JP2537045B2 - Ｃ４ｂ結合蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents
Ｃ４ｂ結合蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体Info
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- JP2537045B2 JP2537045B2 JP62063983A JP6398387A JP2537045B2 JP 2537045 B2 JP2537045 B2 JP 2537045B2 JP 62063983 A JP62063983 A JP 62063983A JP 6398387 A JP6398387 A JP 6398387A JP 2537045 B2 JP2537045 B2 JP 2537045B2
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- Japan
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- protein
- c4bp
- monoclonal antibody
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、血液凝固制御因子として知られているプロ
テインＳの定量に有用なC4b結合蛋白質に対するモノク
ローナル抗体に関するものである。
テインＳの定量に有用なC4b結合蛋白質に対するモノク
ローナル抗体に関するものである。
近年、脳梗塞や心筋梗塞などの血栓症の発症要因の一
つとして血液凝固制御因子の量的、質的変化があげられ
ることが明らかにされ、この血液凝固制御因子として、
プロテインＣおよびその関連因子のプロテインＳの研究
がなされている。
つとして血液凝固制御因子の量的、質的変化があげられ
ることが明らかにされ、この血液凝固制御因子として、
プロテインＣおよびその関連因子のプロテインＳの研究
がなされている。
このプロテインＳは血液中では、約半量がC4b結合蛋
白質（以下C4bpと記す）と結合した複合体として存在し
ており、この複合体は、血液凝固制御作用を有せず、遊
離のプロテインＳがこの作用を有することが明らかにさ
れている（J.Clin.Invest.74、2082−2088（1984））。
白質（以下C4bpと記す）と結合した複合体として存在し
ており、この複合体は、血液凝固制御作用を有せず、遊
離のプロテインＳがこの作用を有することが明らかにさ
れている（J.Clin.Invest.74、2082−2088（1984））。
また、C4bpは分子量75,000ダルトン（Ｄ）のサブユニ
ット約７個がＳ−Ｓ係合にり連結された分子量550,000D
の高分子蛋白質であり、このC4bpは、キモトリプシン処
理後、ゲルろ過を行うと分子量160,000Dの断片と分子量
48,000Dの断片に分離され、C4bpにおけるプロテインＳ
の結合部位は、この分子量160,000Dの断片側に存在する
ことが明らかにされている。
ット約７個がＳ−Ｓ係合にり連結された分子量550,000D
の高分子蛋白質であり、このC4bpは、キモトリプシン処
理後、ゲルろ過を行うと分子量160,000Dの断片と分子量
48,000Dの断片に分離され、C4bpにおけるプロテインＳ
の結合部位は、この分子量160,000Dの断片側に存在する
ことが明らかにされている。
従来、血液中のプロテインＳの測定法としては、免疫
学的測定法あるいは生物活性測定法が知られているが、
免疫学的測定法においては、血液中のプロテインＳ複合
体と遊離のプロテインＳとの総量を測定するのみであ
り、また、生物活性測定法は、プロテインＣの活性の測
定を通じて、間接的にのみプロテインＳの活性を判断し
ているに過ぎないものであった。
学的測定法あるいは生物活性測定法が知られているが、
免疫学的測定法においては、血液中のプロテインＳ複合
体と遊離のプロテインＳとの総量を測定するのみであ
り、また、生物活性測定法は、プロテインＣの活性の測
定を通じて、間接的にのみプロテインＳの活性を判断し
ているに過ぎないものであった。
一方、血液中には、プロテインＳと複合体を形成して
