JPH0746999B2 - ヒトの心房ナトリウム排泄増加性ペプチドに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ - Google Patents
ヒトの心房ナトリウム排泄増加性ペプチドに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマInfo
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- JPH0746999B2 JPH0746999B2 JP6014950A JP1495094A JPH0746999B2 JP H0746999 B2 JPH0746999 B2 JP H0746999B2 JP 6014950 A JP6014950 A JP 6014950A JP 1495094 A JP1495094 A JP 1495094A JP H0746999 B2 JPH0746999 B2 JP H0746999B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一般に新規なハイブリ
ドーマ細胞系統、とくに心房ナトリウム排泄増加性ペプ
チド（atrial，natriuretic peptides）（ＡＮＰ）につ
いての特異性をもつモノクローナル抗体（mAb）を生産
するハイブリドーマ細胞系統、その細胞の調製方法に関
する。
ドーマ細胞系統、とくに心房ナトリウム排泄増加性ペプ
チド（atrial，natriuretic peptides）（ＡＮＰ）につ
いての特異性をもつモノクローナル抗体（mAb）を生産
するハイブリドーマ細胞系統、その細胞の調製方法に関
する。
【０００２】マウスの骨髄腫細胞と免疫化マウスからの
脾細胞との融合［ケーラー（Koehler）およびマイルス
テイン（Milstein）、ネイチヤー（Nature）、２５６、
４９５−４９７（１９７５）］は、均一な（「モノクロ
ーナル」と呼ばれる）抗体を生産する連続な細胞系統を
得る可能性の最初の指示であつた。それ以来、種々の雑
種細胞（「ハイブリドーマ」と呼ばれる）を調製しかつ
種々の科学的研究にそれらにより形成された抗体を使用
する多数の試みがなされてきた［例えば、微生物学およ
び免疫学における現在のトピツクス（Current Topics i
n Microbiologyand Immunology）、Ｖｏｌ．８１−“リ
ンパ球ハイブリドーマ（Lymphocyte Hybridomas）”、
Ｆ．メルチヤーズ（Melchers）ら、スプリンガー・フエ
ルラーグ（Springer Verlag）、１９７８およびその中
の刊行文献；Ｃ．バルンステイブル（Barnstable）ら、
細胞（Cell）、１４、９−２０（１９７８）；Ｐ．パー
ハム（Parham）、Ｗ．Ｆ．ボドマー（Bodmer）、ネイチ
ヤー（Nature）、２７６、３９７−３９９（１９７
５）、実験免疫学のハンドブツク（Handbook of Experi
mental Immunology）、第３版、Ｖｏｌ．２、Ｄ．Ｍ．
ウイアー（Wier）編、ブラツクウエル（Blackwell）１
９７８、第２５章；ケミカル・アンド・エンジニアリン
グ・ニユーズ（Chem．Eng．News)、１５−１７（１９７
９）９］。これらの刊行物は、ハイブリドーマによるモ
ノクローナル抗体の生産についての主要な技術を記載し
ている。
脾細胞との融合［ケーラー（Koehler）およびマイルス
テイン（Milstein）、ネイチヤー（Nature）、２５６、
４９５−４９７（１９７５）］は、均一な（「モノクロ
ーナル」と呼ばれる）抗体を生産する連続な細胞系統を
得る可能性の最初の指示であつた。それ以来、種々の雑
種細胞（「ハイブリドーマ」と呼ばれる）を調製しかつ
種々の科学的研究にそれらにより形成された抗体を使用
する多数の試みがなされてきた［例えば、微生物学およ
び免疫学における現在のトピツクス（Current Topics i
n Microbiologyand Immunology）、Ｖｏｌ．８１−“リ
ンパ球ハイブリドーマ（Lymphocyte Hybridomas）”、
Ｆ．メルチヤーズ（Melchers）ら、スプリンガー・フエ
ルラーグ（Springer Verlag）、１９７８およびその中
の刊行文献；Ｃ．バルンステイブル（Barnstable）ら、
細胞（Cell）、１４、９−２０（１９７８）；Ｐ．パー
