DK165326B

DK165326B - Monoklonale antistoffer mod humanrenin og derivater deraf samt fremgangsmaade til deres fremstilling, hybridoma-cellelinier samt fremgangsmaade til deres fremstilling, anvendelse af de monoklonale antistoffer og deres derivater samt testsaet indeholdende antistofferne og/eller deres derivater

Info

Publication number: DK165326B
Application number: DK153385A
Authority: DK
Inventors: Christoph Heusser; Rudolf Heinrich Andreatta; Sefik Alkan; Jeanette Wood
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1984-04-09
Filing date: 1985-04-03
Publication date: 1992-11-09
Also published as: US4780401A; AU591870B2; ES8707295A1; CA1277261C; FI87933C; NO851384L; ATE57392T1; EP0158599A3; JPH0669390B2; ZA852557B; DK153385A; FI87933B; NO165556C; JPS60231624A; ES542017A0; AU4088685A; EP0158599B1; IE57956B1; DK165326C; NO165556B

Description

i

DK 165326B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte monoklonale antistoffer .ned høj affinitet til humanrenin og strukturelt lignende renin, samt derivater deraf, fremgangsmåder til fremstilling af disse antistoffer og deres derivater, hybridoma-cellelinier, som producerer disse 5 antistoffer, fremgangsmåder til fremstilling af nævnte hybridoma-cellelinier, endvidere anvendelsen af de monoklonale antistoffer og deres derivater til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af humanrenin og strukturelt lignende renin og testsæt til disse bestemmelser.

10 Renin er et proteolytisk enzym, som ved frigørelse af angio-tensinerne er medansvarlig for blodtrykkets regulering. Humanrenin er et glycosyleret protein med en molekylvægt på ca. 40.000. Nogle af humanrenins strukturegenskaber er kendt. Eksempelvis er aminosyresekvensen for polypeptidet klarlagt 15 ved bestemmelse af den for renin kodende komplementære des-oxyribonucleinsyre (cDNA).

Renin frigøres i nyrerne fra en inaktiv form, prorenin, og overføres derefter til blodbanen, hvor det findes i koncentrationer på 20-100 pg/ml. I blodbanen fremkalder det spalt-20 ning af angiotensinogen (reninsubstrat) under dannelse af decapeptidet angiotensin I, der igen spaltes af det såkaldte "angiotensinomdannende enzym" (Angiotensin converting enzyme, ACE) i lungerne, nyrerne og andre organer til oktapeptidet angiotensin II. Angiotensin II forhøjer blodtrykket såvel 25 direkte ved arteriel konstriktion som indirekte ved frigørelse af det natrium-tilbageholdende hormon aldosteron fra binyrerne, hvilket er forbundet med en forøgelse af det ekstracellulære væskerumfang. Angiotensin II spaltes af angiotensinaser til heptapeptidet angiotensin III, hvis 30 virkninger ligner virkningerne af angiotensin II, og til mindre, inaktive brudstykker.

DK 165326B

2

Anvendelsen af antistoffer til diagnose og terapi var indtil for nylig kraftigt begrænset med hensyn til anvendelsesområde. Antistoffer blev udvundet i små mængder fra dyre-serum som kompleks blanding af forskellige proteiner. Det 5 var ikke muligt at foretage standardisering af antistofferne, da hvert enkelt immuniseret dyrisk individ og også et enkelt individ ved gentagen immunisering hver giver et serum med antistoffer af forskellig sammensætning. Ved anvendelsen af en ny teknik udviklet af Kohier og Milstein [1] er· det 10 nu blevet muligt at udvinde antistoffer i homogen form, d.v.s. såkaldte monoklonale antistoffer, på reproducerbar måde i teoretisk ubegrænsede mængder fra cellekulturer.

Ved fusion af egnede myeloma-celler med antistofproducerende lymfocyter fra en med antigen immuniseret donor dannes 15 hybridoma-celler, som forbinder evnen til ubegrænset celledeling og til ubegrænset vækst in vitro med produktionen af et homogent antistof. Det er således muligt at selvstændiggøre en organismes immunrespons på et bestemt antigen og at fremstille monoklonale antistoffer ved permanent dyrk-20 ning af hybridceller.

Selvom der i dag kendes mange eksempler på fremstillingen af specifikke monoklonale antistoffer ved hybridoma-teknik, og den generelle fremgangsmåde principielt er beskrevet, optræder der dog for hvert nyt eksempel specifikke proble-25 mer, som kræver en tilpasning af teknikken til det pågældende tilfælde. Uden en sådan tilpasning findes der ikke sikkerhed for, at de ønskede hybridoma-celler overhovedet dannes, at de er genetisk stabile, danner de ønskede monoklonale antistoffer, og at de således fremstillede antistoffer 30 har den Ønskede specificitet. Graden af resultatet påvirkes i princippet af arten og renheden af det til immuniseringen af lymfocytdonoren anvendte antigen, immuniseringsmetoden, cellefusionsteknikken, fremgangsmåden ved selektionen af egnede hybridoma-cellelinier og arten og måden for iso-35 leringen og rensningen af de monoklonale antistoffer.

DK 165326B

3

Der kendes monoklonale antistoffer, som binder humanrenin. Således beskriver Simon et al. [2] et monoklonalt antistof med ringe affinitet til humanrenin. Dzau et al. [3] beskriver monoklonale antistoffer, som binder humanrenin og sam-5 tidig hæmmer dets enzymatiske funktion. Til bestemmelse af humanrenin i blodet anvendes principielt to forskellige metoder [4]. Ved den ene måles den enzymatiske aktivitet af humanrenin i plasma ved bestemmelse af den fra anqio-tensinogen frigjorte mængde angiotensin I. Et mål for den 10 samlede mængde renin fås da ved bestemmelse af den enzymatiske aktivitet efter aktivering af inaktivt plasmarenin, f.eks. ved behandling med syre ved pH-værdien 3-4. Denne indirekte metode tillader ganske vist bestemmelse af renin i lave koncentrationer, men den er dog behæftet med stor 15 usikker hed. Ved den anden metode bestemmes humanrenin ved immunanalyse-r ved hjælp af de kendte monoklonale antistoffer eller med polyklonale antistoffer fra serum. Denne direkte metode har imidlertid hidtil ikke været tilstrækkelig følsom til pålidelig bestemmelse af de overordentlig 20 lave koncentrationer af humanrenin i plasma. Der er således et behov for monoklonale antistoffer, som binder humanrenin væsentligt stærkere end de kendte antistoffer, således at de kan anvendes i immunanalyser til nøjagtig bestemmelse af renin i humant blodplasma. Denne opgave løses ved den fore-25 liggende opfindelse, som tilvejebringer monoklonale antistoffer, der binder humanrenin kraftigt og samtidig effektivt hæmmer dets enzymatiske funktion.

Monoklonale antistoffer mod humanrenin kan karakteriseres ved bindingskonstanten til overfladebundet eller opløst 30 humanrenin, hæmningskoncentrationen for enzymaktiviteten af humanrenin, krydsreaktiviteten overfor beslægtede antigener, f.eks. overfor renin fra andre arter, immunglobulin-klassen eller underklassen samt den N-terminale aminosyre-sekvens i polypeptidkæderne.

DK 165326B

4

De monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen samt derivaterne deraf er ejendommelige ved, at de ved en koncentration _g på 2x10 M hæmmer enzymaktiviteten af humanrenin til mindst 50%. En fordelagtig udførelsesform for de monoklonale anti-5 stoffer ifølge opfindelsen og derivater deraf er ejendommelig ved, at de ved en koncentration på 3x10 binder mindst 50% opløst humanrenin, som tilsættes i limiterende mængde.

Der foretrækkes især monoklonale antistoffer og derivater deraf, som ved en koncentration på 5x10 hæmmer enzym-10 aktiviteten af humanrenin til mindst 50%.

Som eksempel på et særligt foretrukket monoklonalt antistof ifølge opfindelsen kan nævnes antistoffet med betegnelsen R 3-36-16, som produceres af cellelinien R 3-36-16. Monoklonale antistoffer R 3-36-16 er Gamma 1 Kappa-immunglobu-15 liner, som i den første hypervariable region i den lette polypeptidkæde i stillingen 28-38 fra N-terminalen indehol-der ammo syrerne serin- valm, serin- tyrosin- glyc^n-^lysin og ^phenylalanin-^methionin.

Som eksempler på derivater af monoklonale antistoffer ifølge 20 opfindelsen er brudstykker, såsom Fab, Fab' eller Fiab'^-fragmenter, som bibeholder deres specificitet overfor de antigene determinanter i humanrenin, radioaktivt mærkede monoklonale antistoffer, som eksempelvis er mærket med radioaktivt iod (1I, , kulstof (14C) , svovl (2^S) , tritium o 25 ( h) eller lignende, eller monoklonale antistof-konjugater med enzymer, såsom peberrodsperoxidase, alkalisk phosphatase, β-D-galactosidase, glucoseoxidase, glucoamylase, carboanhyd-rase, acetylcholinesterase, lysozym, malat-dehydrogenase eller glucose-6-phosphat-dehydrogenase.

30 Foretrukne derivater er med iQd mærkede monoklonale antistoffer og monoklonale antistof-konjugater med alkalisk phosphatase .

