JPH09131179A - 動物細胞培養用添加剤 - Google Patents
動物細胞培養用添加剤Info
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- JPH09131179A JPH09131179A JP7317576A JP31757695A JPH09131179A JP H09131179 A JPH09131179 A JP H09131179A JP 7317576 A JP7317576 A JP 7317576A JP 31757695 A JP31757695 A JP 31757695A JP H09131179 A JPH09131179 A JP H09131179A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 動物細胞、特に抗体産生ハイブリドーマの培
養に際しての、ＦＣＢＳの使用量低減化、ＹＬＰ使用に
おける共存物質の不要化、ＦＣＢＳ単独添加の場合に比
しての細胞増殖効果および目的有用産物産生効果の顕著
な促進、およびＦＣＢＳとＹＬＰとを併用した場合に比
しての目的有用産物産生効果の顕著な促進、並びに目的
有用産物、特に抗体の単離精製の容易化を可能にする動
物細胞培養用添加剤の提供。 【解決手段】 卵黄リポタンパク質（ＹＬＰ）とウシ胎
児または子ウシ血清（ＦＣＢＳ）中のＩｇＧを除去した
血清成分（ＦＣＢＳ−Ｇ）とを組み合わせてなる動物細
胞培養用添加剤。
養に際しての、ＦＣＢＳの使用量低減化、ＹＬＰ使用に
おける共存物質の不要化、ＦＣＢＳ単独添加の場合に比
しての細胞増殖効果および目的有用産物産生効果の顕著
な促進、およびＦＣＢＳとＹＬＰとを併用した場合に比
しての目的有用産物産生効果の顕著な促進、並びに目的
有用産物、特に抗体の単離精製の容易化を可能にする動
物細胞培養用添加剤の提供。 【解決手段】 卵黄リポタンパク質（ＹＬＰ）とウシ胎
児または子ウシ血清（ＦＣＢＳ）中のＩｇＧを除去した
血清成分（ＦＣＢＳ−Ｇ）とを組み合わせてなる動物細
胞培養用添加剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、動物細胞培養用添
加剤に関する。さらに詳しくは、動物細胞の培養のため
の基礎培地に添加して、動物細胞、特に抗体産生ハイブ
リドーマの増殖を促進し、また、動物細胞の産生する有
用物質、特に抗体の産生量を増大させることを目的とし
た動物細胞培養用添加剤に関する。
加剤に関する。さらに詳しくは、動物細胞の培養のため
の基礎培地に添加して、動物細胞、特に抗体産生ハイブ
リドーマの増殖を促進し、また、動物細胞の産生する有
用物質、特に抗体の産生量を増大させることを目的とし
た動物細胞培養用添加剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞融合技術を応用して作製されたモノ
クローナル抗体の産生を目的としたハイブリドーマの培
養、遺伝子組換え技術を応用して構築された組換え動物
細胞による有用物質の産生等のために、動物細胞の培養
に関して盛んに研究が進められている。これらの有用物
質の大量生産には、目的物質を産生する動物細胞の大量
培養が行われるが、これらの動物細胞を培養するために
は、アミノ酸、ビタミン、無機塩および糖類（例えば、
グルコース）から通常なる基礎培地に、通常、動物細胞
増殖因子を添加する必要がある。この動物細胞増殖因子
としては、通常、ウシ胎児血清または子ウシ血清が使用
される。ウシ胎児血清または子ウシ血清は、基礎培地
に、通常、１０〜２０容量％添加する（山下修二ら、組
織細胞化学 （１９８６） ｐｐ１７５−１９４ 日本
組織細胞化学会編）。
クローナル抗体の産生を目的としたハイブリドーマの培
養、遺伝子組換え技術を応用して構築された組換え動物
細胞による有用物質の産生等のために、動物細胞の培養
に関して盛んに研究が進められている。これらの有用物
質の大量生産には、目的物質を産生する動物細胞の大量
培養が行われるが、これらの動物細胞を培養するために
は、アミノ酸、ビタミン、無機塩および糖類（例えば、
グルコース）から通常なる基礎培地に、通常、動物細胞
増殖因子を添加する必要がある。この動物細胞増殖因子
としては、通常、ウシ胎児血清または子ウシ血清が使用
される。ウシ胎児血清または子ウシ血清は、基礎培地
に、通常、１０〜２０容量％添加する（山下修二ら、組
織細胞化学 （１９８６） ｐｐ１７５−１９４ 日本
組織細胞化学会編）。
【０００３】ウシ胎児血清および子ウシ血清は、その供
給に制限があり、非常に高価であり、さらにロット差が
ある。さらに、ウシ胎児血清および子ウシ血清中の免疫
グロブリンは、動物細胞の培養により得ようとする目的
物質が抗体である場合には、それらの相互分離を困難に
するという問題点がある。そこで、ウシ胎児または子ウ
シ血清中から免疫グロブリン分画を除去したものがあ
り、市販されている。
給に制限があり、非常に高価であり、さらにロット差が
ある。さらに、ウシ胎児血清および子ウシ血清中の免疫
グロブリンは、動物細胞の培養により得ようとする目的
物質が抗体である場合には、それらの相互分離を困難に
