍ／（室温で、一様に５分間にわた
り）を加えた。更にｐＭＥＭ２０−の添加の後に％細胞
を沈殿させ、新しいＤＭＥＭ−完全培地（５−）中に再
懸濁組織培養容器径１０個上に分配した。個々の培養物
に１，２．３．５．７，１０．１３日０にＤＭＥＭ−完
全培地を与えたう フイτＡ細胞〔（腹腔−マクロファージ）：融合の前日
に同系交配マウス（Ｂａ１ｈ／ｃ　）を伸＋４によシ殺
した。無菌条件下でＢＢｉ９４〜５−を腹腔内に注入し
、１分後に再び吸引した。

洗出した細胞ｔ−ＤＭＢＭ中で洗浄し、完全培地−中に
１−当り細胞２Ｘ１０５個の密度で懸濁させ、２４コー
スタ−スポット（ｆｌａｔｔｅｒ　Ｔ’ｕｐｆ−ｅＯ上
に、０・５−宛分配させた。

肺臓細胞：　Ｂｓ１ｂ／ｃ−マウスから、無菌条件下で
融合の直前に肺臓を」り除し、その細胞をＤＭＥＭ中に
懸濁させた。細胞集塊物及び組織片′ｔガーセを用いて
枦去した。

マウス−免疫グロブリン上のＥＬＩ８Ａ：マイクロ滴定
プレートに羊のマウス−Ｉｇ−抗体（ＩｇＧ−フラクシ
ョン；スポット１個当シ０．９％Ｎａ０Ｌ−溶液１０．
、／＋ｄ　：抗体溶液１５０μｔ）を塗布し九。培養上
澄み各１００μｔｖｒ。

この塗布されたスポット上に点滴し、室温で１時間イン
キュ４−トした。上澄みの吸引除去及び２回洗浄の後に
、このスポットに抗−マウス−Ｉｇ−ＰＯＤ−接合体−
溶液（前記と同じ抗体；オランダガラシーペルオキンダ
ーゼと共有結合）１００μｔｔ装入し、室温でｌ時間イ
ンキュベートした。３回洗浄の後罠。

スポット１個当シ基質溶液（ＡＢＴＢ）１００μｔを点
滴し１発色を光学的に測定した。

８．３結果 λによ）調製された細胞質体、核質体及び沈殿フラクシ
ョンｔ−，平行的にｓ　Ｂａ　ｌ　ｂ　／　ｃ−マウス
の肺臓細胞と融合させ、各１０〜１−−培養液上に分配
させた。培養分径５個にはｆ（ＡＴ−添加物を与えず（
プレー）１）、各５個にはＩ（ＡＴ−添加物を与えた（
プレートＩＩ）。

融合後（ｎ、Ｆ）２１日までは、沈殿フラクションの融
合物がＨＡＴ−媒体管含有しないプレートＩ上のスポッ
ト４Ａ、４Ｂ、４０゜３０及び３Ｄは例外として、どの
スポット中でもリンフ系細胞胞の生長は、肉眼的にも顕
微鏡でも検出できなかった。こわらのスポット中では、
融合後（ｎ、Ｆ、）５日で既に迅速に生長したコロニー
が昭識可能であった。ｎ、ｐ。

８日目には、これらスポット中にＨｈＴ−培地を加え、
従って、４日以内にすべての可視のコロニーは枯死した
。

＋１．Ｆ、２７日目から、差当り、別々にすると１次に
殆んどすべてのスポット中でコロニーが見え、こわらは
、大きな球状の透明な非粘着性で生長する細胞よシ成っ
ていえ。ｎ、Ｆ。

６５日目に、）−３Ｂ、１−ＩＡ、１−４Ａを例外とし
てすべてのスポットにリン・ぐ系細胞の複数のコロニー
が付いていた。この日における培養上澄みのマウス−Ｉ
ｇの含分に関する検査で、第１表にまとめて示しえよう
に。

前記のコロニー不含スポラ）ｔ−除いてすべての培讐分
内のＦ！ＬＩＳＡ中で、陽性〜強い陽性値が得らえた： 第　　１　　表 実験Ｂの培養上置み中のマウス−免疫グロブリンを検出
する丸めのＥＬＩ８Ａ（融合後６５日）（例外：　４Ａ
、４Ｂ、４０，３０．３Ｄ：＋）（ＡＴ、８〜１５日） ↑　　　↑　　　↑ １　　　　　２　　　　　３ １＝細胞質休−融合物 ２＝核質体　−融合物 ３＝沈殿細胞−融合物 漬滴一培養プレート　ＩＩ： ＨＡＴ含有　（１〜１４日） 陰性−ｋｔｒ、１　　（ＤＭＢＭ−完全培地）：°旧Ｏ
陰性−ｋｔｒ、２　　（ＤＭＦ！Ｍ、ＦＫ８不含）：’
０４０陽性−ｋｔｒ、１　　（ｙウス血清ｌＸｌ０　　
）：’７２３陽性−ｋｔｒ、２　　（マウス血清ｌＸｌ
０　　）：＞１５００ａ）核質体とマウス膵臓細胞との
融合によシ。

試験管内で増殖可能な免疫グロブリン−分泌細胞管生じ
九。悪性成分の細胞質の小部分のみをこのハイブリッド
中に導入しても、永久生長のこの特徴全消失することは
できなかつ九。

ｂ）核質体を用いて得たハイブリッド細胞は。

マウス−免疫グロブリンをハイブリドーマ一定量的に合
成しかつ分泌させた。従って＋Ａｇ８、６５３の細胞質
分の欠如は、核質体−膵臓一ハイブリッドの産生性及び
分泌性に悪影響を及ぼした。

Ｃ）細胞質体と膵臓細胞との融合から、同様に試験管内
で増殖し、抗体を分泌する細胞クローンが明らかになっ
た。この特別な意想外の挑象に対する満足しうる説明は
現在の所、得られていない。

例２ グリ毛リンー分解及び−ヒト血液リンノぐ球との融合に
よる細胞断片化 材料 １−ルズ嗜、々ランスト・ソルトーソリューシン（ＥＢ
ｓ８　）、培地ＡＰＭ１１６４０．ベーりンガー・マン
ノ・イムの牛胎児血清（ＦＫＳ　）、セルノ々（５ｅｒ
ｖｅ　、　Ｈｅｉｄｅｒｈｅｒｇ）の８−アザグアニン
（８−Ａｇ）ｂディフコ（Ｄｉｆｃｏ、　Ｆａ、Ｈｅｄ
ｉｎｇｅｒ　ＫＧ。

