JPH067192A - 抗ｄｃｃ遺伝子産物モノクローナル抗体 - Google Patents
抗ｄｃｃ遺伝子産物モノクローナル抗体Info
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- JPH067192A JPH067192A JP4167101A JP16710192A JPH067192A JP H067192 A JPH067192 A JP H067192A JP 4167101 A JP4167101 A JP 4167101A JP 16710192 A JP16710192 A JP 16710192A JP H067192 A JPH067192 A JP H067192A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 癌抑制遺伝子ＤＣＣ遺伝子によりコードされ
るペプチド（ＤＣＣ遺伝子産物）に特異的に反応するモ
ノクローナル抗体および該抗体を生産するハイブリドー
マ。とくに、ＤＣＣ遺伝子の一つであるＤＣＣ−２に特
異的に反応するＩｇＧ３サブクラスに属するマウスモノ
クローナル抗体ＫＭ８９０および該抗体を生産するハイ
ブリドーマＫＭ８９０。 【効果】 本発明のモノクローナル抗体は、ＤＣＣ遺伝
子産物に特異的に反応するため、免疫組織染色、ＤＣＣ
遺伝子産物の定量等に応用することができ、癌の診断等
に有用である。
るペプチド（ＤＣＣ遺伝子産物）に特異的に反応するモ
ノクローナル抗体および該抗体を生産するハイブリドー
マ。とくに、ＤＣＣ遺伝子の一つであるＤＣＣ−２に特
異的に反応するＩｇＧ３サブクラスに属するマウスモノ
クローナル抗体ＫＭ８９０および該抗体を生産するハイ
ブリドーマＫＭ８９０。 【効果】 本発明のモノクローナル抗体は、ＤＣＣ遺伝
子産物に特異的に反応するため、免疫組織染色、ＤＣＣ
遺伝子産物の定量等に応用することができ、癌の診断等
に有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、癌抑制遺伝子ＤＣＣに
よりコードされるペプチドに特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体に関する。本発明のモノクローナル抗体は癌
の診断等に有用である。
よりコードされるペプチドに特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体に関する。本発明のモノクローナル抗体は癌
の診断等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】Vogelsteinらは、家族性ポリポーシスの
良性腺腫から癌にいたる患者の染色体を調べたところ、
第５、１７、１８および２２番染色体にヘテロ接合性消
失（対立遺伝子欠失）が検出されることを見いだし（Ne
w Engl.J.Med., 319:525-532,1988 ）、これらの欠失し
た染色体には、家族性ポリポーシスに関係した癌抑制遺
伝子が存在することが予測された。その後、染色体１７
Ｐに存在する癌抑制遺伝子は、以前、癌遺伝子として知
られていたＰ５３遺伝子であることが実証された（Scie
nce, 244:217-221, 1989）。さらに、染色体１８ｑの癌
抑制遺伝子としてＤＣＣ（deleted in colorectal carc
inoma ）遺伝子が発見され（Science, 247:49-56, 199
0）、つづいて染色体５ｑからＭＣＣ（mutated in colo
rectal cancer）遺伝子とＡＰＣ遺伝子（adenomatous p
olyposis ）の単離が相次いで報告された（Science, 25
1:1366-1370, 1991; Science, 253:665-669, 1991）。
良性腺腫から癌にいたる患者の染色体を調べたところ、
第５、１７、１８および２２番染色体にヘテロ接合性消
失（対立遺伝子欠失）が検出されることを見いだし（Ne
w Engl.J.Med., 319:525-532,1988 ）、これらの欠失し
た染色体には、家族性ポリポーシスに関係した癌抑制遺
伝子が存在することが予測された。その後、染色体１７
Ｐに存在する癌抑制遺伝子は、以前、癌遺伝子として知
られていたＰ５３遺伝子であることが実証された（Scie
nce, 244:217-221, 1989）。さらに、染色体１８ｑの癌
抑制遺伝子としてＤＣＣ（deleted in colorectal carc
inoma ）遺伝子が発見され（Science, 247:49-56, 199
0）、つづいて染色体５ｑからＭＣＣ（mutated in colo
rectal cancer）遺伝子とＡＰＣ遺伝子（adenomatous p
olyposis ）の単離が相次いで報告された（Science, 25
1:1366-1370, 1991; Science, 253:665-669, 1991）。
【０００３】ＤＣＣ遺伝子は非常に大きな遺伝子（２〜
３メガベース）であり、現在クローニングされている３
７０キロベースには少なくとも８個のエクソンが存在す
ると考えられている。メッセンジャーRNA は、１〜１２
キロベースであり、正常大腸、脳等に発現していること
が見いだされている。実際の大腸癌細胞においては、欠
失、点突然変異、DNA のインサーションといった突然変
異がＤＣＣ遺伝子内に起こることが確認されている。今
後ＤＣＣ遺伝子をＤＣＣ遺伝子が欠失している癌細胞に
導入する等の方法により、ＤＣＣ遺伝子の癌抑制遺伝子
としての働きが解明されていくと考えられる。
３メガベース）であり、現在クローニングされている３
７０キロベースには少なくとも８個のエクソンが存在す
ると考えられている。メッセンジャーRNA は、１〜１２
キロベースであり、正常大腸、脳等に発現していること
が見いだされている。実際の大腸癌細胞においては、欠
失、点突然変異、DNA のインサーションといった突然変
異がＤＣＣ遺伝子内に起こることが確認されている。今
後ＤＣＣ遺伝子をＤＣＣ遺伝子が欠失している癌細胞に
導入する等の方法により、ＤＣＣ遺伝子の癌抑制遺伝子
としての働きが解明されていくと考えられる。
【０００４】ＤＣＣ遺伝子よりコードされるペプチド
（以下、ＤＣＣ遺伝子産物と略記する）の機能について
は、予想されるアミノ酸配列の中に細胞接着分子の一つ
であるN-CAM(Neural cell adhesion molecule)と相同性
がある部分があり、細胞間伝達に関与していることなど
が推察されている。しかし、これまでにＤＣＣ遺伝子産
物に反応する抗体がないことから、ＤＣＣ遺伝子産物の
局在、機能等は不明な点が多い。
（以下、ＤＣＣ遺伝子産物と略記する）の機能について
は、予想されるアミノ酸配列の中に細胞接着分子の一つ
であるN-CAM(Neural cell adhesion molecule)と相同性
がある部分があり、細胞間伝達に関与していることなど
が推察されている。しかし、これまでにＤＣＣ遺伝子産
物に反応する抗体がないことから、ＤＣＣ遺伝子産物の
局在、機能等は不明な点が多い。
【０００５】染色体１７Ｐに存在する癌抑制遺伝子Ｐ５
３については、その遺伝子産物に対する抗体が作製され
ており（Eur.J.Biochem., 159:529-534, 1986 ）、それ
を用いた免疫組織染色法によりＰ５３遺伝子産物を過剰
発現している癌細胞が陽性に染色されることが報告され
ている（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87:7555-7559, 199
0）。また、同様のＰ５３遺伝子によりコードされるペ
プチド（以下、Ｐ５３遺伝子産物と略記する）に対する
抗体を用いた酵素抗体法により、Ｐ５３遺伝子産物の定
量化ができることが報告されている（J.Cell Science,
101:183-189, 1992 ）。
３については、その遺伝子産物に対する抗体が作製され
ており（Eur.J.Biochem., 159:529-534, 1986 ）、それ
を用いた免疫組織染色法によりＰ５３遺伝子産物を過剰
発現している癌細胞が陽性に染色されることが報告され
ている（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87:7555-7559, 199
0）。また、同様のＰ５３遺伝子によりコードされるペ
プチド（以下、Ｐ５３遺伝子産物と略記する）に対する
抗体を用いた酵素抗体法により、Ｐ５３遺伝子産物の定
量化ができることが報告されている（J.Cell Science,
101:183-189, 1992 ）。
【０００６】ＤＣＣ遺伝子産物に対する抗体が作製でき
れば、免疫組織染色やＤＣＣ遺伝子産物の定量化等に応
用することができ、癌の診断等に役立つと考えられる。
れば、免疫組織染色やＤＣＣ遺伝子産物の定量化等に応
用することができ、癌の診断等に役立つと考えられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、癌の
診断等に有用な癌抑制遺伝子ＤＣＣ遺伝子産物に対する
モノクローナル抗体を提供することにある。
診断等に有用な癌抑制遺伝子ＤＣＣ遺伝子産物に対する
モノクローナル抗体を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、公知のＤ
ＣＣ遺伝子の部分配列から予測される７５０残基のＤＣ
Ｃ遺伝子産物のアミノ酸配列（Science, 247:49-56, 19
90）の中から１０〜３０残基程度の部分配列を何種類か
選択し、それに基づいて合成ペプチドを作製した。この
合成ペプチドとキャリヤー蛋白との複合体を動物に免疫
し、免疫した動物の脾細胞とマウスの骨髄腫細胞とを融
合させてハイブリドーマを作製し、免疫したペプチドに
反応し、免疫したペプチドとアミノ酸配列の異なるペプ
チドとは反応しないモノクローナル抗体を生産するハイ
ブリドーマを選択した。該ハイブリドーマを培地で培養
するか、または動物に投与して該動物を腹水癌化し、該
培養液または腹水よりモノクローナル抗体を採取し、得
られたモノクローナル抗体の中から、免疫組織染色の第
一抗体として使用したときに癌細胞を陽性に染色できる
ものを選択したところ、当該モノクローナル抗体が、Ｄ
ＣＣ遺伝子産物に特異的に反応し、組織診断等による癌
の診断に応用できることを見いだし、本発明を完成し
た。
ＣＣ遺伝子の部分配列から予測される７５０残基のＤＣ
Ｃ遺伝子産物のアミノ酸配列（Science, 247:49-56, 19