するという問題点がある。そこで、ウシ胎児または子ウ
シ血清中から免疫グロブリン分画を除去したものがあ
り、市販されている。
【０００４】また、卵黄リポタンパク質は公知の物質で
あり、動物細胞増殖作用を有することが報告されている
（岡崎祐一ら、日本農芸化学会、昭和６１年度大会講演
要旨第６００頁）。また、卵黄リポタンパク質を、ニワ
トリの卵黄から、塩析、ゲルろ過およびイオン交換クロ
マトグラフィーにより得ることができること、および無
血清培地あるいは血清培地に卵黄リポタンパク質を添加
することの有用性についても報告されている（Ｈｉｒｏ
ｋｉ Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：１５９−１６９（１９８
８））。ただし、卵黄リポタンパク質による動物細胞増
殖効果は、インシュリン、トランスフェリン、エタノー
ルアミン、およびセレン化合物（亜セレン酸ナトリウム
等）等の共存下に発揮される（Ｈｉｒｏｋｉ Ｍｕｒａ
ｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，前出）。しかしながら、これ
らの共存物質の添加は、経済性、作業性の観点から問題
がある。なお、従来、卵黄リポタンパク質、またはウシ
胎児血清および卵黄リポタンパク質を添加剤として培地
に用いた例として、さらに特開昭６３−２１６４７７、
特公平６−３１３２０、特開昭６１−６３２８３、特開
平２−２５７８９２がある。
あり、動物細胞増殖作用を有することが報告されている
（岡崎祐一ら、日本農芸化学会、昭和６１年度大会講演
要旨第６００頁）。また、卵黄リポタンパク質を、ニワ
トリの卵黄から、塩析、ゲルろ過およびイオン交換クロ
マトグラフィーにより得ることができること、および無
血清培地あるいは血清培地に卵黄リポタンパク質を添加
することの有用性についても報告されている（Ｈｉｒｏ
ｋｉ Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：１５９−１６９（１９８
８））。ただし、卵黄リポタンパク質による動物細胞増
殖効果は、インシュリン、トランスフェリン、エタノー
ルアミン、およびセレン化合物（亜セレン酸ナトリウム
等）等の共存下に発揮される（Ｈｉｒｏｋｉ Ｍｕｒａ
ｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，前出）。しかしながら、これ
らの共存物質の添加は、経済性、作業性の観点から問題
がある。なお、従来、卵黄リポタンパク質、またはウシ
胎児血清および卵黄リポタンパク質を添加剤として培地
に用いた例として、さらに特開昭６３−２１６４７７、
特公平６−３１３２０、特開昭６１−６３２８３、特開
平２−２５７８９２がある。
【０００５】動物細胞による有用物質の大量生産の方法
として、高密度大量培養法があり、中でも動物細胞から
その産生する有用物質、特に抗体産生細胞から抗体を大
量に得るのに適した方法として、ホローファイバーを利
用したバイオリアクターを用いる方法がある。すなわ
ち、この方法では、一定のポアサイズ（通常、分子量１
万未満〜７万未満のタンパク質等は通過させるが、それ
より分子量の大なるタンパク質等は通過させない程度の
ポアサイズ）を有する内径１ｍｍ以下のホローファイバ
ーの内側と外側をそれぞれ基礎培地供給側および培養細
胞側として使用する。ホローファイバーの内側には基礎
培地を供給すると共に老廃物の除去を行い、外側では、
血清を含有した基礎培地中で細胞を培養し、その産生物
を回収する。細胞はもとより血清成分の多くはホローフ
ァイバーの膜を通過できず、目的産生物も、多くの場合
タンパク質であるので、膜を通過できないが、基礎培地
中の各成分は膜を通過する。なお、ホローファイバーの
ポアサイズに関しては、分子量１万〜７万の間の、ある
一定の分子量未満のタンパク質等を通過させるが、それ
より分子量の大なるタンパク質等は通過させないポアサ
イズを有するホローファイバーが市販されている。図１
に一般的なホローファイバー方式のバイオリアクターの
概略を示す。
として、高密度大量培養法があり、中でも動物細胞から
その産生する有用物質、特に抗体産生細胞から抗体を大
量に得るのに適した方法として、ホローファイバーを利
用したバイオリアクターを用いる方法がある。すなわ
ち、この方法では、一定のポアサイズ（通常、分子量１
万未満〜７万未満のタンパク質等は通過させるが、それ
より分子量の大なるタンパク質等は通過させない程度の
ポアサイズ）を有する内径１ｍｍ以下のホローファイバ
ーの内側と外側をそれぞれ基礎培地供給側および培養細
胞側として使用する。ホローファイバーの内側には基礎
培地を供給すると共に老廃物の除去を行い、外側では、
血清を含有した基礎培地中で細胞を培養し、その産生物
を回収する。細胞はもとより血清成分の多くはホローフ
ァイバーの膜を通過できず、目的産生物も、多くの場合
タンパク質であるので、膜を通過できないが、基礎培地
中の各成分は膜を通過する。なお、ホローファイバーの
ポアサイズに関しては、分子量１万〜７万の間の、ある
一定の分子量未満のタンパク質等を通過させるが、それ
より分子量の大なるタンパク質等は通過させないポアサ
