JPH07330795A

JPH07330795A - ペプチドおよびモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH07330795A
Application number: JP6125569A
Authority: JP
Inventors: Masaji Okamoto; 雅次岡本; Mitsuya Hanatani; 満也花谷; Shinichi Kondo; 伸一近藤; Makoto Asano; 誠浅野; Tomoe Matsumoto; 友恵松本; Katsuhiko Matsuo; 克彦松尾; Iwao Omori; 巌大森
Original assignee: Toagosei Co Ltd
Current assignee: Toagosei Co Ltd
Priority date: 1994-06-07
Filing date: 1994-06-07
Publication date: 1995-12-19

Abstract

(57)【要約】【構成】ヒト血管透過性因子の一部のペプチド及び該
ペプチドを認識する血管透過性因子モノクローナル抗
体。【効果】本発明のペプチドは、血管透過性因子に対す
るモノクローナル抗体を作製するための抗原、生化学試
薬、癌やその他の疾病の診断薬等として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト血管透過性因子の
一部のペプチドおよび該ペプチドを認識する血管透過性
因子モノクローナル抗体並びにその用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】血管新生すなわち毛細血管内皮細胞の増
殖、移動および組織への浸潤は胎児の生長、創傷治癒、
癌細胞の増殖などの生理的または病理的現象において重
要な役割を果たしていることが知られている[(Folkman,
J.,Cancer Res.46:467(1986)]。血管新生を誘導する因
子としては、直接的に血管内皮細胞に作用する物質とし
て塩基性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth
factor,bFGF) 、酸性線維芽細胞増殖因子(acidic fibr
oblast growth factor,aFGF)、血管内皮細胞増殖因子／
血管透過性因子(vascular endothelial cell growth fa
ctor/vascular permeability factor,VEGF/VPF)、血小
板由来内皮細胞増殖因子(platelet-derivedendothelial
cell growth factor,PD-ECGF)などが、また間接的に血
管内皮細胞に作用する物質としてtransforming growth
factor-α(TGF-α)、transforminggrowth factor-β(TG
F-β)、angiogenin、tumor necrosis factor-α(TNF-
α)などが知られている[Folkman,J. & Shing,Y.,J.Bio
l.Chem.,267:10931(1992)]。

【０００３】血管透過性因子に関しては、マウス、ラッ
ト、モルモット、ウシおよびヒトの正常または腫瘍細胞
株で分泌されており、組織別では脳、下垂体、腎臓、卵
巣に存在することが明らかにされている[(Ferrara,N.,
et.al. Endocrine Reviews 13:18(1992)]。また、ヒト
血管透過性因子は乳癌の血管新生と転移[Weider,N, et.
al. N.Engl.J.Med. 324:1(1991)]や腎細胞癌の血管新生
[医学のあゆみ,168:231(1994)]、あるいは網膜疾患にお
ける血管新生[Adamis,A.P. et.al., Biochem.Biophys.R
es.Comm.,193:631(1993)]に関与していることが報告さ
れている。さらに血管透過性因子は標的細胞表面に存在
する受容体（flt, fms-like tyrosine kinase)と結合す
ることにより細胞内へシグナルを伝達することが明らか
になっている[De Vies,C. et.al. Science,255:989(199
2)]が、血管透過性因子とその受容体との相互作用機構
やシグナル伝達機構については詳細には解明されていな
い。

【０００４】ヒト血管透過性因子遺伝子についてはその
cDNAがすでに単離されて塩基配列が決定され、アミノ酸
配列も推定されている。この血管透過性因子遺伝子から
アミノ酸残基数の異なる４種類の蛋白（アミノ酸残基数
が１２１個、１６５個、１８９個、２０６個の４種類）
が作られ、それらの中で１２１個のアミノ酸残基数のも
の（VPF121）と１６５個のアミノ酸残基数のもの（VPF1
65）が血管内皮細胞に対する作用が強いと言われている
[(Ferrara,N., et.al. Endocrine Reviews 13:18(199
2)]。VPF121はVPF165のカルボキシル末端付近の４４個
のアミノ酸が欠損したものであるが、VPF121とVPF165の
間に、血管内皮細胞に対する作用の違いがあるかどうか
については明らかでない。