90）の中から１０〜３０残基程度の部分配列を何種類か
選択し、それに基づいて合成ペプチドを作製した。この
合成ペプチドとキャリヤー蛋白との複合体を動物に免疫
し、免疫した動物の脾細胞とマウスの骨髄腫細胞とを融
合させてハイブリドーマを作製し、免疫したペプチドに
反応し、免疫したペプチドとアミノ酸配列の異なるペプ
チドとは反応しないモノクローナル抗体を生産するハイ
ブリドーマを選択した。該ハイブリドーマを培地で培養
するか、または動物に投与して該動物を腹水癌化し、該
培養液または腹水よりモノクローナル抗体を採取し、得
られたモノクローナル抗体の中から、免疫組織染色の第
一抗体として使用したときに癌細胞を陽性に染色できる
ものを選択したところ、当該モノクローナル抗体が、Ｄ
ＣＣ遺伝子産物に特異的に反応し、組織診断等による癌
の診断に応用できることを見いだし、本発明を完成し
た。
【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明
は、ＤＣＣ遺伝子産物に特異的に反応するモノクローナ
ル抗体（以下、抗ＤＣＣ遺伝子産物モノクローナル抗体
と略記する）、該抗体を生産するハイブリドーマ、該抗
体を有効成分として含有してなる癌の治療薬および該抗
体を製造するのに有用な抗原に関する。本発明に係るＤ
ＣＣ遺伝子産物としては、例えば、配列番号２に示され
るアミノ酸配列を含むペプチドがあげられる。本発明の
抗ＤＣＣ遺伝子産物モノクローナル抗体は、ＤＮＡの欠
失、点突然変異、インサーション等の突然変異により、
塩基配列の一部が変化したＤＣＣ遺伝子よりコードされ
るペプチドに対するモノクローナル抗体を包含する。本
発明の抗ＤＣＣ遺伝子産物モノクローナル抗体は、抗原
としてＤＣＣ遺伝子産物を動物に免疫することにより製
造することができる。抗原としては、例えば、配列番号
２で示されるアミノ酸配列を有するペプチドがあげられ
る。
は、ＤＣＣ遺伝子産物に特異的に反応するモノクローナ
ル抗体（以下、抗ＤＣＣ遺伝子産物モノクローナル抗体
と略記する）、該抗体を生産するハイブリドーマ、該抗
体を有効成分として含有してなる癌の治療薬および該抗
体を製造するのに有用な抗原に関する。本発明に係るＤ
ＣＣ遺伝子産物としては、例えば、配列番号２に示され
るアミノ酸配列を含むペプチドがあげられる。本発明の
抗ＤＣＣ遺伝子産物モノクローナル抗体は、ＤＮＡの欠
失、点突然変異、インサーション等の突然変異により、
塩基配列の一部が変化したＤＣＣ遺伝子よりコードされ
るペプチドに対するモノクローナル抗体を包含する。本
発明の抗ＤＣＣ遺伝子産物モノクローナル抗体は、抗原
としてＤＣＣ遺伝子産物を動物に免疫することにより製
造することができる。抗原としては、例えば、配列番号
２で示されるアミノ酸配列を有するペプチドがあげられ
る。
【００１０】以下に、本発明の抗ＤＣＣ遺伝子産物モノ
クローナル抗体の製造法を詳細に説明する。
クローナル抗体の製造法を詳細に説明する。
【００１１】（１）抗原ペプチドの合成 配列番号１〜５で示されるアミノ酸配列を有するペプチ
ドは、ペプチド自動合成機を用いた固相法により合成す
ることができる。固相法により得られるペプチドが結合
した固相担体をフッ化水素で処理し、ペプチドを固相担
体より遊離させると同時にアミノ酸側鎖の保護基を除去
する。このようにして得られるペプチドの粗生成物は、
逆相系カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以
下、HPLCと略記する）で精製し、抗原ペプチドとして用
いる。
ドは、ペプチド自動合成機を用いた固相法により合成す
ることができる。固相法により得られるペプチドが結合
した固相担体をフッ化水素で処理し、ペプチドを固相担
体より遊離させると同時にアミノ酸側鎖の保護基を除去
する。このようにして得られるペプチドの粗生成物は、
逆相系カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（以
下、HPLCと略記する）で精製し、抗原ペプチドとして用
いる。
【００１２】（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製 ３〜２０週令のマウス、ラットまたはハムスターに、
（１）で得られる抗原ペプチドとヘモシアニン・キーホ
ール・リンペット（Hemocyanin, Keyhole Limpet；以下
ＫＬＨと略記する）、牛血清アルブミン、サイログロブ
リン、卵白アルブミン、人血清アルブミンなどのキャリ
ヤー蛋白との複合体を免疫して、その動物の脾、リンパ
節または末梢血中の抗体産生細胞を採取する。
（１）で得られる抗原ペプチドとヘモシアニン・キーホ
ール・リンペット（Hemocyanin, Keyhole Limpet；以下
ＫＬＨと略記する）、牛血清アルブミン、サイログロブ
リン、卵白アルブミン、人血清アルブミンなどのキャリ
ヤー蛋白との複合体を免疫して、その動物の脾、リンパ
節または末梢血中の抗体産生細胞を採取する。
【００１３】免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるい
は腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインド
の完全アジュバント（Complete Freund's Adjuvant)や
水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とと
もに抗原を投与することにより行う。抗原の投与は、１
回目の投与の後１〜２週間おきに５〜１０回行う。各投
与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗
原と反応することを酵素免疫測定法〔Antibodies - A L
aboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,19
88 〕などで調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血
清が十分な抗体価を示したマウス、ラットまたはハムス
ターを脾細胞の供給源として提供する。
は腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインド
の完全アジュバント（Complete Freund's Adjuvant)や
水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とと
もに抗原を投与することにより行う。抗原の投与は、１
回目の投与の後１〜２週間おきに５〜１０回行う。各投
与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗
原と反応することを酵素免疫測定法〔Antibodies - A L
aboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,19
88 〕などで調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血
清が十分な抗体価を示したマウス、ラットまたはハムス
ターを脾細胞の供給源として提供する。
【００１４】脾細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあた
って、抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウ
ス、ラットまたはハムスターより脾臓を摘出し、脾細胞
を採取する。脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細
断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ
、５分）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニ
ウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理して赤血
球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄して融合用脾細胞と
して提供する。
って、抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウ
ス、ラットまたはハムスターより脾臓を摘出し、脾細胞
を採取する。脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細
断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ
、５分）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニ
ウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理して赤血
球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄して融合用脾細胞と
して提供する。
【００１５】（３）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１
（Ｐ３−Ｕ１）(Current Topics in Microbiology and
Immunology，18: 1-7, 1978 ）、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａ
ｇ４１（ＮＳ−１）(European J. Immunology, 6: 511-
519, 1976)、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ−２）(Natur
e, 276:269-270, 1978)、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３
（６５３）(J. Immunology, 123:1548-1550, 1979) 、
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）(Nature, 256: 495-49
7,1975)などが用いられる。これらの細胞株は、８−ア
ザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン
（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０
-5Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛
胎児血清（ＦＣＳ）を加えた培地（以下、正常培地とい
う）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を
加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正
常培地に継代し、融合当日２×１０7 個以上の細胞数を
確保する。
用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡ
ＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１
（Ｐ３−Ｕ１）(Current Topics in Microbiology and
Immunology，18: 1-7, 1978 ）、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａ
ｇ４１（ＮＳ−１）(European J. Immunology, 6: 511-
519, 1976)、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ−２）(Natur
e, 276:269-270, 1978)、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３
（６５３）(J. Immunology, 123:1548-1550, 1979) 、
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）(Nature, 256: 495-49
7,1975)などが用いられる。これらの細胞株は、８−ア
ザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン
（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０
-5Ｍ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛
胎児血清（ＦＣＳ）を加えた培地（以下、正常培地とい
う）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を
加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正
常培地に継代し、融合当日２×１０7 個以上の細胞数を
確保する。
【００１６】（４）細胞融合 （２）で免疫した抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄
腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム
１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６
５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、
細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１に
なるよう混合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分）
した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした
後、撹拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコー
ル−１，０００（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ２
ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液０．
２〜１ｍｌ／１０8 抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎
にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を
加えて全量が５０ｍｌになるようにする。遠心分離（９
００ｒｐｍ、５分）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞を
ほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆる
やかに細胞をＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン
（１０-4Ｍ）、チミジン（１．５×１０-5Ｍ）およびア
ミノプテリン（４×１０-7Ｍ ）を加えた培地〕１００
ｍｌ中に懸濁する。この懸濁液を９６穴培養用プレート
に１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ2 インキュベー
ター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム
１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６
５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、
細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１に
なるよう混合し、遠心分離（１，２００ｒｐｍ、５分）
した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした
後、撹拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコー
ル−１，０００（ＰＥＧ−１，０００）２ｇ、ＭＥＭ２
ｍｌおよびジメチルスルホキシド０．７ｍｌの混液０．
２〜１ｍｌ／１０8 抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎
にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回加えた後、ＭＥＭ培地を
加えて全量が５０ｍｌになるようにする。遠心分離（９
００ｒｐｍ、５分）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞を
ほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆる
やかに細胞をＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン
（１０-4Ｍ）、チミジン（１．５×１０-5Ｍ）およびア
ミノプテリン（４×１０-7Ｍ ）を加えた培地〕１００
ｍｌ中に懸濁する。この懸濁液を９６穴培養用プレート
に１００μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ2 インキュベー
ター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
【００１７】培養後、培養上清の一部をとり酵素免疫測
定法などにより、免疫原として用いたペプチドに反応
し、免疫原として用いたペプチドと配列の異なるペプチ
ドに反応しないものを選択する。ついで、限界希釈法に
よりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地
（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回
目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認
められたものを抗ＤＣＣ遺伝子産物モノクローナル抗体
産生ハイブリドーマ株として選択する。
定法などにより、免疫原として用いたペプチドに反応
し、免疫原として用いたペプチドと配列の異なるペプチ
ドに反応しないものを選択する。ついで、限界希釈法に
よりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地
（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回
目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認
められたものを抗ＤＣＣ遺伝子産物モノクローナル抗体
産生ハイブリドーマ株として選択する。
【００１８】（５）モノクローナル抗体の調製 プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投
与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまた
はヌードマウスに、（４）で得られる抗ＤＣＣ遺伝子産
物モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２×１０
6 〜５×１０7 細胞／匹を腹腔内注射する。１０〜２１
日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹
水を採取し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分）して
固形分を除去後、４０〜５０％硫酸アンモニウムで塩析
し、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カ
ラムあるいはゲル濾過カラム等に通塔し、ＩｇＧあるい
はＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
ンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍｌを腹腔内投
与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまた
はヌードマウスに、（４）で得られる抗ＤＣＣ遺伝子産
物モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２×１０
6 〜５×１０7 細胞／匹を腹腔内注射する。１０〜２１