８ｔｕｔｔｇａｒｔ　）の蝶天（Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ
　１６１４　）。ヒト・プラズマサイドーム−系（ｈｕ
ｍａｎ　ｐｌａｓｍａｃ　−ｙｔｏｍ−Ｌｉｎｉｅ）Ｈ
８８ＴＪＬＴＡＮ　　ＡＴＯＯ０ＲＬ−１４８４を１冷
凍保存した（　ｋｒｙｏｐｒ’ｊｓｅｒｖｉｅｒｔｅｓ
）細胞材料としてＡＴＯＯ−処方に従って融かし、培養
液中に入れる。

Ｐｒｃｃ、Ａｃａｒｌ、　Ｓｅｉ、ＴＪＳＡ　７１　”
２６７９〜２６８３頁（１９７４年）に記載の方法によ
り、ＨＳスルタンー細胞（Ｈ８８ｕｌｔ’ｍｎ　ＺｅＮ
ｅｎ）　８　Ｘ　１０個をＲＰＭＩ　１６４−０一完全
培地（８ＸＡｇ２０μＭ含有）１００ｍ／中で４８時間
培キした。生残細胞を８−Ａｇ不薔のＲＰＭＩ　１６４
０−完全培地１〇−中に人！１．１０日間にわたり増殖
させた。次のこの細胞を軟−寒天−プレート（ＯＯＦ　
Ｆ　Ｉ　Ｎ　０１Ｐ０等によるＰｒｏ、Ｎ５ｔ１．Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、ＴＪＳＡ　６８２１９〜２２３頁（１９
７１年））（ＲＰＭＩ　１６４０−完全培地＋８−Ａｇ
２ＯμＭから製造した）上に播種（ハトリシャーレ１個
当り約５００″細胞）シ。

ＣＯ□−インキュベータ中で温室した。９日後に。

単離した生長性のコロニーを無菌下にこの寒天表面から
９！シ、ＲＰＭＩ　　１６４０＋８−Ａｇ中で増殖させ
た。約２０時間の２倍の時間で生長したｌクローン（Ｈ
８−８ＴＪＬＴＡＮ−８Ａｇ−Ｒ１と称す）を次の実験
に使用した。Ｈ８−Ｒ１細胞はＩ（ＡＴ　−敏感であり
％ＨＡ’ｒ−培地（ＩＩＬＰＭＩ　１６４０−完全培地
＋ヒポキサンチン１１．１ｍＭ％アミノプテリン４００
ｎＭ、チミジン３１μＭ）１−当り１〜５×１０５の密
度で培饗した細胞は、増殖せず、７日間以内に完全に死
滅した。

ヒト１７７２球（末梢血液：　ＰＢＬから）：静脈血３
００ｍｊｔ−１無菌下に、ヘノクリン溶液（２Ｕ／血液
−）中に集め、単核細胞（ＭＮＯ：ＩＪンＡ球、単核白
血球）のフラクション管標準法で単一した。ＭＮＯ３Ｘ
１０をＲＰＭＩ　１６４０＋１０チＦＫＳ　１００−中
に懸濁させ、単核白血球の分離の九めに、培養器中、３
７℃で５チ００２雰囲気中で２４時間イ／キュ４−トし
た。

方法 Ｈ８−Ｒ１の断片化：細胞’ｉ：　ＪｅｔｔｌＭ、等の
方法（Ｊｅｔｔ、Ｍ、等　；　　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　
　ａｎｄ　　ｃｈａｒａｃｔｅ−ｒ（ｚ−ａｔｉｎｎ　
　ｏｆ　　ｐｌａ＠ｍａ　　ｍｅｍｂｒａｎｓ　　ａｎ
ｄ　　１ｎｔａＣ１ｎｕｃｌ−ｆ！ｉ　　ｆｒｏｍ　　
ｌｙｍｐｈｏｉｄ　　ｃｅｌｌｓ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｏｈ
ｅｍ、２５２．２１３４〜２１４２（１９７７年）参照
）で、グリセリン塗布し、１０ｍＭトリス−Ｈ０２−緩
衝液中でインキュベートすることにより溶解させた。核
ｔ−２００２（１０分、４℃）での遠心により膜嚢から
分離し、こね自体は、、５００（１（４０分、４℃）で
の遠心により沈殿された。

融合：　７２９Ｈ８−Ｒ１−核的１ｘｌＯａ’ｅヒトー
リンパ球と共にＩ’ＬＰＭ１１６４０中に、１：１の割
合で懸濁させ１例１．Ｂ、２に記載と同様に、ＰＥＧｆ
：用いて融合させた。

Ｅ（Ｓ−Ｒ，１−細胞約１×１０８個からの膜嚢の沈殿
に、ヒト−リン・ぐ球ｌＸｌＯ７個の懸濁液を重積させ
ＰＥＧ１用いて融合させた、 対照パッチ中にＲＰＭＩ　１６４０−完全培地（ＨＡＴ
不含）Ｈ８−几１−核約２　Ｘ　１０７個を入ね、２４
コスタ一点滴板４個中、Ｃ０２−インキュシータ中で培
養液中に入わた。

融合物及び対照−培養液のすべて１−、マウス−腹腔−
マクロファージ上で例１に記載と同様に、フィーダー細
胞として培養した。

培養液上澄み中のヒ）−Ｉｇの検出：マイクロ滴定ＥＬ
ＩＳＡは例１．Ｂ２の記載と同様であった。

塗布のために、免疫吸着性の精製した羊の抗ヒト−Ｉｇ
ｉ用い九。同じλに一調製物を抗−ヒトーＩｇ−ＰＯＤ
−共有物の製造のために使用した。羊−ＡＫはすべての
ヒ）Ｉｇ一群と反応し。

又 牛−資はマウスＩｇとの交叉反応は示さなかった。

結果 グリセリン−トリス−Ｈｏｔ−リーゼによる断片化二こ
の処理によりＩ（８−Ｒ１−細胞は、核含有フラクショ
ン（これは２００ｔで沈殿した）と核不含の細胞質−膜
一嚢−フラクンヨン（５０００Ｆで沈殿可能であった）
とに分かねた。

顕微鏡下では、前記双方のフラクションのどちらの中に
も、無傷のｆ（Ｓ−Ｒ１−細胞は認められなかつ九。核
は多かれ少なかれ、不規則に限らねた細胞質片で包囲さ
れていた。計測によゐと、核収率は８５チであった。嚢
−フラクションは少量のデブリス（Ｄｅｂｖｉｓ）と共
に多量の０．５〜２μの大きさの嚢を有し、認識可能の
核成分を有しなかった。