【０００５】一方、モノクローナル抗体は抗血清（ポリ
クローナル抗体）に比べて特異性が高く、抗原決定基が
単一であるため必要な親和性の抗体を選択でき、恒常的
に均一な品質のものを得ることができる。したがって、
現在では生化学的な解析や臨床的には種々の疾患の診断
に広くモノクローナル抗体が使用されている。

【０００６】ヒト血管透過性因子に対するモノクローナ
ル抗体もVPF165についてはすでに取得されているが、そ
の抗体の血管透過性因子中の反応部位は明らかでない[K
im,K.J. et.al. Growth Factors,7:53(1992)]。またマ
ウスモノクローナル抗体の作製技術はKohler & Milstei
nによりにすでに確立されており[Kohler & Milstein,Na
ture 256:495(1975)]、蛋白質、ペプチド、糖質、脂質
あるいは低分子化合物に対するモノクローナル抗体の作
製が可能である。しかしながら効率よくモノクローナル
抗体を作製するためには免疫する抗原として何を用いる
かが重要である。すなわち、血管透過性因子のような蛋
白質（高分子物質）を抗原とする場合、モノクローナル
抗体と反応する部位は分子表面に存在するアミノ酸であ
るため、抗原分子中のどのアミノ酸が分子表面に存在す
るかが明らかにすれば、容易にモノクローナル抗体を作
製できると考えられる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明はVPF121の一部
分のペプチド及びこれと反応するモノクローナル抗体並
びにその用途を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
に基づいて鋭意研究を行った結果、ヒト血管透過性因子
のアミノ酸配列中の連続した10個のアミノ酸からなる57
種類のペプチドにおいて、このうち遺伝子工学的に得ら
れた血管透過性因子に対するモノクローナル抗体と反応
するペプチド及び該ペプチドと反応するモノクローナル
抗体を提供することに成功し、本発明を完成させた。

【０００９】即ち、本発明は、配列番号２で表されるア
ミノ酸配列、配列番号３で表されるアミノ酸配列又は配
列番号４で表されるアミノ酸配列のうち、少なくとも１
つのアミノ酸配列を有するペプチドである。更に、本発
明は、前記ペプチドを認識する血管透過性因子モノクロ
ーナル抗体である。更に、本発明は、前記血管透過性因
子モノクローナル抗体を有効成分とする制癌剤である。
以下、本発明を詳細に説明する。

【００１０】本発明のペプチドは、ヒト血管透過性因子
（以下「ＶＰＦ」と略す）モノクローナル抗体と特異的
に反応するものである。（１）モノクローナル抗体の製造本発明のモノクローナル抗体は、マウスをヒトＶＰＦで
免疫し、脾細胞を取り出し、これとマウスミエローマ細
胞とを融合して得たハイブリドーマ細胞を培養すること
により製造することができる。このハイブリドーマの製
造は、例えばKohlerとMilsteinの方法〔Nature 256:495
(1975)〕等により行うことができる。

【００１１】抗体産生細胞の調製免疫用マウスには、BALB/C、C57BL/6系マウス、C3H系マ
ウス等が用いられる。そして、免疫マウス１匹（８〜12
週齢）に対してＶＰＦ50〜100 μｇの量を抗原として２
〜３週間ごとに２〜３回免疫を行う。マウスの飼育及び
脾細胞の採取は常法に従ってよい。尚、免疫の際には、
ＶＰＦに例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ等
を融合させ、得られた蛋白質を抗原として用いることも
できる。

【００１２】ミエローマ細胞の調製ミエローマ細胞としては、Sp2/0-Ag14(Sp2)、P3/NS1/1-
Ag4-1(NS-1)、P3X63Ag8U.1 等が挙げられる。これら細
胞の継代培養は常法に従う。細胞融合脾細胞とミエローマ細胞とを１：１〜10：１の割合で混
合し、分子量1000〜4000のポリエチレングリコール（以
下ＰＥＧという）、ダルベッコ改変イーグル培地中、両
細胞を30〜40℃、１〜３分間インキュベートすることに
より細胞融合を行うことができる。

