FI87933C - Foerfarande foer framstaellning av monoklonal humanreninantikropp r 3-36-16 och hybridomacell som producerar densamma - Google Patents

Description

87 9 33

Menetelmä monoklonaalisen ihmisreniinivasta-aineen R 3-36-16 ja sitä tuottavan hybridoomasoluIinjän valmistamiseksi -Förfarande för framställning av monoklonal humanreninanti-kropp R 3-36-16 och hybridomacell som producerar densamma

Keksinnön kohteena on menetelmä uusien monoklonaalisten vasta-aineiden, joilla on voimakas affiniteetti ihmisrenii-niin, ja niiden johdannaisten valmistamiseksi, sekä näitä vasta-aineita tuottavien hybridooma-solulinjojen valmistamiseksi. Näitä monoklonaalisia vasta-aineita ja niiden johdannaisia voidaan käyttää ihmisreniinin ja rakenteellisesti samankaltaisen reniinin kvalitatiiviseksi ja kvantitatiiviseksi määrittämiseksi, ihmisreniinin ja rakenteellisesti samankaltaisen reniinin puhdistamiseksi, sekä sellaisenaan tai farmaseuttisina valmisteina korkean verenpaineen ja sydämen vajaatoiminnan hoitamiseksi.

Reniini on proteolyyttinen entsyymi, joka vapauttamalla angiotensiinejä vaikuttaa osaltaan verenpaineen säätelyyn. Ihmisreniini on glykosyloitu proteiini, jonka molekyylipaino on n. 40 000. Ihmisreniinin jotkut rakenteelliset ominaisuu- det ovat tunnettuja. Esimerkiksi polypeptidin aminohappojär-jestys on selvitetty määrittämällä reniiniä koodittava komplementaarinen deoksiribonukleiinihappo (cDNA). Reniini vapautuu munuaisissa inaktiivisesta muodosta, proreniinistä ja joutuu sitten verenkiertoon, jossa sitä esiintyy 20-100 pg/ml konsentraatioina. Siellä se aiheuttaa angiotensinogee-nin (reniini-substraatti) hajoamisen, jolloin muodostuu de-kapeptidi angiotensiini I, joka puolestaan lohkeaa nk. "angiotensiiniä muuttavan entsyymin" (angiotensin converting enzyme, ACE) vaikutuksesta keuhkoissa, munuaisissa ja muissa elimissä angiotensiini II:ksi, joka on oktapeptidi. Angio- pnn-?7 2 c' / >·:) ύ tensiini II kohottaa verenpainetta sekä suoraan valtimokons-triktion vuoksi että epäsuorasti natriumia pidättävän hormonin aldosteronin vapautuessa lisämunuaisista, mihin liittyy solun ulkopuolisen nestetilavuuden kasvu. Angiotensinaasit pilkkovat angiotensiini II:n angiotensiini III:ksi, joka on heptapeptidi ja jolla on samankaltaiset vaikutukset kuin angiotensiini II:lla, ja pienemmiksi, inaktiivisiksi osasiksi.

Tiettyjen kohonneen verenpaineen (verenpainetauti) ja sydämen vajaatoiminnan muotojen hoito on mahdollista vaikuttamalla reniini-angiotensiini-järjestelmään. Tällöin voidaan saavuttaa verenpaineen lasku (a) estämällä angiotensiini II:n (tai III:n) vaikutus reseptoreihinsa, (b) angioten-siiniä muuttavan entsyymin estolla tai (c) estämällä renii-nin vaikutus angiotensinogeeniin. Reniinin estäjiä ovat esimerkiksi pepstatiini ja pepstatiinianalogit, angiotensino-geenianalogit ja reniini-vasta-aineet. Tällaiset reniini-estäjät vähentävät angiotensiini I:n vapautumista angioten-sinogeenistä ja pienentävät siten myös aktiivisen peptidi-hormonin, angiotensiini II:n konsentraatiota. Päinvastoin kuin tunnetuilla reniini-estäjillä, on keksinnön mukaisilla reniini-vasta-aineilla se etu, että ne estävät reniinin vaikutuksen jo äärimmäisen pieninä konsentraatioina ja täysin spesifisesti.

Vasta-aineiden käyttö diagnoosissa ja terapiassa on viime aikoihin saakka ollut käyttöalojensa suhteen voimakkaasti rajoittunut. Vasta-aineita saatiin pieniä määriä eläinseeru-meista komplekseina erilaisten proteiinien seoksina. Vasta-aineiden standardointi ei ollut mahdollista, koska kustakin immunisoidusta eläinyksilöstä ja myös yksittäisestä yksilöstä toistetulla immunisaatiolla saadaan kulloinkin erilaisen vasta-ainekoostumuksen omaavaa seerumia. Käyttämällä Köhle-rin ja Milateinin [1] kehittämää uutta tekniikkaa on nyt tullut mahdolliseksi saada vasta-aineita homogeenisessa muo- 3 37933 dossa, so. niinkutsuttuja monoklonaalisia vasta-aineita, jotka voivat lisääntyä teoreettisesti rajoittamattomina määrinä soluviljelmissä. Sopivien myeloomasolujen fuusiolla vasta-aineita tuottavien, antigeenillä immunisoidusta luovuttajasta saatujen lymfosyyttien kanssa muodostuu hybridomaso-luja, jotka kykenevät rajoittamattomaan solunjakautumiseen ja rajoittamattomaan kasvuun iji vitro, tuottaen samalla homogeenista vasta-ainetta. Siten on mahdollista tehdä organismin immuunivaste riippumattomaksi tietystä antigeenistä ja valmistaa monoklohaalisia vasta-aineita hybridisolujen jatkuvalla kasvatuksella.

Vaikka tähän mennessä on esitetty useita esimerkkejä spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamisesta hybridomatekniikalla ja yleiset toimenpiteet on periaatteessa kuvattu, esiintyy kuitenkin jokaisessa uudessa esimerkissä spesifisiä ongelmia, jotka vaativat tekniikan soveltamista kuhunkin tapaukseen. Ilman tällaista soveltamista ei ole mitään varmuutta siitä, että on muodostunut kulloinkin haluttuja hybridomasoluja, että ne ovat geneettisesti stabiileja, että ne valmistavat haluttuja monoklonaalisia vasta-aineita ja että tällöin valmistetuilla vasta-aineilla on haluttu spesifisyys. Tuloksen laatuun vaikuttaa periaatteessa lymfosyyttien luovuttajan immunisointiin käytettyjen antigeenien laatu ja puhtaus, immunisointimenetelmät, solufuusiotekniik-ka, sopivien hybridomasolulinjojen valinnassa suoritetut toimenpiteet ja tapa, millä monoklonaaliset vasta-aineet eristetään ja puhdistetaan.

Ihmisreniiniä sitovat monoklonaaliset vasta-aineet ovat tunnettuja. Simon et ai. [2] esittävät monoklonaalisen vasta-aineen, jolla on alhainen affiniteetti ihmisreniiniin. Dzau et ai. [3] kuvaavat monoklonaalisia vasta-aineita, jotka sitovat ihmisreniiniä ja estävät samanaikaisesti sen entsymaattista funktiota. Ihmisreniinin määrittämiseksi veressä 4 8797)3 käytetään periaatteessa kahta erilaista menetelmää [4]. Toisaalta mitataan ihmisreniinin entsymaattinen aktiivisuus plasmassa määrittämällä angiotensinogeenistä vapautuneen an-giotensiini I:n määrä. Reniinin kokonaismäärä saadaan sitten määrittämällä entsymaattinen aktiivisuus inaktiivisen plasma-reniinin aktivoinnin jälkeen, joka tapahtuu esimerkiksi käsittelemällä hapolla pH:ssa 3-4. Tällä epäsuoralla menetelmällä on mahdollista mitata reniini pieninäkin kon-sentraatioina, mutta siinä on kuitenkin suuria epävarmuustekijöitä. Toisaalta ihmisreniiniä määritetään immunomääri-tysmenetelmillä tunnetun monoklonaalisen vasta-aineen tai seerumista saatavien polyklonaalisten vasta-aineiden avulla. Näillä suorilla menetelmillä ei kuitenkaan tähän saakka ole ollut riittävää herkkyyttä plasman ihmisreniinin äärimmäisen alhaisten konsentraatioiden määrittämiseksi luotettavasti.

Sen vuoksi tarvitaan sellaisia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka sitovat ihmisreniiniä oleellisesti voimakkaammin kuin tunnetut vasta-aineet, jolloin nämä voidaan yhdistää immunomääritysmenetelmiin reniinin määrittämiseksi tarkasti ihmisen veriplasmassa. Edelleen tarvitaan sellaisia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka estävät reniinientsyymin vaikutuksen niin tehokkaasti, että niitä voidaan käyttää kohonneen verenpaineen hoidossa. Tämä keksintö tyydyttää nämä tarpeet, esittämällä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka sitovat ihmisreniiniä voimakkaasti ja estävät samanaikaisesti niiden entsymaattisen funktion tehokkaasti.

Keksinnön kohteena ovat ihmisreniinin ja rakenteellisesti samankaltaisen reniinin monoklonaaliset vasta-aineet sekä niiden johdannaiset, joille on tunnusomaista voimakas affiniteetti ihmisreniiniin.

Ihmisreniinin monoklonaaliset vasta-aineet voidaan karakterisoida pintaan sitoutuneen tai liuenneen ihmisreniinin si-toutumisvakioilla, ihmisreniinin entsyymiaktiivisuuden esto- 5 37933 konsentraatiolla, ristikkäisreaktiivisuudella sukulaisanti-geeneihin, esimerkiksi muiden lajien reniiniin, immunoglobu-liiniluokilla tai alaluokilla sekä polypeptidiketjujen N-terminaalisella aminohappojärjestyksellä.

Keksinnön kohteena ovat erityiset monoklonaaliset vasta-aineet ja niiden johdannaiset, jotka konsentraatiossa 3 x 10“10 m (moolia/litra) tai vähemmän sitovat merkitsevästi pintaan sitoutunutta ihmisreniiniä, monoklonaaliset vasta-aineet ja niiden johdannaiset, jotka konsentraatiossa 3 x 10“10 M sitovat vähintään 50 % liuenneesta ihmisreniinistä, jota on lisätty rajoittava määrä, ja monoklonaaliset vasta-aineet ja niiden johdannaiset, jotka konsentraatiossa 2 x 10"® M estävät ihmisreniinin entsyymiaktiivisuutta vähintään 50 %. Edullisia ovat monoklonaaliset vasta-aineet ja niiden johdannaiset, jotka konsentraatiossa 2 x 10”® M estävät ihmisreniinin entsyymiaktiivisuutta vähintään 50 %. Aivan erityisen edullisia ovat monoklonaaliset vasta-aineet ja niiden johdannaiset, jotka konsentraatiossa 5 x 10~H M estävät ihmisreniinin entsyymiaktiivisuutta vähintään 50 %.

Esimerkki aivan erityisen edullisesta monoklonaalisesta vasta-aineesta on vasta-aine, jota merkitään R 3-36-16, jota tuottaa solulinja R 3-36-16. Monoklonaaliset vasta-aineet R

3-36-16 ovat gamma 1 kappa-immunoglobuliineja, joissa on kevyen polypeptidiketjun hypervariaabelilla alueella asemassa 28-38 N-terminaalisesta päästä aminohapot 28geriini_29vam_ ni, 31seriini-32tyrosiini-33giySiini-34iySiini ja 36fenyyH_ alaniini-37metioniini.