いないC4bp（プロテインＳに対する結合部位があいてい
るCSpb）が存在する。従って、プロテインＳと複合体を
形成していないC4bp（複合体非形成C4bp）と全C4bpとの
それぞれの定量が可能であれば、前記のプロテインＳ複
合体と遊離プロテインＳの総量測定から、結局、遊離プ
ロテインＳの量を算出することが可能となる。
いないC4bp（プロテインＳに対する結合部位があいてい
るCSpb）が存在する。従って、プロテインＳと複合体を
形成していないC4bp（複合体非形成C4bp）と全C4bpとの
それぞれの定量が可能であれば、前記のプロテインＳ複
合体と遊離プロテインＳの総量測定から、結局、遊離プ
ロテインＳの量を算出することが可能となる。
本発明者らは、C4b結合蛋白質に対して免疫反応性を
有するモノクローナル抗体であって、C4b結合蛋白質と
結合することによりプロテインＳのC4b結合蛋白質への
結合を阻害する性質を有することを特徴とするモノクロ
ーナル抗体を得ることに成功した。
有するモノクローナル抗体であって、C4b結合蛋白質と
結合することによりプロテインＳのC4b結合蛋白質への
結合を阻害する性質を有することを特徴とするモノクロ
ーナル抗体を得ることに成功した。
本発明に係るモノクローナル抗体を用いることによ
り、下記のごとくして血液中の遊離プロテインＳの定量
を行うことができる。
り、下記のごとくして血液中の遊離プロテインＳの定量
を行うことができる。
本発明に係るモノクローナル抗体のうち、C4bpと結合
することによりプロテインＳのC4bpへの結合を阻害する
ものを選択する。
することによりプロテインＳのC4bpへの結合を阻害する
ものを選択する。
で選択したモノクローナル抗体と上記の性質を有
しないモノクローナル抗体とを用いてELISA法、EIA法又
はRIA法により、血液中の遊離C4bpを定量する（ことの
量をＰとする）。
しないモノクローナル抗体とを用いてELISA法、EIA法又
はRIA法により、血液中の遊離C4bpを定量する（ことの
量をＰとする）。
上記の性質を有しないモノクローナル抗体のうちC4bp
における結合部位の異なる２種のモノクローナル抗体を
用いてELISA法、EIA法又はRIA法により、血液中の全C4b
pを定量する（この量をＱとする）。
における結合部位の異なる２種のモノクローナル抗体を
用いてELISA法、EIA法又はRIA法により、血液中の全C4b
pを定量する（この量をＱとする）。
血液中のプロテインＳ複合体と遊離のプロテインＳの
総量の既知の測定法により定量する（この量をＲとす
る）。
総量の既知の測定法により定量する（この量をＲとす
る）。
遊離プロテインＳの量（Ｘ）は次式により算出するこ
とができる。
とができる。
Ｘ＝Ｒ−（Ｑ−Ｐ） 以下に、本発明に係るC4bpに対するモノクローナル抗
体の取得法、ならびに、それらモノクローナル抗体の結
合能、特異性等につき、実施例を掲げて具体的に説明す
る。
体の取得法、ならびに、それらモノクローナル抗体の結
合能、特異性等につき、実施例を掲げて具体的に説明す
る。
実施例１ 抗ヒトC4bpモノクローナル抗体の作製 （ａ）抗原−ヒトC4bpの調製 Biochem.J.209、837−846及び847−856（1983）に記
載のＤhlbackらの方法に従い４の健常者新鮮血漿を
クエン酸バリウムに吸着させ、さらにその溶出液中のC4
bpをDEAE−Sephacel、ヘパリン−Sepharose（Kabi製）
及びSepharose CL−6B（Pharmacia）カラムクロマトグ
ラフィー法で単離、精製した。精製したヒトC4bpは、J.
Mol.Biol.80、579−599（1973）に記載のLaemmliらの方
法に従い還元剤存在下ドデシル硫酸ナトリウム−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）で調べたとこ
ろ分子量約70,000Dの単一バンドを示した。
載のＤhlbackらの方法に従い４の健常者新鮮血漿を
クエン酸バリウムに吸着させ、さらにその溶出液中のC4
bpをDEAE−Sephacel、ヘパリン−Sepharose（Kabi製）
及びSepharose CL−6B（Pharmacia）カラムクロマトグ
ラフィー法で単離、精製した。精製したヒトC4bpは、J.