ハム（Parham）、Ｗ．Ｆ．ボドマー（Bodmer）、ネイチ
ヤー（Nature）、２７６、３９７−３９９（１９７
５）、実験免疫学のハンドブツク（Handbook of Experi
mental Immunology）、第３版、Ｖｏｌ．２、Ｄ．Ｍ．
ウイアー（Wier）編、ブラツクウエル（Blackwell）１
９７８、第２５章；ケミカル・アンド・エンジニアリン
グ・ニユーズ（Chem．Eng．News)、１５−１７（１９７
９）９］。これらの刊行物は、ハイブリドーマによるモ
ノクローナル抗体の生産についての主要な技術を記載し
ている。
【０００３】組織適合性抗原、ハプテン、蛋白質および
酵素に対するモノクローナル抗体は生産されてきてい
る。しかしながら、哺乳動物、例えば、ヒトまたはラツ
トの心房ナトリウム排泄増加性ペプチドと高度に選択的
に反応するモノクローナル抗体はまだ知られていない。
酵素に対するモノクローナル抗体は生産されてきてい
る。しかしながら、哺乳動物、例えば、ヒトまたはラツ
トの心房ナトリウム排泄増加性ペプチドと高度に選択的
に反応するモノクローナル抗体はまだ知られていない。
【０００４】心房ナトリウム排泄増加性ペプチドは、そ
の最小活性配列が２３アミノ酸から成る、異なる鎖長を
有する１群である。他のＮ−末端およびＣ−末端アミノ
酸をさらに含有するペプチドは同様に活性である。これ
らのペプチドは、約１５２アミノ酸の前駆分子から、心
臓の房において酵素の作用により生産される。ＡＮＰの
遺伝情報を指定する遺伝子はクローニングされてきてお
り、そしてＤＮＡは配列決定されてきている。
の最小活性配列が２３アミノ酸から成る、異なる鎖長を
有する１群である。他のＮ−末端およびＣ−末端アミノ
酸をさらに含有するペプチドは同様に活性である。これ
らのペプチドは、約１５２アミノ酸の前駆分子から、心
臓の房において酵素の作用により生産される。ＡＮＰの
遺伝情報を指定する遺伝子はクローニングされてきてお
り、そしてＤＮＡは配列決定されてきている。
【０００５】ＡＮＰ類は持続時間が短いが、強力なナト
リウム排泄を誘導し、これらの物質の攻撃の正確な管の
部位（tubular site）を明らかにすることはまだ不可能
である。さらにＡＮＰ類は強力な脈管拡張剤であり、な
かでも、ノルアドレナリン、アンギオテンシンＩＩ、ヒ
スタミンおよびセロトニンの脈管作用に拮抗することが
できる。ＡＮＰ類の作用はインドメタシンにより中和さ
れず、それゆえこの作用が内因性のプロスタグランジン
合成を経て起こることはありえない。２−クリツプ（tw
o-clip）高血圧症のラツトおよびＳＨラツトにおけるＡ
ＮＰの低血圧作用は記載された。
リウム排泄を誘導し、これらの物質の攻撃の正確な管の
部位（tubular site）を明らかにすることはまだ不可能
である。さらにＡＮＰ類は強力な脈管拡張剤であり、な
かでも、ノルアドレナリン、アンギオテンシンＩＩ、ヒ
スタミンおよびセロトニンの脈管作用に拮抗することが
できる。ＡＮＰ類の作用はインドメタシンにより中和さ
れず、それゆえこの作用が内因性のプロスタグランジン
合成を経て起こることはありえない。２−クリツプ（tw
o-clip）高血圧症のラツトおよびＳＨラツトにおけるＡ
ＮＰの低血圧作用は記載された。
【０００６】単離された細胞において、アルドステロン
およびバソプレツシンの分泌への阻害作用は検出され
た。従来の抗体を使用してＡＮＰの血漿レベルを放射線
免疫学的に測定することは可能であり、そのレベルは特
定の実験動物の体積状態（vlume status）に依存する。
単離された糸球体の細胞への特異的結合は、125ヨウ素
標識ＡＮＰ誘導体を使用して検出された。初期の実験
は、ＡＮＰが腎におけるカリクレインの放出を誘発する
ことを示した。ある条件下に、ペプチドの腎活性はハロ
ペリドールの予備処理により中和されうる［サグネラ
（Sagnella）］およびマクグレゴール（McGregor）、ネ
イチヤー（Natuer）、３９９、６６６−６６８、１９８
４参照］。ＡＮＰの活性は、これらのペプチドが循環系
の疾患（高血圧、低血圧、動脈硬化）、心臓疾患（急性
および慢性の心不全、心筋梗塞、心臓不整脈、冠状動脈
性心臓病）および腎疾患（種々に基本的疾患の途中にお
ける急性および慢性の腎不全、尿毒症）において、因果
的にまたは症候的に、関与することが非常にありうるこ
とを示す。こうして、種々の生物学的体液（例えば、血
液、血漿、血清、尿、リンパ液または脳脊髄液）の中の