イズを有するホローファイバーが市販されている。図１
に一般的なホローファイバー方式のバイオリアクターの
概略を示す。
【０００６】卵黄リポタンパク質とホローファイバー方
式のバイオリアクターとを組み合わせて、動物細胞の高
密度大量培養を行うことも考えられるが、以下の問題が
ある。すなわち、ホローファイバーはポアサイズが１万
以上のものしか通常入手できないので、系に共存させる
インシュリン（分子量：５８０７）、エタノールアミ
ン、セレン化合物等は、ホローファイバー膜を自由に通
過できる。このため、これらの物質はホローファイバー
の内外いずれの培地に添加する場合でも、結局両方の培
地に添加するのと同じこととなり、結果的にこれらの物
質を大量に用いることが余儀なくされ、実用上、経済
性、作業性に問題がある。
式のバイオリアクターとを組み合わせて、動物細胞の高
密度大量培養を行うことも考えられるが、以下の問題が
ある。すなわち、ホローファイバーはポアサイズが１万
以上のものしか通常入手できないので、系に共存させる
インシュリン（分子量：５８０７）、エタノールアミ
ン、セレン化合物等は、ホローファイバー膜を自由に通
過できる。このため、これらの物質はホローファイバー
の内外いずれの培地に添加する場合でも、結局両方の培
地に添加するのと同じこととなり、結果的にこれらの物
質を大量に用いることが余儀なくされ、実用上、経済
性、作業性に問題がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、動物
細胞の培養に際し、非常に有効であるが、問題点の多い
ウシ胎児または子ウシ血清の使用量を極力減らすことを
可能にすると共に、卵黄リポタンパク質の上記問題点も
解決し、かつウシ胎児または子ウシ血清単独添加の場合
に比し、優るとも劣らない、通常より優れた、動物細胞
増殖効果および目的有用物質産生効果をもたらし、さら
には、ウシ胎児もしくは子ウシ血清と卵黄リポタンパク
質とを組み合わせて使用した場合に比べても、より優れ
た目的有用物質産生効果をもたらす、動物細胞、特に抗
体産生ハイブリドーマ培養用添加剤を提供することにあ
る。
細胞の培養に際し、非常に有効であるが、問題点の多い
ウシ胎児または子ウシ血清の使用量を極力減らすことを
可能にすると共に、卵黄リポタンパク質の上記問題点も
解決し、かつウシ胎児または子ウシ血清単独添加の場合
に比し、優るとも劣らない、通常より優れた、動物細胞
増殖効果および目的有用物質産生効果をもたらし、さら
には、ウシ胎児もしくは子ウシ血清と卵黄リポタンパク
質とを組み合わせて使用した場合に比べても、より優れ
た目的有用物質産生効果をもたらす、動物細胞、特に抗
体産生ハイブリドーマ培養用添加剤を提供することにあ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】上記課題は、卵黄リポタ
ンパク質（以下「ＹＬＰという」）とウシ胎児または子
ウシ血清中のＩｇＧを除去した血清成分（以下「ＦＣＢ
Ｓ−Ｇ」という）とを組み合わせてなる動物細胞培養用
添加剤によって解決された。すなわち、本発明の動物細
胞培養用添加剤を基礎培地に添加した培地を用いて、動
物細胞の培養を行うことによって、ＦＣＢＳ−Ｇの使用
量を極力減らすことが可能になるのはもとより、ＹＬＰ
の使用に際し、必要とされる前記共存物質の添加が不要
となり、さらにウシ胎児または子ウシ血清（以下「ＦＣ
ＢＳ」という）単独添加の場合に比し、通常より優れ
た、動物細胞増殖効果および目的有用物質産生効果が達
成され、さらにはＦＣＢＳとＹＬＰとを組み合わせて使
用した場合に比べても、より優れた目的有用物質、特に
抗体産生効果がもたらされる。
ンパク質（以下「ＹＬＰという」）とウシ胎児または子
ウシ血清中のＩｇＧを除去した血清成分（以下「ＦＣＢ
Ｓ−Ｇ」という）とを組み合わせてなる動物細胞培養用
添加剤によって解決された。すなわち、本発明の動物細
胞培養用添加剤を基礎培地に添加した培地を用いて、動
物細胞の培養を行うことによって、ＦＣＢＳ−Ｇの使用
量を極力減らすことが可能になるのはもとより、ＹＬＰ
の使用に際し、必要とされる前記共存物質の添加が不要
となり、さらにウシ胎児または子ウシ血清（以下「ＦＣ
ＢＳ」という）単独添加の場合に比し、通常より優れ
た、動物細胞増殖効果および目的有用物質産生効果が達
成され、さらにはＦＣＢＳとＹＬＰとを組み合わせて使
用した場合に比べても、より優れた目的有用物質、特に
抗体産生効果がもたらされる。
【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
動物細胞培養用添加剤の一方の必須成分であるＹＬＰは
公知の物質で、ニワトリの卵黄から塩析、ゲルろ過およ
びイオン交換クロマトグラフィー等により得ることがで
きる。具体的には、例えばＨｉｒｏｋｉ Ｍｕｒａｋａ
ｍｉｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１：１５９−１６９（１９８８）（前出）に記載された
方法により得ることができる。また、ＹＬＰはコスモバ
イオ（株）、フナコシ薬品（株）から市販されている。
なお、本発明の動物細胞培養用添加剤を、抗体産生ハイ