Mol.Biol.80、579−599（1973）に記載のLaemmliらの方
法に従い還元剤存在下ドデシル硫酸ナトリウム−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）で調べたとこ
ろ分子量約70,000Dの単一バンドを示した。
（ｂ）抗体産生細胞の調製 ６週令のBalb/c雌マウス２匹をまずフロイントか全ア
ジュバンド中で、前記（ａ）で記述した精製ヒトC4bpで
初回免疫する。それらのマウスにそれぞれ50μｇのヒト
C4bpを0.4mlの溶液として腹腔内投与する。さらに15日
目に生理食塩水に溶解した50μｇのヒトC4bpを追加免疫
する。最終免疫として52日目に静脈内投与（45μg/100
μ生理食塩水）により補助免疫し、３日後にマウス脾
臓を取り出し、脾細胞を調製する。
ジュバンド中で、前記（ａ）で記述した精製ヒトC4bpで
初回免疫する。それらのマウスにそれぞれ50μｇのヒト
C4bpを0.4mlの溶液として腹腔内投与する。さらに15日
目に生理食塩水に溶解した50μｇのヒトC4bpを追加免疫
する。最終免疫として52日目に静脈内投与（45μg/100
μ生理食塩水）により補助免疫し、３日後にマウス脾
臓を取り出し、脾細胞を調製する。
（ｃ）細胞融合 （１）以下の材料および方法を用いる。
RPMI 1640培地:RPMI No.1640（Difco Laboratories）
に重炭酸ナトリウム（12mM）、ピルビン酸ナトリウム
（1mM）、Ｌ−グルタミン（2mM）、ペニシリンＧカリウ
ム（50U/ml）、硫酸ストレプトマイシン（50μg/ml）、
および硫酸アミカシン（100μg/ml）を加え、ドライア
イスでpHを7.2にし、0.2μｍ東洋メンブレンフイルター
で除菌ろ過する。
に重炭酸ナトリウム（12mM）、ピルビン酸ナトリウム
（1mM）、Ｌ−グルタミン（2mM）、ペニシリンＧカリウ
ム（50U/ml）、硫酸ストレプトマイシン（50μg/ml）、
および硫酸アミカシン（100μg/ml）を加え、ドライア
イスでpHを7.2にし、0.2μｍ東洋メンブレンフイルター
で除菌ろ過する。
NS−１培地：上記RPMI 1640培地に除菌ろ過した仔牛
胎児血清（M.A.Bioproducts）を15％（v/v）を濃度に加
える。
胎児血清（M.A.Bioproducts）を15％（v/v）を濃度に加
える。
PEG 4,000溶液:RPMI 1640培地のポリエチレングリコ
ール4,000（PEG 4,000、Merck ＆ CO.,Inc.）50％（w/
w）無血清溶液を調製する。
ール4,000（PEG 4,000、Merck ＆ CO.,Inc.）50％（w/
w）無血清溶液を調製する。
８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞NS−１（P3−NS
1−１）との融合はSelected Method in Cellular Immun
olgy（ed.B.B.Mishell and S.M.Shiigi）、W.H.Freeman
and Company（1980）351−372に記載のOiらの方法を若
干改変して行った。
1−１）との融合はSelected Method in Cellular Immun
olgy（ed.B.B.Mishell and S.M.Shiigi）、W.H.Freeman
and Company（1980）351−372に記載のOiらの方法を若
干改変して行った。
（２）前記（ｂ）で調製した有核脾臓細胞（生細胞率10
0％）とミエローマ細胞（生細胞率100％）とを5:1の割
合で融合する。脾臓細胞とミエローマ細胞とを別に前記
のRPMI 1640培地で洗浄する。次に同じ培地にけん濁
し、融合させるため上記の割合で混合する。容量50mlの
円錐形スチロール樹脂製試験管（Iwaki Glass）を用
い、39mlのRPMI 1640培地中400×ｇ、10分間遠心し、上
清を完全に吸出する。沈澱細胞に37℃加温PEG 4,000溶