DK 165326B

5

De omhandlede monoklonale antistoffer og derivater deraf fremstilles på i og for sig kendt måde. Fremgangsmåden i-følge opfindelsen er ejendommelig ved, at man a) in vitro dyrker hybridoma-celler, som producerer sådanne 5 monoklonale antistoffer, og isolerer de monoklonale antistoffer fra dyrkningssupernatanterne eller b) formerer hybridoma-celler, som producerer sådanne monoklonale antistoffer, in vivo i et egnet pattedyr og isolerer de monoklonale antistoffer fra dette pattedyrs 10 legemsvæsker og, om ønsket c) omdanner et dannet monoklonalt antistof til et derivat deraf.

Egnede dyrkningsmedier for in vitro-dyrkningen ifølge fremgangsmåde a) er de gængse standarddyrkningsmedier, f.eks.

15 Dulbecco's Modified Eagle-Medium eller RPMI 1640-medium tilsat føtalt kalveserum. Til isolering af de monoklonale antistoffer fældes proteinerne i kultursupernatanterne med ammoniumsulfat eller lignende og renses ved anvendelse af de gængske kromatografiske metoder, f.eks. ved gelfiltre-20 ring, ionbytterkromatografi, kromatografi på DEAE-cellulose eller immunoaffinitetskromatografi.

Der kan fremstilles store mængder af de ønskede monoklonale antistoffer ved formering af hybridoma-cellerne in vivo ifølge fremgangsmåde b) . Til dette formål injiceres celle-25 kloner i syngene pattedyr, og efter 1-3 uger isoleres anti-. stofferne fra disse pattedyrs legemsvæsker. Eksempelvis injiceres hybridoma-celler stammende fra Balb/c-mus intra-peritonealt i eventuelt med et carbonhydrid, såsom pristan, forbehandlede Balb/c-mus, og efter 8-10 dage udtages 30 ascitesvæsken fra disse dyr. De ønskede monoklonale antistoffer isoleres fra legemsvæskerne på i og for sig kendt måde, f.eks. ved fældning med ammoniumsulfat eller lignende og kromatografisk rensning, f.eks. over DEAE-cellulose, ion-bytterharpiks, ved gelfiltrering eller immunoaffinitetskro-35 matografi.

DK 165326 B

6

Omhandlede brudstykker af monoklonale antistoffer, eksempelvis Fab, Fab’ eller F(ab') fragmenter, som bibeholder deres specificitet for de antigene determinanter for humanrenin, fremstilles under anvendelse af i og for sig kendte frem-5 gangsmåder, f.eks. ved behandling af monoklonale antistoffer fremstillet ifølge fremgangsmåde a) eller b) med enzymer, såsom pepsin eller papain, og/eller spaltning af disulfidbindinger ved kemisk reduktion.

3.2 5 131

Monoklonale antistoffer mærket med iod t i, i) fremit) stilles ud fra de omhandlede monoklonale antistoffer ved i og for sig kendt iodering, f.eks. ved radioaktivt natrium- eller kaliumiodid og et kemisk oxidationsmiddel, såsom natriumhypochlorit, chloramin T eller lignende, eller et enzymatisk oxidationsmiddel, såsom lactoperoxidase, glu-15 coseoxidase og glucose. De omhandlede radioaktivt mærkede monoklonale antistoffer fremstilles også ved, at man på i og for sig kendt måde tilsætter dyrkningsmedierne til in vitro-dyrkningen radioaktivt mærkede næringsstoffer, som 14 3 indeholder radioaktivt kulstof ( C), tritium ( H), svovl 3 c 14 3 20 (S) eller lignende, f.eks. L-( C)-leucin, L-( H)-leucin 35 eller L-( S)-methionin,og udvinder de monoklonale antistoffer ifølge fremgangsmåde a).

Enzymmærkede omhandlede monoklonale antistoffer fremstilles under anvendelse af i og for sig kendte fremgangsmåder, i-25 det man omsætter monoklonale antistoffer fremstillet ifølge fremgangsmåde a) eller b) og det Ønskede enzym med et koblingsreagens, eksempelvis glutaraldehyd, periodat, Ν,Ν'-ο-phenylendimaleimid, N-(m-maleimidobenzoyloxy)-succinimid, N-(3-(2 *-pyridyldithio)-propionoxy)-succinimid eller lig-30 nende.

Hybridoma-cellelinierne ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de producerer monoklonale antistoffer, der ved en koncentration på 2x10 M hæmmer enzymaktiviteten af humanrenin til mindst 50%. Der foretrækkes cellelinier, som pro-35 ducerer monoklonale antistoffer, som desuden ved en koncen-

DK 165326B

7 ^ration på 3x10 binder mindst 50% humanrenin, som er tilsat i limiterende mængde. Især foretrækkes cellelinier, som producerer monoklonale antistoffer, der ved en koncentration på 5x10 hæmmer enzymaktiviteten af humanrenin til mindst 5 50%.

Som eksempel på en ganske specielt foretrukket hybridoma-cellelinie kan nævnes cellelinien med betegnelsen R 3-36-16, som den 7.11.1983 blev deponeret i "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" i Pasteur-instituttet i Paris 10 under deponeringsnummeret 1-253. Hybridomacellelinie R 3-36-16 er en hybrid af muse-myelomacellelinien Sp2/0-Agl4 og en B-lymfocyt fra milten af en Balb/c-mus. R 3-36-16 er en stabil cellelinie, som udskiller de monoklonale antistoffer med ensartet specificitet, og som kan aktiveres fra dyb-15 frosne kulturer ved optøning og re-kloning.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af ‘ hybridoma-cellelinier, som producerer monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man immuniserer egnede pattedyr med renset humanrenin, fusionerer de 20 fra pattedyrene udtagne antistofproducerende celler med myeloma-celler, kloner de dannede hybridoma-celler og selekterer de cellekloner, som producerer de ønskede monoklonale antistoffer med høj affinitet til humanrenin', idet man undersøger cellesupernatanterne med hensyn til 25 binding af monoklonale antistoffer på overfladefikseret humanrenin, binding til opløst humanrenin og hæmning af humanrenins enzymaktivitet.

Der foretrækkes en immunisering med humanrenin med stor renhed. Sådant humanrenin kan eksempelvis udvindes på i 30 og for sig kendt måde fra ekstrakter fra menneskenyrer ved hjælp af immunoaffinitetskromatografi.

DK 165326 B

8

Foretrukne pattedyr til immuniseringen er mus, især Balb/ c-mus, men der kan dog også anvendes andre musestammer. Immuniseringen gennemføres på i og for sig kendt måde, f.eks. ved at man foretager tre til seks injektioner par-5 enteralt, f.eks. intraperitonealt, intravenøst og/eller subkutant med 1 til 20 ug renset humanrenin pr. injektion med en til seks ugers mellemrum, fortrinsvis sammen med et hjælpestof, som stimulerer lymfocytproduktionen, f.eks. komplet eller inkomplet Freund's Adjuvans.

10 Antistofproducerende celler fra de immuniserede dyr, for trinsvis miltceller, udtages to til seks dage efter den sidste ("booster") immunisering af dyrene og fusioneres med myeloma-celler af en egnet cellelinie i nærværelse af en fusionspromotor. Flere forskellige myeloma-cellelinier 15 og deraf afledte cellelinier er kendt som egnede fusionspartnere. Der foretrækkes myeloma-celler, som mangler enzymet hypoxanthin-guanin-phosphoribosyl-transferase (HGPRT) eller enzymet thymidinkinase (TK), og som derfor ikke overlever i et selektivt dyrkningsmedium, som indeholder hypo-20 xanthin, aminopterin og thymidin (HAT-medium). Især foretrækkes myeloma-celler og deraf fremstillede cellelinier, som ikke overlever i HAT-medium, og som ikke udskiller immunglobuliner eller dele deraf, f.eks. cellelinien X63-Ag8.653 og Sp2/0-Agl4. Som fusionspromotorer kan an-25 vendes sendai-virus eller andre paramyxovira, eksempelvis i UV-inaktiveret form, calcium-ioner, overfladeaktive li-pider, såsom lysolecithin, eller polyethylenglycol. Fortrinsvis fusioneres myeloma-celler med et tre-tyvedobbelt overskud af miltceller fra immuniserede dyr i en opløsning 30 indeholdende 30-50% polyethylenglycol med en molekylvægt mellem 1000 og 4000.

Efter fusionen opdeles og dyrkes cellerne i et selektivt HAT-medium, hvorved kun hybridoma-celler overlever, fordi disse forener myeloma-cellernes evne til at kunne vokse in 35 vitro med de manglende HGPRT- eller TK-gener i antistofproducerende celler fra de immuniserede dyr og dermed evnen til at overleve i HAT-medium.

DK 165326 B

9

Egnede dyrkningsmedier til ekspansionen af hybridoma-cellerne er de gængse standarddyrkningsmedier, eksempelvis Dulbecco's Modified Eagle-Medium eller RPMI 164O-medium, tilsat 10-15% føtalt kalveserum. Til initiering af celle-5 væksten tilsættes fortrinsvis såkaldte feeder-celler, eksempelvis normale peritoneale muse-exsudatceller, miltceller, knoglemarvsmakrofager eller lignende. Med regelmæssige mellemrum tilsættes der de pågældende dyrkningsmedier selektivt HAT-medium for at forhindre en overbegroning af 10 hybridoma-cellerne med sædvanlige myeloma-celler.