ブリドーマの培養に用いる場合には、産生抗体とＹＬＰ
中のＩｇＧとの相互作用および分離が問題になるように
思われるが、ニワトリＩｇＧについての以下の報告か
ら、これらの問題は生じない。すなわち、ニワトリＩｇ
Ｇは哺乳動物由来のＩｇＧとの反応性が非常に低く（Ｈ
ａｄｇｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，２１，６９９−７０７，１９８４）、プロテイン
Ａと結合せず（Ｇｕｓｓ，Ｂ．，ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯ
Ｊ．，５，１５６７−１５７５，１９８６）、さらに
哺乳動物血清の補体系を活性化せず、リューマチ因子と
も反応しない（Ｌａｒｓｓｏｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｗｔｈｏｄｓ，１１３，９３−
９９，１９８８）。したがって、ニワトリＩｇＧはＦＣ
ＢＳ−Ｇに対し、相互作用を及ぼさず、培養後の産生抗
体の単離精製において、プロテインＡまたはプロテイン
Ａとよく似ていて同様にニワトリＩｇＧと結合性を示さ
ないと思われるプロテインＧを用いるアフィニティーク
ロマトグラフィーにより、両者は簡単に分離できると解
される。
動物細胞培養用添加剤の一方の必須成分であるＹＬＰは
公知の物質で、ニワトリの卵黄から塩析、ゲルろ過およ
びイオン交換クロマトグラフィー等により得ることがで
きる。具体的には、例えばＨｉｒｏｋｉ Ｍｕｒａｋａ
ｍｉｅｔ ａｌ．， Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１：１５９−１６９（１９８８）（前出）に記載された
方法により得ることができる。また、ＹＬＰはコスモバ
イオ（株）、フナコシ薬品（株）から市販されている。
なお、本発明の動物細胞培養用添加剤を、抗体産生ハイ
ブリドーマの培養に用いる場合には、産生抗体とＹＬＰ
中のＩｇＧとの相互作用および分離が問題になるように
思われるが、ニワトリＩｇＧについての以下の報告か
ら、これらの問題は生じない。すなわち、ニワトリＩｇ
Ｇは哺乳動物由来のＩｇＧとの反応性が非常に低く（Ｈ
ａｄｇｅ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，２１，６９９−７０７，１９８４）、プロテイン
Ａと結合せず（Ｇｕｓｓ，Ｂ．，ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯ
Ｊ．，５，１５６７−１５７５，１９８６）、さらに
哺乳動物血清の補体系を活性化せず、リューマチ因子と
も反応しない（Ｌａｒｓｓｏｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｗｔｈｏｄｓ，１１３，９３−
９９，１９８８）。したがって、ニワトリＩｇＧはＦＣ
ＢＳ−Ｇに対し、相互作用を及ぼさず、培養後の産生抗
体の単離精製において、プロテインＡまたはプロテイン
Ａとよく似ていて同様にニワトリＩｇＧと結合性を示さ
ないと思われるプロテインＧを用いるアフィニティーク
ロマトグラフィーにより、両者は簡単に分離できると解
される。
【００１０】また、ＦＣＢＳも公知の物質であり、例え
ば、コスモバイオ（株）等の製品を利用することができ
る。ＦＣＢＳ−Ｇも公知の物質で、ＦＣＢＳから、例え
ば、実施例１に示したような方法で調製することがで
き、また、例えばギブコ社より市販されている。調製ま
たは購入したＦＣＢＳ−Ｇは、必要に応じ、さらに凍結
乾燥処理等に付すことができる。
ば、コスモバイオ（株）等の製品を利用することができ
る。ＦＣＢＳ−Ｇも公知の物質で、ＦＣＢＳから、例え
ば、実施例１に示したような方法で調製することがで
き、また、例えばギブコ社より市販されている。調製ま
たは購入したＦＣＢＳ−Ｇは、必要に応じ、さらに凍結
乾燥処理等に付すことができる。
【００１１】本発明の動物細胞培養用添加剤は、ＹＬＰ
とＦＣＢＳ−Ｇとの混合物もしくはＹＬＰおよびＦＣＢ
Ｓ−Ｇを含有する組成物の形態（以下、単一形態とい
う）であっても良いし、ＹＬＰ単独もしくはこれを含有
する組成物とＦＣＢＳ−Ｇ単独もしくはこれを含有する
組成物とが空間的には離れているが、１つにセットされ
た形態（以下、キット形態という）であっても良い。い
ずれにせよ組成物は、通常の増量剤・希釈剤（基礎培
地、生理食塩水等）、保存剤・雑菌生成抑制剤（チメロ
サール、ストレプトマイシン、ペニシリン等）等を含有
することができ、また基礎培地を補う成分（タンパク
質、ホルモン、ビタミン、アミノ酸、有機酸、糖類、重
金属等）や他の動物細胞増殖因子等を含有することもで
きる。
とＦＣＢＳ−Ｇとの混合物もしくはＹＬＰおよびＦＣＢ
Ｓ−Ｇを含有する組成物の形態（以下、単一形態とい
う）であっても良いし、ＹＬＰ単独もしくはこれを含有
する組成物とＦＣＢＳ−Ｇ単独もしくはこれを含有する
組成物とが空間的には離れているが、１つにセットされ
た形態（以下、キット形態という）であっても良い。い
ずれにせよ組成物は、通常の増量剤・希釈剤（基礎培
地、生理食塩水等）、保存剤・雑菌生成抑制剤（チメロ
