JPH05276985A - モノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体Info
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- JPH05276985A JPH05276985A JP4026634A JP2663492A JPH05276985A JP H05276985 A JPH05276985 A JP H05276985A JP 4026634 A JP4026634 A JP 4026634A JP 2663492 A JP2663492 A JP 2663492A JP H05276985 A JPH05276985 A JP H05276985A
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- JP
- Japan
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- hair
- cells
- monoclonal antibody
- cell
- antibody
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 毛乳頭細胞に特異的なモノクローナル抗体及
びこれを産生するハイブリドーマ。 【効果】 このモノクローナル抗体は毛乳頭細胞と特異
的に反応するため、毛乳頭細胞の検出、精製はもちろ
ん、毛母細胞と毛乳頭細胞との間の相互作用を介在する
因子の解明に利用することができる。
びこれを産生するハイブリドーマ。 【効果】 このモノクローナル抗体は毛乳頭細胞と特異
的に反応するため、毛乳頭細胞の検出、精製はもちろ
ん、毛母細胞と毛乳頭細胞との間の相互作用を介在する
因子の解明に利用することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は毛球部の毛乳頭細胞のみ
を特異的に認識するモノクローナル抗体及びこれを産生
するハイブリドーマに関する。
を特異的に認識するモノクローナル抗体及びこれを産生
するハイブリドーマに関する。
【０００２】
【従来の技術】毛包組織は、毛球部において間質系の細
胞である毛乳頭細胞を取り囲む様にして存在する。この
毛包中に存在する毛母細胞が増殖、分化することによっ
て毛が成長することが知られている。人を始めとする様
々な動物の体毛は毛母細胞が盛んに増殖する時期（成長
期）に毛が伸長し、毛母細胞の増殖が停止する時期（休
止期）に抜け落ちる。人の頭髪の場合、成長期が短くな
り休止期の状態が長時間続くと脱毛状態になる。このよ
うに毛の成長に重要な毛母細胞の増殖にはこの細胞が接
している毛乳頭細胞との相互作用が必要であることが明
らかにされている（Ｈａｉｒ ａｎｄ Ｈａｉｒ Ｄｉ
ｓｅａｓｅｓ，Ｃ．Ｅ．Ｏｒｆａｎｏｓａｎｄ Ｒ．Ｈ
ａｐｐｌｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ Ｂｅｒｌｉｎ，１９９０）。
胞である毛乳頭細胞を取り囲む様にして存在する。この
毛包中に存在する毛母細胞が増殖、分化することによっ
て毛が成長することが知られている。人を始めとする様
々な動物の体毛は毛母細胞が盛んに増殖する時期（成長
期）に毛が伸長し、毛母細胞の増殖が停止する時期（休
止期）に抜け落ちる。人の頭髪の場合、成長期が短くな
り休止期の状態が長時間続くと脱毛状態になる。このよ
うに毛の成長に重要な毛母細胞の増殖にはこの細胞が接
している毛乳頭細胞との相互作用が必要であることが明
らかにされている（Ｈａｉｒ ａｎｄ Ｈａｉｒ Ｄｉ
ｓｅａｓｅｓ，Ｃ．Ｅ．Ｏｒｆａｎｏｓａｎｄ Ｒ．Ｈ
ａｐｐｌｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ Ｂｅｒｌｉｎ，１９９０）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】こうした毛母細胞と毛
乳頭細胞との相互作用を介在する因子を同定し、これを
活性化することができれば脱毛予防、育毛が可能になる
と考えられる。従って、当該因子の単離、同定が望まれ
ていた。そして、当該因子を単離・同定するためには毛
母細胞と毛乳頭細胞との共存培養系の確立、毛母細胞又
は毛乳頭細胞のいずれかを特異的に阻害する物質の開発
等が必要となる。そこで、本発明者らは当該因子の単離
・同定を目的として種々検討し、毛母細胞と毛乳頭細胞
の共存培養系を確立し、先に特許出願した（特願平２−
２１４１８１号）。従って、本発明の目的は毛母細胞又
は毛乳頭細胞のいずれかを特異的に阻害する物質、すな
わちモノクローナル抗体を提供することにある。
乳頭細胞との相互作用を介在する因子を同定し、これを
活性化することができれば脱毛予防、育毛が可能になる
と考えられる。従って、当該因子の単離、同定が望まれ
ていた。そして、当該因子を単離・同定するためには毛
母細胞と毛乳頭細胞との共存培養系の確立、毛母細胞又
は毛乳頭細胞のいずれかを特異的に阻害する物質の開発
等が必要となる。そこで、本発明者らは当該因子の単離
・同定を目的として種々検討し、毛母細胞と毛乳頭細胞
の共存培養系を確立し、先に特許出願した（特願平２−
２１４１８１号）。従って、本発明の目的は毛母細胞又
は毛乳頭細胞のいずれかを特異的に阻害する物質、すな
わちモノクローナル抗体を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは前記課題を
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、毛母細胞・毛乳頭細
胞共存培養系を抗体のスクリーニング系に応用し、加え
て細胞融合技術を利用することにより毛乳頭細胞を認識
するモノクローナル抗体が得られることを見出し、本発
明を完成した。
解決すべく鋭意研究を重ねた結果、毛母細胞・毛乳頭細
胞共存培養系を抗体のスクリーニング系に応用し、加え
て細胞融合技術を利用することにより毛乳頭細胞を認識
するモノクローナル抗体が得られることを見出し、本発
明を完成した。
【０００５】すなわち、本発明は毛乳頭細胞に特異的な
モノクローナル抗体を提供するものである。
モノクローナル抗体を提供するものである。
【０００６】また本発明は毛乳頭細胞に特異的なモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供するもの
である。
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供するもの
である。
【０００７】本発明のモノクローナル抗体は、自体公知
の細胞融合法、すなわち、例えば毛乳頭細胞で免疫した
哺乳動物の抗体産生細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞とを融
合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を培養す
ることにより製造することができる。
の細胞融合法、すなわち、例えば毛乳頭細胞で免疫した
哺乳動物の抗体産生細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞とを融
合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を培養す
ることにより製造することができる。
【０００８】この方法に使用する抗原である毛乳頭細胞
は、例えば次の如くして調製できる。材料としてはヒ
ト、ラットを含む全ての哺乳動物を用いることができる
が、特にマウスが好ましい。これらの皮膚を適当なプロ
テアーゼで処理し、真皮を調製する。ここで使用するプ
ロテーゼとしては、トリプシン等が用いられるが、ディ
スパーゼがより好ましい。得られた真皮は、酵素処理、
例えばコラゲナーゼ処理により線維成分を消化し、次い
でクッションを用いた遠心分離に付すことにより毛母細
胞画分及び毛乳頭細胞画分を得る。クッションとしては
パーコール、ショ糖などが用いられるが、特にフィコー
ルが好ましい。また、上記の方法以外にヒト頭髪やその
他の哺乳動物より毛包を調製し、これより実体顕微鏡下
で毛乳頭細胞を採取することも可能である。
は、例えば次の如くして調製できる。材料としてはヒ
ト、ラットを含む全ての哺乳動物を用いることができる
が、特にマウスが好ましい。これらの皮膚を適当なプロ
テアーゼで処理し、真皮を調製する。ここで使用するプ
ロテーゼとしては、トリプシン等が用いられるが、ディ
スパーゼがより好ましい。得られた真皮は、酵素処理、
例えばコラゲナーゼ処理により線維成分を消化し、次い
でクッションを用いた遠心分離に付すことにより毛母細
胞画分及び毛乳頭細胞画分を得る。クッションとしては
パーコール、ショ糖などが用いられるが、特にフィコー
ルが好ましい。また、上記の方法以外にヒト頭髪やその
他の哺乳動物より毛包を調製し、これより実体顕微鏡下
で毛乳頭細胞を採取することも可能である。