ＡＮＰの定量は、前述のすべての症候について非常な重
要性を獲得するであろう。
およびバソプレツシンの分泌への阻害作用は検出され
た。従来の抗体を使用してＡＮＰの血漿レベルを放射線
免疫学的に測定することは可能であり、そのレベルは特
定の実験動物の体積状態（vlume status）に依存する。
単離された糸球体の細胞への特異的結合は、125ヨウ素
標識ＡＮＰ誘導体を使用して検出された。初期の実験
は、ＡＮＰが腎におけるカリクレインの放出を誘発する
ことを示した。ある条件下に、ペプチドの腎活性はハロ
ペリドールの予備処理により中和されうる［サグネラ
（Sagnella）］およびマクグレゴール（McGregor）、ネ
イチヤー（Natuer）、３９９、６６６−６６８、１９８
４参照］。ＡＮＰの活性は、これらのペプチドが循環系
の疾患（高血圧、低血圧、動脈硬化）、心臓疾患（急性
および慢性の心不全、心筋梗塞、心臓不整脈、冠状動脈
性心臓病）および腎疾患（種々に基本的疾患の途中にお
ける急性および慢性の腎不全、尿毒症）において、因果
的にまたは症候的に、関与することが非常にありうるこ
とを示す。こうして、種々の生物学的体液（例えば、血
液、血漿、血清、尿、リンパ液または脳脊髄液）の中の
ＡＮＰの定量は、前述のすべての症候について非常な重
要性を獲得するであろう。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従来の抗血清を使用し
て測定されたＡＮＰの血漿レベルのあるものは、非常に
高く、これはこれらの抗体の交差反応性または特異性の
欠如により説明することができる。心房ナトリウム排泄
増加性ペプチドの誤つた高い血漿レベルの検出の危険性
は、高度に特異性の（モノクローナル）抗体の使用によ
り排除することができる。それゆえ、この型の抗体はＡ
ＮＰレベルの変化に関連するすべての疾患の診断に非常
に適する。
て測定されたＡＮＰの血漿レベルのあるものは、非常に
高く、これはこれらの抗体の交差反応性または特異性の
欠如により説明することができる。心房ナトリウム排泄
増加性ペプチドの誤つた高い血漿レベルの検出の危険性
は、高度に特異性の（モノクローナル）抗体の使用によ
り排除することができる。それゆえ、この型の抗体はＡ
ＮＰレベルの変化に関連するすべての疾患の診断に非常
に適する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、心房ナトリウ
ム排泄増加性ペプチドに対して高度に特異的なモノクロ
ーナル抗体を合成しかつ分泌するハイブリドーマ細胞系
統の調製に関する。本発明は、また、心房ナトリウム排
泄増加性ペプチド、とくにヒトまたはラツトのそれに対
するモノクローナル抗体を合成しかつ分泌するハイブリ
ドーマ細胞系統に関する。これらのハイブリドーマは上
に述べたケーラー（Koehler）およびミイルステイン（M
ilstein）の方法により調製される。免疫原担体、例え
ば、蛋白質に結合した心房ナトリウム排泄増加性ペプチ
ドでマウスを免疫化した後、これらのマウスの脾細胞を
マウスの骨髄腫細胞系統の細胞と融合する。これから得
られるハイブリドーマは、心房ナトリウム排泄増加性ペ
プチドと選択的に反応する抗体について系統的に検査さ
れる。このようにして、心房ナトリウム排泄増加性ペプ
チドを生産するハイブリドーマが単離された。
ム排泄増加性ペプチドに対して高度に特異的なモノクロ
ーナル抗体を合成しかつ分泌するハイブリドーマ細胞系
統の調製に関する。本発明は、また、心房ナトリウム排
泄増加性ペプチド、とくにヒトまたはラツトのそれに対
するモノクローナル抗体を合成しかつ分泌するハイブリ
ドーマ細胞系統に関する。これらのハイブリドーマは上
に述べたケーラー（Koehler）およびミイルステイン（M
ilstein）の方法により調製される。免疫原担体、例え
ば、蛋白質に結合した心房ナトリウム排泄増加性ペプチ
ドでマウスを免疫化した後、これらのマウスの脾細胞を
マウスの骨髄腫細胞系統の細胞と融合する。これから得
られるハイブリドーマは、心房ナトリウム排泄増加性ペ
プチドと選択的に反応する抗体について系統的に検査さ
れる。このようにして、心房ナトリウム排泄増加性ペプ
チドを生産するハイブリドーマが単離された。
【０００９】これらの抗体を生産するハイブリドーマ
は、英国サリスブリー（Salisbury）ポートン・ダウン
（Porton Down）所在のナシヨナル・コレクシヨン・オ
ブ・アニマル・セル・カルチヤーズ、ＰＨＬＳセンター