Cellekultursupernatanterne fra hybridoma-cellerne undersøges derefter for indhold af de ønskede monoklonale antistoffer.

Med fordel testes cellesupernatanterne ikke kun i en immunanalyse, som påviser bindingen af monoklonale antistoffer 15 til overfladefikseret humanrenin, men samtidig bestemmes også bindingen til opløst humanrenin og hæmningen af enzymaktiviteten af humanrenin. Det har nemlig overraskende vist sig, at monoklonale antistoffer, som binder godt til overfladef ikseret renin, kun hæmmer enzymaktiviteten af renin 20 i ringe grad. Ved kombination af forskelligartede testmetoder er det muligt at identificere hybridoma-celler, som udskiller monoklonale antistoffer, der både har en høj bindingsaffinitet og en kraftig enzymhæmmende virkning overfor humanrenin. Sådanne hybridoma-celler klones ved begrænsende 25 fortynding på i og for sig kendt måde for at sikre deres ensartethed.

Opfindelsen angår som nævnt tillige anvendelsen af de monoklonale antistoffer og/eller deres derivater ifølge opfindelsen til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af human-30 renin og strukturelt lignende renin in vitro, især i biologiske væsker. De monoklonale antistoffer og antistofderivater i-følge opfindelsen kan eksempelvis anvendes ved en vilkårlig af de i og for sig kendte immunanalyser, som udnytter den bindende vekselvirkning mellem antigen (humanrenin) og 35 monoklonalt antistof. Som eksempler på sådanne analyser kan nævnes radioimmunanalyser (RIA), enzym-immunanalyser, immuno-fluorescens-tests, latexagglutination eller hæm-

DK 165326 B

10

De monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen kan anvendes som sådanne eller som radioaktivt mærkede derivater enkeltvis eller i kombination i en radioimmunanalyse (RIA). Der kan anvendes en vilkårlig kendt form for RIA, eksempelvis 5 RIA i homogen fase, RIA i fast fase eller heterogen fase, enkelt RIA eller dobbelt (sandwich) RIA med direkte eller indirekte (kompetitiv) bestemmelse af humanrenin. Der foretrækkes en enkelt RIA,ved hvilken en egnet bærer, eksempelvis plastoverfladen på en titerplade eller et testrør, f.eks.

10 af polystyren, polypropylen eller polyvinylchlorid, glaseller plast-perler, filtrerpapir, dextran-, celluloseacetateller nitrocellulose-blade eller lignende, belægges med et eller en blanding af to,forskellige epitoper erkendbare monoklonale antistoffer ved enkelt adsorption eller even-15 tuelt efter aktivering af bæreren med f.eks. glutaraldehyd eller bromcyan, hvorpå man inkuberer med prøveopløsningen og en opløs- 125 ning af en kendt mængde med I radioaktivt mærket humanrenin og bestemmer radioaktiviteten fikseret på den pågældende bærer.

20 Især foretrækkes en sandwich-radioimmunanalyse, ved hvilken en med et eller to monoklonale antistoffer belagt bærer inkuberes med prøveopløsningen og en opløsning af et med 125 I radioaktivt mærket monoklonalt antistof, idet det opløste monoklonale antistof erkender en anden epitop af 25 humanrenin end det eller de bærerbundne monoklonale antistoffer, og mængden af renin i prøveopløsningen bestemmes ved måling af den til bæreren bundne radioaktivitet. På tegningen er i fig. 1 vist den målte, til bæreren bundne radioaktivitet som funktion af den i prøveopløsningen in-30 deholdte humanrenin, således som den kan måles med den i eksempel 8.4 nærmere beskrevne sandwich-RIA. Følsomheden for denne analyse tillader pålidelig, kvantitativ bestemmelse af kun 1 pg op til mere end 100 pg humanrenin i 50 μΐ prøveopløsning på mindre end 4 timer. Anvendelsen 35 af de monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen med høj affinitet til renin muliggør således den kvantitative be-

DK 165326B

11 stemmelse af humanrenin ved koncentrationer, som normalt optræder i biologiske væsker og især i blod, og tillader dermed en hurtig og pålidelig diagnose af reninbetinget højt blodtryk.

5 De monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen kan anvendes som sådanne eller som enzymkonjugerede derivater enkeltvis eller i kombination ved en enzym-immunanalyse. Sådanne immunanalyser omfatter testudstyr, hvor enzymmarkerede monoklonale antistofderivater ifølge opfindelsen erkender og 10 binder i og for sig kendte enzymmarkerede antistoffer, epitoperne for de omhandlede eller andre anti-human-renin-antistoffer, eller hvor der anvendes enzymmarkeret humanrenin.

Der foretrækkes en ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), 15 ved hvilken en bærer som beskrevet ovenfor for en enkelt RIA-test belægges med et eller to monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen, inkuberes med en humanreninholdig prøveopløsning og derpå med et polyklonalt serum mod humanrenin, f.eks. kaninserum mod humanrenin, hvorefter de bundne antistoffer 20 i det polyklonale serum fremkaldes ved hjælp af enzymmærkede antistoffer, som erkender og binder disse, hvorpå den hundne mængde humanrenin bestemmes ved hjælp af enzymsubstratreaktion. Et sådant enzymmærket antistof er eksempelvis et phosphåtase-mærket gede-anti-kanin-immunglobulin.

25 Først og fremmest foretrækkes en ELISA, ved hvilken en med et eller to monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen belagt bærer inkuberes med en humanreninholdig prøveopløsning og en opløsning af et med et enzym konjugeret monoklonalt antistof ifølge opfindelsen, hvor det opløste monoklonale antistof 30 erkender en anden epitop af humanrenin end det eller de bærerbundne monoklonale antistoffer. Ved en enzym-substrat-reaktion, der eksempelvis medfører en farveændring, og som kan følges med øjet eller med optisk måleapparatur, bestemmes mængden af det bundne enzym, som er proportionalt med

DK 165326B

12 mængden af humanrenin i prøveopløsningen.

På tegningen viser kurven i fig. 2 den målte optiske tæthed ved den maksimale ekstinktion for det frigjorte farvede enzymsubstrat som funktion af den i prøveopløsningen 5 indeholdte humanrenin, der kan måles ved hjælp af den i eksempel 9.3 nærmere beskrevne ELISA. Følsomheden for ELISA muliggør pålidelig, kvantitativ bestemmelse af mindre end 1 pg op til 100 pg humanrenin i 50 jil prøveopløsning på mindre end 5 timer. I forhold til den ovenfor beskrevne 10 foretrukne sandwich-RIA udviser ELISA ved samme eller let større følsomhed den fordel, at der ikke kræves kompliceret måleudstyr til bestemmelse af radioaktiviteten, og at der stilles lavere krav til sikkerheden end ved omgang med radioaktive stoffer.

15 Foretrukne enzymer i enzym-immunanalysen ifølge opfindelsen er peberrod-peroxidase, der eksempelvis kan fremkaldes med enzymsubstraterne 5-aminosalicylsyre, o-phenylendiamin, 3,3'-dimethoxybenzidin, 2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothia-zolin-6-sulfonsyre) eller lignende, og især alkalisk phos-20 phatase, som eksempelvis fra enzymsubstratet p-nitrophenyl-phosphat _ frigør p-nitrophenol.

Den omhandlede anvendelse af monoklonale antistoffer med høj affinitet overfor humanrenin til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af humanrenin omfatter også andre i og 25 for sig kendte ixnmunanalyser, eksempelvis immunfluorescens-tests under anvendelse af antistof- eller antigen-konjuga-ter med fluorescerende stoffer, latex-agglutination med antistc f- eller antigenbelagte latex-partikler eller hæm-agglutination med antistof- eller antigenbelagte røde blod-30 legemer eller lignende.

De beskrevne immunanalyser kan anvendes til bestemmelse af mængden af humanrenin, som findes i biologiske væsker, især i menneskeblod, og dermed til diagnose af reninbetin-

DK 165326B

13 get højt blodtryk. På denne måde bestemmes ikke blot den mængde humanrenin, der som aktivt enzym omdanner angio-tensinogen (reninsubstrat) til angiotensin I, men også alle andre former for humanrenin, som indeholder de samme, 5 af antistoffet erkendte antigene determinanter. Med de beskrevne immunanalyser bestemmes især den totale mængde humanrenin, som omfatter det aktive enzym og det inaktive humanrenin eller humanprorenin. Immunanalyserne kan også anvendes til bestemmelse af primat-renin, især renin fra 10 egernaber (Callitrix jacchus) eller andet animalt renin, som udviser lignende eller identiske antigene determinan ter.

Testsættet ifølge opfindelsen til bestemmelse af humanrenin og strukturelt lignende rénin er ejendommeligt ved, 15 at det indeholder monoklonale antistoffer og/eller derivater deraf ifølge opfindelsen og eventuelt hjælpemidler.

Testsæt ifølge opfindelsen til en radioimmunanalyse indeholder eksempelvis en egnet bærer, eventuelt frysetørrede eller koncentrerede opløsninger af et eller flere 20 monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen, opløsninger af et radioaktivt mærket monoklonalt antistof ifølge opfindelsen eller af radioaktivt mærket humanrenin, standardopløsninger af humanrenin, pufferopløsninger og eventuelt detergenter til forhindring af uspecifik adsorption og aggregat-25 dannelse, pipetter, reaktionsbeholdere, justerkurver og lignende.