日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹
水を採取し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分）して
固形分を除去後、４０〜５０％硫酸アンモニウムで塩析
し、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カ
ラムあるいはゲル濾過カラム等に通塔し、ＩｇＧあるい
はＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
【００１９】抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタ
イピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋
白量の定量は、ローリー法および２８０ｎｍでの吸光度
より算出する。
イピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋
白量の定量は、ローリー法および２８０ｎｍでの吸光度
より算出する。
【００２０】（６）抗ＤＣＣ遺伝子産物モノクローナル
抗体の選択 （５）で得られるモノクローナル抗体を免疫組織染色法
〔Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Ha
rbor Laboratory, 1988 〕の第一抗体として用い、組織
切片中の癌細胞を陽性に染色するものを選択する。この
際、凍結組織由来の組織切片およびホルマリン固定パラ
フィン包埋ブロック由来の組織切片の両方に陽性に染色
するモノクローナル抗体を選択することが好ましい。
抗体の選択 （５）で得られるモノクローナル抗体を免疫組織染色法
〔Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Ha
rbor Laboratory, 1988 〕の第一抗体として用い、組織
切片中の癌細胞を陽性に染色するものを選択する。この
際、凍結組織由来の組織切片およびホルマリン固定パラ
フィン包埋ブロック由来の組織切片の両方に陽性に染色
するモノクローナル抗体を選択することが好ましい。
【００２１】このようにして選択される抗ＤＣＣ遺伝子
産物モノクローナル抗体の具体例としては、ハイブリド
ーマ細胞株ＫＭ８９０が生産する抗ＤＣＣ遺伝子産物モ
ノクローナル抗体ＫＭ８９０をあげることができる。ハ
イブリドーマ細胞株ＫＭ８９０は平成４年６月16日付で
ブダペスト条約に基づき工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研条寄第３８８９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８８
９）として寄託されている。
産物モノクローナル抗体の具体例としては、ハイブリド
ーマ細胞株ＫＭ８９０が生産する抗ＤＣＣ遺伝子産物モ
ノクローナル抗体ＫＭ８９０をあげることができる。ハ
イブリドーマ細胞株ＫＭ８９０は平成４年６月16日付で
ブダペスト条約に基づき工業技術院微生物工業技術研究
所に微工研条寄第３８８９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３８８
９）として寄託されている。
【００２２】以下に、本発明の実施例を示す。なお、以
下の実施例に示す方法において、ペプチドの合成はアプ
ライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems, In
c., Foster City, California, USA; 以下ABI 社と略記
する）のペプチド合成機430A型機を用い、ABI 社の試薬
および溶媒を用いてABI 社の合成プログラムにより行っ
た。縮合反応は、アスパラギン、グルタミンおよびアル
ギニンについては１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを
用いて活性エステル体として、他のアミノ酸は対称酸無
水物として標準の条件で行った。また、理化学的性質の
測定は次の機器類を用いて測定した。
下の実施例に示す方法において、ペプチドの合成はアプ
ライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems, In
c., Foster City, California, USA; 以下ABI 社と略記
する）のペプチド合成機430A型機を用い、ABI 社の試薬
および溶媒を用いてABI 社の合成プログラムにより行っ
た。縮合反応は、アスパラギン、グルタミンおよびアル
ギニンについては１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを
用いて活性エステル体として、他のアミノ酸は対称酸無
水物として標準の条件で行った。また、理化学的性質の
測定は次の機器類を用いて測定した。
【００２３】質量分析 日立 M-80B アミノ酸分析 Waters pico tag
【００２４】
実施例１ （１）抗原ペプチドの合成 配列番号１〜５にそれぞれ示したアミノ酸配列を有する
抗原ペプチドであるＤＣＣ−１, ＤＣＣ−２, ＤＣＣ−
３, ＤＣＣ−４およびＤＣＣ−５を以下のようにして合
成した。
抗原ペプチドであるＤＣＣ−１, ＤＣＣ−２, ＤＣＣ−
３, ＤＣＣ−４およびＤＣＣ−５を以下のようにして合
成した。
【００２５】（１−１） ＤＣＣ−１の合成 t-Boc-Ile の0.25mmolが結合した担体樹脂0.37g を自動
合成機の反応容器に入れ、ABI 社の合成プログラムに従
い、次の処理および洗浄を行い、イソロイシンの結合し
た担体樹脂を得た (1)33%トリフルオロ酢酸を含む塩化メチレン溶液で80秒
間処理する。 (2)50%トリフルオロ酢酸を含む塩化メチレン溶液で18.5
分間処理する。 (3) 塩化メチレンで３回洗浄する。 (4)10%ジイソプロピルエチルアミンを含む塩化メチレン
溶液で１分間、２回処理する。 (5) ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で５回洗浄する。 このようにして得られたイソロイシンの結合した担体樹
脂に、さらに次の処理および洗浄を行った。 (6)t-Boc-Thr(Bzl) の対称酸無水物1.0mmol を含むＤＭ
Ｆ溶液4ml を加え、反応容器を18分間攪拌する。 (7) 塩化メチレンで５回洗浄する。
合成機の反応容器に入れ、ABI 社の合成プログラムに従
い、次の処理および洗浄を行い、イソロイシンの結合し
た担体樹脂を得た (1)33%トリフルオロ酢酸を含む塩化メチレン溶液で80秒
間処理する。 (2)50%トリフルオロ酢酸を含む塩化メチレン溶液で18.5
分間処理する。 (3) 塩化メチレンで３回洗浄する。 (4)10%ジイソプロピルエチルアミンを含む塩化メチレン
溶液で１分間、２回処理する。 (5) ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で５回洗浄する。 このようにして得られたイソロイシンの結合した担体樹
脂に、さらに次の処理および洗浄を行った。 (6)t-Boc-Thr(Bzl) の対称酸無水物1.0mmol を含むＤＭ
Ｆ溶液4ml を加え、反応容器を18分間攪拌する。 (7) 塩化メチレンで５回洗浄する。
【００２６】この結果得られたt-Boc-Thr(Bzl)-Ileが結
合した担体樹脂に、上記の(1) 〜(5) の脱保護工程を行
った後、(6) の工程でt-Boc-Thr(Bzl)の代わりにt-Boc-
Proの対称酸無水物を加えて縮合反応を行い、次いで(7)
の洗浄工程を経てt-Boc-Pro-Thr(Bzl)-Ileを担体樹脂
上に合成した。以下、工程(1) 〜(7) を順次繰り返して
保護ペプチドの結合した担体樹脂1.09g を得た。なお、
工程(6) には順次t-Boc-Met,t-Boc-Pro,t-BocGlu(OBz
l),t-Boc-Gly,t-Boc-Ile,t-Boc-Val,t-Boc-Glu(OBzl),t
-Boc-Cys(4-CH3Bzl),t-BocLys(Cl-Z),t-BocLeu(H2O), t
-BocLeu(H2O),t-Boc-Val, t-Boc-Thr(Bzl), t-Boc-Asp
(OBzl),t-Boc-Gly,t-Boc-Met,t-Boc-Phe,t-Boc-Ala を
用いた。合成反応終了後、得られた担体樹脂1.09g にア
ニソール1.4ml を加え15時間放置した後、フッ化水素15
mlを加えて1.2 時間氷冷下攪拌した。次いでフッ化水素
を減圧下除去し、担体樹脂に酢酸エチル100ml を加え0.
5 時間攪拌した。濾過して得られた担体樹脂に2M酢酸10
0ml を加えて１時間攪拌した。担体樹脂を濾過で除き濾
液を凍結乾燥して424mg の粗成物を得た。これを逆相カ
ラム（CAPCELL PAK C18 SG120 30 ×250mm ）を用いた
HPLCで精製した。0.1%トリフルオロ酢酸とアセトニトリ
ルを用いた直線濃度勾配法で溶出し、220nm で検出する
ことによりＤＣＣ−１を含む画分を得た。この画分を凍
結乾燥してＤＣＣ−１を26.0mg得た。
合した担体樹脂に、上記の(1) 〜(5) の脱保護工程を行
った後、(6) の工程でt-Boc-Thr(Bzl)の代わりにt-Boc-
Proの対称酸無水物を加えて縮合反応を行い、次いで(7)
の洗浄工程を経てt-Boc-Pro-Thr(Bzl)-Ileを担体樹脂
上に合成した。以下、工程(1) 〜(7) を順次繰り返して
保護ペプチドの結合した担体樹脂1.09g を得た。なお、
工程(6) には順次t-Boc-Met,t-Boc-Pro,t-BocGlu(OBz
l),t-Boc-Gly,t-Boc-Ile,t-Boc-Val,t-Boc-Glu(OBzl),t
-Boc-Cys(4-CH3Bzl),t-BocLys(Cl-Z),t-BocLeu(H2O), t
-BocLeu(H2O),t-Boc-Val, t-Boc-Thr(Bzl), t-Boc-Asp
(OBzl),t-Boc-Gly,t-Boc-Met,t-Boc-Phe,t-Boc-Ala を
用いた。合成反応終了後、得られた担体樹脂1.09g にア
ニソール1.4ml を加え15時間放置した後、フッ化水素15
mlを加えて1.2 時間氷冷下攪拌した。次いでフッ化水素
を減圧下除去し、担体樹脂に酢酸エチル100ml を加え0.