液4.5mlを穏やかに撹拌しながら１分間で滴下し、さら
に１分間撹拌し細胞を再けん濁、分散させる。次に37℃
加温RPMI 1640培地4.5mlを１分間で滴下する。この操作
をさらに１回繰り返した後、同培地32mlを２〜３分間で
常に撹拌しながら滴下し細胞を分散させる。これを400
×ｇ、10分間遠心分離し、上清を完全に吸引除去する。
次にこの沈澱細胞に37℃加温NS−１培地45mlをすみやか
に加え、細胞の大きい塊りを10mlのピペットを用いて注
意深くピペッテイングして分散する。さらに同培地90ml
を加えて希釈し、ポリスチレン製96穴マイクロウエル
（Iwaki Glass）にウエル当り6.0×105個/0.1mlの細胞
を加える。なお、この時使用する96穴マイクロウエルは
前処理として0.2mlのNS−１培地を加え、炭酸ガス培養
器中（37℃）で一晩保温し、使用時に培地を吸引除去し
ておく。細胞を加えた上記のマイクロウエルを７％炭酸
ガス/93％空気中で温度37℃、湿度100％下に培養に付す
る。
0％）とミエローマ細胞（生細胞率100％）とを5:1の割
合で融合する。脾臓細胞とミエローマ細胞とを別に前記
のRPMI 1640培地で洗浄する。次に同じ培地にけん濁
し、融合させるため上記の割合で混合する。容量50mlの
円錐形スチロール樹脂製試験管（Iwaki Glass）を用
い、39mlのRPMI 1640培地中400×ｇ、10分間遠心し、上
清を完全に吸出する。沈澱細胞に37℃加温PEG 4,000溶
液4.5mlを穏やかに撹拌しながら１分間で滴下し、さら
に１分間撹拌し細胞を再けん濁、分散させる。次に37℃
加温RPMI 1640培地4.5mlを１分間で滴下する。この操作
をさらに１回繰り返した後、同培地32mlを２〜３分間で
常に撹拌しながら滴下し細胞を分散させる。これを400
×ｇ、10分間遠心分離し、上清を完全に吸引除去する。
次にこの沈澱細胞に37℃加温NS−１培地45mlをすみやか
に加え、細胞の大きい塊りを10mlのピペットを用いて注
意深くピペッテイングして分散する。さらに同培地90ml
を加えて希釈し、ポリスチレン製96穴マイクロウエル
（Iwaki Glass）にウエル当り6.0×105個/0.1mlの細胞
を加える。なお、この時使用する96穴マイクロウエルは
前処理として0.2mlのNS−１培地を加え、炭酸ガス培養
器中（37℃）で一晩保温し、使用時に培地を吸引除去し
ておく。細胞を加えた上記のマイクロウエルを７％炭酸
ガス/93％空気中で温度37℃、湿度100％下に培養に付す
る。
（ｄ）選択培地によるハイブリドーマの選択的増殖 （１）使用する培地は以下のとおりである。
HAT培地：前記（ｃ）で述べたNS−１培地にさらにヒ
ポキサンチン（100μＭ）、アミノプテリン（0.4μ
Ｍ）、およびチミジン（16μＭ）を加える。
ポキサンチン（100μＭ）、アミノプテリン（0.4μ
Ｍ）、およびチミジン（16μＭ）を加える。
HT培地：アミノプリテンを除去した以外は上記HAT培
地と同一組成のものである。
地と同一組成のものである。
（２）前記（ｃ）の培養開始後翌日（１日目）、細胞に
パスツールピペットでHAT培地２滴（約0.1ml）を加え
る。２、３、５、８、11日目に培地の半分（0.1ml）を
新しいHAT培地で置き換え、14日目に培地の半分を新し
いHT培地で置き換える。以降３〜４日毎に培地の半分を
新しいHT培地で置き換える。通常２〜３週間で充分なハ
イブリドーマの生育が観察される（融合率62％）。ハイ
ブリドーマ生育全ウエルについて次項（ｅ）記載の固相
−抗体結合テスト法（ELISA）により陽性ウエルをチエ
ックする。次に、フィーダーとして107個のマウス胸腺
細胞を含むHT培地1mlをポリスチレン製24穴セルウエル
（Iwaki Glass）に加えたものを用い、上記で検出され
た各陽性ハイブリドーマの全内容物を移す。これを前記
（ｃ）におけると同様に７％炭酸ガス存在下、37℃で約
１週間培養に付する。その間１〜２回各ウエルの上清0.