【０００９】得られた毛乳頭細胞で免疫するための哺乳
動物としては、通常はＢａｌｂ／ｃマウスが用いられる
が、抗原を採取した動物がマウスであるため、マウス以
外の動物を用いるのが好ましい。かかる動物としては、
ラット、特にＬｅｗｉｓラットを用いるのが好ましい。
免疫は、いかなる方法によっても行われるが、アジュバ
ンドを用いず、腹腔内投与によって行うことが好まし
い。１〜２週間間隔で４回投与することにより効率よく
ラットを免疫できる。抗体産生細胞としては脾臓、リン
パ節、末梢血液等から分離した細胞などが使用できる
が、特に脾臓が好ましい。
動物としては、通常はＢａｌｂ／ｃマウスが用いられる
が、抗原を採取した動物がマウスであるため、マウス以
外の動物を用いるのが好ましい。かかる動物としては、
ラット、特にＬｅｗｉｓラットを用いるのが好ましい。
免疫は、いかなる方法によっても行われるが、アジュバ
ンドを用いず、腹腔内投与によって行うことが好まし
い。１〜２週間間隔で４回投与することにより効率よく
ラットを免疫できる。抗体産生細胞としては脾臓、リン
パ節、末梢血液等から分離した細胞などが使用できる
が、特に脾臓が好ましい。
【００１０】一方、骨髄腫細胞は、マウス、ラット、ヒ
トなどの種々の動物の細胞株を使用することができる。
特に好ましい骨髄腫細胞としてはマウスＰ３−ＮＳ−１
／１Ａｇ４．１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＳＰ
２／０Ａｇ１４、ラットＹＢ２／０等を例示することが
できる。通常、骨髄腫細胞は、抗体産生細胞の調製に用
いた動物と同種の動物の細胞株すなわち、ラット骨髄腫
細胞を用いるのが望ましいが、γグロブリンを全く合成
しないラット由来の骨髄腫細胞は未だ確立されていな
い。そのため、マウス由来の骨髄腫細胞を使用するのが
好ましい。
トなどの種々の動物の細胞株を使用することができる。
特に好ましい骨髄腫細胞としてはマウスＰ３−ＮＳ−１
／１Ａｇ４．１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＳＰ
２／０Ａｇ１４、ラットＹＢ２／０等を例示することが
できる。通常、骨髄腫細胞は、抗体産生細胞の調製に用
いた動物と同種の動物の細胞株すなわち、ラット骨髄腫
細胞を用いるのが望ましいが、γグロブリンを全く合成
しないラット由来の骨髄腫細胞は未だ確立されていな
い。そのため、マウス由来の骨髄腫細胞を使用するのが
好ましい。
【００１１】細胞の融合は、抗体産生細胞と骨髄腫細胞
とを適当な個数及び割合、例えば５：１〜１０：１で混
合し、適当な細胞融合培地、例えばＲＰＭＩ１６４０や
ＭＢＭ培地中で５０％ポリエチレングリコール（分子量
１０００〜６０００程度）を用いて行うことができる。
このほかにもセンダイウィルスを用いたり、電気的に細
胞融合を行うことも可能である。
とを適当な個数及び割合、例えば５：１〜１０：１で混
合し、適当な細胞融合培地、例えばＲＰＭＩ１６４０や
ＭＢＭ培地中で５０％ポリエチレングリコール（分子量
１０００〜６０００程度）を用いて行うことができる。
このほかにもセンダイウィルスを用いたり、電気的に細
胞融合を行うことも可能である。
【００１２】得られた融合細胞からの抗体産生ハイブリ
ドーマのスクリーニングは、骨髄腫細胞としてＰ３−Ｎ
Ｓ１／１Ａｇ４．１を用いた場合は、ＨＡＴ培地（ヒポ
キサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する培
地）で培養することによりハイブリドーマのみを生育さ
せて行うことができる。抗体産生ハイブリドーマのスク
リーニングは、一般的にはマイクロタイタープレートを
用いた酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって行う
ことができる（単クローン抗体実験マニュアル、富山朔
二、安東民衛編、講談社）。
ドーマのスクリーニングは、骨髄腫細胞としてＰ３−Ｎ
Ｓ１／１Ａｇ４．１を用いた場合は、ＨＡＴ培地（ヒポ
キサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する培
地）で培養することによりハイブリドーマのみを生育さ
せて行うことができる。抗体産生ハイブリドーマのスク
リーニングは、一般的にはマイクロタイタープレートを
用いた酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって行う
ことができる（単クローン抗体実験マニュアル、富山朔
二、安東民衛編、講談社）。
【００１３】抗体産生ハイブリドーマは、毛母細胞・毛
乳頭細胞共存培養系で毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用を
阻害するかどうかによってスクリーニングされる。すな
わち、Ｙｕｓｐａの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｋ
ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｓ
ｋｅｒｒｏｗ ａｎｄ Ｃ．Ｊ．Ｓｋｅｒｒｗ，ｐ２３
１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．，
１９８５）を応用して毛母細胞及び毛乳頭細胞を含む真
皮ファイブロブラスト画分を調製する。材料としてはラ
ット等、毛を有する動物であればいずれでもよいが、特
にマウスが好ましい。得られた毛母細胞画分と真皮ファ
イブロブラスト画分との共存下で細胞外基質を含むゲル
中で培養する。使用される基質としてはいずれでも良い
が、特にマウス尾腱由来のタイプＩコラーゲンが好まし
い。これに適当な無血清培地で培養した抗体産生ハイブ
リドーマの培養上清を加え、毛母細胞・毛乳頭細胞相互
作用を阻害するハイブリドーマを選択することによって
毛乳頭細胞を特異的に認識する抗体を産生するハイブリ
ドーマを選択することができる。また、選択されたハイ
ブリドーマを単クローン化する方法としては、例えばフ
ィーダー細胞としてマウス胸腺細胞を用いた限界希釈法
に数度かけることにより行うことができる。
乳頭細胞共存培養系で毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用を
阻害するかどうかによってスクリーニングされる。すな
わち、Ｙｕｓｐａの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｋ
ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｓ
ｋｅｒｒｏｗ ａｎｄ Ｃ．Ｊ．Ｓｋｅｒｒｗ，ｐ２３
１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．，
１９８５）を応用して毛母細胞及び毛乳頭細胞を含む真
皮ファイブロブラスト画分を調製する。材料としてはラ
ット等、毛を有する動物であればいずれでもよいが、特
にマウスが好ましい。得られた毛母細胞画分と真皮ファ
イブロブラスト画分との共存下で細胞外基質を含むゲル
中で培養する。使用される基質としてはいずれでも良い
が、特にマウス尾腱由来のタイプＩコラーゲンが好まし
い。これに適当な無血清培地で培養した抗体産生ハイブ
リドーマの培養上清を加え、毛母細胞・毛乳頭細胞相互
作用を阻害するハイブリドーマを選択することによって
毛乳頭細胞を特異的に認識する抗体を産生するハイブリ
ドーマを選択することができる。また、選択されたハイ
ブリドーマを単クローン化する方法としては、例えばフ
ィーダー細胞としてマウス胸腺細胞を用いた限界希釈法
に数度かけることにより行うことができる。
【００１４】得られた単クローン化ハイブリドーマを用
いて本発明モノクローナル抗体を製造するには、当該ハ
イブリドーマを適当な培地中で培養するか、又はマウス
等の動物の腹腔内で培養することによって実施される。
例えば、上記のハイブリドーマを１×１０5〜１０6個／
mlの濃度で１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０改変培
地に加え、３〜４日間培養する。ハイブリドーマが増殖
するにつれて培地中に本発明のモノクローナル抗体が産
生されてくる。この培養上清を遠心分離等に付せば本発
明のモノクローナル抗体を得ることができる。得られた
培養上清中の本発明モノクローナル抗体はそのままでも
使用可能であるが、例えば硫安分画法、イオン交換クロ
マトグラフィー法、プロテインＡ結合担体等によって精
製して用いることがより好ましい。
いて本発明モノクローナル抗体を製造するには、当該ハ
イブリドーマを適当な培地中で培養するか、又はマウス
等の動物の腹腔内で培養することによって実施される。
例えば、上記のハイブリドーマを１×１０5〜１０6個／
mlの濃度で１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０改変培
地に加え、３〜４日間培養する。ハイブリドーマが増殖