5 時間攪拌した。濾過して得られた担体樹脂に2M酢酸10
0ml を加えて１時間攪拌した。担体樹脂を濾過で除き濾
液を凍結乾燥して424mg の粗成物を得た。これを逆相カ
ラム（CAPCELL PAK C18 SG120 30 ×250mm ）を用いた
HPLCで精製した。0.1%トリフルオロ酢酸とアセトニトリ
ルを用いた直線濃度勾配法で溶出し、220nm で検出する
ことによりＤＣＣ−１を含む画分を得た。この画分を凍
結乾燥してＤＣＣ−１を26.0mg得た。
【００２７】ＤＣＣ−１の理化学的性質は以下の通りで
ある。 質量分析（SIMS）: 2263 (M+1) アミノ酸分析 実測値（計算値）： Asx1.0(1),Glx2.2
(2),Thr2.0(2),Ala1.0(1),Pro2.2(2),Val1.6(2),Met2.0
(2),Ile1.7(2),Leu2.1(2),Phe1.1(1),Lys1.0(1),Cys0.8
(1)
ある。 質量分析（SIMS）: 2263 (M+1) アミノ酸分析 実測値（計算値）： Asx1.0(1),Glx2.2
(2),Thr2.0(2),Ala1.0(1),Pro2.2(2),Val1.6(2),Met2.0
(2),Ile1.7(2),Leu2.1(2),Phe1.1(1),Lys1.0(1),Cys0.8
(1)
【００２８】（１−２） ＤＣＣ−２の合成 t-Boc-Thr が結合した担体樹脂および保護アミノ酸とし
て順次ＤＣＣ−２のアミノ酸配列に従ってt-Boc-アミノ
酸を用い、（１−１）と同様にして保護ペプチドが結合
した担体樹脂1.0gを得た。これを（１−１）と同様に処
理して粗成物443mg を得た。このすべてをHPLCを用いて
精製してＤＣＣ−２を107mg 得た。
て順次ＤＣＣ−２のアミノ酸配列に従ってt-Boc-アミノ
酸を用い、（１−１）と同様にして保護ペプチドが結合
した担体樹脂1.0gを得た。これを（１−１）と同様に処
理して粗成物443mg を得た。このすべてをHPLCを用いて
精製してＤＣＣ−２を107mg 得た。
【００２９】ＤＣＣ−２の理化学的性質は以下の通りで
ある。 質量分析 : 2261 (M+1) アミノ酸分析 実測値（計算値）：Asn1.9(2),Glx1.0
(1),Ser2.9(3),Gly2.1(2),Arg3.1(3),Thr1.0(1),Ala2.1
(2),Pro2.0(2)Tyr0.9(1),Ile1.9(2),Leu1.0(1),Cys1.0
(1)
ある。 質量分析 : 2261 (M+1) アミノ酸分析 実測値（計算値）：Asn1.9(2),Glx1.0
(1),Ser2.9(3),Gly2.1(2),Arg3.1(3),Thr1.0(1),Ala2.1
(2),Pro2.0(2)Tyr0.9(1),Ile1.9(2),Leu1.0(1),Cys1.0
(1)
【００３０】（１−３） ＤＣＣ−３の合成 t-Boc-Val が結合した担体樹脂および保護アミノ酸とし
て順次ＤＣＣ−３のアミノ酸配列に従ってt-Boc-アミノ
酸を用い、（１−１）と同様にして保護ペプチドが結合
した担体樹脂1.1gを得た。これを（１−１）と同様に処
理して粗成物512mg を得た。このうち400mg をHPLCを用
いて精製してＤＣＣ−３を144mg 得た。
て順次ＤＣＣ−３のアミノ酸配列に従ってt-Boc-アミノ
酸を用い、（１−１）と同様にして保護ペプチドが結合
した担体樹脂1.1gを得た。これを（１−１）と同様に処
理して粗成物512mg を得た。このうち400mg をHPLCを用
いて精製してＤＣＣ−３を144mg 得た。
【００３１】ＤＣＣ−３の理化学的性質は以下の通りで
ある。 質量分析 : 2387 (M+1) アミノ酸分析 実測値（計算値） : Asx2.9(3),Glx3.2
(3),Ser1.0(1),Gly1.1(1),Arg3.1(3),Thr2.9(3),Pro1.1
(1),Val0.9(1),Leu1.0(1),Phe2.9(3)
ある。 質量分析 : 2387 (M+1) アミノ酸分析 実測値（計算値） : Asx2.9(3),Glx3.2
(3),Ser1.0(1),Gly1.1(1),Arg3.1(3),Thr2.9(3),Pro1.1
(1),Val0.9(1),Leu1.0(1),Phe2.9(3)
【００３２】（１−４） ＤＣＣ−４の合成 t-Boc-Val が結合した担体樹脂および保護アミノ酸とし
て順次ＤＣＣ−４のアミノ酸配列に従ってt-Boc-アミノ
酸を用い、（１−１）と同様にして保護ペプチドが結合
した担体樹脂0.9gを得た。これに1,2-エタンジチオール
0.9ml 、ジメチルスルフィド0.9ml およびアニソール0.
23mlを加え、（１−１）と同様に処理して粗成物399mg
を得た。このすべてをHPLCを用いて精製してＤＣＣ−４
を50mg得た。
て順次ＤＣＣ−４のアミノ酸配列に従ってt-Boc-アミノ
酸を用い、（１−１）と同様にして保護ペプチドが結合
した担体樹脂0.9gを得た。これに1,2-エタンジチオール
0.9ml 、ジメチルスルフィド0.9ml およびアニソール0.