5mlを新しいHT培地0.5mlと交換する。ハイブリドーマの
充分生育した時点でELISA法により陽性を再確認し、そ
れぞれについて次項（ｆ）記載の限界希釈法によるクロ
ーニングを行う。なお、クローニングに使用後の残液を
ポリスチレン製25cm2組織培養フラスコ（Iwaki Glass）
に移し、凍結保存用試料を調製する。
パスツールピペットでHAT培地２滴（約0.1ml）を加え
る。２、３、５、８、11日目に培地の半分（0.1ml）を
新しいHAT培地で置き換え、14日目に培地の半分を新し
いHT培地で置き換える。以降３〜４日毎に培地の半分を
新しいHT培地で置き換える。通常２〜３週間で充分なハ
イブリドーマの生育が観察される（融合率62％）。ハイ
ブリドーマ生育全ウエルについて次項（ｅ）記載の固相
−抗体結合テスト法（ELISA）により陽性ウエルをチエ
ックする。次に、フィーダーとして107個のマウス胸腺
細胞を含むHT培地1mlをポリスチレン製24穴セルウエル
（Iwaki Glass）に加えたものを用い、上記で検出され
た各陽性ハイブリドーマの全内容物を移す。これを前記
（ｃ）におけると同様に７％炭酸ガス存在下、37℃で約
１週間培養に付する。その間１〜２回各ウエルの上清0.
5mlを新しいHT培地0.5mlと交換する。ハイブリドーマの
充分生育した時点でELISA法により陽性を再確認し、そ
れぞれについて次項（ｆ）記載の限界希釈法によるクロ
ーニングを行う。なお、クローニングに使用後の残液を
ポリスチレン製25cm2組織培養フラスコ（Iwaki Glass）
に移し、凍結保存用試料を調製する。
（ｅ）固相−抗体結合テスト（ELISA）による抗ヒトC4b
p抗体産生ハイブイドーマの検索 Anal.Biochem.104、205−214（1980）に記載のRennar
dらの方法を若干改変した方法を用いる。この方法は、
ハイブリドーマ抗体の検出に適している。96穴ミクロタ
イトレーションプレート（Flow Laboratories,Inc.）を
0.5〜1.0μｇのヒトC4bpでコートし、次に、未コート部
分を１％牛血清アルブミン（BSA）でブロックする。こ
れに前記（ｄ）で得られたハイブリドーマ生育ウエルの
上清の一部を加えて室温で約１時間インキュベートす
る。２次抗体として西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤ
ギ抗マウスイムノグロブリン（Cappel Lab.）を加え、
さらに室温で約１時間インキュベートする。次に、過酸
化水素と基質であるｏ−フェニレンジアミンを加え、生
成した褐色の程度を肉眼で定性的に判定するか、あるい
はコロナ２波長マイクロプレート光度計（MTP−22、コ
ロナ電気社）を用いて500nmの吸光度を測定する。
p抗体産生ハイブイドーマの検索 Anal.Biochem.104、205−214（1980）に記載のRennar
dらの方法を若干改変した方法を用いる。この方法は、
ハイブリドーマ抗体の検出に適している。96穴ミクロタ
イトレーションプレート（Flow Laboratories,Inc.）を
0.5〜1.0μｇのヒトC4bpでコートし、次に、未コート部
分を１％牛血清アルブミン（BSA）でブロックする。こ
れに前記（ｄ）で得られたハイブリドーマ生育ウエルの
上清の一部を加えて室温で約１時間インキュベートす
る。２次抗体として西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤ
ギ抗マウスイムノグロブリン（Cappel Lab.）を加え、
さらに室温で約１時間インキュベートする。次に、過酸
化水素と基質であるｏ−フェニレンジアミンを加え、生
成した褐色の程度を肉眼で定性的に判定するか、あるい
はコロナ２波長マイクロプレート光度計（MTP−22、コ
ロナ電気社）を用いて500nmの吸光度を測定する。
（ｆ）クローニング 前記（ｄ）の操作後、各ウエル中には２種以上のハイ
ブリドーマが生育している可能性があるので、限界希釈
法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを取得する。NS−１倍地ml当りフィーダ
ーとして107個のマウス胸腺細胞を含むクローニング倍
地を調製し、96穴マイクロウエルの36ウエル、36ウエル
および24ウエルにウエル当り５個、１個および0.5個の
ハイブリドーマを加える。５日目と12日目に全ウエルに
各約0.1mlのNS−１培地を追加する。クローニング開始
後14〜15日で充分なハイブリドーマの生育が認められ、
コロニー形成陰性ウエルが50％以上である群についてEL
ISA法を行う。テストした全ウエルが陽性でない場合、
抗体陽性ウエル中のコロニー数を確認し、ウエル中に１
コロニーが確認されたウエルを４〜６個選び再クローニ