サール、ストレプトマイシン、ペニシリン等）等を含有
することができ、また基礎培地を補う成分（タンパク
質、ホルモン、ビタミン、アミノ酸、有機酸、糖類、重
金属等）や他の動物細胞増殖因子等を含有することもで
きる。
【００１２】単一形態の動物細胞培養用添加剤の場合、
含有させるＹＬＰとＦＣＢＳ−Ｇの相互比率およびＹＬ
ＰおよびＦＣＢＳ−Ｇの合計量は、後述の本発明添加剤
の基礎培地に対する添加量を可能にする限り、特に限定
されない。また、キット形態の動物細胞培養用添加剤の
場合、ＹＬＰ単独もしくはこれを含有する組成物中のＹ
ＬＰの量、およびＦＣＢＳ−Ｇ単独もしくはこれを含有
する組成物中のＦＣＢＳ−Ｇの量は、後述の本発明添加
剤の基礎培地に対する添加量を可能にする限り、特に限
定されない。
含有させるＹＬＰとＦＣＢＳ−Ｇの相互比率およびＹＬ
ＰおよびＦＣＢＳ−Ｇの合計量は、後述の本発明添加剤
の基礎培地に対する添加量を可能にする限り、特に限定
されない。また、キット形態の動物細胞培養用添加剤の
場合、ＹＬＰ単独もしくはこれを含有する組成物中のＹ
ＬＰの量、およびＦＣＢＳ−Ｇ単独もしくはこれを含有
する組成物中のＦＣＢＳ−Ｇの量は、後述の本発明添加
剤の基礎培地に対する添加量を可能にする限り、特に限
定されない。
【００１３】本発明の動物細胞培養用添加剤は、これを
一般の動物細胞培養用基礎培地に添加して、動物細胞培
養に供することができる。上記基礎培地としては、特に
限定はなく、公知の各種のものをいずれも使用できる。
その具体例としては、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培
地、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地等が挙げられる。本発明
添加剤の上記基礎培地に対する添加量は、添加後の培地
を使用して本発明の効果を達成できる限り、特に限定さ
れないが、通常、ＹＬＰが、最終濃度として、１０〜３
００μｇタンパク／ｍｌ、特に５０〜１５０μｇタンパ
ク／ｍｌ、ＦＣＢＳ−Ｇが、最終濃度として、固形分と
して、１３０〜１５００μｇ／ｍｌ、特に４００〜８０
０μｇ／ｍｌとなるような添加量が好ましい。
一般の動物細胞培養用基礎培地に添加して、動物細胞培
養に供することができる。上記基礎培地としては、特に
限定はなく、公知の各種のものをいずれも使用できる。
その具体例としては、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培
地、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地等が挙げられる。本発明
添加剤の上記基礎培地に対する添加量は、添加後の培地
を使用して本発明の効果を達成できる限り、特に限定さ
れないが、通常、ＹＬＰが、最終濃度として、１０〜３
００μｇタンパク／ｍｌ、特に５０〜１５０μｇタンパ
ク／ｍｌ、ＦＣＢＳ−Ｇが、最終濃度として、固形分と
して、１３０〜１５００μｇ／ｍｌ、特に４００〜８０
０μｇ／ｍｌとなるような添加量が好ましい。
【００１４】本発明添加剤を添加した培地を用いて培養
できる動物細胞については、特に制限はなく、付着性細
胞でも、浮遊性細胞でもよく、またすでに株化された細
胞でも、新鮮な悪性腫瘍細胞や正常細胞でもよく、いず
れの細胞でも本発明添加剤を添加した培地での培養によ
り、良好な増殖が達成され、また一般に目的産生物質の
高収量が達せられる。しかしながら、本発明添加剤を添
加した培地を用いて培養できる動物細胞のうち、もっと
も好適なものは抗体産生ハイブリドーマであり、該培地
での培養により、該ハイブリドーマの良好な増殖のみな
らず、一般に抗体の産生が顕著に促進される。
できる動物細胞については、特に制限はなく、付着性細
胞でも、浮遊性細胞でもよく、またすでに株化された細
胞でも、新鮮な悪性腫瘍細胞や正常細胞でもよく、いず
れの細胞でも本発明添加剤を添加した培地での培養によ
り、良好な増殖が達成され、また一般に目的産生物質の
高収量が達せられる。しかしながら、本発明添加剤を添
加した培地を用いて培養できる動物細胞のうち、もっと
も好適なものは抗体産生ハイブリドーマであり、該培地
での培養により、該ハイブリドーマの良好な増殖のみな
らず、一般に抗体の産生が顕著に促進される。
【００１５】本発明添加剤を添加した動物細胞培養用培
地を用いて動物細胞を培養する方法は、従来の動物細胞
の培養方法と特に異なるところはなく、培養すべき細胞
の増殖に適した適当なｐＨおよび温度条件下に、通常ｐ
Ｈ６〜８および温度約３７℃前後で培養を行えばよい。
さらに具体的には、通常、例えば、５容量％ＣＯ2−９
５容量％空気の雰囲気下で、上記ｐＨおよび温度条件
下、１〜５日程度培養する。本発明添加剤を添加した動
物細胞培養用培地は、上記したごとく、従来の動物細胞
の培養方法における培地と同様に用いることができる
が、ホローファイバーを利用したバイオリアクターを用
いる動物細胞、特に抗体産生細胞の培養に特に適してい
る。
地を用いて動物細胞を培養する方法は、従来の動物細胞
の培養方法と特に異なるところはなく、培養すべき細胞
の増殖に適した適当なｐＨおよび温度条件下に、通常ｐ