【００１３】ハイブリドーマの選択融合細胞（ハイブリドーマ）の選択は、ヒポキサンチン
（10^-3〜10^-5Ｍ）、アミノプテリン（10^-6〜10^-7Ｍ）、
チミジン（10^-5〜10^-6Ｍ）、ペニシリン（100〜200単位
／ml）、牛胎児血清（10〜20％）、ストレプトマイシン
（100〜200μg/ml）、２−メルカプトエタノール（10^-5
〜10^-6Ｍ）を含む基礎培地を用いて培養し、生育してく
る細胞をハイブリドーマとして選択することができる。
基礎培地としては、動物細胞の培養に一般に用いられる
ＲＰＭＩ１６４０培地、イーグルＭＥＭ培地、イスコフ
改変ダルベッコ培地等が用いられる。

【００１４】ハイブリドーマの培養ハイブリドーマのクローン化は、限界希釈法により、少
なくとも２回繰り返して行う。ハイブリドーマを通常の
動物細胞の培養と同様にして培養すれば、培地中に本発
明の抗体(MV415) が産生される。通常、５〜10×10⁵個
／mlのハイブリドーマ細胞を、牛胎児血清（10％）、ペ
ニシリン（100単位／ml）、ストレプトマイシン（100μ
g/ml）、２−メルカプトエタノール（５×10^-5Ｍ）を含
むＲＰＭＩ１６４０培地中で５％ＣＯ₂存在下、37℃、
３〜４日間培養することによって培養液中に抗体が分
泌、蓄積される。また、ハイブリドーマ細胞をＢＡＬＢ
／Ｃ系マウスの腹腔内に移植して増殖することにより、
腹水中に本発明の抗体を蓄積させることもできる。

【００１５】モノクローナル抗体の精製ハイブリドーマ細胞の培養液中又は腹水中に蓄積したモ
ノクローナル抗体は以下のようにして採取され、精製さ
れる。即ち、従来から用いられている硫安分画法、ＰＥ
Ｇ分画法、陰イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾
過クロマトグラフィーを用いる方法である。また、プロ
テインＡやプロテインＧ等のアフィニティークロマトグ
ラフィーによる方法も利用できる。モノクローナル抗体
の選別には、酵素免疫測定法、ウエスタンブロッティン
グ法等が用いられる。また、モノクローナル抗体のＩｇ
Ｇアイソタイプの決定は、モノクローナル抗体の酵素免
疫測定法又はオクタロニー法によって行うことができ
る。

【００１６】（２）モノクローナル抗体の反応部位の同
定 VPFのアミノ酸配列の一部分に相当するペプチドの
作製ヒトVPF121のアミノ末端からのアミノ酸残基数が奇数の
アミノ酸から、連続した10個のアミノ酸を１つのペプチ
ドとして、57種類のペプチドを設計する。設計された各
ペプチドは、例えばマルチピンペプチド合成法[Maeji,
N,J, et.al. J.Immunol.method,134:23(1990)]等により
合成することができる。尚、合成したペプチドの定量は
オルトフタルアルデヒドを用いてアミノ基を定量するこ
とにより行うことが可能である。

【００１７】 MV415抗体と反応するペプチドの同定以上のようにして合成した57種のペプチドはヒトVPF121
の全領域に対応するものである。したがって、57種のペ
プチドとMV415抗体との反応性を調べることによりMV415
抗体がVPFのどの部位に反応しているかを明らかにする
ことができる。反応性の測定には、酵素免疫測定法、オ
クタロニー法、ウエスタンブロッティング法等が用いら
れる。

【００１８】次に、本発明のＶＰＦモノクローナル抗体
を制癌剤として投与する場合には、投与する対象を特に
限定しない。例えば、個々の癌種の予防あるいは治療す
ることを特異目的として用いることができる。また、投
与する方法は経口又は非経口でもよく、経口投与には舌
下投与を包含する。非経口投与には、注射、例えば皮
下、筋肉、静脈注射、点滴、座剤等を含む。また、その
投与量は動物か人間かによって、また、年齢、投与経
路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができ
る。この場合、本発明のＶＰＦモノクローナル抗体の有
効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体の組
成物として投与される有効量は0.1〜100mg／kg体重／日
であり、１日１回から数回に分けて投与される。