Keksinnön mukaiset monoklonaalisten vasta-aineiden johdannaiset ovat esimerkiksi osasia, kuten Fab-, Fab'- tai F(ab'>2-jaksoja, jotka säilyttävät spesifisyytensä ihmisreniinin antigeenisiin determinantteihin, radioaktiivisesti leimattuja monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on leimattu ?7 933 esimerkiksi radioaktiivisella jodilla (^25χ/ 131χ)# hiilellä (l^C), rikillä (35s), tritiumilla (½) tai vastaavilla, tai monoklonaalisia vasta-ainekonjugaatteja, joissa on entsyymejä kuten piparjuuriperoksidaasi, alkalinen fosfataasi, β-D-galaktosidaasi, glukoosioksidaasi, glukoamylaasi, karbo-anhydraasi, asetyylikoliiniesteraasi, lysotsyymi, malaatti-dehydrogenaasi tai glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi.

Edullisia johdannaisia ovat l25jodilla leimatut monoklonaaliset vasta-aineet ja monoklonaaliset vasta-ainekonjugaatit alkalisen fosfataasin kanssa.

Keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita ja niiden johdannaisia saadaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä, jolloin näitä monoklonaalisia vasta-aineita tuottavia hybrido-masoluja (a) viljellään in vitro ja eristetään kasvuliuoksesta monoklonaaliset vasta-aineet tai (b) kasvatetaan iri vivo sopivassa nisäkkäässä ja eristetään monoklonaaliset vasta-aineet tämän nisäkkään ruumiinnesteistä ja haluttaessa (c) muunnetaan saatu monoklonaalinen vasta-aine johdannai-sekseen.

Menetelmän a) mukaisen in vitro-kasvatukseen sopivia kasvualustoja ovat tavalliset vakiokasvualustat, esimerkiksi Dul-beccon muunnettu Eagle-alusta tai RPMI 1640-alusta, johon on lisätty naudan sikiöseerumia. Monoklonaalisten vasta-aineiden eristämiseksi seostetaan proteiinit kasvuliuoksesta ammoniumsulfaatilla tai vastaavilla ja puhdistetaan tavanomaisilla kromatografisilla menetelmillä, esimerkiksi geelisuo-datuksella, ioninvaihtokromatografiällä, DEAE-selluloosa-kromatografiällä tai immunoaffiniteettikromatografiällä.

Suuria määriä haluttuja monoklonaalisia vasta-aineita voi- 7 07933 daan saada kasvattamalla hybridomasoluja in vivo menetelmän b) mukaisesti. Sitä varten injektoidaan solukloonit synge-neettisiin nisäkkäisiin ja 1-3 viikon kuluttua eristetään vasta-aineet näiden nisäkkäiden elimistön nesteistä. Esimerkiksi Balb/c-hiiristä peräisin olevat hybridomasolut injektoidaan intraperitoneaalisesti mahdollisesti jollain hiilivedyllä kuten Pristanilla (2,6,10,14-tetrametyylipentadekaa-ni) esikäsiteltyihin Balb/c-hiiriin ja 8-10 päivän kuluttua otetaan näiden eläinten ascites-neste talteen. Halutut monoklonaaliset vasta-aineet eristetään elimistön nesteistä sinänsä tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi saostamalla ammoniumsulfaatilla tai vastaavilla, ja kromatografisella puhdistuksella, esim. DEAE-selluloosalla, ioninvaihtohart-silla, geelisuodatuksella tai immunoaffiniteettikromatogra-fiällä.

Keksinnön mukaisia monoklonaalisten vasta-aineiden osasia, esim. Fab-, Fab'- tai F(ab'>2“jaksoja, jotka säilyttävät spesifisyytensä ihmisreniinin antigeenisiin determinantteihin, valmistetaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi käsittelemällä menetelmillä a) ja b) valmistettuja monoklonaalisia vasta-aineita entsyymeillä kuten pepsiinillä tai papaiinilla ja/tai lohkaisemalla disulfidisidoksia kemiallisella pelkistyksellä.

Jodilla <125i, 131χ) radioaktiivisesti leimattuja monoklonaalisia vasta-aineita saadaan keksinnön mukaisista monoklo-naalisista vasta-aineista sinänsä tunnetulla jodauksella, esimerkiksi radioaktiivisen natrium- tai kaliumjodidin ja kemiallisen hapetusaineen kuten natriumhypokloriitin, kloramiini T:n tai vastaavien tai entsymaattisen hapetusaineen kuten laktoperoksidaasin, glukoosioksidaasin ja glukoosin avulla. Keksinnön mukaisia radioaktiivisesti leimattuja monoklonaalisia vasta-aineita valmistetaan myös siten, että sinänsä tunnetulla tavalla lisätään iii vitro-viljelmän kas- 8 87933 vualustaan radioaktiivisesti leimattuja ravintoaineita, jotka sisältävät radioaktiivista hiiltä (14C), tritiumia (3H), rikkiä (35S) tai vastaavia, esimerkiksi L-(14C)-leusiinia, L-(3H)-leusiinia tai L-(3^S)-metioniinia ja monoklonaaliset vasta-aineet otetaan talteen menetelmän a) mukaisesti.

Entsyymileimattuja keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita saadaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä siten, että menetelmien a) tai b) mukaisesti valmistetut monoklonaaliset vasta-aineet ja haluttu entsyymi saatetaan reagoimaan kytkentäreagenssin, esimerkiksi glutaraldehydin, perjo-daatin, Ν,Ν'-ο-fenyleenidimaleimidin, N-(m-maleimidobentso-yylioksi)-sukkinimidin, N-[3-(2'-pyridyylitio)-propionyyli-oksi]-sukkinimidin tai vastaavien kanssa.

Keksinnön kohteena ovat edelleen hybridoma-solulinjät, joille on tunnusomaista, että ne tuottavat monoklonaalisia vasta-aineita, joilla on voimakas affiniteetti ihmisreniiniin. Erityisesti keksinnön kohteena ovat solulinjat, jotka tuottavat monoklonaalisia vasta-aineita, jotka konsentraatiossa 3 x 10“10 m (moolia/litra) sitovat vähintään 50 % ihmisre-niinistä, jota on lisätty rajoittava määrä ja/tai jotka konsentraatiossa 2 x 10-8 M estävät ihmisreniinin entsyymiak-. . tiivisuutta vähintään 50 %. Edullisia ovat solulinjat, jotka tuottavat monoklonaalisia vasta-aineita, jotka konsentraatiossa 3 x 10“10 M sitovat vähintään 50 % ihmisreniinistä ja/tai jotka konsentraatiossa 2 x 10“9 M estävät ihmisreniinin entsyymiaktiivisuutta vähintään 50 %. Aivan erityisen edullisia ovat solulinjat, jotka tuottavat monoklonaalisia vasta-aineita, jotka konsentraatiossa 5 x ΙΟ"*11 M estävät ihmisreniinin entsyymiaktiivisuutta vähintään 50 %.

Esimerkki aivan erityisen edullisesta hybridoma-solulinjas-ta, joka tuottaa monoklonaalisia vasta-aineita, joilla on voimakas affiniteetti, on solulinja, jota merkitään R 3-36- 9 87933

16, joka on 7.11.1983 talletettu Pariisin Pasteur-instituu-tin "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes"-talletuslaitokseen numerolla 1-253. Hybridoma-solulinja R

3-36-16 on hiiri-myelooma-solulinjän Sp2/0-Agl4 ja Balb/c-hiiren pernan B-lymfosyytin hybridi. R 3-36-16 on stabiili solulinja, joka erittää monoklonaalisia vasta-aineita, joilla on muuttumaton spesifisyys ja jotka voidaan aktivoida pakastetuista viljelmistä sulattamalla ja uudel-leenkloonaamalla.

Keksinnön kohteena on edelleen menetelmä sellaisten hybrido-masolujen valmistamiseksi, jotka tuottavat monoklonaalisia vasta-aineita, joilla on voimakas affiniteetti ihmisrenii-niin, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että sopivia nisäkkäitä immunisoidaan puhdistetulla ihmisreniinillä, nisäkkäästä talteenotetut vasta-aineita tuottavat solut fuusioidaan myeloomasolujen kanssa, kloonataan saadut hybrido-masolut ja valitaan ne solukloonit, jotka tuottavat haluttuja monoklonaalisia vasta-aineita, joilla on voimakas affiniteetti ihmisreniiniin.

Edullisesti immunisoidaan hyvin puhtaalla ihmisreniinillä. Tällaista ihmisreniiniä voidaan saada esimerkiksi sinänsä . tunnetulla tavalla ihmisen munuaisuutteesta immuno- affiniteettikromatografiän avulla.

Edullisia nisäkkäitä immunisointia varten ovat hiiret, erityisesti Balb/c-hiiret, voidaan kuitenkin myös käyttää muita hiirikantoja. Immunisointi suoritetaan sinänsä tunnetulla tavalla, esimerkiksi siten, että annetaan kolme-kuusi injektiota parenteraalisesti, esim. intraperitoneaalisesti, int-rnvonftftsist i jn/tnl Huhkutaanlsestl kulloinkin 1 i cj - 20 |ig puhdistettua ihmisreniiniä 1-6 viikon välein, edullisesti yhdessä lymfosyyttituotannon alullepanevan apuaineen kanssa, esimerkiksi täydellisen tai epätäydellisen Freundin apuaineen kanssa.

10 87 933

Immunisoitujen eläinten vasta-aineita tuottavat solut, edullisesti pernasolut, otetaan talteen 2-6 päivää eläinten viimeisen ("booster”) immunisoinnin jälkeen ja fuusioidaan sopivan solulinjan myeloomasolujen kanssa fuusiopromoottorin läsnäollessa. Useita erilaisia myelooma-solulinjoja ja niistä johdettuja solulinjoja tunnetaan sopivina fuusioin-tipartnereina. Edullisia ovat myeloomasolut, joilta puuttuu hypoksantiini-guaniini-fosforibosyylitransferaasi-entsyymi (HGPRT) tai tymidiinikinaasi-entsyymi (TK), ja jotka sen vuoksi eivät elä selektiivisessä kasvualustassa, joka sisältää hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tymidiiniä (HAT-alusta). Erityisen edullisia ovat myeloomasolut ja niistä valmistetut solulinjat, jotka eivät elä HAT-alustassa eivätkä eritä immunoglobuliineja tai niiden osia, esimerkiksi solulinjat X63-Ag8.653 ja Sp2/0-Agl4. Fuusiointipromoot-toreina tulevat kysymykseen Sendai-virus tai muut paramykso-virukset, mahdollisesti UV-inaktivoidussa muodossa, kalsium-ionit, pinta-aktiiviset lipidit kuten lysolesitiini, tai polyeteeniglykoli. Myeloomasolut fuusioidaan edullisesti 3-20-kertaisen ylimäärän kanssa pernasoluja, jotka on saatu immunisoiduista eläimistä, liuoksessa, joka sisältää 30-50 % polyeteeniglykolia, jonka molekyylipaino on 1000-4000.

Fuusion jälkeen solut eritellään ja kasvatetaan selektiivisessä HAT-kasvualustassa, jolloin vain hybridomasolut jäävät eloon, koska ne ovat myeloomasoluilta saaneet kyvyn kasvaa in vitro ja immunisoitujen eläinten vasta-aineita tuottavilta soluilta puuttuvat HGPRT- tai TK-geenit ja siten kyvyn pysyä elossa HAT-kasvualustassa.

Sopivia viljelyalustoja hybridomasolujen lisäämiselle ovat tavanomaiset vakio-viljelyalustat, esimerkiksi Dulbeccon muunnettu Eagle-alusta tai RPMI 1640-alusta, johon on lisätty 10-15 % naudan sikiöseerumia. Edullisesti lisätään solu-kasvun aloittamiseksi niinsanottuja syöttösoluja (Feeder- 11 8 7 9 33 zellen), esimerkiksi normaaleja hiiren vatsakalvon tulehdussoluja, pernasoluja, luuydin-makrofaageja tai vastaavia. Mainittuun viljelyalustaan lisätään säännöllisin väliajoin selektiivistä HAT-alustaa, jotta estettäisiin tavallisten myeloomasolujen ylikasvu verrattuna verrattuna hybridomaso-luihin.