するにつれて培地中に本発明のモノクローナル抗体が産
生されてくる。この培養上清を遠心分離等に付せば本発
明のモノクローナル抗体を得ることができる。得られた
培養上清中の本発明モノクローナル抗体はそのままでも
使用可能であるが、例えば硫安分画法、イオン交換クロ
マトグラフィー法、プロテインＡ結合担体等によって精
製して用いることがより好ましい。
【００１５】かくして得られた本発明のモノクローナル
抗体は、例えばウェスタンブロッティング法によりその
特異性を確認することができ、また常法によりそのグロ
ブリンサブクラスを特定することができる。その結果、
本発明モノクローナル抗体は、毛乳頭細胞と強く反応す
るが、毛母細胞とはほとんど反応しない。また、本発明
モノクローナル抗体にはＩｇＧに属するものとＩｇＭに
属するものとがある。
抗体は、例えばウェスタンブロッティング法によりその
特異性を確認することができ、また常法によりそのグロ
ブリンサブクラスを特定することができる。その結果、
本発明モノクローナル抗体は、毛乳頭細胞と強く反応す
るが、毛母細胞とはほとんど反応しない。また、本発明
モノクローナル抗体にはＩｇＧに属するものとＩｇＭに
属するものとがある。
【００１６】本発明モノクローナル抗体を用いて通常の
免疫学的測定法を実施すれば、毛乳頭細胞及びこの細胞
に存在する表面抗原を迅速かつ簡便に同定、検出でき
る。本発明モノクローナル抗体を適用することができる
免疫学的測定法としては特に限定されないが、例えば、
スライドガラス上に固定した組織標本を用いた組織染色
法などが挙げられる。これは例えばパラホルムアルデヒ
ド、ピクリン酸等によってスライドガラス上に固定され
た組織又は細胞に本発明モノクローナル抗体を反応さ
せ、結合した本発明モノクローナル抗体を標識した抗ラ
ットイムノグロブリン抗体で検出することにより行うこ
とができる。これらの方法に使用される抗ラットイムノ
グロブリン抗体の標識は酵素の場合、ペルオキシダー
ゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等
があり、そのほかに金コロイドやＩ125、Ｈ3などが挙げ
られる。
免疫学的測定法を実施すれば、毛乳頭細胞及びこの細胞
に存在する表面抗原を迅速かつ簡便に同定、検出でき
る。本発明モノクローナル抗体を適用することができる
免疫学的測定法としては特に限定されないが、例えば、
スライドガラス上に固定した組織標本を用いた組織染色
法などが挙げられる。これは例えばパラホルムアルデヒ
ド、ピクリン酸等によってスライドガラス上に固定され
た組織又は細胞に本発明モノクローナル抗体を反応さ
せ、結合した本発明モノクローナル抗体を標識した抗ラ
ットイムノグロブリン抗体で検出することにより行うこ
とができる。これらの方法に使用される抗ラットイムノ
グロブリン抗体の標識は酵素の場合、ペルオキシダー
ゼ、βガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等
があり、そのほかに金コロイドやＩ125、Ｈ3などが挙げ
られる。
【００１７】
【発明の効果】本発明モノクローナル抗体は毛乳頭細胞
と特異的に反応するため、毛乳頭細胞の検出、精製はも
ちろん、毛母細胞と毛乳頭細胞との間の相互作用を介在
する因子の解明に利用することができる。
と特異的に反応するため、毛乳頭細胞の検出、精製はも
ちろん、毛母細胞と毛乳頭細胞との間の相互作用を介在
する因子の解明に利用することができる。
【００１８】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１９】実施例１ モノクローナル抗体及び産生ハ
イブリドーマの確立 （１） 抗原の調製 抗原に用いた毛乳頭細胞はＹｕｓｐａの方法（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ ＳｋｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｉｔｅ
ｄ ｂｙ Ｄ．Ｓｋｅｒｒｏｗ ａｎｄ Ｃ．Ｊ．Ｓｋ
ｅｒｒｏｗ，ｐ２３１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓ
ｏｎｓ Ｌｔｄ．，１９８５）を目的に合わせて変更し
て調製した。すなわち、生後３〜５日のマウス皮膚を１
０００ｕ／mlのディスパーゼで４℃、３時間処理した。
ピンセットで真皮から表皮を剥しこれを適当量の０．２
％コラゲナーゼ、１００μｇ／mlＤＮａｓｅＩを含むＰ
ＢＳで３７℃、３０分間処理した。１／１０量のＦＣＳ
を加えて反応を停止した後、１５０メッシュのナイロン
フィルターに通し、１２００rpm 、１０分間の遠心にか
け沈澱してくる細胞を回収した。回収した細胞をＰＢＳ
に懸濁し、遠心管に適当量の１０％フィコールを含むＰ
ＢＳを入れたものに重層した。４００rpm 、１０分間遠
心した後、フィコールの上層を真皮ファイブロブラスト
画分（毛乳頭細胞を含む）とし、ペレットを毛母細胞画
分として回収した。毛母細胞画分については１０mlのＰ
ＢＳを加えて再度フィコール分画を行った。回収された
それぞれの画分に２０mlのＰＢＳを加えて懸濁後、１０
００rpm 、５分間の遠心を行い、ペレットを２．０×１
０6〜１０7細胞／mlとなるようにＰＢＳに懸濁した。
イブリドーマの確立 （１） 抗原の調製 抗原に用いた毛乳頭細胞はＹｕｓｐａの方法（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ ＳｋｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｉｔｅ
ｄ ｂｙ Ｄ．Ｓｋｅｒｒｏｗ ａｎｄ Ｃ．Ｊ．Ｓｋ
ｅｒｒｏｗ，ｐ２３１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓ
ｏｎｓ Ｌｔｄ．，１９８５）を目的に合わせて変更し
て調製した。すなわち、生後３〜５日のマウス皮膚を１
０００ｕ／mlのディスパーゼで４℃、３時間処理した。
ピンセットで真皮から表皮を剥しこれを適当量の０．２
％コラゲナーゼ、１００μｇ／mlＤＮａｓｅＩを含むＰ
ＢＳで３７℃、３０分間処理した。１／１０量のＦＣＳ
を加えて反応を停止した後、１５０メッシュのナイロン
フィルターに通し、１２００rpm 、１０分間の遠心にか
け沈澱してくる細胞を回収した。回収した細胞をＰＢＳ
に懸濁し、遠心管に適当量の１０％フィコールを含むＰ
ＢＳを入れたものに重層した。４００rpm 、１０分間遠
心した後、フィコールの上層を真皮ファイブロブラスト
画分（毛乳頭細胞を含む）とし、ペレットを毛母細胞画
分として回収した。毛母細胞画分については１０mlのＰ
ＢＳを加えて再度フィコール分画を行った。回収された
それぞれの画分に２０mlのＰＢＳを加えて懸濁後、１０
００rpm 、５分間の遠心を行い、ペレットを２．０×１
０6〜１０7細胞／mlとなるようにＰＢＳに懸濁した。
【００２０】（２）ラットへの免疫 雌性Ｌｅｗｉｓラット（７もしくは８週齢）を用い次に
示す方法、スケジュールで免疫した。すなわち、初回免
疫として毛乳頭細胞、すなわちファイブロブロスト画分
６．０×１０6個をＰＢＳに懸濁したものを腹腔内に投
与した。２週間後にブースターとして同様に腹腔内投与
を行い、さらに１週間間隔で２度腹腔内投与を行った。
示す方法、スケジュールで免疫した。すなわち、初回免
疫として毛乳頭細胞、すなわちファイブロブロスト画分
６．０×１０6個をＰＢＳに懸濁したものを腹腔内に投
与した。２週間後にブースターとして同様に腹腔内投与
を行い、さらに１週間間隔で２度腹腔内投与を行った。
【００２１】（３）細胞融合 最終免疫から３日後、ラットから脾臓を取り出しＲＰＭ
Ｉ１６４０改変培地中でよくほぐした。これを１０００
rpm で１０分間の遠心にかけ、細胞を集め、再度同培地
で洗浄、遠心した。最終的に１０mlの同培地を加え、
５．０×１０8個の脾細胞浮遊液を得た。これに５．０
×１０7個のマウスＰ３−ＮＳ１／１Ａｇ４．１を混合
し、遠心した。細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で洗
浄後、遠心して細胞を集めた。遠心管を激しく振とうさ
せながら１分間に３mlの５０％ポリエチレングリコール
を含むＰＢＳを加えた。さらに１分間振とうした後、３
０mlの無血清ＲＰＭＩ１６４０を５分間かけて振とうし
ながら徐々に加え反応を停止した。１０００rpm 、５分
間の遠心で回収した細胞を１００mlのＨＡＴ培地（１０
-4Ｍヒポキサンチン、４×１０-7Ｍアミノプテリン、
１．６×１０-5Ｍチミジンを含むＲＰＭＩ１６４０改変
培地）に懸濁し、９６穴マイクロカルチャープレートに
１ウェル当たり０．１mlずつ分注して３７℃、５％ＣＯ
2中で培養した。培養開始１０日後に抗体産生クローン
の選別を行い、１５日後に単クローン化を行った。単ク
ローン化は限界希釈法により行った。すなわち、フィー
ダー細胞としたマウスの胸腺細胞とハイブリドーマをそ