【００１９】本発明のＶＰＦモノクローナル抗体を経口
投与する場合、それに適用される錠剤、顆粒剤、細粒
剤、散剤、カプセル剤等は、通常それらの組成物中に製
剤上一般に使用される結合剤、包含剤、賦形剤、滑沢
剤、崩壊剤、湿潤剤のような添加物を含有する。また、
経口用液体製剤としては、内用水剤、懸濁剤、乳剤、シ
ロップ剤等いずれの状態であってもよく、また、使用す
る際に再溶解させる乾燥生成物であってもよい。更に、
その組成物は添加剤、保存剤のいずれを含有してもよ
い。

【００２０】また、非経口投与の場合には、安定剤、緩
衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤を含有し、通常単位
投与量アンプル若しくは多投与量容器又はチューブの状
態で提供される。上記の組成物は使用する際に適当な担
体、例えば発熱物質不含の滅菌した水で再溶解させる粉
体であってもよい。本発明のＶＰＦモノクローナル抗体
が制癌剤として有効であることを裏付ける薬理試験例を
以下に説明する。

【００２１】〔試験例〕ＰＬＣ／ＰＲＦ／５及びＨＴ−
１０８０のヌードマウス腫瘍系を用いて本発明のモノク
ローナル抗体の抗腫瘍実験及び毒性試験を以下の通り行
った。予め、腫瘍細胞ＰＬＣ／ＰＲＦ／５又はＨＴ−１
０８０をマウス（ヌードマウス）に接種し、腫瘍塊がで
きるまで飼育した。次いで、腫瘍塊を２mm角程度に切り
取り、これを別のヌードマウスの腹部皮下に移植した。

【００２２】移植翌日より本発明のモノクローナル抗体
を、100μｇ／マウス／日の投与量で合計10回投与した
（投与日は、移植後１〜４、７〜11及び14日目とし
た）。また、モノクローナル抗体を投与しないものを対
照とした。尚、実験に使用したマウスは、それぞれの腫
瘍系について、モノクローナル抗体投与群、対照群共に
４匹で行った。

【００２３】各群と腫瘍の形成及び腫瘍の大きさ（体
積）を比較した結果、図１及び図２に示す通り、いずれ
の腫瘍塊を移植した場合でも、腫瘍増殖抑制活性が確認
された。図１はＰＬＣ／ＰＲＦ／５系を、図２はＨＴ−
１０８０系の腫瘍塊を移植した場合の結果を示す。ま
た、図１及び図２中、「□」はモノクローナル抗体投与
群を、「●」は対照群を表す。一方、本発明のモノクロ
ーナル抗体をヌードマウスに投与しても体重減少は認め
られず、また、毛並みや行動も正常なヌードマウスと差
がないことから、毒性は、非常に低いものと考えられ
る。

【００２４】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。

【００２５】〔実施例１〕（１）VPFモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マの作製単離したヒトVPF cDNAを、グルタチオン S-トランスフ
ェラーゼ（GST）との融合蛋白（GST-VPF）として大腸菌
で発現させることにより抗原として使用する蛋白を得
た。次いで、得られた蛋白を抗原として常法に従ってマ
ウスモノクローナル抗体を作製した。すなわち、GST-VP
F(100μg)をフロイント完全アジュバントと等量混合
し、該混合物をBALB/Cマウスの腹腔内に０日、14日後、
25日後の３回投与することにより免疫したマウスの脾細
胞とマウスミエローマ細胞（SP2）とをポリエチレング
リコール存在下で１分間インキュベーションすることに
より細胞融合させた。得られた融合細胞をＨＡＴ培地
〔ヒポキサンチン（１×10^-4Ｍ）、アミノプテリン（４
×10^-7Ｍ）、チミジン（1.6×10^-5Ｍ）、ペニシリン（1
00単位／ml）、ストレプトマイシン（100μg/ml）、牛
胎児血清（20％）、２−メルカプトエタノール（２×10
^-5Ｍ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地〕中で培養すること
によりハイブリドーマを選別した。得られたハイブリド
ーマは限界希釈法によりクローニングした。