・フオー・アプライド・マイクロバイオロジー・アンド
・リサーチ（National Collection of Animal Cell Cul
tures，PHLS Centre for Applied Microbiology and Re
search）に受託番号８５０３１４／１（ｍＡｂ １１Ａ
−Ａ１１を生産するハイブリドーマ細胞系統）および受
託番号８５０３１４／２（ｍＡｂ ２３ Ｍ−Ｄ９を生産
するハイブリドーマ細胞系統）で受託された。
は、英国サリスブリー（Salisbury）ポートン・ダウン
（Porton Down）所在のナシヨナル・コレクシヨン・オ
ブ・アニマル・セル・カルチヤーズ、ＰＨＬＳセンター
・フオー・アプライド・マイクロバイオロジー・アンド
・リサーチ（National Collection of Animal Cell Cul
tures，PHLS Centre for Applied Microbiology and Re
search）に受託番号８５０３１４／１（ｍＡｂ １１Ａ
−Ａ１１を生産するハイブリドーマ細胞系統）および受
託番号８５０３１４／２（ｍＡｂ ２３ Ｍ−Ｄ９を生産
するハイブリドーマ細胞系統）で受託された。
【００１０】本発明のハイブリドーマにより生産される
抗体は、例えば、生物学的流体、例えば、血液、血漿、
血清、尿、リンパ液または脳脊髄液の中の心房ナトリウ
ム排泄増加性ペプチドのレベルの決定に使用することが
できる。本発明による抗体は、免疫アツセイ製品にとく
によく適する。しかしながら、それらは、免疫吸着クロ
マトグラフイーを使用する心房ナトリウム排泄増加性ペ
プチドの単離に使用することもできる。
抗体は、例えば、生物学的流体、例えば、血液、血漿、
血清、尿、リンパ液または脳脊髄液の中の心房ナトリウ
ム排泄増加性ペプチドのレベルの決定に使用することが
できる。本発明による抗体は、免疫アツセイ製品にとく
によく適する。しかしながら、それらは、免疫吸着クロ
マトグラフイーを使用する心房ナトリウム排泄増加性ペ
プチドの単離に使用することもできる。
【００１１】動物の実験研究は、種々の生理学的および
病態生理学的状態のもとのＡＮＰの意味を研究するため
に絶対に必要である。これらの研究およびＡＮＰの薬理
学についてのすべての研究の前提条件は、体液の定量測
定用の特異的で高感度のアツセイ法が存在するというこ
とである。
病態生理学的状態のもとのＡＮＰの意味を研究するため
に絶対に必要である。これらの研究およびＡＮＰの薬理
学についてのすべての研究の前提条件は、体液の定量測
定用の特異的で高感度のアツセイ法が存在するというこ
とである。
【００１２】本発明による抗体は、例えば、診断の目的
で実験動物の血清の中の心房ナトリウム排泄増加性ペプ
チドのレベルの決定に使用することができる。本発明に
よる抗体は、また、生理学的および薬理学的実験のため
に非常によく適する。
で実験動物の血清の中の心房ナトリウム排泄増加性ペプ
チドのレベルの決定に使用することができる。本発明に
よる抗体は、また、生理学的および薬理学的実験のため
に非常によく適する。
【００１３】ハイブリドーマの調製は、一般に、次の工
程からなる： Ａ） 免疫原担体、とくに免疫原担体の蛋白質［例え
ば、キーホールリンペツトヘモシアニン（Keyhole limp
et hemocyanin）］（ＫＬＨ−ＡＮＰ）に結合した、例
えば、ヒトまたはラツトからの、心房ナトリウム排泄増
加性ペプチドで哺乳動物を免疫化する。雌のＢａｌｂ／
ｃマウスはこの目的に適することが明らかにされたが、
他の系統のマウスを使用することも可能である。免疫化
の養生法（regimen）およびＫＬＨ−ＡＮＰの濃度は、
適切な数の抗原刺激リンパ球が形成するように選択すべ
きである。１４日の間隔で１００μｇのＫＬＨ−ＡＮＰ
マウスでリン酸塩緩衝化生理的食塩水中の注射による３
回の免疫化は有効であることが明らかにされた。
程からなる： Ａ） 免疫原担体、とくに免疫原担体の蛋白質［例え
ば、キーホールリンペツトヘモシアニン（Keyhole limp
et hemocyanin）］（ＫＬＨ−ＡＮＰ）に結合した、例
えば、ヒトまたはラツトからの、心房ナトリウム排泄増
加性ペプチドで哺乳動物を免疫化する。雌のＢａｌｂ／
ｃマウスはこの目的に適することが明らかにされたが、
他の系統のマウスを使用することも可能である。免疫化
の養生法（regimen）およびＫＬＨ−ＡＮＰの濃度は、
適切な数の抗原刺激リンパ球が形成するように選択すべ