・　１’ＬＰＭＩ−完全培地（ＨＡＴ不含）中の核２×
１０７個の培養では、１２週間の観察時間で。

Ｈ８−Ｒ１−細胞の生長は、なかった。

融合物の培ＩＩ：核−リンパ球及び細胞質嚢−リンノぞ
球−融合物を９６コスタースポツトもしくは１０個の２
４コスタ−スポット上に分配させ、ＨＡＴ−添加物含有
する又は含有しない各半分を、マウス−マクロファージ
上でインキュ４−トした。融合後筒２遇目からリン・ぞ
系細胞のコロニーが認められ、こねは連続的に増加した
。

ヒト免疫グロブリンの産生：融合後２１日目罠培養液上
澄み（１９日０に完全な培地交替を行かった）をヒト免
疫グロブリンの含分に関して検査した。結果を第２ａ７
ｉび第２ｂ表に示す。

第２１表 培昔液上澄み（核質体−軸合、融合後２１日）中のヒト
免疫グロブリン検出のためのＥＬＴ８Ａ１−１−ＨＡＴ −ＨＡＴ ■＋　ＨＡＴ −ＨＡＴ ＠２ｂ表 細胞質体−融合、融合後２１日 １　　　　２　　　　　　　　　　　３１＝核一対照−
培養液 ２工ＨＡＴ含有 ３＝ＨｋＴ不含 θ〜９９の消失ｎ１ｔｔｓ性〜凝陽性とし。

１００〜２００の値を陽性とし。

〉２００の値を強い陽性とすると。

核融合によシ得られた培養液一対して次の分配が得られ
た： この結果から次のこと１知ることがで考る：溶解７ラク
シヨンを用いて製造され、る融合物は、ＨＡＴ−選択な
しに培養することができる。

この方法はサイトカラシン−Ｂ−押出しによるよシも赫
常に作業経費がかからず、融合可能な材料管高収率で生
じる。核−及び細胞質−膜一フラクション中の明確な分
離は、この２つのいずれの方法でも達成されない。主と
して核物質を有する７ラクシヨンも、主として細胞質膜
嚢を含有するフラクションも、血液からのヒトリンノぞ
球との融合の後に、試験管内で増殖可能なＡＫ−産生性
の細胞−クローンを生じる。

ＨＡＴ−添加物を含有する核−リンｉＲ球−ハイブリッ
ドとＨＡＴ−添加物を含有しない核すンノぐ球−ハイブ
リッドとの平行バッグ・は１選択培地の陰性作用を示し
ている：ＨＡＴを含有すると、１次培讐液の２３チはＩ
ｇ−陰性であシ。

４０９ｇだけが強陽性であシ、ＨＡＴ不含では、７０％
以上が強陽性であり、４％だけがＩｇ−陰性である。

例３ 免疫化されたマウスの牌繊細胞と陰性の断片化され九骨
髄腫ＡＧ８．６５３との融合材料 ヒトの甲状腺刺激ホルモン（ｈＴ８Ｈ）及びその単一さ
れたβ−鎖（β−ｈＴＲＨ）をベーリンガー〇マンハイ
ムから入手した。−ディ７コ（Ｄｉ　ｒｃｏ）の完全又
は不完全な７０インドのアジュハンス（ＯＦＡ、ＩＦＡ
）、７Ａ＝力・ラント・ＦＩＴＯ−コパスフエレス・フ
ォノ・コノ々レント・Ｔｅｃｈ、Ｏｏ。

（Ｆｌｕｋａ　ｕｎｄ　ＦＩＴＯ−Ｏｏｖｍｓｐｈｅｒ
ｅａ　ｖａｎ　Ｏｏｖｍトｅｕｔ　Ｔｅｃｈ、Ｏｏ、　
、　Ａｎｎ、Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＴＪＳＡ
　）のメトセル（Ｍｅｔｈｏｃａｌ　）　１５００゜方
法 免疫化：ＢＲ１ｂ／ｃ−？ウスをβｈＴ８１（（ＯＦＡ
中４０μｇ％腹膜内）で１次的に免疫化しく１日入１９
６日目にｈＴ８Ｈ（ＩＦＡ中５０μ、腹膜内）で、２６
６日目にアジュパンス不含の　ｈＴ８Ｈ（腹膜内）で、
かつ２９４日目にｈＴ８Ｈ（静脈内）で促進させた。（
ｇｅｂｏｏｓｔｅｒｔ）。

免疫化されたマウスの１匹から、最後の促進剤免疫化の
後３日目に１例ＩＢ、２の記載と同様に膵臓細胞（約１
ｘｔＯ）ｔ−得、各々の半分を２種の融合のために用い
た。

融合１：膵臓細胞５Ｘ１０’個及びＡｇ８．６５３−細
胞ｌＸｌ０’個を例ＩＢ、２の記載と同様に混合し、融
合させ、かつ２４スポツトプレ一ト４８枚中でマウス−
マクロファージと共ＫＨＡＴ−含有ＤＭＥＭ−完全培地
中で培養した。

融合２：Ａｇ８．６５３−細胞ｌＸｌ０’個を例２の記
載と同様に、グリセリンとｌＱｍＭ）リスーＨＣｔ−緩
衝液での段階的処置によシ溶解させた。

細胞質−膜１１−　（ＯＭＶ−）フラクション管ペレッ
ト化した（　５０００ｆ、４０分、４℃）。核融合物を
膵臓細胞７Ｘ１０’個と混合し、遠心によりＯＭＶ−沈
殿物上に積層し、ＰＥＧ？用い標準法で１例１，８．２
に記載と同様にして融合させた。この融合物をＤＩＩＪ
ＥＭ−完全培地中で、マクロファージを有する２４コー
スタ−スポットプレート２４枚上に分配し、かつＨＡＴ
−添加物なしで培讐した。

ハイブリッド細胞の抗原特異的標識化及びクローン化：
　（ＦＩＴＯ−）コノζス７エレスヲ製造業者に一般的
処方に従って、ｈＴ８Ｈで共有的に塗布しく　ＴＳＨ−
０８）、５％ナトリウムアジド溶液中で貯蔵した。ＰＡ
ＲＫ　、　Ｄ、　Ｒ，等によるＰｒ０ｅ。

Ｎｓ　ｔ　１．　Ａｃａｄ、　８ｅ　ｔ、　Ｔ）８人７
６．１９８２〜１９６６（１９７９年）に記載の方法で
、細胞を塗布されたコノ々ス７エレスによシ標識付けし
、サイトフルオログラフ（０ｙｔｏｆ　Ｉｕｏｒｏｇｒ
ａｐｈ）　ｆ用いて、大きな螢光陽性細胞１．　伊々に
スポット中及び９６コースタープレート中で貯蔵熟成さ
せた。このスポットは２４時間前に、ＤＭＥＭ−完全培
地中のマウス−マクロファージで塗布した。