Testsæt ifølge opfindelsen til en enzym-immunanalyse indeholder eksempelvis en egnet bærer, eventuelt frysetørrede eller koncentrerede opløsninger af et eller flere 30 monoklonale antistoffer ifølge opfindelsen, eventuelt frysetørrede eller koncentrerede opløsninger af et enzym-mærket monoklonalt antistof ifølge opfindelsen, af enzym-mærket humanrenin, af et polyklonalt anti-humanrenin-serum og/eller af enzym-mærkede monoklonale eller polyklonale

DK 165326 B

14 antistoffer, som erkender og binder de omhandlede eller andre anti-humanrenin-antistoffer, enzym-substrater på fast eller opløst form, standardopløsninger af humanrenin, pufferopløsninger, detergenter, pipetter, reaktionsbeholde-5 re, justerkurver, farveskalatavler og lignende.

Opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende eksempler. I disse eksempler anvendes følgende forkortelser: BSA Okse serum-albumin ELISA Enzymanalyse (enzyme-linked immunosorbent assay) 10 HAT Hypoxanthin/aminopterin/thymidin IC 50 Koncentration, ved hvilken der iagttages en hæmning på 50% PBS Phosphat-pufret fysiologisk natriumchloridopløsning RIA Radioimmunanalyse 15 SDS Natriumdodecylsulfat

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

Enheder: M Mol/liter GE Goldblatt-enheder 20 cpm antal pr. minut (radioaktivt henfald)

Eksempel 1

Rensning af humanrenin

Humanrenin udvindes fra raenneskenyrer og renses på i og for sig kendt måde ved hjælp af immunabsorptionsteknikken.

25 1 kg mekanisk sønderdelte nyrer ekstraheres med vand, og der syrnes med svovlsyre til pH-værdien 2,8. NaCl-koncen-trationen indstilles på 0,8 M, og reninet udfældes med ammoniumsulfat (slutkoncentration 2,3 M) . Det udfældede produkt dialyseres mod 0,1 M phosphatpuffer (pH-værdi 7,4)

30 og har en koncentration på 0,13 GE renin pr. mg protein. Reninindholdet måles ved bestemmelse af angiotensin I

DK 165326B

15 efter inkubation af prøven med et overskud af reninfrit plasma som kilde for angiotensinogen (NEN, New England Nuclear Angiotensin I Radioimmunoassay Kit) og udtrykkes i Goldblatt-enheder (GE) i forhold til en reninstandard 5 (MRL, international reference standard 68/356[5]). Proteinkoncentrationen bestemmes ved farvning med "Coomassie" blåt og sammenligning med okseserum-albumin (bovine serum albumin, BSA) som standard.

Den dialyserede nyreekstrakt sættes på en immun-affinitets-10 kolonne, som indeholder 38 mg monoklonalt anti-humanrenin-antistof F 15 (Clin-Midy, Montpellier)[6] bundet til 6 ml "Affi-Gel”® 10 (Biorad). Ubundne komponenter i plasmaet bortvaskes med 0,1 M phosphatpufferopløsning, og bundet renin elueres med 0,1 M citrat-phosphat-puffer (pH-værdi 15 4,5). Eluatet koncentreres på en "Amikon"®-PM-lO-membran, fortyndes med PBS (phosphatpufret natriumchloridopløsning), indfryses og opbevares ved -80°c. På denne måde udvindes ca. 70% af det i den rå nyreekstrakt tilstedeværende renin med en specifik aktivitet på 400 GE/mg, hvilket svarer til 20 en koncentrering med en faktor 3000. Præparatets renhed analyseres ved SDS-polyacrylamidgel-elektrophorese og højtryksvæskekromatografi og bedømmes til at være >80%.

Eksempel 2

Fremstilling af hybridoma-cellerne 25 2.1. Immunisering af mus med hytmanrenin

Balb/c-mus immuniseres med det ovenfor ifølge eksempel 1 fremstillede rensede humanrenin på følgende måde:

Til mus 1 og 2 indgives 10 GE, svarende til ca. 10 yg renin, i komplet Freund's Adjuvans (CFA) fordelt på to fodpoter 30 og to subkutane (s.c.) injektioner. Den 28. dag derefter injiceres intravenøst yderligere 2 GE renin og den 46. dag 5 GE renin i PBS. 50 dage efter fusionen udtages milten.

DK 165326 B

16

Til mus -3 og 4 indgives 20 GE renin i CFA fordelt på samme måde som for mus 1 og 2, den 35. dag 2 GE renin in inkomplet Freund's Adjuvans (IFA) subkutant, den 60..dag 2 GE renin i PBS intraperitonealt (i.p.) og den 78. dag 5 GE renin 5 i PBS i.v. Fra musen med den højere serumtiter mod in vitro reninaktivitet (mus 3) udtages milten til fusion den 82. dag.

2,2. Cellefusion

Alle fusionseksperimenterne gennemføres under anvendelse af Sp2/0-Agl4 cellelinien [7] i alt væsentligt svarende 10 til fremgangsmåden ifølge Kohier og Milstein [1]. 10 milt- 7 celler fra eksempel 2.1 blandes med 10 myeloma-celler i nærværelse af 1 ml 50%'s polyethylenglycol (PEG 1500, Serva). Efter vaskningen resuspenderes cellerne i 48 ml standard Dulbecco's minimum essential Medium (Gibco nr. 0422501).

g 15 Der tilsættes 15% føtalt kalveserum og 3x10 normale peri-toneale muse-exudatceller pr. fusion som feeder-celler. Cellerne fordeles i 48 x 1 ml-Costar-plader. Kulturerne fodres 2 gange dagligt med standard HAT-selektivmedium [1] i 3-6 uger. Efter væksten af hybridcellerne undersøges 20 dyrkningssupernatanterne for binding til renin (eksempel 4) og for hæmning af reninaktiviteten (eksempel 5). Kloningen af hybridoma-cellerne gennemføres ved begrænsende fortynding i mikrotiterplader. Alle cellelinier klones sekventielt mindst to gange.

25 Der udvælges kloner af ti forskellige moderkulturer, som ekspanderes. RI, R2 og R3 betegner hybridoma-celler og deraf udvundne antistoffer fra fusionen af miltcellerne fra mus 1, 2 eller 3. Klon-nummeret og en eventuelt anført underklon-nummer anføres efter bindestreger (tabel 1).

DK 165326B

Eksempel 3 17

Isolering og rensning af monoklonale antistoffer 8-10 uger gamle Balb/c-mus (dyrefarm Sisseln) forbehandles i.p. med 0,3 ml "Pristan" (Aldrich) . 2-3 uger senere 5 injiceres i.p. 2,5x10 klonede hybridoma-celler og 0,2 ml "Pristan'*. 8-10 dage derefter perforeres musene atter, den således udvundne ascitesvæske centrifugeres ved 800 G og den derved fremkomne klarede supernatant samles ved -20°C.

10 Optøet ascitesopløsning centrifugeres i 60 min. ved 50.000 G, ovenpå svømmende fedt fjernes, og der indstilles en koncentration på 10-12 mg protein pr. ml. Proteinkoncentrationen bestemmes ved måling af den optiske tæthed ved 280 nm * Som standard anvendes en 1%'s op- 15 løsning (r/r.) af murint immunglobulin med OD28Q = 12 (1 cm lagtykkelse). Ved langsom dråbevis tilsætning af 0,9 rumfangsækvivalenter mættet ammoniumsulfatopløsning ved 0°c og omrøring fældes en rå immunglobulin-fraktion, som opløses· i 20 mM tris-HCl/50 mM NaCl (pH-værdi 7,9) 20 og dialyseres. Derefter fortyndes to gange med 20 mM tris-HCl (pH-værdi 7,9), og blandingen sættes på en DEAE-D52 cellulosesøjle (Whatman). Immunglobulin G-fraktio-nen elueres fra søjlen med pufferen 20 mM tris-HCl/80 mM NaCl (pH-værdi 7/9), og efter fornyet ammoniumsulfatfæld-25 ning (se ovenfor) indstilles med PBS på en proteinkoncentration på 10 mg/ml. Det monoklonale antistofpræparats renhed testes ved SDS-polyacrylamid-gel-elektrophorese og er bedre end 95%.

Eksempel 4

DK 165326 B

18

Binding af de monoklonale antistoffer til humanrenin 4.1. Enzymimmun-analyse (ELISA)

Reaktiviteten overfor overfladebundet renin anvendes ved 5 en i og for sig kendt ELISA-fremgangsmåde [8] såvel til selektion af de ønskede monoklonale antistofproducerende ' hybridoma-celler efter cellehybridisering (eksempel 2.2) som til kvantitativ bestemmelse af bindingen til renin hos rensede monoklonale antistoffer. 100 ng renset renin 10 (eksempel 1) i 50 yl 0,05 M natriumhydrogencarbonat-puffer (pH-værdi 9,6) inkuberes i 2 timer ved 37°C og i 15 timer ved 4°C i plast-mikrotiterplader. Efter vaskning med PBS mættes tilbageblevne proteinreaktive steder på plastover-fladerne ved inkubation i 2 timer ved 37°c med 150 yl 15 PBS-"Tween"®-puffer (0,05% "Tween"® 20 i PBS indeholdende 0,2% NaN^/ pH-værdi 7,4), og pladerne vaskes med PBS.