【００２６】一方、ヒトVPFを産生する酵母を、単離し
たヒトVPF ｃＤＮＡを含む環状ＤＮＡを酢酸リチウム法
で酵母Saccharomyces cerevisiaeに導入することにより
作成し、この酵母の培養液中から陽イオン交換クロマト
グラフィー（東ソー製；TSK-SP650）、硫安沈殿及びゲ
ル濾過クロマトグラフィー（ファルマシア製；Superdex
-75）を行うことにより、酵母由来のヒトVPF（以下「YV
PF」とする）を調製した。このYVPFとクローン化したハ
イブリドーマの培養上清の反応性を酵素免疫測定法によ
り調べ、YVPFと反応するモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマを選択した。またこのハイブリドーマが
産生するモノクローナル抗体をMV415と命名した。尚、
得られたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所にFE
RM P-14346として寄託されている。

【００２７】（２）VPFモノクローナル抗体の調製選択したハイブリドーマをヌードマウスの腹腔内に移植
し、モノクローナル抗体を大量に含む腹水を採取した。
この腹水中からプロテインＧアフィニティーカラム（MA
bTrap GII、ファルマシア社製）を用いてモノクローナ
ル抗体を精製した。また抗体のクラスを抗マウス免疫グ
ロブリンサブクラス特異的抗体を用いた酵素免疫測定法
により調べた結果、MV415抗体のクラスはIgG2aであっ
た。

【００２８】（３）抗VPF ポリクローナル抗体の作製 GST-VPFを抗原として常法によりウサギを免疫した。抗
体価の上昇したウサギの血清を分離し、陰イオン交換カ
ラムクロマトグラフィーによりウサギ抗VPFポリクロー
ナル抗体のIgG画分を得た。IgG画分の一部をペプシンで
消化してF(ab') ₂を調製し、マレイミド法によりペルオ
キシダーゼと結合させ、ペルオキシダーゼ標識したウサ
ギ抗VPFポリクローナル抗体を得た。

【００２９】（４）モノクローナル抗体とYVPFとの反応
性 MV415抗体とYVPFとの反応の特性を酵素免疫測定法によ
り調べた。まず96穴の酵素免疫測定用プレートにMV415
抗体（5μg/ml）を入れ４℃で一晩放置することによりM
V415抗体をプレートに吸着させた。0.1％ウシ血清アル
ブミン（以下「ＢＳＡ」とする）を含むＰＢＳでプレー
トの穴を６回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳを穴
一杯に入れ室温で１時間放置した。穴から１％ＢＳＡを
含むＰＢＳを除いた後、種々の濃度のYVPFを入れ室温で
１時間放置した。0.1％ＢＳＡを含むＰＢＳで６回洗浄
後ペルオキシダーゼ標識したウサギ抗VPFポリクローナ
ル抗体（0.1％BSA,PBS溶液）を入れ室温で１時間放置し
た。0.1％ＢＳＡを含むＰＢＳで６回洗浄後0.2mg/mlオ
ルトフェニレンジアミンおよび0.015％過酸化水素を含
む0.15Ｍクエン酸緩衝液（pH5.0 )を入れて発色させ
た。反応は10％硫酸を加えて停止させた後、吸光度（OD
490/650）を測定した。以上の方法で測定した結果をグ
ラフにプロットし図３に示した。YVPFの濃度が10〜200
ng/mlの範囲で吸光度の増加に直線性が認められ、MV415
抗体がYVPFと特異的に反応することおよびこの測定系で
10〜200 ng/mlのYVPFが定量できることがわかった。

【００３０】（５）モノクローナル抗体の反応部位の同
定（ａ）VPFのアミノ酸配列の一部分に相当するペプチド
の作製ヒトVPF121のアミノ末端からのアミノ酸残基数が奇数の
アミノ酸から、連続した10個のアミノ酸を１つのペプチ
ドとして57種のペプチドを設計し、各ペプチドをマルチ
ピンペプチド合成法[Maeji,N,J, et.al. J.Immunol.met
hod,134:23(1990)]により合成した。