ＴＳＨ−特異抗体用のｌ！１ＬＩＳＡ：塗布、培養液上
澄みのインキュベーション、基質−反応及び読み暇りは
１例１．Ｂ、２の同様に行なう。抗マウス−Ｉｇ−ＰＯ
Ｄの代りに、ＴＳ）Ｉ−ＰＯＤ−共有物管用いた。陽性
対照として、　　ｈＴ８）１−過免疫化されたマウスの
血清ｔ−１０稀釈して使用し、陰性対照として、非類縁
抗原に対して抗体（マウス−抗ジゴキシン）を形成する
クローンを用いた。

結果 融合１（無傷のＡｇ８．６５３−細胞と）からの培養液
中にも、融合２　（Ａｇ　８．６５３−リーゼー７クグ
メントと）からの培養液中にも、１４４日目、すべての
スポット中に大きなリン、ｅ系細胞のコロニーが認めら
れた。培養上澄みを用いて１４日に実施したＴＳＨ−特
異抗体検出用のＢＬＩＳＡは、第３表にまとめた値を示
した：すべての培養分で棺−ＴＳＨが検出された。

第　　３　　表 ａ） 陰性一対照（ＤＭＥＭ−完全培地ン：０００陽性一対照
（抗−ＴＳＨ−マウス血清）：３６２融合後１４日目の
培養液上澄み中の抗−ＴＳＨを検出するためのＢＬＩＳ
Ａ。

ａ）融合ｌ（不完全Ａｇ８．６５３） ｂ）＠合２（Ａｇ６５３−７ラグメント）１５５日目非
粘着性細胞を融合ｌ及び２の個々のスポットから洗出さ
せ、別個のノ々ツチ中でＴＳ−Ｈ−抗原−特異的に標識
しく基本二ノ１イブリドーマは、一般にＢ−リンノぞ球
と同様に、こねにより合成された抗体の１部を細胞膜中
に係留担持し、外向きの抗原−結合位置を有する）。

この細胞ツルター（ｚｅｌｌｓｏｒｔｅｒｓ）　１１Ｉ
：用いてクロ−ン化した。

例４ ヒ）　ＰＢＬと無傷でかつ断片化されたＡｇ３．６５３
−細胞との融合 材料 不活性へ、ｅチチスーＢ−表面−抗原（ＨＢｓｉ；Ｂｉ
ｏｔ＠Ｉｔ　）　ｆ血清蛋白質の免疫吸着により精製し
た。ヒトＨＢ、−抗体検出用ＦｔＬＩＳＡ　：マイクｏ
滴定プレーｚｃ精製１（Ｂｓｔ　（２０ｔｔｔｌｏ、９
ｅｓＮｓＯＡ溶液−ンを途布した。培養上澄みのインキ
ュベーション、共有物−及び基質−反応及び読み暇りは
例１．Ｂ、２の記載と同様である。抗−マウス−Ｉｇ−
ＰＯＤの代シに、（羊−）抗−ヒ）−Ｉｇ−ＰＯＤを用
いた。

実施 高い抗ＨＢ、−価を有するスインダー（８ｐｅｎｄ−ｅ
ｒ）のＨＰＢＬを静脈血液２００−から、フイコル勾配
−遠心によシ単離した。Ｂ−リンＪＲ球の増加のために
Ｔ−細胞を羊赤血球（Ｉｉ準法で）でロゼツト形成させ
、第２のフイコル勾配−遠心を用いて分離した。ロゼツ
ト形成しない細胞（ＨＰＢＬ（Ｂ）、）のフラクション
を、ＦＬＰＭｌｌ、６４０＋１０チオートローグプラズ
マ（ａｕｔｏｌ−ｏｇｅｎ　Ｐｌａｓｍａ　）中の細胞
５Ｘ１０’個の密度で（３０分１５６℃−加熱不活化）
　＊　ＨＢｓｔ約１０μｇと共に００２−インキュベー
ター中で培養した（培地交換は１２時間毎）、。

融合ｌ：前処理したＨＰＢＬ（Ｂ）ｌＸ１０７個をＡｇ
８．６５３１ＸＩＯ個と混合し１例１，８．２の記載と
同様に％ＰＥＧＩ用いて軸合させた。この融合物をＲＰ
ＭＴ１６４ｎ＋１０％ヒトプラズマ−１−ＨＡ　Ｔ中、
２４コースタ−スポット４枚中で培養した。

融合２　：　Ａｇ８．６５３−細胞１．ｌＸ１０８個を
グリ七リンー溶解管用いて断片化した。Ａ８．６５３−
核Ｉ　Ｘ　１０’ｍとＨＰＢＬ（Ｂ）ＩＸ１０’個を混
合し、膜−細胞質一嚢の沈殿（Ａｇ８．６５３細胞ｌ×
１０８個より）ｔ−塗布した。ＰＥＧとの融合の後に、
この融合物を、２４コスタ−スポットプレート４枚中、
Ｉ’ＬＰＭＩ　１６４０＋１０％ヒトプラズマ（Ｉ（Ａ
Ｔ−添加物不含）中でインキュベートした。

岸ノ１ 輪金１及び２のすべてのスポット中で、３日目から、非
常に大きな粘着性細胞の著るしい生長が始まった。５日
目に非粘着性細胞の主要量を注意深く懸濁させ、２枚の
新しい２４コスタ−スポットプレート上に分配させた（
例えばＡＩ、Ｂｌ及び０１）。

２８日目に融合１では１人、及びＡ３中に小さなコロニ
ーが堅められ、その他のスボ、シト中には粘着性細胞の
みが認められ、融合２では、０３を除くすべてのスポッ
ト中で複数のコロニーの多量の生長が認められた。培養
上澄みを用いて３５日実施した、肝炎−Ｂ−抗原に対す
る特異性を有するヒト免疫グロブリンの検出用ＥＬＩ８
Ａは、第４表にまとめた結果を示した： 融合１（無傷のＡｇ８．６５３．−細胞、ＨＡＴ−培地
中で培養）で、陽性の培養液は得られず。

これに反して、融合２　（Ａｇ　８．６５３−７ラグメ
ント、通常培地中で培養）の１２培養物の５個で明瞭な
杭ＨＢ、−陽性であった。

第４表 ａ） ｂ） 陰性一対照（抗−ＨＢａ−陰性ヒト血清）：　０００陽
性一対照（抗−ＨＢｓ−陽性ヒト血清）：１８５融合後
３５日目の培養上澄み中のヒトー抗−ＨＢ検出用ＥＬＩ
８Ａ。

１）融合１（無傷のＡｆ　ｓ、６ｓ３）ｂ）融合２（Ａ
ｆ８．６５３−７ラグメント）。

例５ ＨＰＢＬとヒトプラズマ細胞、−系Ｈ８５ＵＬ−ＴＡＮ
　からの７ラグメントとの融合 材料 Ｈ８８ＵＬＴＡＮをＡヤｎｏコードＣＩＩＲＬ−１４８
４として、冷凍保存された細肪物質から入手し、ＡＴ（
’１０−−処方によシ氷解させ、培養液中に入れた。