100 yl af opløsningen, hvori der skal foretages bestemmelse monoklonale anti-renin-antistoffer (celledyrkningssuper-natanter eller rensede monoklonale antistofopløsninger), og 20 tilsvarende fortyndinger deraf inkuberes i 2 timer ved 37°c, og efter vaskning af pladerne fremkaldes de bundne monoklonale muse-antistoffer ved inkubation med 100 yl af en tilsvarende forudbestemt fortynding af et præparat af phosphat-asemærket kanin IgG anti-muse-immunglobulin. Den optagne 25 mængde enzym bestemmes ved inkubation (30 min., 37°C) med 100 yl af en opløsning af enzymsybstratet p-nitrophenyl-phosphat (1 mg/ml i 10%’s diethanolamin-puffer indeholdende 0,5 mM MgC^/ pH-værdi 9,8) og måling af den optiske tæthed for det omsatte produkt ved 405 nm (0D4Q^) med et Multiscan 30 fotometer (Flow Irvine, Scotland). Som kontrol anvendes i stedet for opløsningerne indeholdende monoklonale anti-renin-antistoffer præparater af det uspecifikke monoklonale myeloma-antistof MOPC 21 (Bionetics Labs., Kensington, USA) og et monoklonalt hybridoma-antistof specifikt for phosphor-35 ylcholin.

DK 165326B

19

Koncentrationen af renset monoklonalt antistof, som ved denne analyse med overfladebundet humanrenin til sidst giver en OD.-værdi på 0,1, er anført i tabel 1. Den fundne kon- -7 -11 centration ligger i området fra 5,8 x 10 til 7,5 x 10 M/ -7 5 idet koncentrationer på mere end 10 M ikke udtrykker nogen specifik binding, da også de monoklonale kontrolantistoffer 1 analysen giver værdier af denne størrelsesorden. Særlig effektiv binding til fikseret renin (ELISA) konstateres hos de monoklonale antistoffer R 3-17-7 og R 3-17-8, men 10 også de monoklonale antistoffer R 3-48, R 3-21 og R 3-27 bindes ved koncentrationer under 5 x 10-10 M.

125 4.2. Radioimmunanalyse (RIA) med I-mærket renin

Til bestemmelse af reaktiviteten overfor opløseligt renin sættes til forskellige fortyndinger af en monoklonal anti- 15 stofprøve i 50 yl RIA-puffer (1% BSA i PBS, 0,2% NaN-, pH- 125 ^ værdi 7,4) med 50 yl I-mærket renin (80.000 cpm svarende til 2,5 ng protein, eksempel 8.1) i den samme puffer, og der inkuberes i polyvinylchlorid-mikrotiterplader i 2 timer ved 37°C og i 15 timer ved 4°C. Den antistofbundne 20 mængde I-renin fås ved fældning af de monoklonale antistoffer som immunkomplekser, idet 50 yl af en tilsvarende fortynding af et kanin-antimuse-immunglobulin-serum i 3%'s polyethylenglycol 6000 tilsættes, og der inkuberes i 30 min. ved 37°c og i 30 min. ved 4°C. Det udfældede 25 materiale vaskes flere gange ved opslæmning og centrifugering, og radioaktiviteten bestemmes i en gamma tæller efter opskæring af titerpladen.

Koncentrationen af renset monoklonalt antistof, som stadig udfælder 50% af den maksimalt udfældelige radioaktivitet 125 30 fra den I-reninholdige opløsning (IC 50) , er et udtryk for bindingen til opløst renin og er anført i tabel 1.

Særligt kraftigt binder monoklonale antistoffer R 3-36-16 og R 3-47 opløst renin, selvom de i ELISA (eksempel 4.1) kun viser en ringe affinitet til overfladebundet renin.

Eksempel 5

DK 165326B

20 Hæmning af reninaktiviteten in vitro 5.1. Bestemmelse af hæmningen af humanreninaktiviteten.

Til renindepleteret, normalt humant plasma indeholdende an-5 giotensinogen sættes renset humanrenin (eksempel 1) til en koncentration på 250 pg/ml renin. 50 μΐ portioner af dette forbehandlede plasma inkuberes med forskellige fortyndinger af de monoklonale antistofprøver, som skal analyseres, i 50 μΐ 0,1 M tris-acetat-puffer (pH-værdi 7,4) i nærvæ-10 relse af 2,3-dimercapto-l-propanol og 8-hydroxyquinolin, som blokerer omsætningen af angiotensin I til angiotensin o o II, i 2 timer ved 4 C og i 1 time ved 37 C. Den enzymatiske reaktion standses ved afkøling til 4°C. Den dannede mængde angiotensin I bestemmes med en RIA (NEN, New Eng- 15 land Nuclear Angiotensin I Radioimmunoassay Kit). Til 125 dette fomål forsynes prøverne med I-mærket angiotensin I-tracer og en tilsvarende mængde antiserum mod angiotensin I, og efter inkubation i 15 timer ved 4°c adsorberes ubundet angiotensin I til aktivt kul, og det 125 20 antistofbundne I-mærket angiotensin I i supernatanten bestemmes med en Gammatæller. I dette system udviser positivkontrollen (prøve uden monoklonale antistoffer) 10 ng angiotensin I pr. ml og time.

Koncentrationen af renset monoklonalt antistof, som kon- 25 stateres ved 50% af den maksimalt opnåelige hæmning af humanreninaktiviteten (IC 50), er anført i tabel 1, og —6 “11 strækker sig fra >10 M til 1,3 x 10 M. De monoklonale antistoffer R 3-17-7 og R 3-48 hæmmer ikke reninaktiviteten signifikant, selvom de binder renin kraftigt i 30 ELISA (eksempel 4.1). Signifikant men dog svag hæmning af reninaktiviteten udviser de monoklonale antistoffer R 1-19', R 1-20, R 3-17-8, R 2-12 og R 3-21. Udpræget hæmning af reninaktiviteten iagttages ved de monoklonale antistoffer R 3-27, R 2-1 og især R 3-47 og R 3-36-16.

DK 165326B

21

De monoklonale antistoffer R 3-21 og R 2-1 hæmmer renin op til kun 60% over hele det undersøgte koncentrationsområde —6 (til 10 M), R 3-27 udviser en maksimal hæmning på kun 35%. Disse monoklonale antistoffer erkender og binder antigene 5 determinater (epitoper), der højst sandsynligt ligger i nærheden af renins aktive centrum. Med deres binding hæmmer de enzymaktiviteten ved sterisk påvirkning eller begunstiger en allosterisk konfiguration i reninmolekylet, hvilket tillader et endnu mindre substratudvekslingstal. Derimod for-10 årsager de kun svagt hæmmende monoklonale antistoffer R 1-19 og R 1-20 ved høje koncentrationer fuldstændig reninhasnning nøjagtigt som de monoklonale antistoffer med den største affinitet, nemlig antistofferne R 3-47 og R 3-36-16.

DK 165326B

22

S

rH

S ® +j (D Ck<%> 4-J Ow

ΐΟ ^ ΟΛΟ O O O O

S1""* 'd 21 Λ ja ,D ,fi vo ΡΊΌ OO OO

i in gi -*-· ^ s I —.—_____ um

*ti 2, O O HH

•o vo co co σ\ ph en τ-ι·-ι co oo o i i i i i i i ii ii

Sul m oooo ooo oo oo

rH rH rH pH Η Η Η rH rH pH rH

P XX XXX xx xx g Η λ λ o Λ Hf o f"· co o Hf Hf m A« » » * «hf« jg ¢000 ri H tf) pH CM η h -»H,

CM

Hf . _ o o o o

,n Γ·» Cf\ CO H rt θ' Η H CO

S h-h.1 i i III II I CO

e -¾ JO o o o ooo oo o I

H ^ i-Hr-<rH r-4 f—i Η Η H O

'g ^ XXX XXX XX X rH

« tfl θ' Η H in H Γ* Hf in x r' <ϊ, * * ·> * * ·► * * » 0 w H rH Hf CM σ' ΙΛ Hf pH CM CM r rH * « •H — — r - ----. — - - - . ... .

-μ -

tp C

fi 7 £j Hf

_ 5 rn rH rH O O O

O ri pH σ> rH rH rH pH Γη 00O\ CO N

ra ra •S till III II || <u oooo .ooo oo oo

.Lj . ν' rH rH pH pH rH pH rH rH rH rH rH

C < X X X X XXX XX xx S w tf) CM m rH «η co co in cm cp γη g i" M r r r r Prr r r r r ή P JJ 0)·0 (HH rH Hf ΙΛ \0C0 σ» oo

1 -S__H

i £ 3

ϋ 4» H

»S $ <u μ m .2 S Η Μ Η Η Η Η Η Η H «»4 «—1 & £> 4J(0 X ►* S ^ ° sa g ω - -η > ίο) 7 °? 7 φ 7j $ J9 f'NOW rH Γ-H tf IN O O S jj

Ή | rt 1 pH rH pH Hf CM CM rH CO Hf PH CM M’S

fri t S till III li II Tis S Op) CO CM CO CO CO CO CM COCO HH (0+) ® £j jj Di (4 04 ti 04 ti oi 04 ti ti d £ £ --£ Λ Η 0 Π g)

“d S ' SS

3 rH CM CO Hf Ή E-< -2__ (0Λ 5.2. Sammenligning af bindingen til humanrenin og hæmningen _af humanreninaktiviteten.__

DK 165326B

23

De monoklonale antistoffer kan med hensyn til deres bindings-og hæmningsegenskaber opdeles i fire forskellige grupper.