23mlを加え、（１−１）と同様に処理して粗成物399mg
を得た。このすべてをHPLCを用いて精製してＤＣＣ−４
を50mg得た。
【００３３】ＤＣＣ−４の理化学的性質は以下の通りで
ある。 質量分析 : 2160 (M+1) アミノ酸分析 実測値（計算値）： Asx1.0(1),Glx4.2
(4),Ser1.9(2),Gly2.1(2),Thr1.0(1),Ala2.0(2),Pro2.1
(2),Tyr0.9(1),Val2.0(2),Ile0.9(1),Lys0.9(1),Trp1.0
(1)
ある。 質量分析 : 2160 (M+1) アミノ酸分析 実測値（計算値）： Asx1.0(1),Glx4.2
(4),Ser1.9(2),Gly2.1(2),Thr1.0(1),Ala2.0(2),Pro2.1
(2),Tyr0.9(1),Val2.0(2),Ile0.9(1),Lys0.9(1),Trp1.0
(1)
【００３４】（１−５） ＤＣＣ−５の合成 t-Boc-Ala が結合した担体樹脂および保護アミノ酸とし
て順次ＤＣＣ-5のアミノ酸配列に従ってt-Boc-アミノ酸
を用い、（１−１）と同様にして保護ペプチドが結合し
た担体樹脂の1.2gを得た。このすべてにＤＭＦ5.9ml お
よびチオフェノール0.5ml を加え室温で１時間撹拌し
た。次いで濾過して得られた担体樹脂をＤＭＦ20ml、水
20ml、エタノール20ml、塩化メチレン20mlで順次洗浄
後、自動合成機の反応器に入れ、脱Boc プログラムに従
い（１−１）の(1) 〜(5) の脱保護工程を行い、担体樹
脂0.92g を得た。これを（１−１）と同様に処理して粗
成物406mg を得た。このすべてをHPLCを用いて精製して
ＤＣＣ−５を115.4mg 得た。
て順次ＤＣＣ-5のアミノ酸配列に従ってt-Boc-アミノ酸
を用い、（１−１）と同様にして保護ペプチドが結合し
た担体樹脂の1.2gを得た。このすべてにＤＭＦ5.9ml お
よびチオフェノール0.5ml を加え室温で１時間撹拌し
た。次いで濾過して得られた担体樹脂をＤＭＦ20ml、水
20ml、エタノール20ml、塩化メチレン20mlで順次洗浄
後、自動合成機の反応器に入れ、脱Boc プログラムに従
い（１−１）の(1) 〜(5) の脱保護工程を行い、担体樹
脂0.92g を得た。これを（１−１）と同様に処理して粗
成物406mg を得た。このすべてをHPLCを用いて精製して
ＤＣＣ−５を115.4mg 得た。
【００３５】ＤＣＣ−５の理化学的性質は以下の通りで
ある。 質量分析 : 2461 (M+1) アミノ酸分析 実測値（計算値）： Glx3.2(3),Gly2.1
(2),His1.0(1),Arg4.0(4),Thr4.0(4),Tyr0.9(1),Met0.9
(1),Ile0.9(1),Leu1.1(1),Lys1.9(2)
ある。 質量分析 : 2461 (M+1) アミノ酸分析 実測値（計算値）： Glx3.2(3),Gly2.1
(2),His1.0(1),Arg4.0(4),Thr4.0(4),Tyr0.9(1),Met0.9
(1),Ile0.9(1),Leu1.1(1),Lys1.9(2)
【００３６】（２） 動物の免疫と抗体産生細胞の調製 Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）スクシンイミ
ド〔N-(m-maleimidobenzoyloxy)succinimide ; 以下、
ＭＢＳと略記する〕（ナカライテスク社製）にＫＬＨま
たはサイログロブリンを反応させた後、セファデックス
Ｇ２５カラムで精製したものと（１）で合成した各ペプ
チドを５：１で混合し、公知の方法（Cell,28:477-487,
1982）でペプチド−ＫＬＨ複合体を作り、ＰＢＳで透析
したものを抗原として用いた。ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス
（各ペプチド当たり５匹免疫）１匹当たり１００μｇの
各ペプチド−ＫＬＨ複合体をアルミニウムゲル２ｍｇお
よび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０9
細胞／マウスとともに投与し、２週間後１００μｇの各
ペプチド−ＫＬＨ複合体を１週間に１回、計５回投与し
た。眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を以下に示
す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウス
から最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
ド〔N-(m-maleimidobenzoyloxy)succinimide ; 以下、
ＭＢＳと略記する〕（ナカライテスク社製）にＫＬＨま
たはサイログロブリンを反応させた後、セファデックス
Ｇ２５カラムで精製したものと（１）で合成した各ペプ
チドを５：１で混合し、公知の方法（Cell,28:477-487,
1982）でペプチド−ＫＬＨ複合体を作り、ＰＢＳで透析
したものを抗原として用いた。ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス
（各ペプチド当たり５匹免疫）１匹当たり１００μｇの
各ペプチド−ＫＬＨ複合体をアルミニウムゲル２ｍｇお
よび百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０9
細胞／マウスとともに投与し、２週間後１００μｇの各
ペプチド−ＫＬＨ複合体を１週間に１回、計５回投与し
た。眼底静脈叢より採血し、その血清抗体価を以下に示
す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したマウス
から最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
【００３７】脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細
断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐ
ｍ、５分）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニ
ウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球
を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用い
た。
断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐ
ｍ、５分）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニ
ウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球
を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用い
た。
【００３８】酵素免疫測定法 ９６穴のＥＩＡ用プレート〔グライナー（Ｇｒｅｉｎｅ
ｒ）社製〕に（１）で作製したペプチド１〜５０μｇ／
ｍｌをそれぞれ０〜１００μｌ／穴ずつ分注し、４℃で
一晩放置して抗原をプレートにコートした。次いで、１
％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液（ＢＳＡ−ＰＢＳ）を１００
〜２００μｌ／穴分注し、室温で１〜２時間または、４
℃で１〜２晩放置して、プレート上に残った蛋白質との
結合残基をブロック（ブロッキング）した。その後、Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳを捨て、ＰＢＳでよく洗浄した後、第一抗
体として、ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した試料（マウス血
清、ハイブリドーマ培養上清または精製モノクローナル
抗体）を２０〜１００μｌ／穴分注し、室温で２〜３時
間または、４℃で一晩放置した。ＰＢＳまたは0.05%Twe
en-20を含むＰＢＳで、よく洗浄した後、第二抗体とし
てペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体
〔ダコ（ＤＡＫＯ）社製〕、またはペルオキシダーゼ標
識抗ラットイムノグロブリン抗体〔ダコ（ＤＡＫＯ）社
製〕を５０〜１００μｌ／穴分注し、室温で２時間放置
した。
ｒ）社製〕に（１）で作製したペプチド１〜５０μｇ／
ｍｌをそれぞれ０〜１００μｌ／穴ずつ分注し、４℃で
一晩放置して抗原をプレートにコートした。次いで、１
％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液（ＢＳＡ−ＰＢＳ）を１００
〜２００μｌ／穴分注し、室温で１〜２時間または、４
℃で１〜２晩放置して、プレート上に残った蛋白質との
結合残基をブロック（ブロッキング）した。その後、Ｂ
ＳＡ−ＰＢＳを捨て、ＰＢＳでよく洗浄した後、第一抗
体として、ＢＳＡ−ＰＢＳで希釈した試料（マウス血
清、ハイブリドーマ培養上清または精製モノクローナル
抗体）を２０〜１００μｌ／穴分注し、室温で２〜３時
間または、４℃で一晩放置した。ＰＢＳまたは0.05%Twe
en-20を含むＰＢＳで、よく洗浄した後、第二抗体とし
てペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体
〔ダコ（ＤＡＫＯ）社製〕、またはペルオキシダーゼ標
識抗ラットイムノグロブリン抗体〔ダコ（ＤＡＫＯ）社
製〕を５０〜１００μｌ／穴分注し、室温で２時間放置
した。
【００３９】ＰＢＳでよく洗浄した後、ＡＢＴＳ基質液
〔２，２′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン
−６−スルホン酸）二アンモニウム５５０ｍｇを０．１
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）１リットルに溶かした
溶液に、使用直前に過酸化水素１μｌ／ｍｌを加えた溶
液〕を用いて発色させ、ＯＤ415nm の吸光度を測定し
た。
〔２，２′−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン
−６−スルホン酸）二アンモニウム５５０ｍｇを０．１