実　　施 ＨＰ　Ｂ　Ｌを、例４に記載と同じスペンダーから同様
に後処理し、試験管中、ＨＢｓｉ　で促進屯せた。

融合：　　Ｈ８５ＵＬＴＡＮ−細肪４Ｘ１０７個をグリ
セリン−溶解を用いて断片化した。膜−細肪質一嚢一フ
ラクションを５５０ｏｆ（４０分）で沈澱させ、ＨＢ−
５ＵＬＴＡＮ−核的４×１０″個とＨＰＢＬＱ３）　４
　Ｘ　１０’個との混合物をこの上に積層した。ＰＥＧ
−融合は例４の方法で行なった。この融合物を２４コス
タ−スポットプレート１２枚上で、ＲＰＭＩＩ　６４０
＋２０チＦＫ８　　＋ピル４−ト＋インシュリン（Ｎｏ
ｖｏ　２Ｕ／ｓｕ）　＋　Ｉ　Ｔｏ非必須アミノ酸（Ｂ
Ｍ）＋ＨＡＴ−添加物不含の１％メトセル１５００中に
播種した。

結９果 融合後１４日：　大きな非粘着性リン）Ｉ？系細胞コロ
ニーの生長。

例６ ヒトＴ−リンパ球の不滅化 ６．１　材料及び方法 Ｔ　＋　ＩＪンノξ球を標準法で（羊赤血球を用いるロ
ゼツト化、フイコル勾配遠心）、リンパ球全フラクショ
ンから単離し、直ちに又は３日培養の後に処理した。エ
ールリッヒ腹水細胞（ＡＴＯＯ：００Ｌ７７）を１０％
ウマ血清含有ＤＭＢＭ中で培養し、形質転換されたフラ
グメントのスペンダーとして用いた。とのＥＡＺの断片
化は、ジェン）　（Ｊｅｔｔ　）等による方法（Ｊ、　
　　Ｂｉｏｌ、　　　ｃｈｅｍ、　　　２　５　２　　
、　２１３４　〜２１４２頁（１９７７年））で、グリ
セリン溶解を用いて実施した。主として核物質を有する
フラクションを遠心分離し捨てた。ミトコンドリアの多
い細胞質膜嚢フラクション（ＣＭＶ　）　　を形質転換
のために使用した。Ｔ−リンノぞ球５Ｘ１０’個に過剰
のＰＨＡ−レクチン（旧ｆｃｏ　）　　を施４□し、Ｆ
ＡＺからのＯＭＶ−７ラクシヨンと混合し、宰温で２０
分インキｚ　Ｓ　−）　した。混合物を遠心によシ沈澱
させ、液体上澄みを完全に除去し５０％ＰＥＧ−溶液１
１で代えた。１分間の作用時間の後に、ＰＥＧ−溶液を
ＲＰＭＩ−１６４０培地の添加により稀釈し、遠心によ
多細胞を分離した。細胞を牛胎児血清（ＦＫ８．ＢＭ）
２０％番含有するＲＰＭＩ−培地中に入れ、１ｓｌ−培
養スポットプレート１２枚に分配させ、３７℃で５％０
０　ｇ雰囲気中で培養した。表面特性に基づく細胞の同
定は、羊赤血球但）−ロゼツト化を用いる（　ＫＡＰＬ
ＡＮ　、Ｍ、Ｂ、等によるＪ　、　Ｉｍｍｕｎ　ｏ　ｌ
　。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　５．１３１頁（１９７４年））を用い
、かつ双方のＴ−細胞特異性抗体０ＫＴ−３（Ｏｒｔｈ
ｏ；ＲＥＩＮＥＲＺ、Ｂ、Ｌ、　　等によるＪ、Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、１２３．１３１２頁（１９７９年））もしく
はＭＡＫ　　４−１１　（ＲＩＢＢＢＲ，Ｐ、　＠によ
るＨｙｂｒｌｄｏｍａ　１　５９頁（１８８１年））の
使用下における螢光標識された抗−ヒトー免疫グロブリ
ン（ＩＩＰ　；　Ｆｓ　＊　Ｄａｋｏ　社）ｔ−用いる
、Ｂ−細胞一典型的な膜−Ｉｆの検出のための標準的方
法によシ行なった。

６．２　結果 最初の１４日以内に、培養液中の細胞のはとんどけ死滅
した。２１日５から、細胞デブリス中に小〜中程度の細
胞のコロニーが認められ、これは連続的に増殖し次。す
べての１２枚のスポットプレート中でコロニーの生長が
見出され、１スポット当シ５０個までのコロニーが見出
された。３０日５にこのコロニーを大きな培養容器中に
移し、更に増殖させ九。

細胞をその表面マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）に基づき分析
し１次の結果を得た ａ）Ｅ−ロゼツト−陽性　　　〉９５％ｂ）ＯＫＴ−３
−陽性　　　　＞９０％ｃ）４−１１−陽性　　　　　
、＞９０％ｄ）　　Ｉｆｓ−陽性　　　　　　　〈　５
％６．３　評価 ＥＡＺ（永久マウス細緻糸）からグリセリン溶解により
得ることのできるフラグメントは、単離されたＴ−リン
ノＲ球とのＰＥＧ　　−融合の後に、永久的に培養液中
で生長する細胞を生じ、これは表面特徴に基づき、明白
ＫＴ−リンノξ球として同定可能である。

例７ ヒト内皮細胞の不滅化 ７．１　材制及び方法 すべての培養容器に細胞の播種の前にゼラチンを層状に
装入した。この培地は、几ＰＭＩ−１６４０と２０％Ｆ
Ｋ８含有培地１９９（ＢＭ）との１：１−渭合物よシ成
った。ヒト内皮細胞をシャツ７エ（Ｊａｆｆｅ）笠にょ
る方法（Ｊ、　（ｌｌＩｎ、　　Ｉｎｖｅｓｔ、　　５
２，２７４５〜２７５６頁（１９７３年））で、コラ−
ゲナーゼ−溶液（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、新しい腹帯の
静脈から得、形質転換の前に１次培養液の添付によシ約
１４日間にわたシ増殖させた。