【００３１】まず96穴アッセイプレート用ピンブロック
のピンの先端に導入された９-フルオレニルメトキシカ
ルボニル（Fmoc）-β-アラニンからピペリジンによりFm
oc基を除去した後、ジシクロヘキシカルボジイミドとヒ
ドロキシベンゾトリアゾール存在下でFmoc-アミノ酸を
縮合させた。N,N-ジメチルホルムアミドで洗浄後、再び
ジシクロヘキシカルボジイミドとヒドロキシベンゾトリ
アゾール存在下でFmoc-アミノ酸を縮合させ、この操作
を繰り返すことにより目的のペプチドを合成した。縮合
反応終了後、無水酢酸でアセチル化を行い、さらにトリ
フルオロ酢酸で側鎖保護基を除去した。ピン上で合成し
たペプチドはピンを中性溶液中に浸すことにより切り出
した。合成したペプチドの定量はオルトフタルアルデヒ
ドを用いてアミノ基を定量することにより行った。合成
した57種のペプチドのアミノ酸配列を以下の表１に示
す。

【００３２】

【表１】

【００３３】表中、１から57までの数字はペプチド識別
番号を示す。尚、「配列場所」に記載した番号（ｍ−
ｎ）は、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち何番目
（ｍ番目）から何番目（ｎ番目）までの位置に相当する
ものであるかを意味する。例えば、識別番号１の配列場
所は、配列番号１記載のアミノ酸配列のうち、第１番目
から第10番目までを意味し、括弧内はそのアミノ酸の表
示（第１番目のアラニン〜第10番目のアスパラギン）で
ある。

【００３４】（ｂ）MV415抗体と反応するペプチドの同
定以上のようにして合成した57種のペプチドは、ヒトVPF1
21の全領域に対応するものである。したがって、57種の
ペプチドとMV415抗体との反応性を調べることによりMV4
15抗体がVPFのどの部位に反応しているかを明らかにす
ることができる。そこで、酵素免疫測定法により57種の
ペプチドとMV415抗体との反応性を調べた。

【００３５】96穴スミロンＡプレート（住友ベークライ
ト社製）に２％グルタルアルデヒドを入れ室温で２時間
放置した後水で洗浄し、57種の10μＭペプチド溶液を入
れ４℃で一晩放置した。0.1％ＢＳＡを含むＰＢＳでプ
レートの穴を６回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ
を入れて室温で１時間放置した。１％ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓを除いた後、ウサギ抗VPF抗体（0.1％BSA,PBS溶液）
を入れ室温で１時間放置した。0.1 ％ＢＳＡを含むＰＢ
Ｓで６回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識したヒツジ抗ウ
サギIgG（カッペル社；0.1％BSA,PBS溶液）を入れ室温
で１時間放置した。0.1 ％ＢＳＡを含むＰＢＳで６回洗
浄後0.2mg/mlオルトフェニレンジアミンおよび0.015 ％
過酸化水素を含む0.15Ｍクエン酸緩衝液（pH5.0)を入れ
て発色させた。反応は10％硫酸を加えて停止させた後、
吸光度（OD490/650）を測定した。以上の方法で測定し
た結果をグラフにプロットし、図４に示した。

【００３６】MV415抗体は57種類のペプチドの中でペプ
チド識別番号20番、28番、29番、30番、47番、48番の６
つのペプチドに強く反応した。ペプチド識別番号28、29
及び30番のペプチドには、順に「グリシン、システイ
ン、システイン、アスパラギン、アスパラギン酸、グル
タミン酸」という配列が共通に含まれていることより、
MV415抗体は配列番号１に記載の第59〜64番目のアミノ
酸配列部分と反応していると考えられる。同様にペプチ
ド識別番号47及び48番のペプチドには、順に「セリン、
フェニルアラニン、ロイシン、グルタミン、ヒスチジ
ン、アスパラギン、リジン、システイン」という配列が
共通に含まれていることより、この領域ではMV415抗体
は配列番号１に記載の第95〜102番目のアミノ酸配列部
分と反応しているものと考えられる。

【００３７】したがって、MV415抗体は、配列番号１に
記載したVPFのアミノ酸配列中、第39〜48番目のアミノ
酸配列（配列番号２）、第59〜64番目のアミノ酸配列
（配列番号３）および第95〜102番目のアミノ酸配列
（配列番号４）を認識しているものと考えられる。