きである。１４日の間隔で１００μｇのＫＬＨ−ＡＮＰ
マウスでリン酸塩緩衝化生理的食塩水中の注射による３
回の免疫化は有効であることが明らかにされた。
【００１４】Ｂ） 免疫化された哺乳動物（例えば、マ
ウス）の脾を得そして適当な媒質中の脾細胞の懸濁液を
調製する。約１ｍｌの媒質／脾細胞は十分である。この
ための実験技術は知られている。
ウス）の脾を得そして適当な媒質中の脾細胞の懸濁液を
調製する。約１ｍｌの媒質／脾細胞は十分である。この
ための実験技術は知られている。
【００１５】Ｃ） 適当な融合プロモーター（例えば、
ポリエチレングリコール）の使用による、懸濁した脾細
胞と適当な細胞系統（例えば、マウス骨髄腫ＰＸ６３Ａ
ｇ８）の骨髄腫細胞との融合。好ましい融合プロモータ
ーは平均分子量１,０００〜４,０００のポリエチレング
リコール（例えば、商業的に入手可能なＰＥＧ １,００
０など）である。しかしながら、他の既知の融合プロモ
ーターを使用することも可能である。好ましい脾細胞／
骨髄腫細胞の比は約１０である。約０.５〜１.０ｍｌの
融合媒質の合計の体積は１０8脾細胞について十分であ
る。多くの骨髄腫細胞は既知であり、そして、例えば、
科学研究所または細胞受託施設から入手することができ
る。使用する細胞系統は好ましくは遺伝的欠損を有し、
こうして融合しない骨髄腫細胞が選択培地中で死ぬが、
雑種は生存するようにする。最も頻繁に使用される細胞
系統は、８−アザグアンニンに対して抵抗性でありかつ
酵素のハイポキサンチングアニンホスホリボシルトラン
スフエラーゼを欠き、こうしてＨＡＴ培地（ハイポキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジン）［サイエンス（Sc
ience）１４５：７０９、１９６４］中で生育すること
ができないものである。
ポリエチレングリコール）の使用による、懸濁した脾細
胞と適当な細胞系統（例えば、マウス骨髄腫ＰＸ６３Ａ
ｇ８）の骨髄腫細胞との融合。好ましい融合プロモータ
ーは平均分子量１,０００〜４,０００のポリエチレング
リコール（例えば、商業的に入手可能なＰＥＧ １,００
０など）である。しかしながら、他の既知の融合プロモ
ーターを使用することも可能である。好ましい脾細胞／
骨髄腫細胞の比は約１０である。約０.５〜１.０ｍｌの
融合媒質の合計の体積は１０8脾細胞について十分であ
る。多くの骨髄腫細胞は既知であり、そして、例えば、
科学研究所または細胞受託施設から入手することができ
る。使用する細胞系統は好ましくは遺伝的欠損を有し、
こうして融合しない骨髄腫細胞が選択培地中で死ぬが、
雑種は生存するようにする。最も頻繁に使用される細胞
系統は、８−アザグアンニンに対して抵抗性でありかつ
酵素のハイポキサンチングアニンホスホリボシルトラン
スフエラーゼを欠き、こうしてＨＡＴ培地（ハイポキサ
ンチン、アミノプテリン、チミジン）［サイエンス（Sc
ience）１４５：７０９、１９６４］中で生育すること
ができないものである。
【００１６】使用する骨髄腫細胞系統は、好ましくはま
た、非分泌型であり、こうしてそれ自体抗体または免疫
グロブリンのＨ−もしくはＬ−鎖を形成しないものであ
るべきである。しかしながら、ある場合において、分泌
性骨髄腫細胞は有利であることがある。
た、非分泌型であり、こうしてそれ自体抗体または免疫
グロブリンのＨ−もしくはＬ−鎖を形成しないものであ
るべきである。しかしながら、ある場合において、分泌
性骨髄腫細胞は有利であることがある。
【００１７】Ｄ） 融合混合物（脾細胞および骨髄腫細
胞）を希釈しそして個々の容器内の選択培地中で培養
し、こうして融合しない細胞が増殖せずかつ１〜２週間
以内に死ぬようにする。個々の融合細胞を希釈剤の体積
の調節により単離し、こうしてある数の細胞（約１〜
４）が各個々の容器［例えば、マイクロタイター平板
（microtiter plate）のウエル（well）］内に配置させ
る。
胞）を希釈しそして個々の容器内の選択培地中で培養
し、こうして融合しない細胞が増殖せずかつ１〜２週間
以内に死ぬようにする。個々の融合細胞を希釈剤の体積
の調節により単離し、こうしてある数の細胞（約１〜
４）が各個々の容器［例えば、マイクロタイター平板
（microtiter plate）のウエル（well）］内に配置させ
る。
【００１８】Ｅ） 各容器において心房ナトリウム排泄
増加性ペプチドに対する抗体の存在について試験する。
増加性ペプチドに対する抗体の存在について試験する。
