SU1109437A1 - Способ культивировани гибридом - Google Patents

Abstract

СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ П1БIРВДОМ на питательной среде с добавлением сыворотки животных, отличающийс  тем, что, с целью увеличени  продолжительности продуктивного периода синтеза антител, в качестве сыворотки животных используют свиную сыворотку.

Description

(Л

с:

789 Фиг.1

О СО 4 ОО

vj

to f5 21

ЦО Изобретение относитс  к иммуноло гии и касаетс  способа культигзирова ии  1п vitro гибридом (искусственно созданных гибрнцаьк клеток, продуцируюгцих моноклоиальные антитела) и может найти пр.иг 1енение в медищ-гне, ветеринарии, вирусологии, онкологии биохимии, биотехнологии дл  пол ™ени  определенно заданных мсноклонал ных антител, которые используютс  например, дл  ранней диагностики рак и других заболеваний как человека, так и животных; дл . высокоэффективной очисткч и получени  биологически активных белков (например, интер ферона); дл  хи;-гао- и иммунотерапии В 1975 г создан:. соматические гибриды клеток млекопитающих (гибридомы ), Которые продупировали чистые или моноклональные антитела. Препараты моноклональных антител получают либо из ггсцитной Ж1адкости при культивировании гибридом in vivo либо из культурал1)Ной жидкости (клеточный супернатант) при культивирова нии гибридом in vitro. Дл  этого отбирают те гибридомы, которые обладают нар большей стабильностью и высокой продуктивность о. Под стабильностью подразумеваетс  длительное сохранение способности к образованию антител (т.е. .антителопродуцирующей способности) при непрерывном культивировании . Продуктивность - это способность клеток клона производить определенное количество антител. Ста бильные клоны с разной продуктивностью удаетс  на раннем эт пе выделени  гибридом, но значитель на  часть клонов (может быть 2-3) обычно тер ет способность к синтезу антител через 3-10 недель непрерывно го культивировании. При этом утрата основного признака гге зависит от спо соба культивировани  in vivo (асцитна  форма) или in vitro. Это  вл етс  одним из основных факторов., преп тствующих промыишенному получению моноклональны: антител. Нужно oTi eтить , что межвидовые гибридомы (мышь х. человек, крыса х человек и т.д.)  вл ютс  всегда нестабильными дак как происходит быстра  злиминаци  хромосом человека. Поэтому увеличение продолжительности продуктивного периода синтеза антител такими гибри домами хот  бы на несколько неделЬ}  вл етс  болькшм успехом. 72 Известен способ культивировани  гибридом на питательной среде ДНЕМ (питательна  среда Игла, модифициронаина  Дальбекко) с добавлением эмбриональной сыворотки коров Cl J Недостаток этого способа заключаетс , в TDM. что при lienpepbiBHOM культивировании гибридом в такой питательной среде они тер ют свою исходную антителопродупирующую способность (стабильность) через 310 недель культивировани  (в зависимости от свойств гибридомы). Другой недостаток этого способа состоиг в необходимости добавл ть в питательную среду эмбриональную сыворотку коров, котора   вл етс  весьма дорогосто щим и дефицитным компонентом питательной среды. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату  вл етс  способ культивировани  гибридом на питательной среде Дг-IIi.M с добавлением эмбриональной сыворотки коров и человеческих Э;1дотелиалы1ых клеток или их клеточного суперната1 та (HECS) . Добавление в питательную среду дл  гибридом че .ловеческих эндотелиальных клеток или их члеточного супернатанта позвол ет увеличить период способности продуцировать антитела при непрерывном культивировании гибридом на 34 недели (так, клон гибридомы, полученной после сли ни  человеческих лимфоцитов и Sn 2/0 - Ag 14 миеломными клетками мышей, сохран л способность продуцировать антитела при непрерывном культивировании его в питательной среде, содержащей человеческие эндоте-гшальные клетки в течение 10 недель, в то врем , как тот же клон, культивируемьш без такой добавки, сохран л способность продуи;иро1зать антитела только в течение 7 недель) L23. Недостаток известного способа состоит в том, что гибридомы сохран ют свою стабильность не более 12 недель. Кроме того, дл  его осуществлени  необходимы (кроме дефицитной эмбриональной сыворотки коров) эндотелиальные человеческие клетки, которые получают из пупочного канатика (вены) эмбриона человека,. Это очень осложн ет и удорожает осуществление способа и ограничивает его применение при крупномасштабном культивировании. 