Hybridomasolujen soluviljelyliuoksista tutkitaan, sisältävätkö ne haluttuja monoklonaalisia vasta-aineita. On edullista, ettei soluliuoksia tutkita vain immunomääritysmene-telmillä, jotka osoittavat monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutumisen pintaan kiinnittyneeseen ihmisreniiniin, vaan että samanaikaisesti määritetään myös sitoutuminen liuenneeseen ihmisreniiniin ja ihmisreniinin aktiivisuuden esto. Yllättävästi nimittäin todettiin, että monoklonaaliset vasta-aineet, jotka sitovat hyvin pintaan kiinnittynyttä ihmisre-niiniä, estävät vain vähän reniinin entsyymiaktiivisuutta. Yhdistelemällä erilaisia koemenetelmiä onnistutaan identifioimaan hybridomasolut, jotka erittävät monoklonaalisia vasta-aineita, joilla on sekä voimakas sitoutumisaffiniteet-ti että voimakas entsyymiä estävä vaikutus ihmisreniiniin. Tällaiset hybridomasolut kloonataan rajoittavalla laimennuksella sinänsä tunnetulla tavalla, niiden yhtenäisyyden varmistamiseksi.

Keksinnön kohteena on edelleen monoklonaalisten vasta-aineiden ja niiden johdannaisten, joilla on voimakas affiniteetti ihmisreniiniin, käyttö ihmisreniinin ja rakenteellisesti samankaltaisen reniinin kvalitatiiviseen ja kvantitatiiviseen määrittämiseen, erityisesti biologisissa nesteissä. Esimerkiksi keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita ja vasta-ainejohdannaisia voidaan käyttää missä tahansa sinänsä tunnetussa immunomääritysmenetelmässä, jossa käytetään hyödyksi sitovia vuorovaikutuksia antigeenin (ihmisreniini) ja monoklonaalisen vasta-aineen välillä.

12 87 933

Esimerkkejä tällaisista määritysmenetelmistä ovat radioimmu-noanalyysit (RIA), entsyymi-immunoanalyysit, immunofluore-senssikokeet, latex-agglutinaatio tai hemagglutinaatio. Keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan määrittää radioimmunoanalyysillä (RIA) sellaisenaan tai ra-dioaktiivisesti leimattuina johdannaisina joko yksinään tai yhdistelminä. Mitä tahansa tunnettua RIA-muunnosta voidaan käyttää, esimerkiksi RIA homogeenisessa faasissa, kiinteä-faasi- tai heterogeeninen RIA, yksinkertainen RIA tai kaksinkertainen (sandwich) RIA, jossa ihmisreniini määritetään suoraan tai epäsuorasti (kompetitiivisesti). Edullinen on yksinkertainen RIA, jossa sopiva kantaja, esimerkiksi tit-rauslevyn tai koeputken muovipinta, joka on esimerkiksi po-lystyreeniä, polypropeenia tai polyvinyylikloridia, lasi-tai muovihelmet, suodatinpaperi, dekstraani-, selluloosa-asetaatti- tai nitroselluloosalevyt tai vastaavat päällystetään yhtä epitooppia tai kahden erilaisen epitoopin seosta tunnistavalla monoklonaalisella vasta-aineella, yksinkertaisen adsorption avulla tai mahdollisesti aktivoimalla kantaja esimerkiksi glutaraldehydillä tai bromisyaanilla, inkuboi-daan koeliuoksen ja sellaisen liuoksen kanssa, jossa on tunnettu määrä l^ijiiä radioaktiivisesti leimattua ihmisrenii-niä, ja mainittuun kantajaan kiinnittynyt radioaktiivisuus määritetään.

Erityisen edullinen on "sandwich"-radioimmunoanalyysi, jossa yhdellä tai kahdella monoklonaalisella vasta-aineella päällystettyä kantajaa inkuboidaan koeliuoksen ja sellaisen liuoksen kanssa, jossa on 125Isllä radioaktiivisesti leimattua monoklonaalista vasta-ainetta, jolloin liuennut monoklonaa-linen vasta-aine tunnistaa ihmisreniinin eri epitooppia kuin kantajaan kiinnittynyt monoklonaalinen vasta-aine (vasta-aineet) ja reniinin määrä koeliuoksessa määritetään mittaamalla kantajaan sitoutunut radioaktiivisuus. Kuviossa 1 on esitetty mitatun, kantajaan sitoutuneen radioaktiivi- 13 87933 suuden suhde koeliuoksen sisältämään reniinimäärään, siten kuin se voidaan mitata esimerkissä 8.4 lähemmin kuvatulla "sandwich"-RIA:lla. Kokeen herkkyys tekee mahdolliseksi ih-misreniinin luotettavan, kvantitatiivisen määrityksen aina lähtien 1 pg:sta yli 100 pg:aan saakka 50 yl:sta koeliuosta alle neljässä tunnissa. Keksinnön mukaisten, voimakkaan re-niiniaffiniteetin omaavien monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö mahdollistaa siten ihmisreniinin kvantitatiivisen määrittämisen konsentraatioina, joina se normaalisti esiintyy biologisissa nesteissä ja erityisesti veressä, ja mahdollistaa siten nopean ja luotettavan diagnoosin reniinistä riippuvalle verenpaineen nousulle.

Entsyymi-immunoanalyysi voidaan suorittaa keksinnön mukaisista monoklonaalisista vasta-aineista sellaisenaan tai entsyymiin konjugoituneena johdannaisena yksin tai yhdistelmänä. Tällaisissa immunomääritysmenetelmissä on koejärjestely, jossa sekoitetaan keskenään entsyymileimattuja keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-ainejohdannaisia, sinänsä tunnettuja entsyymileimattuja vasta-aineita, jotka tunnistavat ja sitovat keksinnön mukaisten tai muiden anti-ihmisreniini-vasta-aineiden epitooppeja, tai entsyymileimattua ihraisre-niiniä.

Edullinen on ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), jossa kantaja, kuten yllä on selitetty yksinkertaisen RIA-kokeen yhteydessä, päällystetään yhdellä tai kahdella keksinnön mukaisella monoklonaalisella vasta-aineella, inkuboi-daan ihmisreniiniä sisältävän koeliuoksen ja sitten ihmisreniinin vastaisen polyklonaalisen seerumin, esimerkiksi ihmisreniinin vastaisen kaniiniseerumin kanssa, lopuksi polyklonaalisen seerumin sitoutuneet vasta-aineet kehitetään entsyymileimatulla vasta-aineella, joka tunnistaa ja sitoo näitä, ja sitoutuneen ihmisreniinin määrä määritetään ent-syymi-substraattireaktion avulla. Tällainen entsyymileimattu 14 37 933 vasta-aine on esimerkiksi fosfataasileimattu vuohi-anti-kaniini-immunoglobuliini.

Aivan erityisen edullinen on ELISA, jossa yhdellä tai kahdella keksinnön mukaisella vasta-aineella päällystettyä kantajaa inkuboidaan ihmisreniiniä sisältävän koeliuoksen ja entsyymin kanssa konjugoidun keksinnön mukaisen monoklonaa-lisen vasta-aineen liuoksen kanssa, jolloin liuennut mono-klonaalinen vasta-aine tunnistaa toisen ihmisreniinin epi-toopin kuin kantajaan sitoutunut monoklonaalinen vasta-aine (vasta-aineet). Entsyymi-substraattireaktiolla, joka johtaa esimerkiksi värinmuutokseen, jota voidaan seurata silmin tai optisilla mittalaitteilla, voidaan määrittää sitoutuneen entsyymin määrä, joka on verrannollinen ihmisreniinin määrään koeliuoksessa.

Kuviossa 2 on esitetty mitattu absorbanssi vapautuneen värillisen entsyymisubstraatin maksimiekstinktiolla suhteessa koeliuoksen sisältämän ihmisreniinin määrään, siten kuin se voidaan mitata esimerkissä 9.3 lähemmin kuvatulla ELISA:lla. ELISA:n herkkyys mahdollistaa luotettavan, kvantitatiivisen määrityksen alle yhdestä pgssta aina 100 pg:n ihmisreniini-määrille 50 ylistä koeliuosta alle viidessä tunnissa. Verrattuna yllä kuvattuun edulliseen "sandwich"-RIA:aan, on ELISA:11a samalla tai hieman suuremmalla herkkyydellä se etu, että ei tarvita monimutkaisia mittalaitteita, kuten radioaktiivisuuden mittaukseen, eikä tarvita niin suuria turvallisuusjärjestelyltä kuin radioaktiivisia aineita käytettäessä.

Edullisia entsyymejä keksinnön mukaisissa entsyymi-immuno-määrityksissä ovat piparjuuriperoksidaasi, joka voidaan kehittää esimerkiksi entsyymisubstraattien 5-aminosalisyyli-happo, o-fenyleenidiamiini, 3,3'-dimetoksibentsidiini, 2,2'-atsino-bis-(3-etyylibentstiatsoliini-6-sulfonihappo) is 37933 tai vastaavien kanssa, ja erityisesti alkalinen fosfataasi, joka esim. vapauttaa entsyymisubstraattina käytetystä p-nitro-fenyylifosfaatista p-nitrofenolia.

Monoklonaalisten vasta-aineiden, joilla on voimakas affiniteetti ihmisreniiniin, keksinnönmukainen käyttö ihmisrenii-nin kvalitatiiviseen ja kvantitatiivisen määritykseen käsittää myös muita sinänsä tunnettuja immunomääritysmene-telmiä, esimerkiksi immunofluoresenssikokeita, joissa käytetään vasta-aine- tai antigeenikonjugaatteja fluoresoivien aineiden kanssa, latex-agglutinaatiota vasta-aineella tai antigeenillä päällystetyillä latex-partikkeleilla tai hem-agglutinaatiota vasta-aineella tai antigeenillä päällystetyillä punaisilla verisoluilla, tai vastaavia.

Kuvattuja immunomääritysmenetelmiä voidaan käyttää biologisissa nesteissä, erityisesti ihmisen veressä esiintyvän ih-misreniinin määrittämiseksi ja siten reniinistä riippuvan korkean verenpaineen diagnosoimiseksi. Tällöin ei mitata ainoastaan sitä ihmisreniiniä, joka muuttaa aktiivisen entsyymin angiotensinogeenin (reniini-substraatti) angiotensiini I:ksi, vaan myös kaikki muut ihmisreniinin muodot, joilla on samoja, vasta-aineiden tunnistamia antigeenisiä determinantteja. Erityisesti määritetään kuvatuilla immuno-määritysmenetelmillä ihmisreniinin kokonaismäärä, joka koostuu aktiivisesta entsyymistä ja inaktiivisesta ihmisrenii-nistä tai vastaavasti ihmis-proreniinistä. Immun©määritysmenetelmät ovat käyttökelpoisia myös määritettäessä kädellisten reniiniä, erityisesti marmosetin (eräs silkkiapina, Cal-litrix jacchus) reniiniä, tai muita eläinten reniineitä, joilla on identtiset antigeeniset determinantit.