【００１９】Ｆ） 所望の抗体を生産するハイブリドー
マの選択およびクローニング（例えば、制限希釈によ
る）。
マの選択およびクローニング（例えば、制限希釈によ
る）。
【００２０】いつたん所望のハイブリドーマが選択され
かつクローニングされると、２つの異なる方法により抗
体を生産することができる。ハイブリドーマを適当な培
地中である時間培養し、そして抗体を上澄み液から得る
とき、非常に高い純度のモノクローナル抗体が得られ
る。適当な培地および最適な培養時間は決定が簡単であ
る。この生体外技術は、異質血清（例えば、ウシ胎児血
清）からの少量のみの蛋白質で汚染されたモノクローナ
ル抗体を提供する。
かつクローニングされると、２つの異なる方法により抗
体を生産することができる。ハイブリドーマを適当な培
地中である時間培養し、そして抗体を上澄み液から得る
とき、非常に高い純度のモノクローナル抗体が得られ
る。適当な培地および最適な培養時間は決定が簡単であ
る。この生体外技術は、異質血清（例えば、ウシ胎児血
清）からの少量のみの蛋白質で汚染されたモノクローナ
ル抗体を提供する。
【００２１】ほんのわずかに低い純度のかなり高い濃度
のモノクローナル抗体を調製するためには、選択された
ハイブリドーマをマウスに、好ましくは同系遺伝的また
は準同系遺伝的であるマウスに、腹腔内注射することが
可能である。インキユベーシヨンの時間後、これはマウ
スにおいて腫瘍の形成に導き、これは宿主動物の血液お
よび腹膜滲出液の中に高い濃度の抗体（５〜２０ｍｇ／
ｍｌ）を放出する。これらのマウスが血液および腹水の
中に正常の抗体を有する場合でさえ、それにもかかわら
ずそれらの濃度はｍＡｂに比較して非常に低い。このよ
うにして得られるモノクローナル抗体は非常に高い力価
を有し（それは１０-3以下の希釈で活性である）、そし
て特異的免疫グロブリンおよび非特異的免疫グロブリン
の比は約２０：１である。
のモノクローナル抗体を調製するためには、選択された
ハイブリドーマをマウスに、好ましくは同系遺伝的また
は準同系遺伝的であるマウスに、腹腔内注射することが
可能である。インキユベーシヨンの時間後、これはマウ
スにおいて腫瘍の形成に導き、これは宿主動物の血液お
よび腹膜滲出液の中に高い濃度の抗体（５〜２０ｍｇ／
ｍｌ）を放出する。これらのマウスが血液および腹水の
中に正常の抗体を有する場合でさえ、それにもかかわら
ずそれらの濃度はｍＡｂに比較して非常に低い。このよ
うにして得られるモノクローナル抗体は非常に高い力価
を有し（それは１０-3以下の希釈で活性である）、そし
て特異的免疫グロブリンおよび非特異的免疫グロブリン
の比は約２０：１である。
【００２２】
【実施例】実施例１ ヒトおよびラツトに心房ナトリウム排泄増加性ペプチド
に対するモノクローナル抗体の調製免疫化のために使用する抗原の調製 使用した抗原は、ラツトのヒトα−ＡＮＰまたはアトリ
オペプチン（atriopeptin）ＩＩ［ベイチヤム（Bache
m）により供給される］およびキーホールリンペツトヘ
モシアニン［ＫＬＨ、パシフイツク・バイオマリン・サ
プライ（PacificBiomarine Supply Company）］であつ
た。調製のため、ＫＬＨおよびヒトα−ＡＮＰまたはア
トリオペプチンＩＩを１：１の混合比で混合し、そして
リン酸塩緩衝化生理的食塩水中の２ｍｇ／ｍｌの濃度
で、グルタルアルデヒドを添加した。反応混合物中のグ
ルタルアルデヒドの最終濃度は０.２５％であつた。室
温において１時間インキユベーシヨンした後、蛋白質複
合体をリン酸塩緩衝化生理的食塩水に対して４℃で数時
間透析した。
に対するモノクローナル抗体の調製免疫化のために使用する抗原の調製 使用した抗原は、ラツトのヒトα−ＡＮＰまたはアトリ
オペプチン（atriopeptin）ＩＩ［ベイチヤム（Bache
m）により供給される］およびキーホールリンペツトヘ
モシアニン［ＫＬＨ、パシフイツク・バイオマリン・サ
プライ（PacificBiomarine Supply Company）］であつ
た。調製のため、ＫＬＨおよびヒトα−ＡＮＰまたはア
トリオペプチンＩＩを１：１の混合比で混合し、そして
リン酸塩緩衝化生理的食塩水中の２ｍｇ／ｍｌの濃度
で、グルタルアルデヒドを添加した。反応混合物中のグ
ルタルアルデヒドの最終濃度は０.２５％であつた。室
温において１時間インキユベーシヨンした後、蛋白質複
合体をリン酸塩緩衝化生理的食塩水に対して４℃で数時
間透析した。