3 Целью изобретени   вл етс  уветиченне продолжительности продуктивного периода синтеза антител гибтидомами , путем создани  селективного преимущества дл  антителопродуцирующих клеток Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу культивировани  гибридом на питательной сред с добавлением сыворотки животных в качестве сыворотки животных исполь . зуют свиную сыворотку. Нестабильность гибридом, т.е. потер  ими способности производить антитела, св зана с обиюй тенденцией клеточных гибридов потерь хромосом в процессе их культивировани . Так, дл  гибридомы мьпиь X мышь утрата клеткой хот  бы одной хромосомы из трех, в которых наход тс  все гены иммуноглобулинов у мьрлей, ведет к этой клеткой признакгг антителообразовани , а затем в процессе дальнейшего культивировани  весь клон тер ет этот признак, поскольку дл  многих клонов гибридом селектив ное преимущество имеют клетки, утра тившие способность образовани  анти тел. Таким образом, повысить стабил ность гибридом можно лишь созданием условий, в которых бы селективное преимущество имели антителопродуцируюш 1е клетки. Вз то 3 клона гибридом (мышь X мышь), полученных известным способом, которые культивировали в среде даШМ с добавлением 5%-ной свиной сыворотки и параллель но в этой же среде, но с добавлением 10%-ной эмбриональной сыворотки коров.. Концентрации сывороток выбраны с таким расчетом, чтобы не было различий в скорости пролиферации и в конечном урожае клеток в 1 мл. Периодически проводили тестирование клеточных супернатантов дл  опр делени  антителопродуцирующей спосо ности клонов. Результаты этого продоллштельного опыта (9 мес) показал что: а) клоны гибридом различаютс  исходно по своей стабильности и про дуктивности; б) из трех клонов два клона потер ли антителопродуьщрующу способность через 4-9 недель культи вировани  в .среде с эмбриональной сывороткой коров; один из них при культивировании .в среде со соиной сывороткой сохран л исходную актив™ кость в течение всего опыта (т.е. 9 мес), активность второго (Н14)о 7 не.тель кульпшироззни  no;i растала на З-Л пор дка и оставалась ; высоко -; yponiie л.о конца опыта; в) третий клоп оказалс  исходно в ы с о к о с т а б ил ь н ым и вые о к о а к т и. в i ым и оставалс  такиь при культивировании с использованием обеих сывороток; г) возросша  активность гибридом .ы Н14 бьша высокостабт1льной и соxpaHHjiacb в да,Г;Ь ейшем при куггьтивм-роваш-ги в среде с добавлением как сви1ой, так и эмбриональной сыворотки . TaKHN образом, сврпа  сыворотка создает селект11вные преимущества дл  антптелопродуцируопп-ix клеток, П р и м е р 1 . Культиитп сЕппис гибрпдомы НЯ12.2I,9. Пл  культтпзировалп   исип Т; овали клетки Пбридомы 11,112.21.9, полученной путег- сли ни  клеток селезенки мышей линии ВАР В/С, иммунр зированпых фагом л, с .1:гломными мыц11П1Ыми клетками Sp 2/0 - Ар,/14 и последуюего отбора гибридного клона, обладающего способпостью продуцировать антитела в фагу Д, Титр антител в суперпатанти: (т.е. антителопродуцирую1иую способность гибpидo iы) определ ли известным способом. Исходна  антитслопродуцирующа  способность гибpидo iы 12.21.9 выралсена в og % инактивировапного фага Л и 2,0 (фиг. 1, точка 2 на оси у), это означает, что при добавлении определенного количества супернатанта (0.3 iл) к oпpeдeлe Iпo y количеству фаговых частиц (250 частиц ) инактивмруетс  100% 4S; 3biA часСуспензию исходных клеток гибридо: .;ы Н/1 12.21.9 разделили на две части. К.четки каждоГг по)Ц1П1 отмыли центрифугированием (5 мин, 1000 об/мин) в бессывороточ ой среде ДМЕМ (среда ДМЕМ - известна  среда Hroia, модифицированна  Дальбекко). Первую порцию клеток (510 кл) поместили во флакон КаррелЯ(с1 60 мм), содержащий 10 мл среды ДМЕМ с добавлением 5%-ной свиной сыворотки, использовали свиную сыворотку, пол ггенную от животных в возрасте 8 мес, стерилизованную фильтрованием (фильтр №шлипор 0,22 м) и инактивировапную нагреванием до 56°С в течение 30 мин. Свиную сыворотку добавл ли в концентрации 5%, обеспечиваюа ей такую же скорость пролиферации и конечньй урожай клеток в 1 tln, г-сакую обесиечгтваузт 10. л   концентраци  эмбрггона.