Keksinnön kohteena ovat myös testipakkaukset ihmisreniinin ja rakenteellisesti samankaltaisen reniinin määrittämiseksi, jotka sisältävät monoklonaalisia vasta-aineita, joilla on voimakas affiniteetti ihmisreniiniin ja/tai niiden johdan naisia ja mahdollisesti apuaineita.

ie 87933

Keksinnön mukaiset testipakkaukset radioimmunomääritystä varten sisältävät esimerkiksi sopivan kantajan, mahdollisesti yhden tai useamman keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen kylmäkuivatun tai konsentroidun liuoksen, ra-dioaktiivisesti leimatun keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen tai radioaktiivisesti leimatun ihmisreniinin liuoksen, ihmisreniinin standardiliuokset, puskuriliuokset ja mahdollisesti detergenttejä ei-spesifisen adsorption ja aggregaattien muodostumisen estämiseksi, pipetit, reaktioas-tiat, kalibrointikäyrät, yms.

Keksinnön mukaiset testipakkaukset entsyymi-immunomääritystä varten sisältävät esimerkiksi sopivan kantajan, mahdollisesti yhden tai useamman keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen kylmäkuivatun tai konsentroidun liuoksen, mahdollisesti entsyymileimatun keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen, entsyymileimatun ihmisreniinin, polyklo-naalisen anti-ihmisreniiniseerumin ja/tai entsyymileimatun monoklonaalisen tai polyklonaalisen vasta-aineen kylmäkuivatun tai konsentroidun liuoksen, jotka tunnistavat ja sitovat keksinnön mukaisia tai muita anti-ihmisreniini-vasta-ainei-ta, entsyymisubstraatteja kiinteässä tai liuenneessa muodossa, ihmisreniinin standardiliuokset, puskuriliuokset, detergenttejä, pipetit, reaktioastiat, kalibrointikäyrät, värias-teikkotaulukot yms.

Keksinnön kohteena on edelleen monoklonaalisten vasta-aineiden ja niiden johdannaisten, joilla on voimakas affiniteetti ihmisreniiniin, käyttö ihmisreniinin ja rakenteellisesti samankaltaisen reniinin puhdistamiseksi. Ihmisreniini ja rakenteellisesti samankaltainen reniini voidaan puhdistaa esimerkiksi sinänsä tunnetuilla erotusmenetelmillä, joiden 17 87933 erotusvaikutus perustuu sitoviin vuorovaikutuksiin monoklo-naalisten vasta-aineiden ja reniinin antigeenisten determinanttien välillä. Eräs edullinen erotusmenetelmä on immuno-affiniteettikromatografia. Sopiva, epäorgaanis- tai orgaa-nisperustainen kantaja, esimerkiksi verkkoutettu agaroosi, dekstraani tai polyakryyliamidi sopivassa funktionalisoidus-sa muodossa, päällystetään sinänsä tunnetulla tavalla, mahdollisesti etukäteen suoritetulla aktivoinnilla, keksinnön mukaisilla monoklonaalisilla vasta-aineilla tai vasta-aine-johdannaisilla. Sitä varten kantaja-ainetta sisältävät aktivoidut esterifunktiot esimerkiksi suspendoidaan vesipitoiseen puskuriliuokseen, sekoitetaan monoklonaalisen vasta-aineen liuokseen, sitten pestään pois sitoutumattomat monoklonaaliset vasta-aineet ja kantaja-aineen sitoumattomat reaktiiviset kohdat sidotaan.

Keksinnön kohteena ovat myös farmaseuttiset preparaatit, jotka sisältävät monoklonaalista vasta-ainetta tai sen johdannaista, jolla on voimakas affiniteetti ihmisreniiniin, ja mahdollisesti farmaseuttisia apuaineita. Sopivia johdannaisia ovat monoklonaalisten vasta-aineiden osaset, esim. Pab-, Fab'- tai F(ab'>2-jaksot, jotka ovat säilyttäneet spesifisyytensä ihmisreniinin antigeenisiin determinantteihin. Farmaseuttiset valmisteet sisältävät esimerkiksi tehokkaan määrän monoklonaalisia vasta-aineita tai niiden osasia yhdessä tai seoksena epäorgaanisten tai orgaanisten, kiinteiden tai juoksevien farmaseuttisesti käyttökelpoisten kantoaineiden kanssa.

Edullisia ovat farmaseuttiset preparaatit parenteraaliseen, esimerkiksi lihaksensisäiseen tai erityisesti laskimonsisäi-seen käyttöön. Tällaiset valmisteet ovat isotonisia vesipitoisia liuoksia tai suspensioita, jotka haluttaessa valmistetaan vasta vähän ennen käyttöä lyofilisoiduista preparaateista tai konsentroiduista liuoksista. Farmaseuttiset pre- 18 8 7933 paraatit voivat olla steriloituja ja/tai ne voivat sisältää apuaineita, esim. säilöntä-, stabilointi-, kostutus- ja/tai emulgointiaineita, liukoisuutta parantavia aineita, suoloja osmoottisen paineen säätämiseksi ja/tai puskuria ja ne voidaan valmistaa sinänsä tunnetuilla menetelmillä, esim. tavanomaisilla liuotus- tai lyofilisointimenetelmillä. Mainitut liuokset tai suspensiot, voivat sisältää viskositeettia lisääviä aineita, kuten natriumkarboksimetyyliselluloosaa, dekstraania, polyvinyylipyrrolidonia tai liivatetta.

Injektiopreparaattien valmistus tapahtuu tavanomaisella tavalla antimikrobisissa olosuhteissa, samoin täyttö ampulleihin tai pikkupulloihin sekä myös astioiden sulkeminen.

Keksinnön kohteena on edelleen monoklonaalisten vasta-aineiden, joilla on voimakas affiniteetti ihmisreniiniin tai sen johdannaisiin, käyttö korkean verenpaineen ja sydämen vajaatoiminnan hoitoon.

Osoituksena keksinnön mukaisten monoklonaalisten vasta-aineiden verenpainetta alentavasta vaikutuksesta käytetään in vivo-koetta marmosetilla (eräs silkkiapina, Callitrix jacchus). Keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet estävät marmosetti-reniiniä suunnilleen samassa määrin kuin ihmisreniiniä, ne tunnistavat ja sitovat siis antigeenisiä determinantteja, jotka ovat samankaltaisia tai identtisiä marmosetti- ja ihmisreniinissä.

Tavallisessa koejärjestelyssä kumpaakin sukupuolta olevia normotensiivisiä marmosetteja (Callitrix jacchus), joiden ruumiinpaino on n. 300 g, pidetään normaalilla suolaruokava-liolla (NAFAG, Na+: 100 mmoolia/kg, K+: 250 mmoolia/kg), jota on täydennetty hedelmillä. Reniinin endogeeninen vapautuminen käynnistetään furosemidin (5 mg/kg) laskimoruiskeella. 45 minuutin kuluttua injektoidaan monoklonaaliset vasta- 19 87933 aineet katetrin avulla ulompaan häntälaskimoon ja niiden vaikutus verenpaineeseen ja sydämen lyöntinopeuteen mitataan reisivaltimossa olevan katetrin avulla. Kaksi tuntia mono-klonaalisten vasta-aineiden injektion jälkeen injektoidaan teprotidia (1 mg/kg i.v.), joka estää angiotensiiniä muuttavaa entsyymiä (ACE), ja sen vaikutusta verenpaineeseen seurataan. Kontrollikokeissa injektoidaan keksinnön mukaisten monoklonaalisten anti-ihmisreniini-vasta-aineiden sijasta fysiologista keittosuolaliuosta (1 ml/kg) tai ei-spesifistä monoklonaalista myelooma-vasta-ainetta MOPC 21 (0,1 mg/kg).

Näissä koeolosuhteissa saa monoklonaalisen vasta-aineen R

3-36-16 yksi injektio annoksena 0,01 mg/kg i.v. aikaan verenpaineen laskun 18+5 mm Hg (n = 4), joka kestää enintään kaksi tuntia ilman että sydämen lyöntinopeus muuttuu. 30 minuutin aikana plasman reniiniaktiivisuus estyy täysin. Tep-rotidin injektio vasta-aineen annon jälkeen ei aiheuta ylimääräistä verenpaineen laskua. Monoklonaalisen vasta-aineen R 3-36-16 suuremmilla annoksilla (0,1 mg/kg i.v.) on samanlainen verenpainetta alentava vaikutus ilman vaikutusta sydämen lyöntinopeuteen, pienemmillä annoksilla (0,001 mg/kg i.v.) ei ole lainkaan vaikutusta.

Seuraavat esimerkit kuvaavat yllä selitettyä keksintöä, ne eivät kuitenkaan rajoita sitä millään tavoin.

Esimerkeissä käytetyillä lyhenteillä on seuraavat merkitykset: BSA naudan seerumialbumiini ELISA entsyymimääritysmenetelmä (enzyme linked immunosorbent assay) HAT hypoksantiini/aminopteriini/tymidiini IC 50 konsentraatio, jossa saavutetaan 50 %:n esto 20 3 7 933 PBS fosfaattipuskuroitu fysiologinen keittosuolaliuos RIA radioimmunoanalyysi SDS natriumdodekyylisulfaatti

Tris Tris-(hydroksimetyyli)-aminometaani

Yksiköt: M moolia/litra GU Goldblatt-yksikkö cpm pulssia minuutissa (radioaktiivinen hajoaminen)

Esimerkki 1: Ihmisreniinin puhdistus

Ihmisreniini saadaan ihmisen munuaisista ja se puhdistetaan sinänsä tunnetulla tavalla immunoabsorptiotekniikan avulla.

1 kg mekaanisesti murskattuja munuaisia uutetaan vedellä ja hapotetaan rikkihapolla pH-arvoon 2,8. NaCl-konsentraatio säädetään arvoon 0,8 M ja reniini saostetaan ammoniumsulfaatilla (loppukonsentraatio 2,3 M). Sakka dialysoidaan 0,1 M fosfaattipuskuria vastaan (pH 7,4) ja siinä on 0,13 GU:ta reniiniä mg:aan proteiinia kohti. Reniinipitoisuus mitataan määrittämällä angiotensiini I, kun näyte on inkuboitu ylimäärän kanssa reniinivapaata plasmaa, joka toimii angioten-sinogeenilähteenä (NEN, New England Nuclear Angiotensin I Radioimmunoassay Kit), ja se ilmaistaan Goldblatt-yksiköinä (Glodblatt units, GU) verrattuna reniinistandardiin (MRL, kansainvälinen referenssistandardi 68/356 [5]). Proteiinikon-sentraatio määritetään värjäämällä Coomassie Blue:11a ja vertaamalla standardina käytettyyn naudan seerumialburniiniin (bovine serum albumin, BSA).

Dialysoitu munuaisuute pannaan immunoaffiniteettipylvääseen, joka sisältää 38 mg monoklonaalista anti-ihmisreniini-vasta- 2i 37933 ainetta F 15 (Clin-Midy, Montpellier) [6] sitoutuneena 6 ml:aan Affi-Gel® 10:tä (Biorad). Plasman sitoutumattomat komponentit pestään pois 0>1 M fosfaattipuskurilla ja sitoutunut reniini eluoidaan 0,1 M sitraatti-fosfaattipuskurilla (pH 4,5). Eluaatti konsentroidaan Amikon-PM-10®-membraanil-la, laimennetaan PBS:llä (phosphate buffered saline), pakastetaan ja säilytetään -80 °C:ssa. Tällä tavalla saadaan n.

70 % raa'assa munuaisuutteessa esiintyvästä reniinistä spesifisellä aktiivisuudella 400 GU/mg, mikä merkitsee 3000-kertaista rikastumista. Preparaatin puhtaus analysoitiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja korkeapaine-nestekromatografiällä ja se arvioitiin >80 %:ksi.

Esimerkki 2: Hybridomasolujen valmistus 2.1 Hiirten immunisointi ihmisreniinillä

Balb/c-hiiret immunisoidaan esimerkin 1 mukaisesti saadulla puhdistetulla ihmisreniinillä seuraavasti:

Hiirille 1 ja 2 annetaan 10 GU:ta, joka vastaa n. 10 g, reniiniä täytellisessä Freundin apuaineessa (CFA), jaettuna kahteen käpälään ja kahteen ihonalaiseen (s.c.) injektioon.