【００２３】Ｂａｌｂ／ｃマウスの免疫化 雌のＢａｌｂ／ｃマウスを０.２ｍｌの完全フロイント
アジユバント中の１００μｇのＫＬＨ−ＡＮＰ複合体で
腹腔内的に免疫化した。１４日後、動物に再び完全フロ
イントアジユバント中の１００μｇの抗原を腹腔内的に
投与した。さらに２回の腹腔内免疫化を１４日の間隔で
１００μｇのリン酸塩緩衝化生理的食塩水中の５０μｇ
の抗原／動物で各回免疫化した。動物の脾を最後の抗原
の投与後３日に切除した。
アジユバント中の１００μｇのＫＬＨ−ＡＮＰ複合体で
腹腔内的に免疫化した。１４日後、動物に再び完全フロ
イントアジユバント中の１００μｇの抗原を腹腔内的に
投与した。さらに２回の腹腔内免疫化を１４日の間隔で
１００μｇのリン酸塩緩衝化生理的食塩水中の５０μｇ
の抗原／動物で各回免疫化した。動物の脾を最後の抗原
の投与後３日に切除した。
【００２４】脾細胞懸濁液の調製 期間をステンレス鋼の篩に強制的に通すことによつて、
切除した脾から個々の細胞懸濁液を調製した。４.５ｇ
／ｌのグルコース、１００単位／ｌのペニシリンおよび
１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したダル
ベコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）の中に細胞を移した。細
胞をＤＭＥＭで３回洗浄し、次いで同一培地中に所望濃
度で再懸濁した。一般に、約１０8細胞を各脾から得
た。
切除した脾から個々の細胞懸濁液を調製した。４.５ｇ
／ｌのグルコース、１００単位／ｌのペニシリンおよび
１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したダル
ベコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）の中に細胞を移した。細
胞をＤＭＥＭで３回洗浄し、次いで同一培地中に所望濃
度で再懸濁した。一般に、約１０8細胞を各脾から得
た。
【００２５】骨髄腫細胞の調製 この目的に使用した骨髄腫細胞系統ＰＸ６３Ａｇ８.６
５３は、マウス骨髄腫細胞系統Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８の
サブクローンであり、これは免疫グロブリンの重鎖また
は軽鎖を発現しない［ジヤーナル・オブ・イムノロジー
（J. Immunol.１２３：１５４３−１５５０（１９８
０）］。細胞は２０μｇ／ｍｌの８−アザグアニンに対
して感受性であり、そしてハイポキサンチン、アミノプ
テリンおよびチミジン（ＨＡＴ）を含有する培地中でも
はや生育することはできない。４.５ｇ／ｌのグルコー
ス、２０ミリモルのグルタミン、１,０００単位／ｌの
ペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンお
よび１０％のウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ（完全培
地）中で、それらを培養した。融合の時、骨髄腫細胞は
細胞増殖の対数期にあつた。
５３は、マウス骨髄腫細胞系統Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８の
サブクローンであり、これは免疫グロブリンの重鎖また
は軽鎖を発現しない［ジヤーナル・オブ・イムノロジー
（J. Immunol.１２３：１５４３−１５５０（１９８
０）］。細胞は２０μｇ／ｍｌの８−アザグアニンに対
して感受性であり、そしてハイポキサンチン、アミノプ
テリンおよびチミジン（ＨＡＴ）を含有する培地中でも
はや生育することはできない。４.５ｇ／ｌのグルコー
ス、２０ミリモルのグルタミン、１,０００単位／ｌの
ペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンお
よび１０％のウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ（完全培
地）中で、それらを培養した。融合の時、骨髄腫細胞は
細胞増殖の対数期にあつた。
【００２６】細胞の融合 脾細胞の懸濁液を血清を含まないＤＭＥＭ中の骨髄腫細
胞に１０：１の脾で添加し、そして遠心を２００ｇで１
０分間丸底のカツプ内で実施した。細胞の沈降後、上澄
み液を注意してデカンテーシヨンにより取り出した。細
胞を２ｍｌの分子量２,０００のポリエチレングリコー
ルの溶液（ＤＭＥＭで３０ｗ／ｗに希釈した、ｐＨ７.