Ｈ６〜８および温度約３７℃前後で培養を行えばよい。
さらに具体的には、通常、例えば、５容量％ＣＯ2−９
５容量％空気の雰囲気下で、上記ｐＨおよび温度条件
下、１〜５日程度培養する。本発明添加剤を添加した動
物細胞培養用培地は、上記したごとく、従来の動物細胞
の培養方法における培地と同様に用いることができる
が、ホローファイバーを利用したバイオリアクターを用
いる動物細胞、特に抗体産生細胞の培養に特に適してい
る。
【００１６】本発明添加剤を添加した動物細胞培養用培
地を使用して、動物細胞の培養を行った後、培養物から
の目的産生物の単離精製は、通常の方法と同様にして行
うことができる。動物細胞が抗体産生細胞の場合には、
培養物から細胞を除去後、プロテインＧやプロテインＡ
を用いるアフィニティークロマトグラフィーあるいはイ
オン交換クロマトグラフィーに付すことにより、目的抗
体を、ＹＬＰ、ＦＣＢＳ−Ｇ、他のタンパク質等から分
離できる。
地を使用して、動物細胞の培養を行った後、培養物から
の目的産生物の単離精製は、通常の方法と同様にして行
うことができる。動物細胞が抗体産生細胞の場合には、
培養物から細胞を除去後、プロテインＧやプロテインＡ
を用いるアフィニティークロマトグラフィーあるいはイ
オン交換クロマトグラフィーに付すことにより、目的抗
体を、ＹＬＰ、ＦＣＢＳ−Ｇ、他のタンパク質等から分
離できる。
【００１７】
【実施例】以下、試験例により、本発明の効果を具体的
に例示説明する。 試験例 本発明添加剤の、抗体産生マウスハイブリドーマについ
ての、細胞増殖効果および抗体産生促進効果を調べた。 （１）抗体産生マウスハイブリドーマ マウスミエローマ樹立株ＳＰ２／０−Ａｇ１４とヒト・
リポプロテイン（ａ）により免疫されたマウス（ＢＡＬ
Ｂ／Ｃ）脾細胞とを融合させて得られた抗ヒト・リポプ
ロテイン（ａ）モノクローナル抗体産生細胞（マウスハ
イブリドーマ）ＡおよびＢを用いた。免疫、細胞融合
（ポリエチレングリコール法）およびクローニングは常
法により行った。これらのハイブリドーマは自社の研究
室で確立されたものである。さらに、Ｂのハイブリドー
マは工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４１４５として寄託されている。
に例示説明する。 試験例 本発明添加剤の、抗体産生マウスハイブリドーマについ
ての、細胞増殖効果および抗体産生促進効果を調べた。 （１）抗体産生マウスハイブリドーマ マウスミエローマ樹立株ＳＰ２／０−Ａｇ１４とヒト・
リポプロテイン（ａ）により免疫されたマウス（ＢＡＬ
Ｂ／Ｃ）脾細胞とを融合させて得られた抗ヒト・リポプ
ロテイン（ａ）モノクローナル抗体産生細胞（マウスハ
イブリドーマ）ＡおよびＢを用いた。免疫、細胞融合
（ポリエチレングリコール法）およびクローニングは常
法により行った。これらのハイブリドーマは自社の研究
室で確立されたものである。さらに、Ｂのハイブリドー
マは工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１４１４５として寄託されている。
【００１８】（２）試験物質 ＹＬＰとしてはコスモバイオ社から販売のＹＬＰを使用
した。ＦＣＢＳ−Ｇとしてはウシ胎児血清（以下、ＦＢ
Ｓという）（コスモバイオ社製）から以下のようにして
調製したＩｇＧ除去血清成分（以下、ＦＢＳ−Ｇとい
う）を使用した。ＦＢＳは、予め５６℃で非働化後０．
２２μｍのフィルターでろ過処理した後、以下の処理に
供した。カラム（１８ｍｍ×５０ｍｍ）に１８ｍｌのプ
ロテイン−Ｇ（ファルマシア（株））を充填し、結合バ
ッファー（０．０２Ｍリン酸バッファー ｐＨ７．０）
で平衡化後、１００ｍｌのＦＢＳを１ｍｌ／ｍｉｎの流
速で通過させ、少量の結合バッファーで洗い流し回収し
た。ただし、ＦＢＳ−Ｇとしての採取画分は、２８０ｎ
ｍの吸光度で１．６以上のものとした。さらに結合バッ
ファーで完全に洗い流し、溶出バッファー（０．１Ｍ
グリシン−塩酸 ｐＨ２．７）によりウシＩｇＧを溶出
した。ここで使用した全てのバッファーは、ＦＢＳ−Ｇ
を細胞培養に供する目的のため、アジ化ナトリウム等の
防腐剤を含まないものであった。再度、採取画分をプロ
テイン−Ｇに通過させウシＩｇＧを完全に除去した（上
記と同様に吸光度により確認）。プロテイン−Ｇにより
除去されたウシＩｇＧは１３ｍｇであった。得られたＦ
ＢＳ−Ｇは、クリーンベンチ内で０．２２μｍのフィル
ターにより、ろ過滅菌後以下の使用に供した。
した。ＦＣＢＳ−Ｇとしてはウシ胎児血清（以下、ＦＢ
Ｓという）（コスモバイオ社製）から以下のようにして
調製したＩｇＧ除去血清成分（以下、ＦＢＳ−Ｇとい
う）を使用した。ＦＢＳは、予め５６℃で非働化後０．
２２μｍのフィルターでろ過処理した後、以下の処理に
供した。カラム（１８ｍｍ×５０ｍｍ）に１８ｍｌのプ
ロテイン−Ｇ（ファルマシア（株））を充填し、結合バ
ッファー（０．０２Ｍリン酸バッファー ｐＨ７．０）
で平衡化後、１００ｍｌのＦＢＳを１ｍｌ／ｍｉｎの流
速で通過させ、少量の結合バッファーで洗い流し回収し
た。ただし、ＦＢＳ−Ｇとしての採取画分は、２８０ｎ
ｍの吸光度で１．６以上のものとした。さらに結合バッ