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）１リットルに溶かした
溶液に、使用直前に過酸化水素１μｌ／ｍｌを加えた溶
液〕を用いて発色させ、ＯＤ415nm の吸光度を測定し
た。
【００４０】（３）マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を
正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０7 以上の細胞
を確保し、細胞融合に親株として供した。
正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０7 以上の細胞
を確保し、細胞融合に親株として供した。
【００４１】（４）ハイブリドーマの作製 （２）で得られたマウス脾細胞と（３）で得られた骨髄
腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（１，
２００ｒｐｍ、５分）した後、上清を捨て、沈澱した細
胞群をよくほぐした後、撹拌しながら、３７℃でポリエ
チレングライコール−１，０００（ＰＥＧ−１，００
０）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍｌおよびジメチルスルホキシ
ド０．７ｍｌの混液０．２〜１ｍｌ／１０8 マウス脾細
胞を加え、１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回
加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるよ
うにした。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分）後、上清を
捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによ
る吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地１００
ｍｌ中に懸濁した。
腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（１，
２００ｒｐｍ、５分）した後、上清を捨て、沈澱した細
胞群をよくほぐした後、撹拌しながら、３７℃でポリエ
チレングライコール−１，０００（ＰＥＧ−１，００
０）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍｌおよびジメチルスルホキシ
ド０．７ｍｌの混液０．２〜１ｍｌ／１０8 マウス脾細
胞を加え、１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍｌを数回
加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍｌになるよ
うにした。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分）後、上清を
捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによ
る吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地１００
ｍｌ中に懸濁した。
【００４２】この懸濁液を９６穴培養用プレートに１０
０μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ2インキュベーター
中、３７℃で１０〜１４日間培養した。培養後、酵素免
疫測定法により、免疫原であるペプチドとサイログロブ
リンとの複合体（以下、ペプチド−ＴＨＹと略記する）
と反応し、免疫原でないペプチドとサイログロブリンと
の複合体には反応しない穴を選び、さらにＨＴ培地と正
常培地に換え、２回クローニングを繰り返して、免疫原
であるペプチド−ＴＨＹと反応し、免疫原でないペプチ
ド−ＴＨＹと反応しないモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマを作製した。
０μｌ／穴ずつ分注し、５％ＣＯ2インキュベーター
中、３７℃で１０〜１４日間培養した。培養後、酵素免
疫測定法により、免疫原であるペプチドとサイログロブ
リンとの複合体（以下、ペプチド−ＴＨＹと略記する）
と反応し、免疫原でないペプチドとサイログロブリンと
の複合体には反応しない穴を選び、さらにＨＴ培地と正
常培地に換え、２回クローニングを繰り返して、免疫原
であるペプチド−ＴＨＹと反応し、免疫原でないペプチ
ド−ＴＨＹと反応しないモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマを作製した。
【００４３】各ペプチドについて５匹の計２５匹のマウ
スを用いてハイブリドーマを作製した。ＤＣＣ−２を免
疫した１匹のマウスより作製したハイブリドーマの中か
ら、ＤＣＣ−２−ＴＨＹと反応し、ＤＣＣ−２以外のペ
プチド−ＴＨＹとは反応しないモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマを１０個選択し、それぞれＫＭ８
９０〜ＫＭ８９９と名付けた。ＫＭ８９０〜ＫＭ８９４
と各ぺプチド−ＴＨＹとの反応性を図１（ａ）に、ＫＭ
８９５〜ＫＭ８９９と各ペプチド−ＴＨＹとの反応性を
図１（ｂ）にそれぞれ示した。その他の２４匹のマウス
より作製した約５万個のハイブリドーマの中にはＤＣＣ
−２−ＴＨＹと反応し、ＤＣＣ−２以外のペプチド−Ｔ
ＨＹとは反応しないモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマは認められなかった。
スを用いてハイブリドーマを作製した。ＤＣＣ−２を免
疫した１匹のマウスより作製したハイブリドーマの中か
ら、ＤＣＣ−２−ＴＨＹと反応し、ＤＣＣ−２以外のペ
プチド−ＴＨＹとは反応しないモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマを１０個選択し、それぞれＫＭ８
９０〜ＫＭ８９９と名付けた。ＫＭ８９０〜ＫＭ８９４
と各ぺプチド−ＴＨＹとの反応性を図１（ａ）に、ＫＭ
８９５〜ＫＭ８９９と各ペプチド−ＴＨＹとの反応性を
図１（ｂ）にそれぞれ示した。その他の２４匹のマウス
より作製した約５万個のハイブリドーマの中にはＤＣＣ
−２−ＴＨＹと反応し、ＤＣＣ−２以外のペプチド−Ｔ
ＨＹとは反応しないモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマは認められなかった。
【００４４】ＫＭ８９０〜ＫＭ８９９のサブクラスをマ
ウスサブクラスタイピングキット（ザイメット社製）を
用いた酵素免疫測定法により決定した。その結果を第１
表に示す。
ウスサブクラスタイピングキット（ザイメット社製）を
用いた酵素免疫測定法により決定した。その結果を第１
表に示す。
【００４５】
【表１】
【００４６】（５）モノクローナル抗体の精製 プリスタン処理した８週令ヌード雌マウスに（４）で得
られたハイブリドーマＫＭ８９０〜ＫＭ８９９をそれぞ
れ５〜１０×１０6 細胞／匹腹腔内注射した。１０〜２
１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたま
ったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍｌ／匹）し、遠
心分離（３，０００ｒｐｍ、５分）して固形分を除去し
た。ついで、５０％硫酸アンモニウムと４０％硫酸アン
モニウムにて、２回塩析し、０．０３Ｍ塩化ナトリウム
を含む０．０４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で透析
後、ＤＥＡＥセファロース〔ＤＥ５２；ワットマン（Ｗ
ｈａｔｍａｎ）社製〕に通塔後、１．０Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．０４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出
しＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体とした。
られたハイブリドーマＫＭ８９０〜ＫＭ８９９をそれぞ
れ５〜１０×１０6 細胞／匹腹腔内注射した。１０〜２
１日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹水のたま
ったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍｌ／匹）し、遠
心分離（３，０００ｒｐｍ、５分）して固形分を除去し
た。ついで、５０％硫酸アンモニウムと４０％硫酸アン
モニウムにて、２回塩析し、０．０３Ｍ塩化ナトリウム
を含む０．０４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で透析
後、ＤＥＡＥセファロース〔ＤＥ５２；ワットマン（Ｗ
ｈａｔｍａｎ）社製〕に通塔後、１．０Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．０４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出
しＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体とした。
【００４７】（６）抗ＤＣＣ遺伝子産物モノクローナル
抗体の選択 以下に示す方法に従って、（５）で得られたモノクロー
ナル抗体を免疫組織染色の第一抗体として用い、ホルマ
リン固定パラフィン包埋標本由来の大腸癌組織切片を染
色した。
抗体の選択 以下に示す方法に従って、（５）で得られたモノクロー
ナル抗体を免疫組織染色の第一抗体として用い、ホルマ
リン固定パラフィン包埋標本由来の大腸癌組織切片を染
色した。
【００４８】パラフィン包埋標本からミクロトームにて
４μm の切片を作製し、これをシランコートスライド
（マツナミ製）にとり、キシレンで脱パラフィン後、エ
タノールで親水化した。これをＰＢＳにて洗浄し、０．
３％過酸化水素を含むメタノールおよび１０％ウサギ血
清でブロッキング後、一次抗体として（５）で得られた
精製モノクローナル抗体（１０μg ／ml）を４℃で一晩
反応させた。これをＰＢＳにて洗浄後、二次抗体（ビオ
チン標識マウス抗体、ニチレイ社製）をかけ室温で９０
分間反応させ、ついでペルオキシダーゼ標識ストレプト
アビジン（ニチレイ社製）を室温で５分間反応させた。