5 Principielt måtte man forvente monoklonale antistoffer, som kun binder renin, og sådanne, som binder renin og samtidig haammer dets enzymatiske aktivitet. Gruppe 1 (tabel 1) omfatter de monoklonale antistoffer, som binder renin, men som dog ikke eller kun ganske svagt hæmmer dets katalytiske ak-10 tivitet. Disse monoklonale antistoffer udviser tilmed en mindst 20 gange så stor affinitet overfor overfladebundet renin (ELISA) i sammenligning med affiniteten overfor renin i opløsning (RIA). De monoklonale antistoffer i alle andre grupper udviser ingen præference over for overfladebundet 15 renin. Monoklonale antistoffer i gruppe 2 hæmmer reninak-tiviteten allerede ved lave koncentrationer, dog kun partielt, d.v.s. kun til en vis, for de monoklonale antistoffer karakteristisk procentsats. Gruppe 3 omfatter monoklonale antistoffer, som hæmmer reninaktiviteten fuldstændigt alle-20 rede ved ekstremt lave koncentrationer. Samtidig binder de opløst renin ved lave koncentrationer fra 1 til 3x10”

Interessant nok reagerer disse monoklonale antistoffer næsten ikke med overfladebundet renin. Sådanne monoklonale antistoffer vil følgelig ikke blive konstateret ved en 25 sædvanlig primærscreening baseret på ELISA-metoden.

Gruppe 4 omfatter monoklonale antistoffer, som hæmmer reninaktiviten fuldstændigt, men ca. 1000 gange svagere end monoklonale antistoffer i gruppe 3. De binder tilmed overfladebundet renin (ELISA) og opløseligt renin (RIA) 30 omtrentlig lige godt. Bindingen i ELISA (ved ca. 10 M) er ganske vist ikke signifikant forskelligt fra bindingen af uspecifikke monoklonale kontrolantistoffer.

5.3. Bestemmelse af hæmningen af rotte- og egernabe-renin-_aktiviteten__ 35 Analogt med den i eksempel 5.1 beskrevne fremgangsmåde af-

DK 165326B

24 prøves de monoklonale antistofprøver, som skal analyseres, for hæmning af aktiviteten af rotterenin og af egernaberenin. Dertil anvendes dog ubehandlet, d.v.s. normale mængder angio-tensinogen og renin indeholdende rotte- eller egernabe-plasma 5 i stedet for det forbehandlede humanplasma.

*

Ingen af de i tabel 1 anførte monoklonale antistoffer hæmmer rotterenin.

De monoklonale antistoffer R 3-27, R 3-36-16, R 3-47 og .

R 1-20 hæmmer egernaberenin på samme måde som humanrenin 10 (samme IC 50-værdi) . De af det tilsvarende monoklonale antistof erkendte determinanter er derfor identiske eller i det mindste meget lig hinanden i humanrenin og egernaberenin.

Da de monoklonale antistoffer R 3-36-16 og R 3-47 yderst effektivt hæmmer humanrenin (tabel 1) , er der påvist en 15 homologi mellem det katalytiske sted hos enzymerne humanrenin og egernaberenin.

Det monoklonale antistof R 1-19 hæmmer aktiviteten af egernaberenin ved en tre gange så lav koncentration (IC 50) som ved humanrenin. Dette monoklonale antistof reage-20 rer altså bedre med et molekyle, som ikke er blevet anvendt til immuniseringen (eksempel 2.1) .

Det monoklonale antistof R 2-1 hæmmer først aktiviteten af egernaberenin ved en koncentration (IC 50-værdi) som er 15 gange større end ved humanrenin. Dette monoklonale 25 antistof erkender derfor determinanter, som ganske vist har stor lighed i egernabe- og humanrenin, men som ikke er identiske.

Den ved de monoklonale antistoffer R 3-21, R 2-1 og R 3-27 iagttagne kun partielle hæmning af humanrenin selv ved 30 høje koncentrationer (tabel 1, sidste kolonne) findes på tilsvarende måde også for egernaberenin.

Eksempel 6

DK 165326 B

25

Karakterisering af de monoklonale antistoffer 6.1. Bestemmelse af antistofklassen

Klassen eller underklassen for monoklonale antistoffer, 5 som produceres af klonede hybridoma-celler, bestemmes ved en ELISA. Mikrotiterplader belægges med 1 yg kanin-immun-globulin-præparat af et klasse- eller underklassespecifikt serum i 50 yl PBS, frie bindingssteder på pladerne mættes med RIA-puffer (1% BSA i PBS, 0,2% NaN^, pH-værdi 7,4), 10 og prøverne, som skal analyseres, inkuberes· i 1 time ved 37°c i fordybningerne. Efter vaskning af pladerne inkuberes de bundne monoklonale museantistoffer med et præparat af phosphatasemærket kanin-immunglobulin af det til pladebelægningen anvendte serumpræparat i 1 time ved 37°C, og 15 den optagne mængde enzym bestemmes på samme måde som i eksempel 4.1. Resultaterne er anført i tabel 1.

6.2. Analyse af aminosvresekvensen

De monoklonale antistoffer derivatiseres med 4-dimethyl-amino-41-iodacetamido-azobenzen, og lette og tunge kæder 20 adskilles ved kromatografi på en "Sepharose"® G 100 søjle. Fraktionerne elueres fra gelen ved elektrodialyse og underkastes en aminosyresekvensanalyse i et Beckman 8906 sekvensbestemmelsesapparatur på kendt måde [9].

Den N-terminale amino syre sekvens for den lette kæde i det 25 monoklonale antistof R 3-36-16 (omfattende den første hypervariable region i position 28-38) er som følger: 10

Asp-Asn-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-P.ro-Ser-Ser-Leu-Ala-Val-Ser-Leu- 20 (Arg)-Gin-(Arg)-Ala-Thr-Ile-Ser-Cys-(Arg)-Ala-Ser-Glu-Ser-Val- 30 40 (Asp)-Ser-Tyr-Gly-Lys-X-Phe-Met-Y-Trp-Tyr

DK 165326 B

26

Aminosyrer anført i parentes er ikke bekendt med sikkerhed.

X og Y udgør ikke-bestemte aminosyrer.

Eksempel 7

Bestemmelse af krydsinhiberingen af de monoklonale antistoffer 5 Mikrotiterplader belægges på samme måde som beskrevet i eksempel 4.1 med monoklonale antistoffer fra grupperne 1-3 (tabel 1) på en sådan måde, at der pr. fordybning bindes ca. 150 ng monoklonalt antistof. 3 jig (20-dobbelt overskud) af det samme monoklonale antistof eller et andet monoklonalt 125 10 antistof fra grupperne 1-3 forinkuberes med 5 ng I-mærket renin (eksempel 8.1) i 10 jil opløsning i 15 timer ved 4°C eller 4 timer ved 37°C, hvorpå der inkuberes i fordybningerne på de belagte mikrotiterplader i 2 timer ved 37°C og i 15 timer ved 4°c. Pladerne vaskes derefter, og det bundne 15 renin bestemmes ved måling af radioaktiviteten.

Resultaterne af dette krydsinhiberingsforsøg er anført i tabel 2. Binding af renin til et overfladebundet monoklonalt antistof inhiberes fuldstændigt (>95%) ved forinkubation med det samme monoklonale antistof i opløsning (ta-20 bel 2, diagonaler) . De monoklonale antistoffer R 3-36-16 og R 3-47 inhiberer hinanden fuldstændigt, d.v.s. erkender , samme epitop på reninmolekylet. Det monoklonale antistof R 3-21, som krydsreagerer med R 3-27, krydsinhiberes ligeledes af det monoklonale antistof R 3-17-7, hvorimod R 3-27 25 og R 3-17-7 ikke gensidigt påvirker hinanden. Disse tre monoklonale antistoffer erkender således delvis overlappende på hinanden følgende epitoper på reninmolekylet. Alle - i øvrige monoklonale antistofpar udviser ingen gensidig påvirkning. Disse monoklonale antistoffer binder således 30 til rummeligt adskilt anbragte epitoper på reninmolekylet.

DK 165326 B

27

Tabel 2; Krydsirihibering af monoklonale antistoffer.

Monoklonale Inhibering af bindingen til renin med antistoffer I overskud af monoklonale antistoffer bundet på titerplade R 2-12 R 3-17-7 R 3-21 R 3-27 R 2-1 R 3-36 R 3-47 •__' _ -16 R 2—12 +++ - - - - . _ R 3-17-7 - +++ +++ - 5 R 3-21 - ++ +++ + R 3-27 - - +++ +++ - R 2-1 - - - +++ R 3-36-16 - - - +++ +++ R 3-47 - “ +++ +++ 10 - 0-30% inhibering + 30-60% inhibering ++ 60-95% inhibering +++ 95-100% inhibering

Eksempel 8 15 Radioimmunanalyse (RIA) til bestemmelse af humanrenin i plasma_ 125

8.1. Mærkning af humanrenin med I

10 yg humanrenin fra eksempel 1 ioderes under anvendelse af standardfremgangsmåde ifølge Greenwood og Hunter [10] 125 20 med i-natriumiodid (0,3 mC) og chloramin T. Reaktionsproduktet renses på en ionbyttersøjle "Bio Rad"® AG 1x8 og indstilles med PBS på en aktivitet på l,6xl06 cpm/ml.