ングする。最終的にヒトC4bpに対するモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマ20株が得られた。
ブリドーマが生育している可能性があるので、限界希釈
法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを取得する。NS−１倍地ml当りフィーダ
ーとして107個のマウス胸腺細胞を含むクローニング倍
地を調製し、96穴マイクロウエルの36ウエル、36ウエル
および24ウエルにウエル当り５個、１個および0.5個の
ハイブリドーマを加える。５日目と12日目に全ウエルに
各約0.1mlのNS−１培地を追加する。クローニング開始
後14〜15日で充分なハイブリドーマの生育が認められ、
コロニー形成陰性ウエルが50％以上である群についてEL
ISA法を行う。テストした全ウエルが陽性でない場合、
抗体陽性ウエル中のコロニー数を確認し、ウエル中に１
コロニーが確認されたウエルを４〜６個選び再クローニ
ングする。最終的にヒトC4bpに対するモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマ20株が得られた。
（ｇ）モノクローナル抗体の生体外増殖および生体内増
殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、
モノクローナル抗体は、得られた各ハイブリドーマをNS
−１培地などの適当な培養液で培養（生体外増殖）し、
その培養上清から得ることができる（モノクローナル抗
体たん白濃度は10〜100μg/mlである）。一方、大量に
抗体を得るためには脾細胞とミエローマ細胞の由来動物
と同系の動物（Balb/c、マウス）に腫瘍形成促進剤プリ
スタン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン、Aldri
ch Chemical Co.Inc.）をマウス一匹当り0.5ml腹腔内投
与し、１〜３週間後に、各ハイブリドーマ１×107個を
同じく腹腔内投与する。それにより１〜２週間後、モノ
クローナル抗体たん白質濃度４〜7mg/mlの腹水を得るこ
とができる（生体内増殖）。
殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、
モノクローナル抗体は、得られた各ハイブリドーマをNS
−１培地などの適当な培養液で培養（生体外増殖）し、
その培養上清から得ることができる（モノクローナル抗
体たん白濃度は10〜100μg/mlである）。一方、大量に
抗体を得るためには脾細胞とミエローマ細胞の由来動物
と同系の動物（Balb/c、マウス）に腫瘍形成促進剤プリ
スタン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン、Aldri
ch Chemical Co.Inc.）をマウス一匹当り0.5ml腹腔内投
与し、１〜３週間後に、各ハイブリドーマ１×107個を
同じく腹腔内投与する。それにより１〜２週間後、モノ
クローナル抗体たん白質濃度４〜7mg/mlの腹水を得るこ
とができる（生体内増殖）。
（ｈ）モノクローナル抗体の重鎖、軽鎖及びアイソタイ
プ 前記（ｇ）で得られた各々の腹水を先ずヒトC4bpをコ
ートしたミクロタイトレーションプレートに前述したEL
ISA法に従って結合させる。PBSによる洗浄後、アイソタ
イプ特異性ウサギ抗マウスIg抗体（Zymed Laboratorie
s）を加える。PBSによる洗浄後、西洋わさびペルオキシ
ダーゼ標識サギ抗ウサギIgG（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、基
質として2,2′−アジノージ（３−エチルベンゾチアゾ
リン硫酸−６）および過酸化水素を用いて検出した。そ
の結果をまとめて後掲の第１表に示した。得られたヒト
C4bpに対するモノクローナル抗体の内14個が免疫グロブ
リン鎖γ1/xを、５がγ2a/xを、そして、１個がγ2b/x
を有していた。
プ 前記（ｇ）で得られた各々の腹水を先ずヒトC4bpをコ
ートしたミクロタイトレーションプレートに前述したEL
ISA法に従って結合させる。PBSによる洗浄後、アイソタ
イプ特異性ウサギ抗マウスIg抗体（Zymed Laboratorie
s）を加える。PBSによる洗浄後、西洋わさびペルオキシ
ダーゼ標識サギ抗ウサギIgG（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、基
質として2,2′−アジノージ（３−エチルベンゾチアゾ
リン硫酸−６）および過酸化水素を用いて検出した。そ
の結果をまとめて後掲の第１表に示した。得られたヒト
C4bpに対するモノクローナル抗体の内14個が免疫グロブ
リン鎖γ1/xを、５がγ2a/xを、そして、１個がγ2b/x