28. päivänä tämän jälkeen injektoidaan laskimonsisäisesti (i.v.) vielä 2 GU:ta reniiniä ja 46. päivänä 5 GU:ta reniiniä PBSissä. Perna otetaan 50. päivänä fuusiota varten.

Hiirille 3 ja 4 annetaan 20 GUrta reniiniä CFA:ssa, jaettuna samoin kuin hiirille 1 ja 2, 35. päivänä annetaan 2 GU:ta reniiniä epätäydellisessä Freund'in apuaineessa (IFA) s.c., 60. päivänä 2 GU:ta reniiniä PBS:ssä intraperitoneaalisesti (i.p.) ja 78. päivänä 5 GU:ta reniiniä PBSissä i.v. Siltä hiireltä, jolla on korkeampi seerumitiitteri in vitro-renii-niaktiivisuutta vastaan (hiiri 3) otetaan 82. päivänä perna fuusiota varten.

22 87933 2.2. Solufuusio

Kaikki fuusiokokeet suoritetaan käyttämällä Sp2/0-Agl4-solulinjaa [7] oleellisesti Köhlerin ja Milsteinin [1] esittämän menetelmän mukaisesti. 10® esimerkin 2.1 mukaisesti saatua pernasolua sekoitetaan 10^:n myeloomasolun kanssa, kun läsnä on 1 ml 50-%:sta polyeteeniglykolia (PEG 1500, Serva). Pesun jälkeen solut suspendoidaan uudelleen 48 ml saan "Standard Dulbecco minimum essential"-kasvualustaan (Gibco n:o 0422501). Lisätään 15 % naudan sikiöseerumia ja syöttösoluina 3 x 10® hiiren normaalia vatsakalvon tulehdussolua fuusiota kohti. Solut jaetaan 48 x 1 ml Costar-levyil-le. Viljelmiin lisättään ravinnoksi kaksi kertaa päivässä vakio-HAT-selektiivialustaa [1] 3-6 viikon ajan. Hybridiso-lujen kasvun jälkeen viljelyliuos tutkitaan reniinin sitoutumisen (esimerkki 4) ja reniiniaktiivisuuden (esimerkki 5) suhteen. Hybridomasolujen kloonaus tapahtuu sitten rajoittavalla laimennuksella mikrotitrauslevyillä. Kaikki solulinjat kloonataan vähintään kaksi kertaa peräkkäin.

Kymmenestä erilaisesta emäliuoksesta valitaan ja kasvatetaan kloonit. Hybridomasoluja ja niistä saatuja vasta-aineita hiirten 1, 2 ja vastaavasti 3 pernasolujen fuusiosta merkitään symboleilla Rl, R2 ja R3. Klooninumero ja mahdollisesti annettu alaklooninumero on liitetty tavuviivan jälkeen (taulukko 1).

Esimerkki 3; Monoklonaalisten vasta-aineiden eristys ja puhdistus 8-10 viikon ikäiset Balb/c-hiiret (eläinfarmi Sissein) esi-käsitellään i.p. 0,3 ml:lla Pristan'ia (Aldrich). 2-3 viikon kuluttua injektoidaan kulloinkin 2-5 x 10® kloonattua hybri-domasolua ja 0,2 ml Pristan'ia i.p. 8-10 päivää sen jälkeen hiiret punkteerataan toistamiseen, näin saadut ascites- 23 07933 nesteet sentrifugoidaan 800 g:ssä ja näin saatu kirkas su-pernatantti kerätään -20 °C:ssa.

Sulatettua ascites-nestettä sentrifugoidaan 60 minuuttia 50 000 g:ssä, pinnalle kertynyt rasva poistetaan ja konsentraa-tio säädetään n. 10-12 mg:aan proteiinia ml:aa kohti. Prote-iinikonsentraatio määritetään mittaamalla absorbanssi 280 nm:ssä (OD280*· Standardina toimii muriini-immunoglobuliinin l-%:inen (paino/tilav.) liuos, jonka OD28O = (kerrospaksuus 1 cm). Kun lisätään hitaasti tipoittain 0,9 tila-vuusekvivalenttia kyllästettyä ammoniumsulfaattiliuosta 0°: ssa sekoittaen, saostuu raaka immunoglobuliinifraktio, joka liuotetaan 20 mM Tris-HCl/50 mM NaClriin (pH 7,9) ja dialy-soidaan. Lopuksi laimennetaan kahdesti 20 mM Tris-HCl:llä (pH 7,9) ja pannaan DEAE-D52-selluloosapylvääseen (Whatman). Immunoglobuliini G-fraktio eluoidaan pylväästä 20 mM Tris-HC1/ 80 mM NaCl-puskurilla (pH 7,9) ja toistetun ammonium-sulfaattisaostuksen jälkeen (ks. edellä) säädetään proteii-nikonsentraatioon 10 mg/ml:aan PBS:llä. Monoklonaalisten vasta-ainepreparaattien puhtaus tutkitaan SDS-polyakryyli-amidigeelielektroforeesilla ja se on parempi kuin 95 %.

Esimerkki 4: Monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutuminen ihmisreniiniin 4.1 Entsyymi-immunoanalyysi (ELISA)

Reaktiivisuutta pintaan sitoutunutta reniiniä kohtaan käytetään eräässä sinänsä tunnetussa ELISA-menetelmässä [8] sekä soluhybridisoinnin jälkeen tapahtuvaan haluttujen monoklo-naalisia vasta-aineita tuottavien hybridomasolujen valintaan (esimerkki 2.2) että määrittämään reniinin kvantitatiivinen sitoutuminen puhdistettuihin monoklonaalisiin vasta-aineisiin. 100 ng puhdistettua reniiniä (esimerkki 1) 50 ui:ssa 0,05 M natriumbikarbonaattipuskuria (pH 9,6) inkuboidaan 2 24 0 7 933 tuntia 37 °C:ssa ja 15 tuntia 4 °C:ssa muovisilla mikrotit-rauslevyillä. Kun on pesty PBS:llä, sidotaan muovipinnoilla vielä esiintyvät proteiinireaktiiviset kohdat inkuboimalla 2 tuntia 37 °C:ssa 150 ui: n kanssa PBS-Tween®-puskuria (0,05 % Tween® 20 PBS:ssä, joka sisältää 0,2 % NaN3, pH 7,4) ja levy pestään PBS:11M. 100 ui liuosta, josta monoklonaaliset anti-reniini-vasta-aineet mitataan (soluviljelyliuokset tai puhdistetut monoklonaaliset vasta-aineliuokset) ja niiden vastaavia laimennoksia inkuboidaan 2 tuntia 37 °C:ssa ja levyn pesun jälkeen sitoutuneet monoklonaaliset hiiri-vasta-aineet kehitetään inkuboimalla 100 ui:n kanssa edeltämäärättyä laimennosta fosfataasileimatun kaniini-IgG-anti-hiiri-immuno-globuliinin preparaatista. Talteenotettu entsyymimäärä määritetään inkuboimalla (30 min. 37 °C) 100 yl:n kanssa ent-syymisubstraattina käytettyä p-nitrofenyylifosfaattia (1 mg/ml 10-%:sessa dietanoliamiinipuskurissa, joka sisältää 0. 5 mM MgCl2/ pH 9,8) ja mittaamalla reaktiotuotteen absor-banssi 405 nmrssä (OD405) Multiscan-fotometrillä (Flow Irvine, Schottland). Kontrollina monoklonaalista anti-reniini-vasta-ainetta sisältävien liuosten sijasta käytetään ei-spesifisen monoklonaalisen myelooma-vasta-aineen MOPC 21 (Bionetics Labs., Kensington, USA) ja monoklonaalisen, fos-foryylikoliinille spesifisen hybridoma-vasta-aineen preparaatteja.

Se puhdistetun monoklonaalisen vasta-aineen konsentraatio, joka tässä määrityksessä pintaan sitoutuneen ihmisreniinin kanssa lopuksi antaa OD4Q5-arvon 0,1, on esitetty taulukossa 1. Havaitut konsentraatiot ovat välillä 5,8 x 10-7 - 7,5 x 10”H M, jolloin 10-7 M suuremmilla konsentraatioi 11a ei esiinny lainkaan spesifistä sitoutumista, koska myös monoklonaaliset kontrollivasta-aineet antavat määrityksissä tätä suuruusluokkaa olevia arvoja. Erityisen tehokas sitoutuminen kiinnittyneeseen reniiniin (ELISA) havaittiin monoklonaali-silla vasta-aineilla R 3-17-7 ja R 3-17-8, mutta myös mono- n 7Q77 25 / 7 0 klonaaliset vasta-aineet R 3-48, R 3-21 ja R 3-27 sitovat alle 5 x 10-^^ M konsentraatioissa.

4.2 Radioimmunomääritys (RIA) 125I-leimatulla reniinillä

Reaktiivisuuden määrittämiseksi liukoista reniiniä kohtaan sekoitetaan eri laimennoksia monoklonaalisesta vasta-ainenäytteestä 50 yl:ssa RIA-puskuria (1 % BSArta PBS:ssä, 0,2 % NaN3, pH 7,4) 50 μ1:η kanssa l25i-ieimattua reniiniä (80000 cpm, joka vastaa 2,5 ng proteiinia, esimerkki 8.1) samassa puskurissa ja inkuboidaan polyvinyylikloridi-mikro-titrauslevyillä 2 tuntia 37 °C:ssa ja 15 tuntia 4 °C:ssa. Vasta-aineeseen sitoutuneen 125I-reniinin määrä saadaan mo-noklonaalisen vasta-aineen saostuessa immunokompleksina, kun 50 μΐ vastaavaa kaniini-anti-hiiri-immunoglobuliini-seerumin laimennosta sekoitetaan 3-%:seen polyetyleeni 6000:een ja inkuboidaan 30 min. 37 °C;ssa ja 30 min.

4 °C:ssa. Sakka pestään useita kertoja liettämällä ja sent-rifugoimalla ja radioaktiivisuus määritetään titrauslevyjen leikkaamisen jälkeen gammalaskijalla.

Se puhdistetun monoklonaalisen vasta-aineen konsentraatio, joka saostaa vielä 50 % l25i-reniinipitoisen liuoksen, maksimaalisesta saostuvasta radioaktiivisuudesta (IC 50), on liuenneen reniinin sitoutumisen mitta ja se on esitetty taulukossa 1. Erityisen voimakkaasti liuennutta reniiniä sitovat monoklonaaliset vasta-aineet R 3-36-16 ja R 3-47, vaikka ne ELISA:ssa (esimerkki 4.1) osoittavat vain vähäistä affiniteettia pintaan sitoutuneeseen reniiniin.