れぞれ１ウェル当たり５×１０5個、１個／１００μｌ
の割合で分注した。３７℃、５％ＣＯ2で１週間培養
し、出現してきたコロニーを観察して単クローンのもの
を選択した。
Ｉ１６４０改変培地中でよくほぐした。これを１０００
rpm で１０分間の遠心にかけ、細胞を集め、再度同培地
で洗浄、遠心した。最終的に１０mlの同培地を加え、
５．０×１０8個の脾細胞浮遊液を得た。これに５．０
×１０7個のマウスＰ３−ＮＳ１／１Ａｇ４．１を混合
し、遠心した。細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で洗
浄後、遠心して細胞を集めた。遠心管を激しく振とうさ
せながら１分間に３mlの５０％ポリエチレングリコール
を含むＰＢＳを加えた。さらに１分間振とうした後、３
０mlの無血清ＲＰＭＩ１６４０を５分間かけて振とうし
ながら徐々に加え反応を停止した。１０００rpm 、５分
間の遠心で回収した細胞を１００mlのＨＡＴ培地（１０
-4Ｍヒポキサンチン、４×１０-7Ｍアミノプテリン、
１．６×１０-5Ｍチミジンを含むＲＰＭＩ１６４０改変
培地）に懸濁し、９６穴マイクロカルチャープレートに
１ウェル当たり０．１mlずつ分注して３７℃、５％ＣＯ
2中で培養した。培養開始１０日後に抗体産生クローン
の選別を行い、１５日後に単クローン化を行った。単ク
ローン化は限界希釈法により行った。すなわち、フィー
ダー細胞としたマウスの胸腺細胞とハイブリドーマをそ
れぞれ１ウェル当たり５×１０5個、１個／１００μｌ
の割合で分注した。３７℃、５％ＣＯ2で１週間培養
し、出現してきたコロニーを観察して単クローンのもの
を選択した。
【００２２】（４）毛母・毛乳頭細胞相互作用を阻害す
る抗体を産生するハイブリドーマの選択とクローン化 抗毛乳頭細胞モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
選択のために、まず培養上清中の抗体量をＥＬＩＳＡ法
で測定した。培養上清５０μｌをマイクロタイタープレ
ートに分注し結合させた後、１％スキムミルクを含むＰ
ＢＳを０．２ml加え１５分間以上静置しブロッキングを
行った。スクムミルク−ＰＢＳを除いた後、適当に希釈
したビオチン化抗ラットＩｇＧ抗体（ウサギ、ベクター
社、アメリカ）を加えて室温で１時間反応させた。これ
をＰＢＳＴで５回洗浄後、アビジン−ビオチン化ワサビ
ペルオキシダーゼ複合体５０μｌを加えて１５分間反応
させた。これをＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＡＢＴＳ
（ＫＰＬ社、アメリカ）を加えて４１５nmにおける吸光
度の高いウェルを選択した。抗体産生ハイブリドーマの
中、毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用を阻害するものは毛
母細胞・毛乳頭細胞共存培養系を用いて選択された。Ｅ
ＬＩＳＡ法によって抗体産生が確認され単クローン化さ
れたハイブリドーマは２４穴カルチャープレートを用い
１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０改変培地１ml中で
培養した。ハイブリドーマが増殖してきたら（１〜２週
間後）遠心して細胞を集め、ＰＢＳで３回洗浄した後、
無血清ＲＰＭＩ１６４０改変培地１ml中で３日間培養を
続けた。遠心により培養上清を調製し、そのうちの０．
１mlを毛母細胞・毛乳頭細胞共存培養系に添加した。こ
の場合に用いる毛母細胞・毛乳頭細胞共存培養系は以下
のように調製した。（１）と同様の方法で調製した毛母
細胞画分と真皮ファイブロブラスト画分をそれぞれ２．
５×１０5細胞／ml、３．０×１０6細胞／mlとなるよう
に無血清Ｍ１９９培地に懸濁した。これらとコラーゲン
溶液（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ ｔｙｐｅＩ−Ａ（新田ゼ
ラチン）、２０mM ＨＥＰＥＳ、２．５mMＮａＯＨ、２
５mM重炭酸ナトリウム、Ｍ１９９培地を含む）を氷冷下
で表１の組成で混合した後、９６穴マイクロカルチャー
プレートに０．１mlずつ分注し、３０分間静置してゲル
化させた。ゲル化が終了したらＭ１９９培地又は培養上
清０．１mlを重層して３７℃、５％ＣＯ2で培養した。
２日後、１ウェル当たり３７kBq トリチウム標識チミジ
ンを加え２時間標識した。培養上清０．１mlを除き０．
１mlの０．２％コラゲナーゼを加え３７℃でコラーゲン
を消化した。１２００rpm 、５分間の遠心にて細胞を回
収し０．２mlのＰＢＳで洗浄後、１７０μｌの１０％Ｔ
ＣＡを加えて４℃で放置する。２２００rpm １０分間の
遠心にて酸不溶画分を回収し２００μｌのＴＣＡで３回
洗浄した。沈澱を１５０μｌの２ＮＮａＯＨで可溶化し
２Ｎ ＨＣｌで中和した後液体シンチレーションカウン
ターを用いて取り込まれた放射活性を測定した。対照実
験と比べハイブリドーマの培養上清を添加することによ
り毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用が阻害されたものは３
種存在した（表２）。
る抗体を産生するハイブリドーマの選択とクローン化 抗毛乳頭細胞モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
選択のために、まず培養上清中の抗体量をＥＬＩＳＡ法
で測定した。培養上清５０μｌをマイクロタイタープレ
ートに分注し結合させた後、１％スキムミルクを含むＰ
ＢＳを０．２ml加え１５分間以上静置しブロッキングを
行った。スクムミルク−ＰＢＳを除いた後、適当に希釈
したビオチン化抗ラットＩｇＧ抗体（ウサギ、ベクター
社、アメリカ）を加えて室温で１時間反応させた。これ
をＰＢＳＴで５回洗浄後、アビジン−ビオチン化ワサビ
ペルオキシダーゼ複合体５０μｌを加えて１５分間反応
させた。これをＰＢＳＴで５回洗浄した後、ＡＢＴＳ
（ＫＰＬ社、アメリカ）を加えて４１５nmにおける吸光
度の高いウェルを選択した。抗体産生ハイブリドーマの
中、毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用を阻害するものは毛
母細胞・毛乳頭細胞共存培養系を用いて選択された。Ｅ
ＬＩＳＡ法によって抗体産生が確認され単クローン化さ
れたハイブリドーマは２４穴カルチャープレートを用い
１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０改変培地１ml中で
培養した。ハイブリドーマが増殖してきたら（１〜２週
間後）遠心して細胞を集め、ＰＢＳで３回洗浄した後、
無血清ＲＰＭＩ１６４０改変培地１ml中で３日間培養を
続けた。遠心により培養上清を調製し、そのうちの０．
１mlを毛母細胞・毛乳頭細胞共存培養系に添加した。こ
の場合に用いる毛母細胞・毛乳頭細胞共存培養系は以下
のように調製した。（１）と同様の方法で調製した毛母
細胞画分と真皮ファイブロブラスト画分をそれぞれ２．
５×１０5細胞／ml、３．０×１０6細胞／mlとなるよう
に無血清Ｍ１９９培地に懸濁した。これらとコラーゲン
溶液（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ ｔｙｐｅＩ−Ａ（新田ゼ
ラチン）、２０mM ＨＥＰＥＳ、２．５mMＮａＯＨ、２
５mM重炭酸ナトリウム、Ｍ１９９培地を含む）を氷冷下
で表１の組成で混合した後、９６穴マイクロカルチャー
プレートに０．１mlずつ分注し、３０分間静置してゲル
化させた。ゲル化が終了したらＭ１９９培地又は培養上
清０．１mlを重層して３７℃、５％ＣＯ2で培養した。
２日後、１ウェル当たり３７kBq トリチウム標識チミジ
ンを加え２時間標識した。培養上清０．１mlを除き０．
１mlの０．２％コラゲナーゼを加え３７℃でコラーゲン
を消化した。１２００rpm 、５分間の遠心にて細胞を回
収し０．２mlのＰＢＳで洗浄後、１７０μｌの１０％Ｔ
ＣＡを加えて４℃で放置する。２２００rpm １０分間の
遠心にて酸不溶画分を回収し２００μｌのＴＣＡで３回
洗浄した。沈澱を１５０μｌの２ＮＮａＯＨで可溶化し
２Ｎ ＨＣｌで中和した後液体シンチレーションカウン
ターを用いて取り込まれた放射活性を測定した。対照実
験と比べハイブリドーマの培養上清を添加することによ
り毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用が阻害されたものは３
種存在した（表２）。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【００２５】（５）モノクローナル抗体の精製 本発明ハイブリドーマを１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１
６４０改変培地で培養し得られる培養上清を１０００rp
m ５分間の遠心分離によって回収した。この上清に５０
％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、４℃に放