を有していた。
（ｉ）モノクローナル抗体の精製 前記（ｇ）で得られた各腹水を硫安分画（40％飽和）
後、IgG1タイプは塩化ナトリウム0.06Mを、IgG2a及びIg
G2bタイプは塩化ナトリウム0.1Mを含む40mMリン酸緩衝
液（pH8.0）で平衡化したDEAE−Sephacelの非吸着画分
を分取し、これらのIgG画分を更に、0.42M塩化ナトリウ
ムを含む50mMリン酸緩衝液、pH7.4で平衡化したSephacr
yl S−300 Superfine（Pharmacia）カラムでゲルろ過
し、培地中のFCSおよびマウス由来のたん白質を分離、
除去した。
後、IgG1タイプは塩化ナトリウム0.06Mを、IgG2a及びIg
G2bタイプは塩化ナトリウム0.1Mを含む40mMリン酸緩衝
液（pH8.0）で平衡化したDEAE−Sephacelの非吸着画分
を分取し、これらのIgG画分を更に、0.42M塩化ナトリウ
ムを含む50mMリン酸緩衝液、pH7.4で平衡化したSephacr
yl S−300 Superfine（Pharmacia）カラムでゲルろ過
し、培地中のFCSおよびマウス由来のたん白質を分離、
除去した。
実施例２ プロテインＳとC4bpとの複合体形成に対する抗ヒトC4bp
モノクローナル抗体の効果 （ａ）複合体形成に対する効果の検索 96穴ミクロタイトレーションプレート（Flow Laborat
ories,Inc.）を、10μg/mlのC4bp50μでコートし、次
に未コート部分を10％牛血清アルブミン（BSA）でブロ
ックする。これに第１表に示した各抗ヒトC4bpモノクロ
ーナル抗体のうち、No.1〜17をそれぞれ含有している腹
水を1/10に希釈したものを80μ加えて、室温で約１時
間インキュベートする。これらをそれぞれ0.1％BSA含有
トリス塩酸緩衝液pH7.5で洗浄する。
モノクローナル抗体の効果 （ａ）複合体形成に対する効果の検索 96穴ミクロタイトレーションプレート（Flow Laborat
ories,Inc.）を、10μg/mlのC4bp50μでコートし、次
に未コート部分を10％牛血清アルブミン（BSA）でブロ
ックする。これに第１表に示した各抗ヒトC4bpモノクロ
ーナル抗体のうち、No.1〜17をそれぞれ含有している腹
水を1/10に希釈したものを80μ加えて、室温で約１時
間インキュベートする。これらをそれぞれ0.1％BSA含有
トリス塩酸緩衝液pH7.5で洗浄する。
次に、上記緩衝液で５μg/mlに溶解したプロテインS5
0μを加えて、さらに室温で約１時間インキュベート
する。これを前記緩衝液で洗浄したのち、２次抗体とし
て前記緩衝液に溶解した西洋わさびペルオキシダーゼ標
識ウサギ抗ヒトプロテインSIgG抗体を100μ加え、さ
らに洗浄する。
0μを加えて、さらに室温で約１時間インキュベート
する。これを前記緩衝液で洗浄したのち、２次抗体とし
て前記緩衝液に溶解した西洋わさびペルオキシダーゼ標
識ウサギ抗ヒトプロテインSIgG抗体を100μ加え、さ
らに洗浄する。
次に、過酸化水素と基質である。ｏ−フェニレンジア
ミンを加え、生成した、褐色の程度をコロナ２波長マイ
クロプレート光度計（MTP−22,コロナ電気社）を用いて
500nmの吸光度を測定して、結合したプロテインＳを定
量する。これらの定量値により各モノクローナル抗体に
ついてC4bpにおけるプロテインＳの結合部位に対しての
結合能を判定した。
ミンを加え、生成した、褐色の程度をコロナ２波長マイ
クロプレート光度計（MTP−22,コロナ電気社）を用いて
500nmの吸光度を測定して、結合したプロテインＳを定
量する。これらの定量値により各モノクローナル抗体に
ついてC4bpにおけるプロテインＳの結合部位に対しての
結合能を判定した。
その結果は、第１図に示した。得られたモノクローナ
ル抗体のうち、No.16（クローン番号11−23H10）がC4bp
へのプロテインＳの結合を強く阻害した。
ル抗体のうち、No.16（クローン番号11−23H10）がC4bp
へのプロテインＳの結合を強く阻害した。
（ｂ）クローン番号11−23H10の結合能の確認C4bpの分
子量160,000Dの断片と分子量48,000Dの断片を、それぞ
れ（ａ）に記載したELISA法によりコートしたのち、前
記のクローン番号11−23H10の抗ヒトC4bpモノクローナ
ル抗体を加え、インキュベート、洗浄し、次に２次抗体
として、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス
イムノグロブリン（Cappel Lab.）を加え、インキュベ
ートしたのち、過酸化水素と基質である。ｏ−フェニレ
ンジアミンを加え、500nmの吸光度を測定して、各断片
への前記のモノクローナル抗体（11−23H10）の結合能
を調べた。
子量160,000Dの断片と分子量48,000Dの断片を、それぞ