26 - 7 Q v ,

Esimerkki 5: Reniiniaktiivisuuden esto in vitro 5.1 Ihmisreniiniaktiivisuuden eston määrittäminen

Ihmisen normaaliin plasmaan, josta on poistettu reniini ja joka sisältää angiotensinogeenia, lisätään puhdistettua ihmisreniiniä (esimerkki 1), siten että reniiniä on 250 pg/ml. Kulloinkin 50 μΐ tätä esikäsiteltyä plasmaa inkuboi-daan analysoitavien monoklonaalisten vasta-ainenäytteiden eri laimennosten kanssa 50 pl:ssa 0,1 M tris-asetaatti-puskuria (pH 7,4) 2,3-dimerkapto-l-propanolin ja 8-hydroksi-kinoliinin läsnäollessa, jotka estävät angiotensiini I:n reaktion angiotensiini II:ksi, 2 tuntia 4 °C:ssa ja 1 tunti 37 °C:ssa. Entsymaattinen reaktio pysäytetään jäähdyttämällä 4 °C:seen. Muodostunut angiotensiinin määrä määritetään RIA:lla (NEN, New England Nuclear Angiotensin I Radioimmunoassay Kit). Tätä tarkoitusta varten näytteisiin lisätään 125x_ieimattua angiotensiini-I-leimausainetta ja vastaava määrä angiotensiini I:n vastaista antiseerumia, kun on inku-boitu 15 tuntia 4 °C:ssa, sitoutumaton angiotensiini I adsorboidaan aktiivihiileen ja vasta-aineeseen sitoutunut 125i_ieimattu angiotensiini I määritetään liuoksesta gamma-laskijalla. Tässä järjestelmässä antaa positiivikontrolli (näytteet ilman monoklonaalista vasta-ainetta) arvon 10 ng angiotensiini Istä millilitraa ja tuntia kohti.

Se puhdistetun monoklonaalisen vasta-aineen konsentraatio, jolla saavutetaan 50 % suurimmasta saavutettavasta ihmisreniiniaktiivisuuden estosta (IC 50), on esitetty taulukossa 1 ja se on välillä >10”® M - 1,3 x 10”H M. Monoklonaaliset vasta-aineet R 3-17-7 ja R 3-48 eivät estä reniiniaktiivi-suutta merkitsevästi, vaikka ne sitovat reniiniä voimakkaasti ELISA:ssa (esimerkki 4.1). Merkitsevästi, joskin heikosti estävät reniiniaktiivisuutta monoklonaaliset vasta-aineet R

1-19, R 1-20, R 3-17-8, R 2-12 ja R 3-21. Selvä reniiniak- 27 87933 tiivisuuden esto havaitaan monoklonaalisilla vasta-aineilla R 3-27, R 2-1 ja erityisesti R 3-47 ja R 3-36-16.

Monoklonaaliset vasta-aineet R 3-21 ja R 2-1 estävät renii-niä vain 60 %:iin saakka koko tutkitulla konsentraatioalu-eella (konsentraatioon 10“® M saakka), R 3-27:n maksimaalinen esto on vain 35 %. Nämä monoklonaaliset vasta-aineet tunnistavat ja sitovat antigeenisiä determinantteja (epitooppeja), jotka sijaitsevat hyvin todennäköisesti re-niinin aktiivisen keskuksen läheisyydessä. Sitoutumisellaan ne haittaavat entsyymiaktiivisuutta vaikuttamalla steerises-ti tai edistävät reniinimolekyylin allosteeristä konfiguraatiota, mikä sallii vielä vähäisemmän substraattivaihdon.

Vain heikosti estävät monoklonaaliset vasta-aineet R 1-19 ja R 1-20 sitävastoin saavat aikaan suurissa konsentraatioissa täydellisen reniinieston, samoin kuin voimakkaimman affiniteetin omaavat monoklonaaliset vasta-aineet, vasta-aineet R

3-47 ja R 3-36-16.

i 28 07933 -μ Φ ο -μ— -μ 3c#> ω > “ Φ ta

td O

c ta μ (I) m ^ Λ Λ λ. ΟΛΟ oo oo x -S jo λ xi -O x n x oo oo

y * Ί' rH ι-H ι-l -H

3 --- -H

3 r- μ to tn · 3 > μ in 3 <d > tn -μ μ ·-- μ g •μ H _ _ μ m O O r—tr—t Ϊ « VO X OO OO (Λ H H HH 00 00

3*0 1111 III II II

μ'— m o o o o o o o oo oo

G rH f*H rH rH rH rH »H rH »H rH rH

μ o xx xxx xx xx m /s λ o m -4· o t~- ro o ό -o

«M «MM MM MM

►J 00 CO -H >-< UI i-l CM r-l —l

OS

(N

- ^ o o o o >i Γ-· O' 00 H H O' r-l -H 00 •h J -~Ί I I III II I 00

•μ £ X O O O OOO OO OI

H .J rH rH rH rH rH rH fH rH rH O

Ij ΓΛ K X X XXX XX X 1-H

Tl ϋΐ tn ON rH H ΓΝ H Γ*% H* ΙΛ X

>1/ MMM MMM MM M O

C M —" I—i CM θ' Λ 4 r-1 CM CM»

φ « CM

μ__

td G

G Φ — •μ c i- •μ H ·

.5 § ^ -H rH O OO

, , rH rH rH rH rH ΓΝ 00 ©N CO f'* h μ · i i i i lii ti ι i G 3 6 OOOO OOO oo oo — QJ 0 *μ pH ι-C r—I t—I H H H f-li—I ι—li—I 5* μ AJ < tn XXXX XXX XX XX Ci ίο -Η mq) λ m λ h λ oo k un <n m r- H t/} -J ’ Ον Ό r- r-ι H 4 Λ vo 00 Oven td & w μ Ä —l--μ •μ Φ -μ G ι—ι tn ·μ \ G td td 3 I td -μ tn td AS h „_J M H M H H rH rH rH rH rH rH rH λ £ tno μ >>. μ >- μ >»►> g •μ td 3 g μ ι-h 3__μ ·* -- 0 ^ m ι 'm oo ι-h ·μ μ Φ I μ II I μ μ 05 ·μ C κ n t> οο η ρ> νο μ· θ' O (dd) 3 ·μ η ι—ι r—ι *ο cm cm ι—ι tn 4 hcm iti μ .. 0 Λ5 till III II II μ ^ q en cm en en en en cm men —1 r-< £ _ rj ^ oi oä oi ei ei eä oi ei oi oi ei β:Φ O Ui £ φ :ro %--S e 3 :td o -μ • -H S >5 Φ 3 μ --ι cm m «o td ίμ -—* -—.

&< _05 td μ 29 3 7933 5.2 Vertailu ihmisreniiniin sitoutumisen ja ihmisreniiniak-tiivisuuden eston välillä

Monoklonaaliset vasta-aineet voidaan jakaa neljään eri ryhmää sitoutumis- ja esto-ominaisuuksiensa perusteella. Periaatteessa on olemassa monoklonaalisia vasta-aineita, jotka vain sitovat reniiniä, ja sellaisia, jotka sitovat reniiniä ja samanaikaisesti haittaavat niiden entsymaattista aktiivisuutta. Ryhmään 1 (taulukko 1) sisältyvät sellaiset monoklonaaliset vasta-aineet, jotka sitovat reniiniä, mutta eivät kuitenkaan estä niiden katalyyttistä aktiivisuutta lainkaan tai vain aivan vähän. Näillä monoklonaalisilla vasta-aineilla on lisäksi vähintään 20-kertainen affiniteetti pintaan sitoutuneeseen reniiniin (ELISA) verrattuna affiniteettiin liuoksessa olevaan reniinin (RIA). Kaikkien muiden ryhmien monoklonaaliset vasta-aineet eivät osoita minkäänlaista preferenssiä pintaan sitoutuneeseen reniiniin. Ryhmän 2 monoklonaaliset vasta-aineet estävät reniiniaktiivisuutta jo vähäisissä konsentraatioissa, kuitenkin vain osittain, so. vain tietyllä, monoklonaaliselle vasta-aineelle ominaisella prosenttimäärällä. Ryhmään 3 sisältyvät sellaiset monoklonaaliset vasta-aineet, jotka estävät reniiniaktiivisuuden täydellisesti jo hyvin pieninä konsentraatioina. Samanaikaisesti ne sitovat liuennutta reniiniä pieninä konsentraatioina, 1 - 3 x 10"10. Mielenkiintoista kyllä, nämä monoklonaaliset vasta-aineet reagoivat tuskin lainkaan pintaan sitoutuneen reniinin kanssa. Sellaiset monoklonaaliset vasta-aineet eivät sen vuoksi sisältyneet ELISA-menetelmään perustuvaan primääriseulontaan. Ryhmään 4 sisältyvät monoklonaaliset vasta-aineet, jotka estävät reniiniaktiivisuuden täydellisesti, mutta ovat n. 1000 kertaa heikompia kuin ryhmän 3 monoklonaaliset vasta-aineet. Ne sitovat lisäksi pintaan sitoutunutta reniiniä (ELISA) ja liukoista reniiniä (RIA) suunnilleen yhtä hyvin. Sitoutuminen ELISA:ssa (konsen-traatiossa n. 10-7 M) ei kuitenkaan eroa merkitsevästi ei-spesifisen kontrollivasta-aineen vastaavasta sitoutumisesta.

30 87 933 5.3 Rotta- ja marmosettireniiniaktiivisuuden eston määrittä minen

Esimerkissä 5.1 esitetyllä tavalla tutkitaari analysoitavat monoklonaaliset vasta-ainenäytteet rottareniiniaktiivisuuden ja marmosettireniiniaktiivisuuden suhteen. Tällöin lisätään kuitenkin käsittelemätöntä, so. normaalit määrät angiotensi-nogeenia ja reniiniä sisältävää rotan ja marmosetin plasmaa esikäsitellyn ihmisplasman sijasta.

Mikään taulukossa 1 esitetyistä monoklonaalisista vasta-aineista ei estä rotan reniiniä.

Monoklonaaliset vasta-aineet R 3-27, R 3-36-16, R 3-47 ja R

1-20 estävät marmosettireniiniä yhtä voimakkaasti kuin ihmisreniiniä (samat IC 50-arvot). Vastaavan monoklonaalisen vasta-aineen tunnistama determinantti on sen vuoksi ihmis-reniinissä ja marmosettireniinissä identtinen tai vähintäänkin hyvin samankaltainen. Koska monoklonaaliset vasta-aineet R 3-36-16 ja R 3-47 estävät ihmisreniiniä hyvin tehokkaasti (taulukko 1), on ihmisreniini- ja marmosettireniinientsyy-mien katalyyttisen kohdan homologia näin osoitettu.

Monoklonaalinen vasta-aine R 1-19 estää marmosettireniiniak-tiivisuutta kolme kertaa pienemmällä konsentraatiolla (IC 50) kuin ihmisreniinin aktiivisuutta. Tämä monoklonaalinen vasta-aine reagoi siis paremmin sellaisen molekyylin kanssa, jota ei ole käytetty immunisointiin (esimerkki 2.1).

Monoklonaalinen vasta-aine R 2-1 estää marmosettireniiniaktii visuutta vasta viisikymmentä kertaa suuremmalla konsentraatiolla (IC 50) kuin ihmisreniinin aktiivisuutta. Tämä monoklonaalinen vasta-aine tunnistaa sen vuoksi determinantin, joka on marmosetti- ja ihmisreniinissä kylläkin samankaltainen, muttei identtinen.

31 3 7 93

Monoklonaalisilla vasta-aineilla R 3-21, R 2-1 ja R 3-27 havaittu vain osittainen ihmisreniinin esto myös suurissa kon-sentraatioissa (taulukko 1, viimeinen sarake), voidaan havaita samalla tavalla marmosettireniinillä.

Esimerkki 6: Monoklonaalisen vasta-aineen karakterisointi 6.1 Vasta-aineluokan määrittäminen

Kloonattujen hybridomasolujen tuottamien monoklonaalisten vasta-aineiden luokka tai vast, alaluokka määritetään ELISA:11a. Mikrotitrauslevyt päällystetään kulloinkin 1 ygslla luokka- tai vast, alaluokkaspesifisen seerumin kaniini-immunoglobuliinipreparaattia 50 pl:ssa PBS:ää, levyn vapaat sitoutumiskohdat sidotaan RIA-puskurilla (1 % BSA PBStssä, 0,2 % NaNj, pH 7,4) ja analysoitavia näytteitä in-kuboidaan syvennyksissä 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. Levyjen pesun jälkeen sitoutuneita monoklonaalisia hiiri-vasta-aineita inkuboidaan levyjen päällystämiseen käytetyn seerumiprepa-raatin fosfataasileimatun kaniini-immunoglobuliinin kanssa 1 tunnin ajan 37 °C:ssa ja talteenotetut entsyymimäärät määritetään kuten esimerkissä 4.1. Tulokset on esitetty taulukossa 1.