形質転換のために、粘着性で生長する内皮細胞をトリゾ
シンーＥＤＴＡ−溶液（ＢＭ）を用いて溶解させ、６．
１に記載と同様に脹濁液中で、ＥＡＺ　からのＯＭＶ−
フラクションと融合させた。このように処理した細胞を
７５１−培養容器１個当り５Ｘ１０’個の細胞密度で播
種し、ＣＯ３−インキュベーター中で培養した。動態の
ために、そ・れぞれ、ＯＭＶ−フラクション不含の１次
培養液からの内皮細胞の小部分をＰＥＧ−溶液で処理し
く偽融合）、再培養した。細胞が、培養容器の底部上で
裂目のない細胞叢を形成したら直ちに、これらをトリプ
シン−ＢＤＴＡ−溶液を用いて溶解させ、１：３の割合
で、新しい培養容器に移した（通過）。

７．２　結果 ＯＭＶ−フラクションと融合した内皮細胞は、播種の後
に２０〜３０％の効率で付着し、２〜３日以内に生長し
て集合細施叢になった。

偽融合した細胞は、はぼ同じ効率で付着するがまったく
増殖せず（集合細胞叢を形成せず）、約２１日以内に完
全にそ滅した。未処理の内皮細胞はすべて、第３通過で
最大まで増殖し、次に、生長を調節し、培養容器の底か
ら団塊崩壊下に溶解し、分解した。異なる計１８！ｉ！
ｌ帯からの内皮細胞を含有する８種の異なるノ々ツチ中
で、ＯＭＶ−処理した細胞は、問題なく、１０通過にわ
たシ生長した。形質転換された内皮細胞は、生存能及び
分裂能を失なうことなしに、液体窒素中で貯蔵でき九。

７．３　評価 と）−１９内皮細胞は形質転換処理をせずには、本発明
によシ第３通過にわたシ培養できなかったので、文献に
記載の知識（例えば（１ｒ１ｍｂｒｏｎｅ、　Ｍ、Ａ、
　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　　ｉｎ　Ｈａｅ　−ｍｏｓｔｍｓ
ｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、　３巻；Ｍｍｃ
ｉｓｇ、　　Ｔ−等によるＪ、　Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏｌ
。

９１．４２０〜４２６頁（１９８１年））は、確認され
た。エールリッヒ腹水細胞からのミドコンｒリアの多い
ＯＭＶ−７ラクシヨンとの融合によシ、内皮細胞の培養
特性は、これらが限界の第３通過を越えて増殖可能であ
るように変化した（かつ第２３通過時にも、疲労現象を
（Ｅｒｍｕ　ｎｄｕｎｇｓｅｒｓｃｈｅｉｎｕｎｇｅｎ
）示さなかった） 例８ ヒト骨髄腫細胞の不滅化 ８．１　材料及び方法 骨髄細胞含有組織を、股すンＡ球転移部の外科的切除に
よシ得、無菌条件下で小立方体に切断し、融合するまで
、液体窒素中に貯蕨した。ＥＡＺからのＯＭＶ−７ラク
シヨンを６．１に記載と同様にして製造した。

融合の前に、この骨髄細胞含有組織を解凍させ、トリプ
シン−処理によシ単細胞懸濁液を製造した。大きな褐赤
色骨髄騨細胞を。

フィコルー勾配遠心によシ付着すンノぐ球を除き、６．
１の記載と同様に、ＯＭＶ−フラクションＰＥＧ−作用
下に融合させ九（骨髄腫約４ＸＩＯＩとＢＡＺ約ｌＸｌ
０”からＯＯＭＶ　）。融合調節のために、ＯＭＶなし
ＫＰＥＧで処理した骨髄腫細胞４Ｘ１０ＳＮを用いた。

細胞を融合の後に１スポット１個当や細胞ｌＸｌ０’個
の密度でＲＰＭＩＩ　６４０　＋２０１６ＦＫＳ中に播
種し、３７℃で５％Ｃ０１−雰囲気中で培養した。

８．２　結果 ＯＭＶと融合した骨髄腫の培養分４個すべてで、２８日
目から、典型的な色を有する細胞のコロニーが半粘着性
細胞塊の形で生長し、これ祉連続的に増大した。偽融合
した細胞の対象−培養では、細胞増殖は起こらず、むし
ろ、８日目から、顆粒化が増化し、２２日目には細胞破
片のみが培養液中に存在した。

８．３　評価 冷凍保存した転移組織からのヒト骨髄腫細胞は、ＯＭＶ
−融合により試験管内で培養−及び増殖可能な細胞に変
えることができた。これに反して、同じ起源の偽融合し
た骨髄腫細胞は、その他は同じ培養条件下で死滅した。

例９ 不滅化されたヒト内皮細胞中への真核性ＤＮｈ−Ｚクタ
ーの導入 ９．１　　ヒルト上澄（旧ｒ　ｔ−ｊｌｊｂｅｒｓｔａ
ｎｄｅｎ％’）蘇生（サウザン、プロティング８ｏｕｔ
ｈｅｒｎｂ１゜を日ｎｇ）による細胞内の形質転換され
た物質の検出。

９．１．１　　材料 プラスミドＺ　−ＰＢＲ３２２／ＲｃｈｒβＧ−△４２
５　Ｂ　（Ｄｉｅｒｋｅｍ、Ｐ、等によるＰｒｏｃ　。

Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ８Ａ　７８　、
１４１１〜１４１５頁（１９８１年））はζ２．０７０
塩基対（ＢＰ）ウサギ−！−グロブリ／−遺伝子フラグ
メント１個を有する。

ｐＢＲ３２２の０１ｇ−Ｐｖｕ　　Ｉ−フラグメントを
、３．０３９　ＢｐＨｐｓ　Ｉ　−ＢｓｍＨＩ　　−フ
ラグメント〔これはＳＶ４０の先の遺伝子の全域及び後
の遺伝子の当初域を有する（　Ｔｏｏｔｓ。

Ｊ、（１９８０）の＠ＤＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓ
ｅｓ、”Ｊ＊　　Ｔｏｏｚｅ、等による、第２版（’１
ｏｌｄ　５ｐｒｉ　−ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ　ｕｎｄ　Ｂ、　Ｗｉｅ　−ｒｉｎｇａ　　
竺による０ｅｔｕｓ　−ＵＯＬＡ　　Ｓｙｍｐｏａ　−
ｉｕｍ　ｏｎ　ｇｅｎｅ　ｒｅｇｕ’ｔｍ口ｏｎ　１９
８２））で換えた。このプラスミドを以後ｐＢＲ３２２
ＲβＧ　８Ｖ４０と称する。