置して得られる沈澱を１００００rpm 、１０分間の遠心
によって回収した。沈澱は２０mMリン酸二水素カリウム
を含む２５mM ＭＥＳ緩衝液（pH６．５）に溶解、透析
した。透析液は２５mM ＭＥＳ緩衝液（pH５．１）で４
倍に希釈し、２０mM ＭＥＳ緩衝液（pH５．６）にて平
衡化したＡＢｘカラム（Ｊ．Ｔ．ベーカー社、アメリ
カ）に吸着させた。溶出は、リン酸二水素カリウムの２
５〜２５０mMの直線的濃度勾配によって行った。得られ
た抗体画分は限外濾過法によって濃縮した後、ＰＢＳ中
でスーパーロース６カラム（ファルマシア社、スウェー
デン）によってさらに精製された。溶出された抗体の分
子量から、得られたモノクローナル抗体はＩｇＧとＩｇ
Ｍの両タイプがあることが示された。
６４０改変培地で培養し得られる培養上清を１０００rp
m ５分間の遠心分離によって回収した。この上清に５０
％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、４℃に放
置して得られる沈澱を１００００rpm 、１０分間の遠心
によって回収した。沈澱は２０mMリン酸二水素カリウム
を含む２５mM ＭＥＳ緩衝液（pH６．５）に溶解、透析
した。透析液は２５mM ＭＥＳ緩衝液（pH５．１）で４
倍に希釈し、２０mM ＭＥＳ緩衝液（pH５．６）にて平
衡化したＡＢｘカラム（Ｊ．Ｔ．ベーカー社、アメリ
カ）に吸着させた。溶出は、リン酸二水素カリウムの２
５〜２５０mMの直線的濃度勾配によって行った。得られ
た抗体画分は限外濾過法によって濃縮した後、ＰＢＳ中
でスーパーロース６カラム（ファルマシア社、スウェー
デン）によってさらに精製された。溶出された抗体の分
子量から、得られたモノクローナル抗体はＩｇＧとＩｇ
Ｍの両タイプがあることが示された。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年３月２４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００２】
【従来の技術】毛包組織は、毛球部において間質系の細
胞である毛乳頭細胞を取り囲む様にして存在する。この
毛包中に存在する毛母細胞が増殖、分化することによっ
て毛が成長することが知られている。人を始めとする様
々な動物の体毛は毛母細胞が盛んに増殖する時期（成長
期）に毛が伸長し、毛母細胞の増殖が停止する時期（休
止期）に抜け落ちる。人の頭髪の場合、成長期が短くな
り休止期の状態が長時間続くと脱毛状態になる。このよ
うに毛の成長に重要な毛母細胞の増殖にはこの細胞が接
している毛乳頭細胞との相互作用が必要であることが明
らかにされている（Ｈａｉｒ ａｎｄ Ｈａｉｒ Ｄｉ
ｓｅａｓｅｓ，Ｃ．Ｅ．Ｏｒｆａｎｏｓａｎｄ Ｒ．Ｈ
ａｐｐｌｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ Ｂｅｒｌｉｎ，１９９０）。
胞である毛乳頭細胞を取り囲む様にして存在する。この
毛包中に存在する毛母細胞が増殖、分化することによっ
て毛が成長することが知られている。人を始めとする様
々な動物の体毛は毛母細胞が盛んに増殖する時期（成長
期）に毛が伸長し、毛母細胞の増殖が停止する時期（休
止期）に抜け落ちる。人の頭髪の場合、成長期が短くな
り休止期の状態が長時間続くと脱毛状態になる。このよ
うに毛の成長に重要な毛母細胞の増殖にはこの細胞が接
している毛乳頭細胞との相互作用が必要であることが明
らかにされている（Ｈａｉｒ ａｎｄ Ｈａｉｒ Ｄｉ
ｓｅａｓｅｓ，Ｃ．Ｅ．Ｏｒｆａｎｏｓａｎｄ Ｒ．Ｈ
ａｐｐｌｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ Ｂｅｒｌｉｎ，１９９０）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】この方法に使用する抗原である毛乳頭細胞
は、例えば次の如くして調製できる。材料としてはヒ
ト、ラットを含む全ての哺乳動物を用いることができる
が、特にマウス又はラットが好ましい。これらの皮膚を
適当なプロテアーゼで処理し、真皮を調製する。ここで
使用するプロテーゼとしては、トリプシン等が用いられ
るが、ディスパーゼがより好ましい。得られた真皮は、
酵素処理、例えばコラゲナーゼ処理により線維成分を消
化し、次いでクッションを用いた遠心分離に付すことに
より毛母細胞画分及び毛乳頭細胞画分を得る。クッショ
ンとしてはパーコール、ショ糖などが用いられるが、特
にフィコールが好ましい。また、上記の方法以外にヒト
頭髪やその他の哺乳動物より毛包を調製し、これより実
体顕微鏡下で毛乳頭細胞を採取することも可能である。
は、例えば次の如くして調製できる。材料としてはヒ
ト、ラットを含む全ての哺乳動物を用いることができる
が、特にマウス又はラットが好ましい。これらの皮膚を
適当なプロテアーゼで処理し、真皮を調製する。ここで
使用するプロテーゼとしては、トリプシン等が用いられ
るが、ディスパーゼがより好ましい。得られた真皮は、
酵素処理、例えばコラゲナーゼ処理により線維成分を消
化し、次いでクッションを用いた遠心分離に付すことに
より毛母細胞画分及び毛乳頭細胞画分を得る。クッショ
ンとしてはパーコール、ショ糖などが用いられるが、特
にフィコールが好ましい。また、上記の方法以外にヒト
頭髪やその他の哺乳動物より毛包を調製し、これより実
体顕微鏡下で毛乳頭細胞を採取することも可能である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】一方、骨髄腫細胞は、マウス、ラット、ヒ
トなどの種々の動物の細胞株を使用することができる。
特に好ましい骨髄腫細胞としてはマウスＰ３−ＮＳ−１
／１Ａｇ４．１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＳＰ
２／０Ａｇ１４、ラットＹＢ２／０等を例示することが
できる。通常、骨髄腫細胞は、抗体産生細胞の調製に用
いた動物と同種の動物の細胞株すなわち、ラット脾臓を
用いた場合はラット骨髄腫細胞を用いるのが望ましい
が、γグロブリンを全く合成しないラット由来の骨髄腫
細胞は未だ確立されていない。そのため、マウス由来の
骨髄腫細胞を使用するのが好ましい。
トなどの種々の動物の細胞株を使用することができる。
特に好ましい骨髄腫細胞としてはマウスＰ３−ＮＳ−１
／１Ａｇ４．１、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＳＰ
２／０Ａｇ１４、ラットＹＢ２／０等を例示することが
できる。通常、骨髄腫細胞は、抗体産生細胞の調製に用
いた動物と同種の動物の細胞株すなわち、ラット脾臓を
用いた場合はラット骨髄腫細胞を用いるのが望ましい
が、γグロブリンを全く合成しないラット由来の骨髄腫
細胞は未だ確立されていない。そのため、マウス由来の
骨髄腫細胞を使用するのが好ましい。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】抗体産生ハイブリドーマは、毛母細胞・毛
乳頭細胞共存培養系で毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用を
阻害するかどうかによってスクリーニングされる。すな
わち、Ｙｕｓｐａの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｋ
ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｓ
ｋｅｒｒｏｗ ａｎｄ Ｃ．Ｊ．Ｓｋｅｒｒｗ，ｐ２３
１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．，
１９８５）を応用して毛母細胞及び毛乳頭細胞を含む真
皮ファイブロブラスト画分を調製する。材料としてはラ
ット等、毛を有する動物であればいずれでもよいが、特
にマウス又はラットが好ましい。得られた毛母細胞画分
と真皮ファイブロブラスト画分との共存下で細胞外基質
を含むゲル中で培養する。使用される基質としてはいず
れでも良いが、特にマウス尾腱由来のタイプＩコラーゲ
ンが好ましい。これに適当な無血清培地で培養した抗体
産生ハイブリドーマの培養上清を加え、毛母細胞・毛乳
頭細胞相互作用を阻害するハイブリドーマを選択するこ
とによって毛乳頭細胞を特異的に認識する抗体を産生す
るハイブリドーマを選択することができる。また、選択
されたハイブリドーマを単クローン化する方法として
は、例えばフィーダー細胞としてマウス胸腺細胞を用い
た限界希釈法に数度かけることにより行うことができ
る。
乳頭細胞共存培養系で毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用を
阻害するかどうかによってスクリーニングされる。すな
わち、Ｙｕｓｐａの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｋ
ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｓ
ｋｅｒｒｏｗ ａｎｄ Ｃ．Ｊ．Ｓｋｅｒｒｗ，ｐ２３
１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．，
１９８５）を応用して毛母細胞及び毛乳頭細胞を含む真
皮ファイブロブラスト画分を調製する。材料としてはラ
ット等、毛を有する動物であればいずれでもよいが、特
にマウス又はラットが好ましい。得られた毛母細胞画分
と真皮ファイブロブラスト画分との共存下で細胞外基質
を含むゲル中で培養する。使用される基質としてはいず
れでも良いが、特にマウス尾腱由来のタイプＩコラーゲ
ンが好ましい。これに適当な無血清培地で培養した抗体
産生ハイブリドーマの培養上清を加え、毛母細胞・毛乳
頭細胞相互作用を阻害するハイブリドーマを選択するこ
とによって毛乳頭細胞を特異的に認識する抗体を産生す
るハイブリドーマを選択することができる。また、選択
されたハイブリドーマを単クローン化する方法として
は、例えばフィーダー細胞としてマウス胸腺細胞を用い
た限界希釈法に数度かけることにより行うことができ
る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１４】得られた単クローン化ハイブリドーマを用
いて本発明モノクローナル抗体を製造するには、当該ハ
イブリドーマを適当な培地中で培養するか、又はマウス
等の動物の腹腔内で培養することによって実施される。
例えば、上記のハイブリドーマを１×１０５〜１０６個
／ｍｌの濃度で１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０改
変培地に加え、３〜４日間培養する。ハイブリドーマが
増殖するにつれて培地中に本発明のモノクローナル抗体
が産生されてくる。この培養上清を遠心分離等に付せば
本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。得ら
れた培養上清中の本発明モノクローナル抗体はそのまま
でも使用可能であるが、例えば硫安分画法、イオン交換
クロマトグラフィー法、プロテインＡ結合担体、抗Ｉｇ
Ｇ抗体カラム等によって精製して用いることがより好ま
しい。
いて本発明モノクローナル抗体を製造するには、当該ハ
イブリドーマを適当な培地中で培養するか、又はマウス
等の動物の腹腔内で培養することによって実施される。
例えば、上記のハイブリドーマを１×１０５〜１０６個
／ｍｌの濃度で１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０改
変培地に加え、３〜４日間培養する。ハイブリドーマが
増殖するにつれて培地中に本発明のモノクローナル抗体
が産生されてくる。この培養上清を遠心分離等に付せば
本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。得ら
れた培養上清中の本発明モノクローナル抗体はそのまま
でも使用可能であるが、例えば硫安分画法、イオン交換
クロマトグラフィー法、プロテインＡ結合担体、抗Ｉｇ
Ｇ抗体カラム等によって精製して用いることがより好ま
しい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１５】かくして得られた本発明のモノクローナル
抗体は、例えばウェスタンブロッティング法によりその
特異性を確認することができ、また常法によりそのグロ
ブリンサブクラスを特定することができる。その結果、
本発明モノクローナル抗体は、毛乳頭細胞と強く反応す
るが、毛母細胞とはほとんど反応しない。また、本発明
モノクローナル抗体にはラットＩｇＧとＩｇＭに属する
ものとマウスＩｇＧ１とＩｇＧ２ａ、ＩｇＭに属するも
のとがある。
抗体は、例えばウェスタンブロッティング法によりその
特異性を確認することができ、また常法によりそのグロ
ブリンサブクラスを特定することができる。その結果、
本発明モノクローナル抗体は、毛乳頭細胞と強く反応す
るが、毛母細胞とはほとんど反応しない。また、本発明
モノクローナル抗体にはラットＩｇＧとＩｇＭに属する
ものとマウスＩｇＧ１とＩｇＧ２ａ、ＩｇＭに属するも
のとがある。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１６】本発明モノクローナル抗体を用いて通常の
免疫学的測定法を実施すれば、毛乳頭細胞及びこの細胞
に存在する表面抗原を迅速かつ簡便に同定、検出でき
る。本発明モノクローナル抗体を適用することができる
免疫学的測定法としては特に限定されないが、例えば、
スライドガラス上に固定した組織標本を用いた組織染色
法などが挙げられる。これは例えばパラホルムアルデヒ
ド、ピクリン酸等によってスライドガラス上に固定され
た組織又は細胞に本発明モノクローナル抗体を反応さ
せ、結合した本発明モノクローナル抗体を標識した抗ラ
ット又は抗マウスイムノグロブリン抗体で検出すること
により行うことができる。これらの方法に使用される抗
ラット又は抗マウスイムノグロブリン抗体の標識は酵秦
の場合、ペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、アル
カリフォスファターゼ等があり、そのほかに金コロイド
や１２５Ｉ、３Ｈなどが挙げられる。
免疫学的測定法を実施すれば、毛乳頭細胞及びこの細胞
に存在する表面抗原を迅速かつ簡便に同定、検出でき
る。本発明モノクローナル抗体を適用することができる
免疫学的測定法としては特に限定されないが、例えば、
スライドガラス上に固定した組織標本を用いた組織染色
法などが挙げられる。これは例えばパラホルムアルデヒ
ド、ピクリン酸等によってスライドガラス上に固定され
た組織又は細胞に本発明モノクローナル抗体を反応さ
せ、結合した本発明モノクローナル抗体を標識した抗ラ
ット又は抗マウスイムノグロブリン抗体で検出すること
により行うことができる。これらの方法に使用される抗
ラット又は抗マウスイムノグロブリン抗体の標識は酵秦
の場合、ペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、アル
カリフォスファターゼ等があり、そのほかに金コロイド
や１２５Ｉ、３Ｈなどが挙げられる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】実施例１ 抗マウス毛乳頭細胞モノクロー
ナル抗体及び産生ハイブリドーマの確立 （１） 抗原の調製 抗原に用いた毛乳頭細胞はＹｕｓｐａの方法（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｓｋｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｉｔ
ｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｓｋｅｒｒｏｗ ａｎｄ Ｃ．Ｊ．Ｓ
ｋｅｒｒｏｗ，ｐ２３１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．，１９８５）を目的に合わせて変更
して調製した。すなわち、生後３〜５日のマウス皮膚を
１０００ｕ／ｍｌのディスパーゼで４℃、３時間処理し
た。ピンセットで真皮から表皮を剥しこれを適当量の
０．２％コラゲナーゼ、１００μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ
Ｉを含むＰＢＳで３７℃、３０分間処理した。１／１０
量のＦＣＳを加えて反応を停止した後、１５０メッシュ
のナイロンフィルターに通し、１２００ｒｐｍ、１０分
間の遠心にかけ沈澱してくる細胞を回収した。回収した
細胞をＰＢＳに懸濁し、遠心管に適当量の１０％フィコ
ールを含むＰＢＳを入れたものに重層した。４００ｒｐ
ｍ、１０分間遠心した後、フィコールの上層を真皮ファ
イブロブラスト画分（毛乳頭細胞を含む）とし、ペレッ
トを毛母細胞画分として回収した。毛母細胞画分につい
ては１０ｍｌのＰＢＳを加えて再度フィコール分画を行
った。回収されたそれぞれの画分に２０ｍｌのＰＢＳを
加えて懸濁後、１０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行い、
ペレットを２．０×１０６〜１０７細胞／ｍｌとなるよ
うにＰＢＳに懸濁した。
ナル抗体及び産生ハイブリドーマの確立 （１） 抗原の調製 抗原に用いた毛乳頭細胞はＹｕｓｐａの方法（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｓｋｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｉｔ
ｅｄ ｂｙ Ｄ．Ｓｋｅｒｒｏｗ ａｎｄ Ｃ．Ｊ．Ｓ
ｋｅｒｒｏｗ，ｐ２３１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．，１９８５）を目的に合わせて変更