пышй сыворотки коров (обычно примен ема  при культивировании гибридом) и культм-вировали при обьпипзК услови х {±37°С5 содержание:- СО в атмосфер-ном воздухе от 5 до 10%) до образовани  моносло  (через 2-3 сут культивировани  j пересевали i3 такой же нропорции, В процессе иепрерывгого ку.гп тивиро-вани  гибридомного клона еженеде. провер ли его антителопродуцирую щую способность, котора  представлена на фиг, 1, крива  1, Каре видно из этой кривой, культгп ирование гиб ридомы НЛ 1 2 ,, 2 1 . 9 па питательной среде с добавлеиргем свиной сыворот ки позвол ет сохранить ее исходную антителопродуцирующ5.о способность на прот жении (по крайней мере) 40 недель непрерывного культивировани Дл  сравнени  вторую порцию клеток (5-10 кл) г Мб РИД омы И/1 12.2К9 выращивали параллельно на тг1кой же питательной среде ДМЕМ с добавление 10%--ной эмбриональной сыворотки коров , в таких же услови хи с такой же еженедельной проверкой антителопродуцирующей способности непрерывн культивируемого клона Результаты-, определени  а}-.тителопродуцирующей способности гибридомы- Н /Т 12 о 21. 9 при ее непрерывном к льтивировании на питательной среде с добавлением эмбрион 1льной сыворотки короз представлены на фиг. 1, крива  2, Как видно из этой кривой, ку.1тьтивирова- ние гибридомы по известному способу позвол ет сохранить ее исходную антител опр одуцирующую способность тол ко в течение 3 недель. Уже через 7 недель такого культивировани  антител опр одущфующа  способность уменьимлась в 10 раз (точка 1 па оси у), т.е. активность сзшернатант вг 1рал енна  в og % инактивР1рованног фага А, равна 1, что означает, что при добавлении 0,3 мл супернатанта к 250 фаговым чacтицa i ннактивирует 10% фаговых частиц, а через 9 недел к льтивировани  антител опр оду гтирующа  активность исчезает совсем (выживает 100% фаговьк частиц)о П р и м е р 2, Культивирование тнбридомы И Л 14.36 Д.). Дл  культивировани  использовали тслетки гибридомь НЛ 14,36.0, получе ной, как описано в примере , Титр антител в супернатанте .определ ли известным способом. Исходна  антителонродуцирующа  способность гибридомы Н 14,36.0 выражена в fog % инактивированного фага / и равна 2 (фиг, 2, точка 2 на оси у). Суспензию исходных клеток гибридомы Н 14.36.0 разделили на 2 части-, клетки каждой порции отмывали центрифугированием в бессывороточной среде и культивировали кажду порцию так же, как описано в примере 1. Еженедельно определ ли антителопродуцирующую способность каждого от/1ельг- о культивируемого клона. График а1гтителопродуцирующей способности гибридомы при непрерывном ее культивировании представлен на фиг. 2. Как ьлщно из этого графика, культивирование гибридомы НЛ 14.36.0 на питательной Среде с добавлением свиной сыворотки - крива  1 не только позвол ет сохранить исходную антителопродуцирующую способность гибридомы в течение длительного времени, но, в данном случае, и повысить ее FI 10000 раз. Как видно из кривой 1, после 5 недель непрерывного культивировани  гибридомы в присутствии свиной сыворотки ее антителопродуцирующа  способность стала возрастать и на 7-й неделе увеличилась в 10000 раз.. На графике 2 это соответствует точке 6 на оси у, это означает , что при добавлении 0,3 мл нераз веденного супернатанта инактивируетс  Ю фаговых частиц, тогда как начальный или исходньй супернатант инагливировал 10 фаговых частиц, Определение антителопродуцирующей активности второй порции гибридомы НД 14.36,0 при непрерывном культивировании в присутствии эмбриональной сыворотки коров (фиг. 2, крива  2) показалоj что в этом случае исходна  активность сохраьшлась в течение не более 2 недель, и уже через 5 недель культивировани  этот клон полностью потер л антителопродуцирующую способность . Таким образом, предлагаемьй способ кзшьтивировани  гибридом в отличие от известного позвол ет увеличить продо ,гокительность продуктивного периода синтеза антител гибридомами в 10 раз и уменьшить стоимость производства антител.

1т

О

г-г-1-//-Г/А-Го-О-ОУ/О/ЛО .1, L /-L-7/LJ

W if ЧГ

в

Claims (1)

1. СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГИБРИДОМ на питательной среде с добавлением сыворотки животных, отличающийся тем, что, с целью увеличения продолжительности продуктивного периода синтеза антител, в качестве сыворотки животных используют свиную сыворотку.

   -// | ί— -г----------—г

   JL— 1______I I у/ 1 χ/. Ι,,./4-X.

   7 8 9 Ю 15 21 U0

   Фиг. 1

   1 10943 7