8.2. Bestemmelse af humanrenin ved enkelt RIA

Polyvinylchlorid-mikrotiterplader (Dynatech Labs.,Inc.) 25 belægges ved inkubation med 100 yl af en opløsning i PBS, som indeholder 10 yg/ml monoklonalt antistof R 2-1 og R 3-27, i 2 timer ved 37°C og i 15 timer ved 4°C. Pladerne vaskes med PBS, og endnu tilstedeværende proteinreaktive steder mættes ved inkubering med 225 yl RIA-puffer 30 (1% BSA i PBS, 0,2% NaN^, pH-værdi 7,4) i 2 timer ved 37°C.

DK 165326B

28 50 yl af fortyndingsrækker af en prøveopløsning eller renin-standardopløsningen i RIA-puffer indeholdende 10% reninfrit humant plasma sættes til fordybningerne i mikrotiterpladerne, der tilsættes 50 yl (80.000 cpm svarende til 2,5 ng) af op-5 løsningen af I-mærket renin fra eksempel 8.1, hvorpå der inkuberes i 2 timer ved 37°C og i 15 timer ved 4°C. Pladerne vaskes med PBS, og radioaktiviteten måles. Koncentrationen af humanrenin i prøveopløsningen bestemmes ved hjælp af en med standardopløsning fremstillet justerkurve.

10 På samme måde belægges mikrotiterplader med et monoklonalt antistof eller med to monoklonale antistoffer, som erkender forskellige epitoper (tabel 2), og de anvendes til en enkelt RIA.

125

8.3. Mærkning af det monoklonale antistof R 3-36-16 med I

125 15 30 yg monoklonalt antistof R 3-36-16 ioderes med I (1 mC) og renses analogt med den i eksempel 8.1 beskrevne fremgangsmåde.

På samme måde mærkes det monoklonale antistof R 3-27.

8.4. Bestemmelse af humanrenin ved hjælp af sandwich-RIA

20 Analogt med den i eksempel 8.2 beskrevne fremgangsmåde belægges mikrotiterplader med 150 yl af en opløsning af det monoklonale antistof R 3-27 (10 yg/ml), og proteinreaktive steder mættes. 50 yl af fortyndingsrækker af en prøveopløsning (f.eks. blodplasma fra en patient) eller reninstandard-25 opløsningen i reninfrit humanplasma, 50 yl RIA-puffer og 50 yl (120.000 cpm svarende til 6 ng) af opløsningen af 125 I-mærket antistof R 3-36-16 fra eksempel 8.3 inkuberes i fordybningerne i mikrotiterpladerne i 2 timer ved 37°C og i 15 min. ved 4°C. Pladerne vaskes med PBS, og radio-30 aktiviteten måles. Koncentrationen af humanrenin i prøveopløsningen bestemmes ved hjælp af en med standardopløsning fremstillet justerkurve (fig. 1) .

DK 165326B

29 Følsomheden ved testen tillader bestemmelse af blot 1 pg humanrenin i 50 μΐ prøveopløsning (20 pg/ml). En lineær dosisafhængighed findes i det samlede område fra 1 til 100 pg renin (50 μΐ prøve).

5 På samme måde kan humanrenin ligeledes bestemmes, når der til belægningen af mikrotiterpladerne f.eks. anvendes det monoklonale antistof R 2-1 eller en blanding af R 2-1 og R 3-27, eller når man ombytter antistoffet, d.v.s. anvender det monoklonale antistof R 3-36-16 til belægningen og 10 f.eks. det I-mærkede monoklonale antistof R 3-27 til fremkaldelsen.

8.5., Testsæt til enkelt RIA

Et testsæt til den under 8.2 beskrevne enkelte RIA indeholder følgende: 15 Mikrotiterplader af polyvinylchlorid 2 ml opløsning af de monoklonale anti-humanrenin-anti- stoffer R 2-1 og R 3-27 (10 μg/ml) 100 ml phosphatpufret fysiologisk natriumchloridopløsning (PBS) 100 ml RIA-puffer (1% BSA i PBS, 0,2% natriumazid) 20 2 ml reninfrit humant plasma 125 2 ml opløsning af i-mærket humanrenin med aktiviteten 1,6x10® cpm/ml 2 ml standardopløsning indeholdende 20 ng/ml humanrenin i reninfrit humant plasma 25 Justerkurve

8.6. Testsæt til sandwich-RIA

Et testsæt til den under 8.4 beskrevne sandwich-RIA indeholder følgende:

Mikrotiterplader af polyvinylchlorid 30 6 ml opløsning af det monoklonale anti-humanrenin-anti- stof R 3-27 (10 μg/ml) 100 ml phosphatpufret fysiologisk saltopløsning (PBS) 100 ml RIA-puffer (1% BSA i PBS, 0,2% natriumazid)

DK 165326B

30 2 ml reninfrit humant plasma 125 2 ml opløsning af I-mærket monoklonalt anti-humanrenin-antistof R 3-36-16 (eksempel 8.3) med aktiviteten 2,4x10^ cpm/ml 5 2 ml standardopløsning indeholdende 20 ng/ml humanrenin i reninfrit humant plasma Justerkurve (fig. 1)

Eksempel 9

Enzymimmunanalyse (ELISA) til bestemmelse af humanrenin i 10 plasma_ 9.1. ELISA med polyklonalt anti-humanrenin-serum

Analogt med den i eksempel 8.2 beskrevne fremgangsmåde belægges mikrotiterpladerne med 100 yl af en opløsning indeholdende 10 yg/ml monoklonalt antistof R 3-36-16, og de 15 proteinreaktive steder mættet. Pladerne inkuberes med 50 yl af fortyndingsrækker af en prøveopløsning eller af en reninstandardopløsning i RIA-puffer (1% BSA i PBS, 0,2% NaNg, pH-værdi 7,4) indeholdende 10% reninfrit humant plasma i 2 timer ved 37°C, hvorpå de vaskes og derefter in-20 kuberes med 50 μΐ af et i forholdet 1:500 forfortyndet polyklonalt kanin-anti-humanrenin-serem [11] il time ved 37°c. Efter vaskning af pladerne fremkaldes de bundne kaninantistoffer ved inkubation (1 time ved 37°C) med et i forholdet 1:2 forfortyndet præparat af phosphatasemærket gede-anti-25 kanin-immunglobulin. Det bundne enzym frigører p-nitrophenol ved den videre inkubation (30 min., 37°C) med 100 yl af en opløsning af p-nitrophenylphosphat (1 mg/ml i 10% diethanol-aminpuffer indeholdende 0,5 mM MgC^, pH-værdi 9,8). Ved måling af den optiske tæthed ved 405 nm bestemmes mængden 30 af den frigjorte p-nitrophenol, der er proportional med mængden af det bundne enzym phosphatase og dermed proportional med mængden af humanrenin i prøveopløsningen.

På samme måde kan humanrenin ligeledes bestemmes, når der til belægningen af mikrotiterpladerne anvendes de monoklo-

DK 165326B

31 nåle antistoffer R 2-1, R 3-27 eller blandinger af to mono-klonale antistoffer.

9.2. Mærkning af det monoklonale antistof R 3-36-16 med _alkalisk phosphatase_ 5 1,4 mg monoklonalt antistof R 3-36-16 i 1,4 ml PBS kobles med en opløsning indeholdende 5 mg alkalisk phosphatase (SIGMA P6774, type VII-T) under anvendelse af standardmetode ifølge Voller et al. [12] med glutaraldehyd (0,2% r/r) i 2 timer og overføres til 5 ml tris-puffer, 0,05 M, 10 pH-værdi 8,0, indeholdende 1 mM MgCl2, 1% BSA og 0,02%

NaN3. Opløsningen opbevares i mørke ved 4°C.

9.3. ELISA med to forskellige monoklonale antistoffer

Polypropylenmikrotiterplader (Dynatech Labs., Inc.) belægges i 2 timer ved 37°c med 150 yl af en opløsning af 15 det monoklonale antistof R 3-27 (10 yg/ml) i puffer med pH-værdi 8,6 (carbonatpufret 0,9% natriumchloridopløsning indeholdende 0,02% natriumacid). Pladerne vaskes fem gange med PBS, og endnu forekommende proteinreaktive steder mættes ved inkubation med 250 yl RIA-puffer (1% BSA i PBS, 20 0,2% NaNg, pH-værdi 7,4) i 1 time ved 37°C. Plader belagt på denne måde kan opbevares i nogle dage i RIA-puffer ved en temperatur på 4°c.

50 yl af fortyndingsrækker af en prøveopløsning (f.eks. blodplasma fra en patient) eller reninstandardopløsningen 25 i reninfrit humant plasma, 50 yl RIA-puffer og 50 yl af en med RIA-puffer 1:100 fortyndet opløsning af det phosphat-asemærkede antistof R 3-36-16 (eksempel 9.2) blandes, og i fordybningerne i mikrotiterpladerne inkuberes i 2 timer ved 37°C og 30 min. ved 4°C.