して調製した。すなわち、生後３〜５日のマウス皮膚を
１０００ｕ／ｍｌのディスパーゼで４℃、３時間処理し
た。ピンセットで真皮から表皮を剥しこれを適当量の
０．２％コラゲナーゼ、１００μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ
Ｉを含むＰＢＳで３７℃、３０分間処理した。１／１０
量のＦＣＳを加えて反応を停止した後、１５０メッシュ
のナイロンフィルターに通し、１２００ｒｐｍ、１０分
間の遠心にかけ沈澱してくる細胞を回収した。回収した
細胞をＰＢＳに懸濁し、遠心管に適当量の１０％フィコ
ールを含むＰＢＳを入れたものに重層した。４００ｒｐ
ｍ、１０分間遠心した後、フィコールの上層を真皮ファ
イブロブラスト画分（毛乳頭細胞を含む）とし、ペレッ
トを毛母細胞画分として回収した。毛母細胞画分につい
ては１０ｍｌのＰＢＳを加えて再度フィコール分画を行
った。回収されたそれぞれの画分に２０ｍｌのＰＢＳを
加えて懸濁後、１０００ｒｐｍ、５分間の遠心を行い、
ペレットを２．０×１０６〜１０７細胞／ｍｌとなるよ
うにＰＢＳに懸濁した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】
【表２】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】（５）ラット抗マウス毛乳頭細胞モノクロ
ーナル抗体の精製 本発明ハイブリドーマを１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１
６４０改変培地で培養し得られる培養上清を１０００ｒ
ｐｍ５分間の遠心分離によって回収した。この上清に５
０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、４℃に
放置して得られる沈澱を１００００ｒｐｍ、１０分間の
遠心によって回収した。沈澱は２０ｍＭリン酸二水素カ
リウムを含む２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に
溶解、透析した。透析液は２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ５．１）で４倍に希釈し、２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液
（ｐＨ５．６）にて平衡化したＡＢｘカラム（Ｊ．Ｔ．
ベーカー社、アメリカ）に吸着させた。溶出は、リン酸
二水素カリウムの２５〜２５０ｍＭの直線的濃度勾配に
よって行った。得られた抗体画分は限外濾過法によって
濃縮した後、ＰＢＳ中でスーパーロース６カラム（ファ
ルマシア社、スウェーデン）によってさらに精製され
た。溶出された抗体の分子量から、得られたモノクロー
ナル抗体はＩｇＧとＩｇＭの両タイプがあることが示さ
れた。また、多量の本発明モノクローナル抗体を製造す
るときには、マウス腹腔内でハイブリドーマを培養し
た。１０６〜１０８細胞の本発明ハイブリドーマをあら
かじめプリスタンを投与したＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔
内に注入した。２〜４週間後に開腹し腹水を得て３００
０ｒｐｍ、１０分間の遠心にかけ、得られる上清を回収
した。上清中の抗体は上述の５０％飽和の硫酸アンモニ
ウムにより回収された後、ＰＢＳに対して透析した。透
析液は抗ラットＩｇＧカラムにかけ、吸着したモノクロ
ーナル抗体は０．０１５Ｎ ＨＣｌにより溶出した。 実施例２ 抗ラット毛乳頭細胞モノクローナル抗体及び
産生ハイブリドーマの確立 生後３〜１０日齢のＳＤラットより実施例１の（１）に
述べた方法により毛乳頭細胞を含む真皮ファイブロブラ
スト画分を調製し、抗原として用いた。Ｂａｌｂ／ｃマ
ウス１匹当たり１０７〜１０８細胞を投与した。適当な
期間をおいて同様に抗原投与を４〜５回繰り返した。最
終免疫後、実施例１と同様に脾臓細胞とマウス骨髄腫と
を細胞融合して抗体産生ハイブリドーマを得た。抗ラッ
ト毛乳頭細胞モノクローナル抗体のスクリーニングも実
施例１と同様の方法で行ったが、毛母細胞・毛乳頭細胞
共存培養はＳＤラット由来の細胞を用いて行った。その
結果、４種類（ＲＤＦ２３−Ｆ７、ＲＤＦ２３−Ｆ９、
ＲＤＦ２７−Ｇ５、ＲＤＦ２７−Ｇ６）の抗ラット毛乳
頭細胞ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体が
有意に毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用を阻害した（表
２）。 実施例３ 抗マウス毛乳頭細胞モノクローナル抗体によ
る毛の再生阻害 本発明モノクローナル抗体産生ハイブリドーマＤＦ２２
０５、４０７２０２の培養上清及び精製した本発明モノ
クローナル抗体１〜１０μｇを背部を毛剃りした７週齢
のＣ３Ｈマウスに皮内投与した。投与後、１週間ごとに
写真撮影を行い、画像解析装置により再生してきた毛の
面積を測定した。その結果、ラット非特異的ＩｇＧを投
与した対照実験と比較して投与後３週目までに著しく毛
の再生抑制が観察された（表３）。
ーナル抗体の精製 本発明ハイブリドーマを１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１
６４０改変培地で培養し得られる培養上清を１０００ｒ
ｐｍ５分間の遠心分離によって回収した。この上清に５
０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、４℃に
放置して得られる沈澱を１００００ｒｐｍ、１０分間の
遠心によって回収した。沈澱は２０ｍＭリン酸二水素カ
リウムを含む２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）に
溶解、透析した。透析液は２５ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ５．１）で４倍に希釈し、２０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液
（ｐＨ５．６）にて平衡化したＡＢｘカラム（Ｊ．Ｔ．
ベーカー社、アメリカ）に吸着させた。溶出は、リン酸
二水素カリウムの２５〜２５０ｍＭの直線的濃度勾配に
よって行った。得られた抗体画分は限外濾過法によって
濃縮した後、ＰＢＳ中でスーパーロース６カラム（ファ
ルマシア社、スウェーデン）によってさらに精製され
た。溶出された抗体の分子量から、得られたモノクロー
ナル抗体はＩｇＧとＩｇＭの両タイプがあることが示さ
れた。また、多量の本発明モノクローナル抗体を製造す
るときには、マウス腹腔内でハイブリドーマを培養し
た。１０６〜１０８細胞の本発明ハイブリドーマをあら
かじめプリスタンを投与したＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔
内に注入した。２〜４週間後に開腹し腹水を得て３００
０ｒｐｍ、１０分間の遠心にかけ、得られる上清を回収
した。上清中の抗体は上述の５０％飽和の硫酸アンモニ
ウムにより回収された後、ＰＢＳに対して透析した。透
析液は抗ラットＩｇＧカラムにかけ、吸着したモノクロ
ーナル抗体は０．０１５Ｎ ＨＣｌにより溶出した。 実施例２ 抗ラット毛乳頭細胞モノクローナル抗体及び
産生ハイブリドーマの確立 生後３〜１０日齢のＳＤラットより実施例１の（１）に
述べた方法により毛乳頭細胞を含む真皮ファイブロブラ
スト画分を調製し、抗原として用いた。Ｂａｌｂ／ｃマ
ウス１匹当たり１０７〜１０８細胞を投与した。適当な
期間をおいて同様に抗原投与を４〜５回繰り返した。最
終免疫後、実施例１と同様に脾臓細胞とマウス骨髄腫と
を細胞融合して抗体産生ハイブリドーマを得た。抗ラッ
ト毛乳頭細胞モノクローナル抗体のスクリーニングも実
施例１と同様の方法で行ったが、毛母細胞・毛乳頭細胞
共存培養はＳＤラット由来の細胞を用いて行った。その
結果、４種類（ＲＤＦ２３−Ｆ７、ＲＤＦ２３−Ｆ９、
ＲＤＦ２７−Ｇ５、ＲＤＦ２７−Ｇ６）の抗ラット毛乳
頭細胞ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体が
有意に毛母細胞・毛乳頭細胞相互作用を阻害した（表
２）。 実施例３ 抗マウス毛乳頭細胞モノクローナル抗体によ
る毛の再生阻害 本発明モノクローナル抗体産生ハイブリドーマＤＦ２２
０５、４０７２０２の培養上清及び精製した本発明モノ
クローナル抗体１〜１０μｇを背部を毛剃りした７週齢
のＣ３Ｈマウスに皮内投与した。投与後、１週間ごとに
写真撮影を行い、画像解析装置により再生してきた毛の
面積を測定した。その結果、ラット非特異的ＩｇＧを投
与した対照実験と比較して投与後３週目までに著しく毛
の再生抑制が観察された（表３）。
【表３】本発明モノクローナル抗体によるマウス毛の再
生阻害 実施例４ 毛母・毛乳頭相互作用に介在する因子の精製
と検出 （１）抗マウス毛乳頭細胞モノクローナル抗体結合カラ