９．１．２　　方法 ヒト内皮細胞を、例７の記載と同様に不滅化しかつ生長
させた。細胞１０６個当Ｊ）ｂｐＢＲ３２２ＲｐＧＳＶ
４０　６ｐｆ及び超音波処理された慣胸腺４μｔを、燐
酸カルシウム沈澱法（Ｇｒｓｈａｍ−Ｆ−Ｌ、等による
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２．４５６〜４６７頁（１９７３
年）及びＷｉｇｌ−ｅｒ、Ｍ＃笠による０ｅ１１．１４
．７２５〜７３１頁（１９７８年）参照〕の使用下にＤ
ＮＡ　　）ランスフエクションした。このトランスフェ
クションの１０時間及び４０時間後にヒルト上澄み←旧
ｒｔ　ＩＪｂｅｒｓｔ’ａｎｄｅ’　）を作った。（Ｈ
ｉｒｔ　、Ｂ−Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　　２５．３５
５〜３６９）ｊ（１９６７年）参照）。

とのヒルト上澄みを１％アガロースゲル上で分離し、サ
ウザン法（５ｏｕｔｈｅｒｎ、　　Ｅ、　Ｍ。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９８　５０３〜５１７頁
（１９７ｓ年）参［）でニトロセルロース紙上に移した
。プラスミドｐＢＲ３２２ＲβＧＳＶ４０を３２ｐでリ
グビイ（Ｒｔｇｂｙ）等（７）＝ツク−トランスレーシ
ョン法（Ｒｉｇｂｙ、　　Ｐ。

Ｗｌ等のＪ、　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ、　　１１３．２
３７〜２５１ｊ（１９７７年）参照〕で標識し。

伝達性ＤＮＡとニトロセルロースフィルター上でハイブ
リダイゼーションさせた（Ｍａｎｉａ口Ｓ。

Ｔ、等によるＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｏｌｏｎｉｎｇ　　
。

０ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ（１９８２年）参照〕。どのフィルターをレン
トゲンフィルム上で−７０，’Ｃで露光させた。

９．１．３　　結果 プラスミドｐＢＲ３２２ＲβＧ　５Ｖ４０−ｔ’）　、
）ンスフエクションされたヒト内皮細胞は、そのアガロ
ースゲル上での運動性に関して真性シラスミげに相応す
る強いハイブリダイゼーション信号を示ス。このトラン
スフェクション４０時間後の細胞のヒルト上澄みの信号
と、トランスフェクション１０時間後の細胞の信号とを
比較すると、ハイブリダイゼーション信号の弾さけ４〜
５倍増加した。

導入されたプラスミドよりも小さいＤＮＡ一種のハイブ
リダイゼーションが同様に観察された。

トランスフェクションされずに不滅化されたヒト内皮細
胞中ではこの信号は測定不能であった。

ＨｅＬａ−細胞をプラスミドｐＢＲ３２２ＲβＧＳｖ４
０　でトランスフェクションスルト、ノ１イブリダイゼ
ーション信号の一様の強度分配が望められた。

９．１．４　　評価 シラスミドｐＢＲ３２２ＲβＧ　　ＳＶ４０でトランス
フェクションされたヒトの不滅化上皮細胞のヒルトー上
澄み中で、ＤＮＡ−ハイブリダイゼーションを　５２．
−標識されて挿入されたプラスミドで測定されるが、ト
ランスフェクションされていない細胞ではｌｌｉ定され
ない事実は、真核性細胞系中にベクターが導入されたこ
とを立証している。トランスフェクションされた細胞で
のハイブリダイゼーション信号はトランスフェクション
の４０時間後に、トランスフェクションの１０時間後の
それよりも４〜５倍の強さを有することの観察は、トラ
ンスフェクションされたシラスミｒが細胞内で複製され
たことを推測させる。

９．２　プラスミドｐＢ］’Ｌ　　３２２　　ＲβＧ　
ＳＶ４０でトランスフェクションされた不滅化されたヒ
ト内皮細胞中へのウサギ−β−グロブリン特異性転写の
立証。

９．２．１　　側斜 ヌクレアーゼＳｉ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及び
慣腸ホスファターゼとして、ペーリンガー・マンハイム
（Ｂ’ｏｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍ＠ｎ　−ｎｈｅｉｍ）社の
市販製品を用いた。

９．２．２　　方法 不滅化されたヒト上皮細胞を例９．１．２の記載と同様
に増殖させ、ウサギ−β−グロブリン−遺伝子誉有ベク
ターでトランスフェクションシ友。このト２ンスフェク
ションノー８時間後に細胞２×１０−個を溶解させ、Ｒ
ＮＡをＬｉ０Ｉ−尿素一法（Ａｆｆｒｓｙ、　ｏ、　　
等によるＥｕｒ、　Ｊ、旧ｏｃｈｅｍ、　１０７．３０
３〜３１４頁（１９８０年）参照）で抽出した。

ウサギ−β−グロブリン特異性ハイブリダイゼーション
ゾンデの製造。

ブーｙスミドｐＢＲ３２２ＲβＧ　ＳＶ４０をＨａｅＷ
ｉを用いて崩壊させ、＋１３５から−７５まで拡がった
７ラグメント（Ｄｉｅｒｋａ、　Ｐ。

等によるＰｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７８．１４１１〜１４１５頁（１９８
１年）及びＶａｎ　　０ｙｅｎ、Ａ、等による８ｃｌｅ
ｎｃｅ＝２０６．３３７〜３４４Ｊｊ参照〕を２チアガ
ロースゲル上でＪ［Ｉｎ、ＤＦｉＡＥ−セルロース−ク
ロマトグラフィにより更に精製した〔ＭＭ　Ｉ　ｌ　ｅ
　ｒ、　Ｗ、等によるＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１
２４．３４３〜３５８頁（１９７８年）参照〕、このフ
ラグメント會、清勝ホスファターゼを用２ いて、かつ　Ｐ−デホスホル化し、γ−５２ｐ−人ＴＰ
及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで、文献（Ｍａｎｔ
ｅｉ、Ｎ、等によるＧｅｎｅｌＯｌｌ　　８頁（１９８
０年））の記載と同様にして標識した。

ヌクレアーゼＳ１記人 キナーゼで処理したフラグメントｔ−１Ｂ・コリーｔ−
ＲＮ人（Ｂ′ｏ′ｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）
１０μ２と共にエタノール全通して沈殿させ、Ｎａ０ｔ
０．４Ｍ／１％Ｅ　Ｄ　Ｔ人１ｍＭ／ｌ、　ノ：イプス
（Ｐｉｐｅｓ）−緩衝液（ｐＨ６，４）４０　ｍＭ／を
及びホルムアミド８０チよりなるもの１００μを中に溶
かした（Ｍａｎｔｅｉ、　Ｎ、等によるＮａｔｕｒｅ２
８１．４０〜４６頁（１９７９年）参照）。