れ（ａ）に記載したELISA法によりコートしたのち、前
記のクローン番号11−23H10の抗ヒトC4bpモノクローナ
ル抗体を加え、インキュベート、洗浄し、次に２次抗体
として、西洋わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス
イムノグロブリン（Cappel Lab.）を加え、インキュベ
ートしたのち、過酸化水素と基質である。ｏ−フェニレ
ンジアミンを加え、500nmの吸光度を測定して、各断片
への前記のモノクローナル抗体（11−23H10）の結合能
を調べた。
その結果、（ａ）で複合体形成を強く阻害したクロー
ン番号11−23H10は、分子量160,000Dの断片に結合し
た。これによりクローン番号11−23H10のモノクローナ
ル抗体はC4bpにおけるプロテインＳの結合部位に対して
結合能を有することが確認された。
ン番号11−23H10は、分子量160,000Dの断片に結合し
た。これによりクローン番号11−23H10のモノクローナ
ル抗体はC4bpにおけるプロテインＳの結合部位に対して
結合能を有することが確認された。
第１図は、本発明の一実施態様により得られたC4bpのモ
ノクローナル抗体のC4bpにおけるプロテインＳのC4bpへ
の結合を阻害する性質を調べた結果を表したグラフであ
り、横軸には第１表に示したモノクローナル抗体試料N
o.が示され、縦軸には、各モノクローナル抗体試料につ
いて、実施例２（ａ）に示した方法により定量した結合
プロテインＳの量のうち最大値を示すものを100とし
て、各試料における結合プロテインＳの量が％で示され
ている。
ノクローナル抗体のC4bpにおけるプロテインＳのC4bpへ
の結合を阻害する性質を調べた結果を表したグラフであ
り、横軸には第１表に示したモノクローナル抗体試料N
o.が示され、縦軸には、各モノクローナル抗体試料につ
いて、実施例２（ａ）に示した方法により定量した結合
プロテインＳの量のうち最大値を示すものを100とし
て、各試料における結合プロテインＳの量が％で示され
ている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 5/10 (Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 ） Ｃ１２Ｒ 1:91） 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 5/10 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (1)
- 【請求項１】C4b結合蛋白質に対して免疫反応性を有す
るモノクローナル抗体であって、C4b結合蛋白質と結合
することによりプロテインＳのC4b結合蛋白質への結合
を阻害する性質を有することを特徴とするモノクローナ
ル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62063983A JP2537045B2 (ja) | 1987-03-20 | 1987-03-20 | Ｃ４ｂ結合蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62063983A JP2537045B2 (ja) | 1987-03-20 | 1987-03-20 | Ｃ４ｂ結合蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63230700A JPS63230700A (ja) | 1988-09-27 |
| JP2537045B2 true JP2537045B2 (ja) | 1996-09-25 |
Family
ID=13245028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62063983A Expired - Lifetime JP2537045B2 (ja) | 1987-03-20 | 1987-03-20 | Ｃ４ｂ結合蛋白質に対するモノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2537045B2 (ja) |
-
1987
- 1987-03-20 JP JP62063983A patent/JP2537045B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３４（５）〔１９８５〕Ｐ．３３２０−３３２４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63230700A (ja) | 1988-09-27 |
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