6.2 Aminohapposekvenssianalyysi

Monoklonaaliset vasta-aineet muutetaan 4-dimetyyliamino-4'-jodiasetamido-atsobentseenijohdannaisikseen ja kevyet ja painavat ketjut erotetaan kromatografisesti Sepharose· G 100-pylväässä. Fraktiot eluoidaan geelistä elektrodialyysin avulla ja aminohapposekvenssianalyysi suoritetaan tunnetulla tavalla [9] Beckman 8906 sekvensointilaitteella.

Monoklonaalisen vasta-aineen R 3-36-16 kevyen ketjun N-terminaalinen aminohapposekvenssi (käsittäen ensimmäisen hy-pervariaabelin alueen kohdissa 28-38) on seuraava: 32 37933 1 10

Asp-Asn-Val-Leu-Thr-Gln-Ser-Pro-Ser-Ser-Leu-Ala-Val-Ser-Leu-(Arg)-20 30

Gln-(Arg)-Ala-Thr-Ile-Ser-Cy8-(Arg)-Ala-Ser-Glu-Ser-Val-(A8p)-Ser- 40

Tyr-Gly-Lya-X-Phe-Met-Y-Trp-Tyr

Suluissa olevia aminohappoja ei tunneta varmuudella. X ja Y tarkoittavat määrittämättömiä aminohappoja.

Esimerkki 7: Monoklonaalisten vasta-aineiden ristikkäisin-hibition määrittäminen

Mikrotitrauslevyt päällystetään, samoin kuin esimerkissä 4.1, ryhmien 1-3 (taulukko 1) monoklonaalisilla vasta-aineilla siten, että syvennystä kohti sitoutuu n. 150 ng mo-noklonaalista vasta-ainetta. 3 pg (20-kertainen ylimäärä) samaa monoklonaalista vasta-ainetta tai jotain toista mono-klonaalista vasta-ainetta ryhmistä 1-3 esi-inkuboidaan 5 ng:n kanssa ^25i_^eimattua reniiniä (esimerkki 8.1) 10 yl:ssa liuosta 15 tuntia 4 °C:ssa tai 4 tuntia 37 °C;ssa, sitten inkuboidaan päällystettyjen mikrotitrauslevyjen syvennyksissä 2 tuntia 37 °C:ssa ja 15 tuntia 4 °C:ssa. Levyt pestään tämän jälkeen ja sitoutunut reniini määritetään mittaamalla radioaktiivisuus.

Tämän ristikkäisinhibitiokokeen tulokset on esitetty taulukossa 2. Reniinin sitoutuminen pintaan sitoutuneeseen mono-klonaaliseen vasta-aineeseen inhiboidaan täydellisesti 095 %) esi-inkubaatiolla liuoksessa saman monoklonaalisen vasta-aineen kanssa (taulukko 2, ristit). Monoklonaaliset vasta-aineet R 3-36-16 ja 3-47 inhiboivat toisiaan täydellisesti, ne tunnistavat siis reniinimolekyylin samaa epitooppia. Mo-noklonaalinen vasta-aine R 3-21, joka ristiinreagoi R 3-27:n kanssa, inhiboituu samoin ristikkäisesti monoklonaalisella vasta-aineella R 3-17-7, sitävastoin R 3-27 ja R 3-17-7 ei- 33 37933 vät vaikuta toisiaan vastaan. Nämä kolme monoklonaalista vasta-ainetta tunnistavat siten osittain päällekkäisiä, toisiaan seuraavia reniinimolekyylin epitooppeja. Muut monoklonaaliset vasta-aineparit eivät osoita minkäänlaista vastak-kaisvaikutusta. Nämä monoklonaaliset vasta-aineet sitovat siten reniinimolekyylin kolmiulotteisesta erillään sijaitsevia epitooppeja.

Taulukko 2: Monoklonaalisten vasta-aineiden ristikkäis-inhibitio

Titrauslevylle Reniinin sitoutumisen inhibitio ylimää- sitoutunut rällä monoklonaalista vasta-ainetta monoklonaalinen vasta-aine R 2-12 R 3-17-7 R 3-21 R 3-27 R 2-1 R 3-36 R 3-47 -16 R 2-12 +++ - R 3-17-7 - +++ +++ - - - - R 3-21 - +♦ +++ ♦ - R 3-27 - - +++ +++ - R 2-1 - - +++ R 3-36-16 - - +++ +♦+ R 3-47 - - - - +++ +++ 0-30 % inhibitio + 30-60 % inhibitio ++ 60-95 % inhibitio +++ 95-100 % inhibitio 34 87933

Esimerkki 8: Radioimmuunimääritys (RIA) ihmisreniinin määrittämiseksi plasmassa 8.1 Ihmisreniinin leimaus llä 10 tig ihmisreniiniä esimerkistä 1 jodataan Greenwood in ja Hunter in [10] esittämällä vakiomenetelmällä 125i_nat-rium-jodidilla (0,3 mC) ja kloramiini T:llä. Reaktiotuote puhdistetaan ioninvaihtopylväällä Bio Rad AG* 1x8 ja säädetään PBStllä aktiivisuuteen 1,6 x 10^ cpm/ml.

8.2 Ihmisreniinin määrittäminen yksinkertaisella RIA:11a

Polyvinyylikloridi-mikrotitrauslevyt (Dynatech Labs. Inc.) päällystetään inkuboimalla 100 yl:n kanssa PBS-liuosta, joka sisältää kulloinkin 10 yg/ml monoklonaalista vasta-ainetta R 2-1 ja R 3-27, 2 tuntia 37 °C:ssa ja 15 tuntia 4 °C:ssa. Levyt pestään PBS:llä ja vielä esiintyvät proteiinireaktiivi-set kohdat sidotaan inkuboimalla 225 ylsn kanssa RIA-pusku-ria (1 % BSA:ta PBS:ssä, 0,2 % NaN3, pH 7,4) 2 tunnin ajan 37 °C:ssa.

Kulloinkin 50 μΐ koeliuoksen laimennussarjaa tai reniini-standardiliuosta RIA-puskurissa, joka sisältää 10 % reniini-vapaata ihmisen plasmaa, pannaan mikrotitrauslevyn syvennyksiin, lisätään kulloinkin 50 yl (80 000 cpm, vastaa 2,5 ng) 125i_]_eimatun reniinin liuosta esimerkistä 8.1 ja inkuboi-daan 2 tuntia 37 °C:ssa ja 15 tuntia 4 °C:ssa. Levyt pestään PBSsllä ja radioaktiivisuus mitataan. Ihmisreniinin konsen-traatio koeliuoksessa määritetään standardiliuosten avulla laaditulta kalibrointikäyrältä.

Samalla tavalla mikrotitrauslevyt päällystetään monoklonaa-lisella vasta-aineella tai kahdella monoklonaalisella vasta-aineella, jotka tunnistavat eri epitooppeja (taulukko 2), ja käytetään yksinkertaiseen RIAraan.

35 87933 8.3 Monoklonaalisen vasta-aineen R 3-36-16 leimaus 30 yg monoklonaalista vasta-ainetta R 3-36-16 jodataan samoin kuin esimerkissä 8.1 (χ mC) ja puhdistetaan.

Monoklonaalinen vasta-aine R 3-27 leimataan samalla tavalla.

8.4 Ihmisreniinin määrittäminen sandwich-RIA:11a

Samalla tavalla kuin esimerkissä 8.2 mikrotitrauslevyt päällystetään 150 yl:lla monoklonaalisen vasta-aineen R 3-27 liuoksella (10 yg/ml) ja proteiinireaktiiviset kohdat tyydytetään. Kulloinkin 50 yl koeliuoksen laimennussarjaa (esim. potilaan veriplasmaa) tai reniini-standardiliuosta reniini-vapaassa ihmisplasmassa, 50 μΐ RIA-puskuria ja 50 yl (120 000 cpm, vastaa 6 ng) 125x_xexmatun vasta-aineen R 3-36-16 liuosta esimerkistä 8.3 inkuboidaan mikrotitrauslevyjen syvennyksissä 2 tuntia 37 °C:ssa ja 15 min. 4 °C:ssa. Levyt pestään PBS:llä ja radioaktiivisuus määritetään. Ihmisreniinin konsentraatio koeliuoksessa määritetään standardiliuos-ten avulla laaditulta kalibrointikäyrältä (kuvio 1).

Kokeen herkkyys mahdollistaaa jopa 1 pg:n ihmisreniinimäärän määrittämisen 50 yl:ssa koeliuosta (20 pg/ml). Lineaarinen annosriippuvuus saavutetaan koko alueella 1-100 pg reniiniä (50 μΐ:n näyte).

Samalla tavalla voidaan määrittää myös ihmisreniini, kun mikrotitrauslevyn päällystämiseen käytetään esim. monoklonaalista vasta-ainetta R 2-1 tai R 2-1 s n ja R 3-27:n seosta, tai kun vasta-ainetta vaihdetaan, so. käytetään monoklonaalista vasta-ainetta R 3-36-16 päällystämiseen ja esim. 125i_ieimattua monoklonaalista vasta-ainetta R 3-27 kehittämiseen.

36 0 7 933 8.5 Testipakkaus yksinkertaista RIAtaa varten

Testipakkaus kohdassa 8.2 kuvattua yksinkertaista RIA:aa varten sisältää: - polyvinyylikloridiset mikrotitrauslevyt - 2 ml monoklonaalisen anti-ihmisreniini-vasta-aineen R 2-1 ja R 3-27 liuosta (kumpikin 10 yg/ml) - 100 ml fosfaattipuskuroitua fysiologista suolaliuosta (PBS) - 100 ml RIA-puskuria (1 % BSA:ta PBS:ssä, 0,2 natrium-atsidia) - 2 ml reniinivapaata ihmisen plasmaa - 2 ml 125i_ieimattua ihmisreniiniä, jonka aktiivisuus on 1,6 x 106 cpm/ml - 2 ml standardiliuosta, joka sisältää 20 ng/ml ihmisreniiniä reniinivapaassa ihmisen plasmassa - kalibrointikäyrän 8.6 Testipakkaus sandwich-RIA:aa varten

Testipakkaus kuvattua sandwich-RIA:aa varten sisältää: - polyvinyylikloridiset mikrotitrauslevyt - 6 ml monoklonaalisen anti-ihmisreniini-vasta-aineen R 3-27 liuosta (10 pg/ml) - 100 ml fosfaattipuskuroitua fysiologista suolaliuosta (PBS) - 100 ml RIA-puskuria (1 % BSA:ta PBS:ssä, 0,2 % natrium-atsidia) - 2 ml reniinivapaata ihmisen plasmaa - 2 ml 125i_iaimattua monoklonaalisen anti-ihmisreniini-vasta-aineen R 3-36-16 (esimerkki 8.3) liuosta, jonka aktiivisuus on 2,4 x 10^ cpm/ml - 2 ml standardiliuosta, joka sisältää 20 ng/ml ihmisreniiniä reniinivapaassa ihmisen plasmassa - kalibrointikäyrän (kuvio 1) 37 37933

Esimerkki 9: Entsyymi-immunomääritys (ELISA) ihmisreniinin määrittämiseksi plasmassa 9.1 ELISA polyklonaalisella anti-ihmisreniiniseerumilla

Esimerkin 8.2 mukaisesti mikrotitrauslevyt päällystetään 100 plrlla liuosta, joka sisältää 10 yg/ml monoklonaalista vasta-ainetta R 3-36-16 ja proteiinireaktiiviset kohdat sidotaan. Levyjä inkuboidaan kulloinkin 50 μ1:η kanssa koeliuoksen laimennussarjaa tai reniini-standardiliuosta RIA-puskurissa (1 % BSA:ta PBSrssä, 0,2 % NaN3, pH 7,4), joka sisältää 10 % reniinivapaata ihmisen plasmaa, 2 tuntia 37 °C:ssa, pestään ja inkuboidaan sitten 50 μ1:η kanssa suhteessa 1:500 esilaimennettua polyklonaalista kaniini-anti-ihmisreniini-seerumia [11] 1 tunti 37 °C:ssa. Levyjen pesun jälkeen kehitetään sitoutunut kaniini-vasta-aine inkuboimal-la (1 tunti 37 °C:ssa) suhteessa 1:1000 esilaimennetulla fosfataasileimatun vuohi-antikaniini-immunoglobuliinin preparaatilla. Sitoutunut entsyymi vapauttaa p-nitrofenolia edelleeninkuboinnin aikana (30 min. 37 °C) 100 μ1:η kanssa p-nitrofenyylifosfaattiliuosta ( 1 mg/ml-10 %:sessa dietano-liamiinipuskurissa, joka sisältää 0,5 mM MgCl2, pH 9,8). Mittaamalla absorbanssi 405 nm:ssä määritetään vapautuneen p-nitrofenolin määrä, joka on verrannollinen sitoutuneen fosfataasientsyymin määrään ja siten verrannollinen ihmisreniinin määrään koeliuoksessa.