ファーで完全に洗い流し、溶出バッファー（０．１Ｍ
グリシン−塩酸 ｐＨ２．７）によりウシＩｇＧを溶出
した。ここで使用した全てのバッファーは、ＦＢＳ−Ｇ
を細胞培養に供する目的のため、アジ化ナトリウム等の
防腐剤を含まないものであった。再度、採取画分をプロ
テイン−Ｇに通過させウシＩｇＧを完全に除去した（上
記と同様に吸光度により確認）。プロテイン−Ｇにより
除去されたウシＩｇＧは１３ｍｇであった。得られたＦ
ＢＳ−Ｇは、クリーンベンチ内で０．２２μｍのフィル
ターにより、ろ過滅菌後以下の使用に供した。
【００１９】（３）測定用培地 測定用培地としては、基礎培地ダルベッコ改変ＭＥＭ培
地（ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社、Ｃｏｄｅ Ｎ
ｏ．ＪＲＨ５６４９９）に、培養前最終濃度として、Ｙ
ＬＰが１００μｇ／ｍｌ、ＦＢＳ−Ｇが表１に示す各濃
度になるように基礎培地に添加した培地を用いた。ま
た、比較目的のため上記でＦＢＳ−Ｇに代えＦＢＳを用
いた培地も使用した。
地（ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ社、Ｃｏｄｅ Ｎ
ｏ．ＪＲＨ５６４９９）に、培養前最終濃度として、Ｙ
ＬＰが１００μｇ／ｍｌ、ＦＢＳ−Ｇが表１に示す各濃
度になるように基礎培地に添加した培地を用いた。ま
た、比較目的のため上記でＦＢＳ−Ｇに代えＦＢＳを用
いた培地も使用した。
【００２０】（４）実験方法 抗体産生マウスハイブリドーマを、５×１０4個／ｍｌ
の細胞密度で、２４ウェル培養プレート上の上記各測定
用培地に接種し、５％容量ＣＯ2−９５％容量空気の雰
囲気下、３７℃で４日間培養した後、通常の血球計算盤
で細胞数をカウントし、抗体量はプロテインＧによる精
製抗体を標準とし、通常の酵素抗体法［酵素標識二次抗
体として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ
Ｇ（Ｇ＋Ｌ）、発色剤として０−フェニレンジアミンを
用いるＥＬＩＳＡ法］で定量した。細胞除去液中の抗体
量はＩｇＧの培地中における濃度（μｇ／ｍｌ）で表示
した。結果を表１に示す。
の細胞密度で、２４ウェル培養プレート上の上記各測定
用培地に接種し、５％容量ＣＯ2−９５％容量空気の雰
囲気下、３７℃で４日間培養した後、通常の血球計算盤
で細胞数をカウントし、抗体量はプロテインＧによる精
製抗体を標準とし、通常の酵素抗体法［酵素標識二次抗
体として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ
Ｇ（Ｇ＋Ｌ）、発色剤として０−フェニレンジアミンを
用いるＥＬＩＳＡ法］で定量した。細胞除去液中の抗体
量はＩｇＧの培地中における濃度（μｇ／ｍｌ）で表示
した。結果を表１に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】表１に示すごとく、通常の細胞培養に用い
られる１０％ＦＢＳ添加培地を使用した場合に比べ、Ｙ
ＬＰと２．５％ＦＢＳを添加した培地を使用した場合に
は、ハイブリドーマＡ、Ｂ共、細胞増殖で２５％の上昇
を認めた。さらに、細胞産生物（モノクローナル抗体：
ＩｇＧ）については、１０％ＦＢＳ添加培地による産生
能に比し、ＹＬＰと２．５％ＦＢＳ−Ｇを添加した培地
による産生能で、ハイブリドーマＡでは２０％、ハイブ
リドーマＡでは１９％の上昇を認めた。さらに、ＦＢＳ
−ＧとＹＬＰを添加した場合には、ＦＢＳとＹＬＰを添
加した場合に比し、顕著に優れたモノクローナル抗体産
生能が発揮された。別の角度から言うと、ＦＢＳ−Ｇ濃
度を低く抑えることにより細胞増殖因子ひいては抗体産
生能上昇因子として添加するＹＬＰの効果を高めること
ができた。
られる１０％ＦＢＳ添加培地を使用した場合に比べ、Ｙ
ＬＰと２．５％ＦＢＳを添加した培地を使用した場合に
は、ハイブリドーマＡ、Ｂ共、細胞増殖で２５％の上昇
を認めた。さらに、細胞産生物（モノクローナル抗体：
ＩｇＧ）については、１０％ＦＢＳ添加培地による産生
能に比し、ＹＬＰと２．５％ＦＢＳ−Ｇを添加した培地
による産生能で、ハイブリドーマＡでは２０％、ハイブ
リドーマＡでは１９％の上昇を認めた。さらに、ＦＢＳ
−ＧとＹＬＰを添加した場合には、ＦＢＳとＹＬＰを添
加した場合に比し、顕著に優れたモノクローナル抗体産
生能が発揮された。別の角度から言うと、ＦＢＳ−Ｇ濃
度を低く抑えることにより細胞増殖因子ひいては抗体産
生能上昇因子として添加するＹＬＰの効果を高めること
ができた。
【００２３】
【発明の効果】本発明の動物細胞培養用添加剤を添加し
た培地を用いて、動物細胞の培養を行う場合には、ＦＣ
ＢＳの使用量を極力減らすことが可能になると共に、Ｙ
ＬＰ使用の場合に必要とされるトランスフェリン、イン
シュリン等の共存物質の添加が不要となり、さらに、Ｆ
ＣＢＳ単独添加の場合に比し、優れた細胞増殖効果およ
び目的有用物質産生効果を達成することができ、さらに
特筆すべきこととして、ＦＣＢＳとＹＬＰを添加した場
合に比しても、目的有用物質、特に抗体の産生量を顕著
に増大させることができる。なお、別の角度から見る