細胞ＲＮＡ（＝２５μｒ）’ｔＸ空乾燥させ、緩衝液中
の前記のように溶かしたゾンデ（Ｑ　、　１　ｐＭｏ　
１５３０００’Ｏｃｐｍ）１０μを中で変性させ、ガラ
ス毛細管中に封入し、４８℃で１６時間ノ・イブリダイ
ゼーションさせた。対照実験では、こ〜のゾンデ全ウサ
ギ−β−グロブリンｍ　−ＲＮＡ（Ｍｉｌｅｓ）トノー
イプリダイゼーションさせた。

試料はＮａ０Ｌ０．２Ｍ／１．、酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ４，５）　５０　ｍＭ／１．、　Ｚｎ８０４１　
ｍＭ／１．及びグリセリン０．５　ｑｂよりなるもの１
００μｌで稀釈し、ヌクレアーゼ８１５００単位と共に
３０℃で６０分間インキュベートした（　Ｗｅａｖｅｒ
　％Ｒ１等による　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、
　７．１１７５〜１１９３（１９７９年）参照〕 試料ｔフェノールで処理し、Ｅ・コリー１−ＲＮＡＩＯ
μｔと共にエタノールによシ沈殿させ、８０チエタノー
ルで（−７０℃で２０分）洗浄し、真空乾燥させ、染料
溶液（ブロムフェノールブルー０．０５％、キーノロキ
サノール０．０５　％、Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　１ｍＭ／ｌ、
ホルアミド９０ｖ／ｖ％）５μを中に溶かし、沸騰水浴
中で２分間加熱し、５係ポリアクリルアミドゲル上の電
気泳動にかけた（トリス塩基８９　ｍｕ／ｌ　。

ホウ酸８９　ｍＭ／１　、　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　１ｍＭ／
を及び尿素７Ｍ／ｌ）。このゲルをフジ社（Ｆｌｒｍａ
　Ｆｕｊｉ）のレントゲンフィルム及び補強スクリーン
を用いて、−７０℃でオートラジオグラフ法にかけ友。

９．２．３　　結果 保繰されｆｃ７ラグメントの大きさは、寸法マーカー（
Ｇｒｏβｅｎｍｉｒｋｅｒｎ％ｐ−標識されたｐａｌ’
Ｌ３２２　Ｘ　Ｈｉｎｆｌ及びｐＢＲ３２２ｘＨａｅｕ
ｌ）との比較によシ評価しり、トランスフェクションさ
れていない細胞は、まったくグロビン特異性ハイブリダ
イゼーション信−号（再生されたハイブリダイゼ−７ョ
ンゾンデ＝　２１０Ｂｐは例外）を示さなかった。トラ
ンスフェクションされ、不滅化され次ヒト上皮細胞から
、大きさが８０〜９０　Ｂｐで測定されたＲＮＡ保膜さ
れた２個のフラグメントを抽出した。この種の転写物は
、グロツクｘｈ　）’　（ＧｒＯａｖｅｌｄ）等による
ネイチュア（Ｎａｔｕｒｅ）２９５．１２０〜１２６頁
（１９８２年）及びワイルド（Ｗｅｉｄｌｅ）Ｕ、等に
よるネイチュア（Ｎａｔｕｒｅ）（１９８１年）によっ
ても発見されておシ、内部の潜在的分割位置の存在がウ
サギ−β−グロブリン−遺伝子上に記載されている。ク
ナギーβ−グｐプリン遺伝子のキャゾ位置から得た転写
は確認できなかった。比較実験でＨｅＬａ−細胞ｔプラ
スミドＰＢＫ３２２　ＲＧ８Ｖ４０でトランスフェクシ
ョンした。正しく開始された転写物（１３５Ｂｐ保＠）
並びに内部の潜在的分割位置の存在に基因する転写物（
Ｇｒｏｓｖｅｌｄ、Ｇ、等によるＮａｔｕｒｅ　２９５
．１２０〜１２６頁（１９８２）及びＷｅ五ｄ　１　ｅ
。

Ｕｏ等によるＮａｔｕｒｅ（１９８３年）参照）を、Ｓ
ｌ−記入により測定した。

９．２．４　　評価 ウサギ−β−グロブリン特異性転写物がウサギ−β−グ
ロビン遺伝子を有する８Ｖ４０起源真核性ベクターを用
いてトランスフエクシ目ンさせた不滅化されたヒト上皮
細胞中で確認可能である事実は、この細胞系が、再導入
されたクローン化された遺伝子の発現のための宿主系と
して好適であることを示している。

４：’？−・。

第１頁の続き 優先権主張　０１９８２年１２月９日■西ドイツ（ＤＥ
）■Ｐ　３２４５６６５．４ ■発　明　者　ヴインフリート・アルベルトドイツ連邦
共和国ベール・モー スシュトラーセ１０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　正常の動物及びヒトー〇細轡ヲ試験管内での培養
   可能性に作用する生物学的成分と共に融合することによ
   り永久培養可能な動物及びヒトの細胞系を得る場合に、
   正常の動物及びヒトの細胞と単独では増殖能力のないト
   ランスフオームＬｌ細胞の細施フラ　り　ショフト、全
   融合させ１選択物質不含の培地中で培養することを特徴
   とする。永久培養可能な動物及びヒトの細胞系を得る方
   法。 ２、　ポリエチレングリコール又はセンダイーウィルス
   の存在で融合を行なわせる。特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ３　サイトカラシンＢを用いる処理により得られ九トラ
   ンスフオームした細胞の核質体又は細胞質体を用いる、
   特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。 ４　トランスフオームし念細胞の溶解又は機械的崩壊に
   より得られた細胞フラクグメント殊に核フラクション又
   は細胞質フラクションを用いる。特許請求の範囲第１項
   又は第２項記載の方法。 ５　融合のために、ミトコンドリア含分の多い細胞質フ
   ラクションを特徴する特許請求の範囲第１項又は第２項
   記載の方法。 ６　トランスフオームした細胞として、骨髄腫細胞、エ
   プスタインーノセールーウイクス接種した細胞又は腹水
   腫瘍細胞を特徴する特許請求の範囲第１項〜第５項のい
   ずれか１項に記載の方法。 ７　同種及び／又は異種細胞産生物、を得るか又は作用
   物質を試験するために、正常の動物及融合させ１選択物
   質不含の培地中で培養して得た永久培養可能な勢物及び
   ヒトの細胞系を使用することを特徴とする。同種及び／
   又はｎ種細胞産生物例えばモノクローン性抗体。 凝固因子及びり／ホカインの製法。 ８　製造した細胞系のノ・イブリッド細胞から。 所望の細胞二二物を得るための遺伝子又はメツセンジャ
   ー１’ＬＮＡを取得し、適当なきフタ−を用いて、微生
   物殊にＥ・コリー中でトランスフォーメーションを行な
   い、このトランスフオームした微生物から細胞産生物ｔ
   −取得する。特許請求の範囲第７項記載の方法。