ムの作製 実施例１の（５）に従って精製した本発明モノクローナ
ル抗体ＤＦ２２０５を０．５Ｍ ＮａＣｌで洗ったＥＡ
Ｈ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ファルマシア社、スウ
ェーデン）と混合する。混合液のｐＨを４．５にあわ
せ、適当量のカルボジイミドを加えて１０℃で一晩反応
させた。ゲルを適当なサイズのカラムに充填し蒸留水で
洗浄した後、開始緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，
ｐＨ８．０、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）にて
平衡化した。 （２）毛母・毛乳頭相互作用に介在する因子の精製及び
検出 ３〜５日齢のＣ３Ｈマウスより実施例１の方法に従って
毛包を精製する。得られた毛包を凍結融解した後、１４
０００ｒｐｍ、１０分間の遠心により上清及び沈澱を回
収した。上清は、そのまま本発明モノクローナル抗体結
合カラムに添加したが、沈澱については適当量の抽出緩
衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．５、５％Ｔ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０μＭ ＰＭＳＦ）を加
え、１０℃で１時間攪拌抽出した。抽出液を１４０００
ｒｐｍ、５分間遠心して上清を回収した。これを蒸留水
で２．５倍に希釈して本発明モノクローナル抗体結合カ
ラムに添加した。カラムを充分に洗浄した後、結合して
いる抗原を溶出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐ
Ｈ８．０、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｄｅｏｘｙ
ｃｈｏｌｉｃ Ａｃｉｄ）で溶出した。溶出した画分は
常法に従いＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
後、銀染色を行ったところ、分子量４３ｋＤａの蛋白質
が精製されていることが示された。溶出画分を電気泳動
後ＰＶＤＦ膜に電気的にトランスファーし、本発明モノ
クローナル抗体ＤＦ２２０５と反応させ、０．１％Ｔｗ
ｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、［１２５Ｉ］抗ラッ
トＩｇＧ抗体と反応させてイメージアナライザーＢＡＳ
２０００（富士フィルム（株））を用いて本発明モノク
ローナル抗体が結合している抗原を検出した。その結
果、本発明モノクローナル抗体ＤＦ２２０５は分子量４
３ｋＤａの蛋白質と特異的に結合することが示された。
生阻害 実施例４ 毛母・毛乳頭相互作用に介在する因子の精製
と検出 （１）抗マウス毛乳頭細胞モノクローナル抗体結合カラ
ムの作製 実施例１の（５）に従って精製した本発明モノクローナ
ル抗体ＤＦ２２０５を０．５Ｍ ＮａＣｌで洗ったＥＡ
Ｈ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ファルマシア社、スウ
ェーデン）と混合する。混合液のｐＨを４．５にあわ
せ、適当量のカルボジイミドを加えて１０℃で一晩反応
させた。ゲルを適当なサイズのカラムに充填し蒸留水で
洗浄した後、開始緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，
ｐＨ８．０、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）にて
平衡化した。 （２）毛母・毛乳頭相互作用に介在する因子の精製及び
検出 ３〜５日齢のＣ３Ｈマウスより実施例１の方法に従って
毛包を精製する。得られた毛包を凍結融解した後、１４
０００ｒｐｍ、１０分間の遠心により上清及び沈澱を回
収した。上清は、そのまま本発明モノクローナル抗体結
合カラムに添加したが、沈澱については適当量の抽出緩
衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．５、５％Ｔ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０μＭ ＰＭＳＦ）を加
え、１０℃で１時間攪拌抽出した。抽出液を１４０００
ｒｐｍ、５分間遠心して上清を回収した。これを蒸留水
で２．５倍に希釈して本発明モノクローナル抗体結合カ
ラムに添加した。カラムを充分に洗浄した後、結合して
いる抗原を溶出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐ
Ｈ８．０、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｄｅｏｘｙ
ｃｈｏｌｉｃ Ａｃｉｄ）で溶出した。溶出した画分は
常法に従いＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
後、銀染色を行ったところ、分子量４３ｋＤａの蛋白質
が精製されていることが示された。溶出画分を電気泳動
後ＰＶＤＦ膜に電気的にトランスファーし、本発明モノ
クローナル抗体ＤＦ２２０５と反応させ、０．１％Ｔｗ
ｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄後、［１２５Ｉ］抗ラッ
トＩｇＧ抗体と反応させてイメージアナライザーＢＡＳ
２０００（富士フィルム（株））を用いて本発明モノク
ローナル抗体が結合している抗原を検出した。その結
果、本発明モノクローナル抗体ＤＦ２２０５は分子量４
３ｋＤａの蛋白質と特異的に結合することが示された。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】 毛乳頭細胞に特異的なモノクローナル抗
体。 - 【請求項２】 毛乳頭細胞で免疫した哺乳動物の抗体産
生細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との融合細胞により産生
されるものである請求項１記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 毛乳頭細胞に特異的なモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ。 - 【請求項４】 毛乳頭細胞で免疫した哺乳動物の抗体産
生細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との融合により得られる
ものである請求項３記載のハイブリドーマ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4026634A JPH05276985A (ja) | 1992-02-13 | 1992-02-13 | モノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4026634A JPH05276985A (ja) | 1992-02-13 | 1992-02-13 | モノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05276985A true JPH05276985A (ja) | 1993-10-26 |
Family
ID=12198888
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4026634A Pending JPH05276985A (ja) | 1992-02-13 | 1992-02-13 | モノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05276985A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0653440A1 (en) * | 1993-11-12 | 1995-05-17 | Research Development Corporation Of Japan | Monoclonal antibodies against hair follicle, hybridomas producing them |
-
1992
- 1992-02-13 JP JP4026634A patent/JPH05276985A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0653440A1 (en) * | 1993-11-12 | 1995-05-17 | Research Development Corporation Of Japan | Monoclonal antibodies against hair follicle, hybridomas producing them |
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