【００３８】抗体はタンパク質の表面に露出している部
分を認識すると考えられるため、この３種類のアミノ酸
配列部分はVPFの表面に露出している部分であると言え
る。また、モノクローナル抗体は抗原決定基が単一であ
ると言われているが、高次構造をとっている蛋白質など
の高分子物質が抗原の場合は抗体が立体的に抗原を認識
し、蛋白質の一次構造レベルで抗体の反応性を調べた時
に二箇所以上の不連続なアミノ酸配列に反応することが
ある。MV415抗体がVPF中の三箇所のアミノ酸配列部分に
反応したことより、本抗体は三箇所のアミノ酸配列部分
を立体的に同時に認識していると考えられる。

【００３９】微量タンパク質やウイルスの研究を行う場
合、現在ではその遺伝子のクローニングを行い、その塩
基配列よりタンパク質のアミノ酸配列が予想できる。こ
のアミノ酸配列をもとにして親水性の高い部位を探索
し、その部位の合成ペプチドに対するポリクローナル抗
体やモノクローナル抗体を作製して免疫学的解析に用い
ている。親水性の高い部位の探索にはHoop＆Woodsらの
方法[Proc. Natl. Acad.Sci. USA 78:3824(1981)]など
を用いて解析しているが、あらゆるタンパク質にあては
まるとは限らない。したがって、タンパク質の表面に露
出している部位が明らかな場合は容易に抗体を作製でき
ると考えられる。

【００４０】以上のことから、配列番号２、３及び４に
記載したアミノ酸配列を有するペプチドは、ヒトVPFに
対するモノクローナル抗体を作製する際の抗原として有
用であると考えられる。また、前記ペプチドと反応する
本発明のモノクローナル抗体は、VPFの生化学的な解
析、例えばVPF受容体に対するVPFの結合様式の解析をす
るための試薬として有用である。更に、本発明のモノク
ローナル抗体は、癌やその他の疾病の診断および疾病の
進行や治療効果の判定などに広く利用することができ
る。

【００４１】

【発明の効果】本発明により、VPFの一部分のペプチド
及びこれと反応するモノクローナル抗体が提供される。
本発明のペプチドは、VPFに対するモノクローナル抗体
を作製するための抗原として有用であり、また、該ペプ
チドと反応する本発明のモノクローナル抗体は、VPFの
生化学的な解析をするための試薬として有用である。更
に、本発明のモノクローナル抗体は、癌やその他の疾病
の診断および疾病の進行や治療効果の判定などに広く利
用することができる。

【００４２】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：１２１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列： Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu 20 25 30 Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys 35 40 45 Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu 50 55 60 Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile 65 70 75 80 Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe 85 90 95 Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg 100 105 110 Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser 115 120

【００４３】配列番号：２配列の長さ：１０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００４４】配列番号：３配列の長さ：６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００４５】配列番号：４配列の長さ：８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【図面の簡単な説明】

【図１】MV415抗体の抗腫瘍活性を示す図である。

【図２】MV415抗体の抗腫瘍活性を示す図である。

【図３】MV415抗体のYVPFに対する認識特性を示す図で
ある。

【図４】ヒトVPF121中の一部分に相当する57種のペプチ
ドに対するMV415抗体の認識を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者浅野誠茨城県つくば市大久保２番東亞合成化学工業株式会社つくば研究所内 (72)発明者松本友恵茨城県つくば市大久保２番東亞合成化学工業株式会社つくば研究所内 (72)発明者松尾克彦茨城県つくば市大久保２番東亞合成化学工業株式会社つくば研究所内 (72)発明者大森巌茨城県つくば市大久保２番東亞合成化学工業株式会社つくば研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号２で表されるアミノ酸配列、配
列番号３で表されるアミノ酸配列又は配列番号４で表さ
れるアミノ酸配列のうち、少なくとも１つのアミノ酸配
列を有するペプチド。
【請求項２】請求項１記載のペプチドを認識する血管
透過性因子モノクローナル抗体。
【請求項３】請求項２記載の血管透過性因子モノクロ
ーナル抗体を有効成分とする制癌剤。