と、培養時間を短縮し、高密度細胞培養を行うことがで
きる。さらに、本発明添加剤を添加した培地を用いて、
ホローファイバー方式のバイオリアクターで動物細胞の
培養を行う場合には、上記利点に加え、ＦＣＢＳ−Ｇお
よびＹＬＰを、図１に書き加えたごとく、ホローファイ
バーの外側にのみ供給すればよいので、ＦＣＢＳ−Ｇお
よびＹＬＰを無駄にせず、それらの使用量を倹約するこ
とができる。ちなみにＦＣＢＳ−ＧおよびＹＬＰともホ
ローファイバーの膜を通過しない。
た培地を用いて、動物細胞の培養を行う場合には、ＦＣ
ＢＳの使用量を極力減らすことが可能になると共に、Ｙ
ＬＰ使用の場合に必要とされるトランスフェリン、イン
シュリン等の共存物質の添加が不要となり、さらに、Ｆ
ＣＢＳ単独添加の場合に比し、優れた細胞増殖効果およ
び目的有用物質産生効果を達成することができ、さらに
特筆すべきこととして、ＦＣＢＳとＹＬＰを添加した場
合に比しても、目的有用物質、特に抗体の産生量を顕著
に増大させることができる。なお、別の角度から見る
と、培養時間を短縮し、高密度細胞培養を行うことがで
きる。さらに、本発明添加剤を添加した培地を用いて、
ホローファイバー方式のバイオリアクターで動物細胞の
培養を行う場合には、上記利点に加え、ＦＣＢＳ−Ｇお
よびＹＬＰを、図１に書き加えたごとく、ホローファイ
バーの外側にのみ供給すればよいので、ＦＣＢＳ−Ｇお
よびＹＬＰを無駄にせず、それらの使用量を倹約するこ
とができる。ちなみにＦＣＢＳ−ＧおよびＹＬＰともホ
ローファイバーの膜を通過しない。
【００２４】さらに、本発明の動物細胞培養用添加剤を
添加した培地は、通常のＦＣＢＳ単独添加の場合に比
し、タンパク質含量が少ないので、通常タンパク質であ
ることが多い目的生産物の単離精製が容易になる。特
に、培養する動物細胞が抗体産生ハイブリドーマである
場合には、プロテインＧまたはプロテインＡのカラムを
通すことにより、極めて容易に目的モノクローナル抗体
を単離精製できる。上記のごとく、本発明の動物細胞培
養用添加剤は、動物細胞、殊に抗体産生ハイブリドーマ
の培養、特にホローファイバー方式のバイオリアクター
での大量培養に際し、および培養後の目的産物、特に抗
体の単離精製に際し、極めて大なる実用上のメリットを
もたらすものである。
添加した培地は、通常のＦＣＢＳ単独添加の場合に比
し、タンパク質含量が少ないので、通常タンパク質であ
ることが多い目的生産物の単離精製が容易になる。特
に、培養する動物細胞が抗体産生ハイブリドーマである
場合には、プロテインＧまたはプロテインＡのカラムを
通すことにより、極めて容易に目的モノクローナル抗体
を単離精製できる。上記のごとく、本発明の動物細胞培
養用添加剤は、動物細胞、殊に抗体産生ハイブリドーマ
の培養、特にホローファイバー方式のバイオリアクター
での大量培養に際し、および培養後の目的産物、特に抗
体の単離精製に際し、極めて大なる実用上のメリットを
もたらすものである。
【図１】一般的なホローファイバー方式のバイオリアク
ターの概略を示す。参考に、本発明添加剤とホローファ
イバー方式とを組み合わせた場合の、本発明添加剤の必
須成分ＦＣＢＳ−ＧおよびＹＬＰの流れも併せ示す。
ターの概略を示す。参考に、本発明添加剤とホローファ
イバー方式とを組み合わせた場合の、本発明添加剤の必
須成分ＦＣＢＳ−ＧおよびＹＬＰの流れも併せ示す。
Claims (2)
- 【請求項１】 卵黄リポタンパク質とウシ胎児または子
ウシ血清中のＩｇＧを除去した血清成分とを組み合わせ
てなる動物細胞培養用添加剤。 - 【請求項２】 卵黄リポタンパク質と該血清成分を含有
することを特徴とする請求項１記載の動物細胞培養用添
加剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7317576A JPH09131179A (ja) | 1995-11-10 | 1995-11-10 | 動物細胞培養用添加剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7317576A JPH09131179A (ja) | 1995-11-10 | 1995-11-10 | 動物細胞培養用添加剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09131179A true JPH09131179A (ja) | 1997-05-20 |
Family
ID=18089790
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7317576A Pending JPH09131179A (ja) | 1995-11-10 | 1995-11-10 | 動物細胞培養用添加剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09131179A (ja) |
-
1995
- 1995-11-10 JP JP7317576A patent/JPH09131179A/ja active Pending
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