Samalla tavalla voidaan määrittää myös ihmisreniini, kun mikrotitrauslevyjen päällystämiseen käytetään monoklonaali-sia vasta-aineita R 2-1, R 3-27 tai kahden monoklonaalisen vasta-aineen seosta.

38 mv 933 9.2 Monoklonaalisen vasta-aineen R 3-36-16 leimaus alkali-sella fosfataasilla 1,4 mg monoklonaalista vasta-ainetta R 3-36-16 1,4 ml:ssa PBSsää kytketään liuoksen kanssa, joka sisältää. 5 mg alkalista fosfataasia (SIGMA P6774, tyyppi VII-T) vakiomenetel-mällä, jonka ovat esittäneet Voller et ai. [12] glutaralde-hydiin (0,2 % v/v) 2 tuntia ja siirretään 5 mlraan Tris-puskuria, 0,05 M, pH 8,0, joka sisältää 1 mM MgCl2, 1 % BSA ja 0,02 % NaN3· Liuosta säilytetään pimeässä 4 °C:ssa.

9.3 ELISA kahdella eri monoklonaalisella vasta-aineella

Polypropyleeni-mikrotitrauslevyjä (Dynatech Labs. Inc.) päällystetään kaksi tuntia 37 °C:ssa 150 yl:lla monoklonaalisen vasta-aineen R 3-27 liuosta (10 )jg/ml) puskurissa, pH 8,6 (karbonaattipuskuroitu 0,9 %:nen keittosuolaliuos, joka sisältää 0,02 % natriumatsidia). Levyt pestään viisi kertaa PBSrllä ja vielä esiintyvät proteiinireaktiiviset kohdat tyydytetään inkuboimalla 250 μ1:η kanssa RIA-puskuria (1 % BSArta PBS:ssä, 0,2 % NaN3, pH 7,4) yhden tunnin ajan. Tällä tavoin päällystettyjä levyjä voidaan säilyttää joitakin päiviH ΗΙΛ-puakurissa 4 °C:ssa.

Kulloinkin 50 μΐ koeliuoksen laimennussarjaa (esim. potilaan veriplasmaa) tai reniini-standardiliuosta reniinivapaassa ihmisen plasmassa, 50 yl RIA-puskuria ja 50 yl RIA-puskurilla 1:100 laimennettua fosfataasileimatun vasta-aineen R 3-36-16 (esimerkki 9.2) liuosta sekoitetaan ja in-kuboidaan mikrotitrauslevyjen syvennyksissä kaksi tuntia 37 °C:ssa ja 30 min. 4 °C:ssa. Levyt pestään viisi kertaa PBS:llä ja sitoutunut entsyymimäärä määritetään samoin kuin esimerkissä 9.1, kun on inkuboitu (30 min., 37 °C) 150 yl:n kanssa p-nitrofenyylifosfaattiliuosta. Ihmisreniinin kon-sentraatio koeliuoksessa lasketaan standardiliuosten avulla laaditun kalibrointikäyrän (kuvio 2) avulla.

39 87933 ELISA:n herkkyys mahdollistaa pienemmän kuin 1 pg:n ihmisre- niinimäärän määrittämisen 50 plssta näyteliuosta (20 pg/ml).

Lineaarinen annosriippuvuus saadaan välillä 1-100 pg reniiniä (50 μ1:η näyte).

9.4 Testipakkaus ELISA:a varten

Testipakkaus esimerkissä 9.3 kuvattua ELISA:a varten sisältää: - polypropyleenisiä mikrotitrauslevyjä - 6 ml monoklonaalisen anti-ihmisreniini-vasta-aineen R 3-27 liuoksen (10 pg/ml) karbonaattipuskuroidussa (0,072 g/1 Na2CC>3 ja 4,2 g/1 NaHCOj) 0,9 %;sessa keittosuolaliuoksessa, joka sisältää 0,02 * ΝβΝβ - 100 ml fosfaattipuskuroitua fysiologista suolaliuosta (PBS) - 100 ml RIA-puskuria (1 % BSAsta PBS:ssä, 0,02 % NaN3) - 2 ml reniinivapaata ihmisen plasmaa - 0,2 ml alkalisella fosfataasilla leimatun monoklonaalisen anti-ihmisreniini-vasta-aineen R 3-36-16 liuosta (esimerkki 9.2) Tris-puskurissa (0,05 M, pH 8,0, 1 mM MgCl2, 1 % BSA, 0,02 % NaN3), jossa vasta-aineen konsentraatio on 0,3 mg/ml - 10 ml p-nitrofenyylifosfaatin (1 mg/ml) liuosta dietanoli-amiinipuskurissa (10 % dietanoliamiinia, 0,5 mM MgCl2» 0,02 % NaN3, pH säädetty arvoon 8,9 HCl:llä) - 2 ml standardiliuosta, joka sisältää 20 ng/ml ihmis-reniiniä reniinivapaassa ihmisen plasmassa.

- kalibrointikäyrän (kuvio 2) - värinvoimakkuusasteikon vapautuneen p-nitrofenolin määrän määrittämiseksi paljaalla silmällä.

40 87933

Esimerkki 10: Immunoaffiniteettikromatoqrafia reniinin puhdistamiseksi 10.1 Immunoaffiniteettigeelin valmistaminen

Affi-Gel® 10 (Bio-Rad) pestään valmistajan ohjeiden mukaisesti kylmällä tislatulla vedellä ja kytkentäpuskurilla, pH

8,0 (0,1 M NaHC03~liuos). Geelin 50-%:nen suspensio kytken-täpuskurissa (1 ml) pannaan muoviputkeen, sekoitetaan saman tilavuuden kanssa puhdistettua monoklonaalista vasta-aine-liuosta, joka sisältää 10 mg proteiinia, ja sekoitetaan 4 tuntia huoneenlämmössä. Tämän jälkeen geeli pestään kytkentäpuskurilla. Vielä vapaiden aktiivisten kohtien sitomiseksi geeliä käsitellään 0,1 ml:lla 1 M etanoliamiini-HClrää (pH 8,0) ml:aa geeliä kohti kaksi tuntia huoneenlämmössä, sitten pestään PBS:llä (sisältää 10 mM natriumatsidia) ja pidetään siinä 4 °C:ssa. Kytkennän voimakkuus määritetään mittaamalla absorbanssi 280 nm:ssä ja se on n. 8 mg monoklonaalista vasta-ainetta ml:aa geeliä kohti.

10.2 Marmosetti- tai ihmisreniinin puhdistus 100 μΐ monoklonaalisen vasta-aineen R 2-1 kanssa esimerkin 10.1 mukaisesti valmistettua immunoaffiniteettigeeliä inku-boidaan marmosetista (Callitrix jacchus) saadun munuaisuut-teen kanssa 5 ml:n Falkon-putkessa 30 min. ajan huoneenlämmössä, ravistellen tietyin väliajoin. Jäännösliuos poistetaan ,geelipestään PBS:llä ja uutetaan 1 ml:lla glysiini-hydrokloridipuskuria, pH 3,0. Uutteet neutraloidaan Tris-puskurilla, pH 8,5. Tällä tavalla saadaan puhtaana 70 % (5-6 ng) raakauutteessa esiintyvästä reniinistä.

Samalla tavalla voidaan puhdistaa ihmisreniini.

Vastaavasti ihmis- tai marmosettireniinin puhdistamiseksi voidaan käyttää monoklonaalisia vasta-aineita R 3-21, R 1-19 tai R 1-20 sisältäviä immunoaffiniteettigeelejä.

41 87933

Esimerkki 11: Farmaseuttinen valmiste parenteraaliseen antoon 7,0 mg monoklonaalista vasta-ainetta R 3-36-16, joka on valmistettu esimerkin 3 mukaan, liuotetaan 20 ml:aan fysiologista keittosuolaliuosta. Liuos lasketaan bakteriologisen suodattimen läpi, suodos jaetaan ja täytetään 10 ampulliin aseptisissa olosuhteissa. Kukin ampulli sisältää 0,7 mg parenteraaliseen antoon soveltuvaa monoklonaalista vasta-ainetta ja niitä säilytetään mieluiten kylmässä, esimerkiksi -20 °C:ssa.

Claims (4)

1. Menetelmä monoklonaalisen ihmisreniinivasta-aineen R 3-36-16 sekä sen johdannaisten valmistamiseksi, tunnettu siitä, että tätä monoklonaalista vasta-ainetta tuottavia hybridoomasoluja a) viljellään in vitro ja kasvuliuoksesta eristetään mono-klonaalinen vasta-aine tai b) kasvatetaan ifl vivo sopivassa nisäkkäässä ja tämän nisäkkään elimistön nesteistä eristetään monoklonaalinen vasta-aine, ja haluttaessa c) saatu monoklonaalinen vasta-aine muutetaan johdannaisek-seen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä 125I-leimattujen monoklonaalisen vasta-aineen R 3-36-16 johdannaisten valmistamiseksi, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine vaiheessa c) saatetaan reagoimaan 125I-natrium-tai kaliumjodidin ja kemiallisen tai entsymaattisen hapetus-aineen kanssa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä alkalisen fos-fataasin kanssa konjugoitujen monoklonaalisen vasta-aineen R 3-36-16 johdannaisten valmistamiseksi, tunnettu siitä, että monoklonaalinen vasta-aine saatetaan vaiheessa c) reagoimaan alkalisen fosfataasin ja kytkentäreagenssin kanssa.

4. Menetelmä hybridoomasolulinjan R 3-36-16 valmistamiseksi, joka on talletettu Pasteur-instituutin "Collection Nationale de Cultures de Microorganismes"-kokoelmaan Pariisissa numerolla 1-253, tunnettu siitä, että Balb/c-hiiriä immunisoidaan puhdistetulla ihmisreniinillä, hiiristä tal-teenotetut, vasta-aineita tuottavat solut fuusioidaan mye-loomasolujen kanssa, saadut hybridoomasolut kloonataan ja valitaan ne solukloonit, jotka tuottavat haluttua monoklonaalista vasta-ainetta R 3-36-16. 44 87933