30 Pladerne vaskes fem gange med PBS, og den bundne mængde enzym bestemmes efter inkubation (30 min., 37°C) med 150 yl af en opløsning af p-nitrophenylphosphat som beskrevet i

DK 165326 B

32 eksempel 9.1. Koncentrationen af humanrenin i prøveopløsningen beregnes ved hjælp af en med standardopløsning fremstillet justerkurve (fig. 2) .

Følsomheden for ELISA tillader bestemmelse af mindre end 5 1 pg humanrenin i 50 μΐ prøveopløsning (20 pg/ral). Der er en lineær dosisafhængighed i området fra 1 til 100 pg renin (50 μΐ prøve).

9.4„ Testsæt til ELISA

Et testsæt til den i eksempel 9.3 beskrevne ELISA inde-10 holder følgende:

Mikrotiterplader af polypropylen, 6 ml opløsning af det monoklonale anti-humanrenin-anti-stof R 3-27 (10 μg/ml) i carbonatpufret (0,072 g/1 Na2CC>2 og 4,2 g/1 NaHC03) 0,9% natriumchloridopløs-15 ning indeholdende 0,02% NaN^, 100 ml phosphatpufret fysiologisk natriumchloridopløsning (PBS), 100 ml RIA-puffer (1% BSA i PBS, 0,2% NaN3), 2 ml reninfrit humant plasma, 20 0,2 ml opløsning af med alkalisk phosphatase mærket mono- klonalt anti-humanrenin-antistof R 3-36-16 (eksempel 9.2) i tris-puffer (0,05 M, pH-værdi 8,0, 1 mM MgCl2, 1% BSA, 0,02% NaN3) med koncentrationen 0,3 mg antistof pr. ml, 25 10 ml opløsning af p-nitrophenylphosphat (1 mg/ml) i diethanolamin-puffer (10% diethanolamin, 0,5 mM MgCl2, 0,02% NaN3, indstillet med HCl på pH-værdien 8,9), 2 ml standardopløsning indeholdende 20 ng/ml humanrenin 30 i reninfrit humant plasma,

Justerkurve (fig. 2),

Farvestyrkeskala til bestemmelse af mængden af frigjort p-nitrophenol med det blotte øje.

DK 165326 B

33

Litteraturhenvisninger [1] G. Kohier og C. Milstein, Nature 256, 495 (1975).

[2] D. Simon, F.X. Galen, C. Devaux, F. Soubrier, B. Pau, J. Menard og P. Corvol, J. Clin. Endocr. Met. 53, 5 453 (1981).

[3] V.J. Dzau, D. Devine, M. Mudgett-Hunter, R.I. Kopelman, A.C. Barger og E. Haber, Clinical and Experimental Hypertension A5, 1207 (1983) [4] F. Soubrier, T.T. Guyenne, M.F. Gonzales, P. Corvol og 10 J· Ménard, i "Heterogeneity of Renin and Renin-Substrate" (Herausg. M.P. Sambhi), Elsevier North Holland Inc. 1981, s. 237.

[5] D.R. Bangkan, I. Robertson, J.I.S. Robertson, C.J. Robinson og M. Iree, Clin. Sci. Mol. Med. £8, 135 (1975).

15 [6] B. Pau, D. Simon, F.X. Galen, C. Devaux, F. Soubrier, J. Ménard og P. Corvol, Clin. Sci. _61, 239 (1981) .

[7] M. Shulman, C.D. Wilde og G. Kohler, Nature 276, 269 (1978).

[8] E. Engvall og P. Perlmann, J. Immunol. 109, 129 (1972).

[9] J.-Y. Chang, H. Herbst, R. Aebersold og D.G. Braun, 20 Biochem. J. 211, 173 (1983).

[10] F.C. Greenwood, W.M. Hunter og J.S. Glover,

Biochem. J. 89^, 114 (1963) .

[11] F.X. Galen, T.T. Guyenne, C. Devaux, C. Auzan, P. Corvol og J. Ménard, J. Clin. Endocr. Met. 48, 1041 (1979).

25 [12] A. Voller, D.E. Bidwell og A. Barlett,

Bull. World Health Organ. j>3, 55 (1976) .

Claims

1. Monoklonale antistoffer mod humanrenin og strukturelt lignende renin, samt derivater deraf, kendetegnet ved, at de ved en koncentration på 2xlO~^M 5 hæmmer enzymaktiviteten af humanrenin til mindst 50%.

2. Monoklonale antistoffer og derivater deraf ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de ved en koncentration på 3xlO-10M binder mindst 50% humanrenin, som er tilsat i limiterende mængde.

3. Monoklonale antistoffer og derivater deraf ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de ved en koncentra- o -11 tion på 5x10 M hæmmer enzymaktiviteten af humanrenin til mindst 50%.

4. Monoklonalt antistof R 3—36-16 ifølge krav 1, k e n-15 detegnet ved, at det produceres af hybridcma-celle- linien med betegnelsen R 3-36-16,der er deponeret i "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" i Pasteur-instituttet i Paris under deponeringsnummeret 1-253.

5. Monoklonale antistofderivater ifølge krav 1-3, k e n- 20' detegnet ved, at de er monoklonale antistofderi- 125 vater mærket med I.

6. Monoklonalt antistofderivat ifølge krav 4, kende- 125 tegnet ved, at det er det med i mærkede derivat af det monoklonale antistof R 3-36-16. 25

7· Monoklonale antistofderivater ifølge et af kravene : 1-3, kendetegnet ved, at det er monoklonale antistofderivater konjugeret med alkalisk phosphatase. DK 165326B

8. Anti stof derivat, kendetegnet ved, at det er det monoklonale antistof R 3-36-16 ifølge krav 4 konjugeret med alkalisk phosphatase.

9· Fremgangsmåde til fremstilling af monoklonale anti-5 stoffer eller derivater deraf ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man a) in vitro dyrker hybridoma-celler, som producerer sådanne monoklonale antistoffer, og isolerer de monoklonale antistoffer fra dyrkningssupernatanterne eller 10 b) formerer hybridoma-celler, som producerer sådanne monoklonale antistoffer, in vivo i et egnet pattedyr og isolerer de monoklonale antistoffer fra dette pattedyrs legemsvæsker og, om ønsket, c) omdanner et dannet monoklonalt antistof til et derivat 15 deraf.

10. Fremgangsmåde ifølge krav g, kendetegnet ved, at man intraperitonealt i eventuelt med et carbonhydrid forbehåndlet Balb/c-mus injicerer fra Balb/c-mus stammende hybridoma-celler, der producerer ønskede monoklonale anti-20 stoffer, efter 8-10 dage udtager ascitesvæsken af disse dyr og deraf isolerer de monoklonale antistoffer ved fældning med ammoniumsulfat og kromatografisk rensning.

11. Hybridoma-cellelinier, kendetegnet ved, at de producerer monoklonale antistoffer ifølge et af 25 kravene 1-4.

12. Hybridoma-cellelinien ifølge krav li, kendetegnet ved, at den har betegnelsen R 3-36-16 og er deponefet i "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" i Pasteur-instituttet i Paris under deponeringsnummeret 1-253.

13. Fremgangsmåde til fremstilling af hybridoma-cellelini er ifølge krav li, kendetegnet ved, at man immuniserer egnede pattedyr med renset humanrenin, fusionerer de DK 165326 B fra pattedyrene udtagne antistofproducerende celler med myeloma-celler, kloner de dannede hybridoma-celler og selekterer de cellekloner, som producerer de ønskede mono-klonale antistoffer med høj affinitet til humanrenin, 5 idet man undersøger cellesupernatanterne med hensyn til binding af monoklonale antistoffer på overfladefikseret humanrenin, binding til opløst humanrenin og hæmning af humanrenins enzymaktivitet.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet 10 ved, at man med mellemrum på 1-6 uger immuniserer Balb/c- mus med 3-6 injektioner parenteralt med hver 1-20 jag renset humanrenin, 2-6 dage efter den sidste ("booster") immunisering af dyrene udtager miltceller og fusionerer disse med myeloma-celler af en egnet cellelinie i nærvær 15 af en fusionspromotor.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at man fusionerer monoklonale antistofproducerende celler af Balb/c-mus med myeloma-celler af cellelinierne X63-Ag8.653 eller Sp2/0-Agl4.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at man fusionerer myeloma-celler med et 3-20 ganges overskud af miltceller fra immuniserede dyr i en opløsning indeholdende 30-50% polyethylenglycol med en molvægt mellem 1000 og 4000.

17. Anvendelse af de monoklonale antistoffer og/elier deres derivater ifølge et af kravene 1-8 til kvalitativ og kvantitativ bestemmelse af humanrenin og strukturelt lignende renin in vitro.

18. ‘Anvendelse af de monoklonale antistoffer og deri-30 vater ved en radioimmunanalyse ifølge krav 17..

19. Anvendelse af de monoklonale antistoffer og derivater i en enzymimmunanalyse ifølge krav 17. DK 165326 B

20. Testsæt til bestemmelse af humanrenin og strukturelt lignende renin, kendetegnet ved, at det indeholder monoklonale antistoffer og/eller derivater deraf ifølge et af kravene 1-8 og eventuelt hjælpemidler.

21. Testsæt ifølge krav 2.0 til en radioiramunanalyse.

22. Testsæt ifølge krav 20 til en enzymimmunanalyse. s