ジアミノベンジディン溶液にて発色させた後、メチルグ
リーンを用いて核染色し、脱水後、封入し検鏡した。そ
の結果、ＫＭ８９０は、癌細胞を陽性に染色することが
できた。ＫＭ８９１〜ＫＭ８９９はＫＭ８９０に比べ、
癌細胞を陽性に染色する率が低かった。また、ＫＭ８９
０はモチリン、モチリン誘導体等の他のペプチドに対し
ては反応性を示さなかった。
４μm の切片を作製し、これをシランコートスライド
（マツナミ製）にとり、キシレンで脱パラフィン後、エ
タノールで親水化した。これをＰＢＳにて洗浄し、０．
３％過酸化水素を含むメタノールおよび１０％ウサギ血
清でブロッキング後、一次抗体として（５）で得られた
精製モノクローナル抗体（１０μg ／ml）を４℃で一晩
反応させた。これをＰＢＳにて洗浄後、二次抗体（ビオ
チン標識マウス抗体、ニチレイ社製）をかけ室温で９０
分間反応させ、ついでペルオキシダーゼ標識ストレプト
アビジン（ニチレイ社製）を室温で５分間反応させた。
ジアミノベンジディン溶液にて発色させた後、メチルグ
リーンを用いて核染色し、脱水後、封入し検鏡した。そ
の結果、ＫＭ８９０は、癌細胞を陽性に染色することが
できた。ＫＭ８９１〜ＫＭ８９９はＫＭ８９０に比べ、
癌細胞を陽性に染色する率が低かった。また、ＫＭ８９
０はモチリン、モチリン誘導体等の他のペプチドに対し
ては反応性を示さなかった。
【００４９】（７）組織診断への応用 大腸癌３１例（進行大腸癌２９例、早期大腸癌２例）の
ホルマリン固定パラフィン包埋標本を用いて、ＫＭ８９
０を第一抗体として免疫組織染色を行なった。その結
果、進行大腸癌８例で癌細胞が陽性と認められた。組織
陽性の所見としては、癌細胞の胞体内および細胞膜で陽
性であった。また、腺管腺腫および絨毛腺腫の良性病変
では、陰性であった。この結果、進行大腸癌では、ＤＣ
Ｃ遺伝子産物が過剰に蓄積していると推測された。
ホルマリン固定パラフィン包埋標本を用いて、ＫＭ８９
０を第一抗体として免疫組織染色を行なった。その結
果、進行大腸癌８例で癌細胞が陽性と認められた。組織
陽性の所見としては、癌細胞の胞体内および細胞膜で陽
性であった。また、腺管腺腫および絨毛腺腫の良性病変
では、陰性であった。この結果、進行大腸癌では、ＤＣ
Ｃ遺伝子産物が過剰に蓄積していると推測された。
【００５０】
【発明の効果】本発明により、癌の診断に有用な抗ＤＣ
Ｃ遺伝子産物モノクローナル抗体が提供される。
Ｃ遺伝子産物モノクローナル抗体が提供される。
【００５１】
【００５２】配列番号：1 配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：ヒト 配列 Ala Phe Met Gly Asp Thr Val Leu Leu Lys Cys Glu Val Ile Gly Glu 1 5 10 15 Pro Met Pro Thr Ile 20
【００５３】配列番号：2 配列の長さ：21 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：ヒト 配列 Leu Gln Pro Gly Asp Ile Gly Ile Tyr Arg Cys Ser Ala Arg Asn Pro 1 5 10 15 Ala Ser Ser Arg Thr 20
【００５４】配列番号：3 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：ヒト 配列 Phe Thr Val Phe Phe Ser Arg Glu Gly Asp Asn Arg Glu Arg Ala Leu 1 5 10 15 Asn Thr Thr Gln 20
【００５５】配列番号：4 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：ヒト 配列 Val Ala Tyr Asn Glu Trp Gly Pro Gly Glu Ser Ser Gln Pro Ile Lys 1 5 10 15 Val Ala Thr Gln 20
【００５６】配列番号：5 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：ヒト 配列 Thr Gly Tyr Lys Ile Arg His Arg Lys Thr Thr Arg Arg Gly Glu Met 1 5 10 15 Glu Thr Leu Glu 20
【図１】（ａ）は、モノクローナル抗体ＫＭ８９０〜Ｋ
Ｍ８９４の各ペプチド−ＴＨＹに対する反応性を示した
図である。（ｂ）は、ＫＭ８９５〜ＫＭ８９９の各ペプ
チド−ＴＨＹに対する反応性を示した図である。
Ｍ８９４の各ペプチド−ＴＨＹに対する反応性を示した
図である。（ｂ）は、ＫＭ８９５〜ＫＭ８９９の各ペプ
チド−ＴＨＹに対する反応性を示した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ 9015−2Ｊ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ０７Ｋ 99:00
Claims (9)
- 【請求項１】 癌抑制遺伝子ＤＣＣによりコードされる
ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 配列番号２で示されるアミノ酸配列を有
するペプチドと特異的に反応する請求項１記載のモノク
ローナル抗体。 - 【請求項３】 ＩｇＧ３サブクラスに属するマウスモノ
クローナル抗体である請求項２記載のモノクローナル抗
体ＫＭ８９０。 - 【請求項４】 請求項１記載のモノクローナル抗体を生
産するハイブリドーマ。 - 【請求項５】 請求項２記載のモノクローナル抗体を生
産するハイブリドーマ。 - 【請求項６】 請求項３記載のモノクローナル抗体を生
産するハイブリドーマＫＭ８９０（微工研条寄第３８８
９号）。 - 【請求項７】 請求項２または３記載のモノクローナル
抗体ＫＭ８９０を有効成分として含有してなる癌の診断
薬。 - 【請求項８】 癌が大腸癌である請求項７記載の診断
薬。 - 【請求項９】 配列番号２で示されるアミノ酸配列を有
するペプチド。
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|---|---|---|---|
| JP16710192A JP3151054B2 (ja) | 1992-06-25 | 1992-06-25 | 抗ｄｃｃ遺伝子産物モノクローナル抗体 |
| US08/080,809 US5445938A (en) | 1992-06-25 | 1993-06-24 | Anti-DCC gene product specific monoclonal antibody |
| CA002099628A CA2099628A1 (en) | 1992-06-25 | 1993-06-24 | Anti-dcc gene product specific monoclonal antibody |
| AU41521/93A AU675067B2 (en) | 1992-06-25 | 1993-06-25 | Anti-DCC gene product specific monoclonal antibody |
| AT93110213T ATE201881T1 (de) | 1992-06-25 | 1993-06-25 | Monoklonare antikörper, spezifisch für dcc- genprodukt |
| EP93110213A EP0577028B1 (en) | 1992-06-25 | 1993-06-25 | Anti-DCC gene product specific monoclonal antibody |
| DE69330297T DE69330297T2 (de) | 1992-06-25 | 1993-06-25 | Monoklonare Antikörper, spezifisch für DCC-Genprodukt |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| AU638954B2 (en) * | 1988-10-31 | 1993-07-15 | Regents Of The University Of California, The | Products and methods for controlling the suppression of the neoplastic phenotype |
| CA2065874C (en) * | 1989-09-15 | 2001-12-11 | Joseph P. Brown | Hybridoma ct43 producing a monoclonal antibody to a mucin epitope of colorectal cancer |
| WO1991009964A1 (en) * | 1990-01-04 | 1991-07-11 | The Johns Hopkins University | Gene deleted in colorectal cancer of humans |
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- 1992-06-25 JP JP16710192A patent/JP3151054B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-06-24 CA CA002099628A patent/CA2099628A1/en not_active Abandoned
- 1993-06-24 US US08/080,809 patent/US5445938A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-06-25 AU AU41521/93A patent/AU675067B2/en not_active Ceased
- 1993-06-25 DE DE69330297T patent/DE69330297T2/de not_active Expired - Fee Related
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- 1993-06-25 AT AT93110213T patent/ATE201881T1/de active
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