６）とともにインキユベーシヨンした。次いで、２０ｍ
ｌのＤＭＥＭを添加し、次いで細胞を数分間注意して再
懸濁した。それらを再び２００ｇで５分間遠心し、そし
て細胞の沈澱をＨＡＴ培地中に１０6細胞／ｍｌの濃度
で再懸濁させ、次いでそれらを１ｍｌの部分でコスター
平板（Costar plate）中に分布させた。
胞に１０：１の脾で添加し、そして遠心を２００ｇで１
０分間丸底のカツプ内で実施した。細胞の沈降後、上澄
み液を注意してデカンテーシヨンにより取り出した。細
胞を２ｍｌの分子量２,０００のポリエチレングリコー
ルの溶液（ＤＭＥＭで３０ｗ／ｗに希釈した、ｐＨ７.
６）とともにインキユベーシヨンした。次いで、２０ｍ
ｌのＤＭＥＭを添加し、次いで細胞を数分間注意して再
懸濁した。それらを再び２００ｇで５分間遠心し、そし
て細胞の沈澱をＨＡＴ培地中に１０6細胞／ｍｌの濃度
で再懸濁させ、次いでそれらを１ｍｌの部分でコスター
平板（Costar plate）中に分布させた。
【００２７】ハイブリドーマの選択および培養 細胞融合後、細胞をＨＡＴ培地（ハイポキサンチン、ア
ミノプテイン、チミジン）中で３７℃において湿潤雰囲
気のもとに５％のＣＯ2を使用して培養した。数週間
後、ハイブリドーマ細胞培養物からの上澄み液を、適当
な酵素免疫検定により抗−ＡＮＰ活性の存在について研
究した（下を参照）。抗−ＡＮＰ検定において陽性の結
果を示すハイブリドーマ細胞系統をクローニングのため
に選択した。
ミノプテイン、チミジン）中で３７℃において湿潤雰囲
気のもとに５％のＣＯ2を使用して培養した。数週間
後、ハイブリドーマ細胞培養物からの上澄み液を、適当
な酵素免疫検定により抗−ＡＮＰ活性の存在について研
究した（下を参照）。抗−ＡＮＰ検定において陽性の結
果を示すハイブリドーマ細胞系統をクローニングのため
に選択した。
【００２８】これはハイブリドーマが限定希釈技術のか
けられることを伴ない、ここで平均０.５細胞／ウエル
を９６マイクロタイターのウエルに分布させ、１０5マ
ウス胸腺細胞／ウエルを「フイーダー・細胞（feeder c
ell）」として添加した。このクローニング後抗−ＡＮ
Ｐをなお生産する細胞を増殖させ、凍結し、そして２５
％のウシ胎児血清および７.５％のジメチルスルホキシ
ドを含有する完全培地中に貯蔵した。
けられることを伴ない、ここで平均０.５細胞／ウエル
を９６マイクロタイターのウエルに分布させ、１０5マ
ウス胸腺細胞／ウエルを「フイーダー・細胞（feeder c
ell）」として添加した。このクローニング後抗−ＡＮ
Ｐをなお生産する細胞を増殖させ、凍結し、そして２５
％のウシ胎児血清および７.５％のジメチルスルホキシ
ドを含有する完全培地中に貯蔵した。
【００２９】大量のモノクローナル抗体の調製 ０.５ｍｌのプリスタンの腹腔内注射により予備処置し
たマウスにクローニングしたハイブリドーマを腹腔内注
射して、約１０〜１５日後に抗生を含有する腹水を得る
ことができるようにした。腹水中の抗体活性を放射能結
合阻止検定において決定した（実施例３参照）。
たマウスにクローニングしたハイブリドーマを腹腔内注
射して、約１０〜１５日後に抗生を含有する腹水を得る
ことができるようにした。腹水中の抗体活性を放射能結
合阻止検定において決定した（実施例３参照）。
【００３０】培養上澄み液の抗−ＡＮＰ活性の決定 ウシ血清アルブミンとラツトのヒトα−ＡＮＰまたはア
トリオペプチンＩＩとの複合体（５μｇ／ｍｌ）を室温
で３時間吸収させ、次いで水で５回洗浄したマイクロタ
イター平板に、１００μｌの培養上澄み液を添加した。
ペルオキシダーゼに結合したウサギ抗−マウス免疫グロ
ブリンを次いで添加した；平板を引続いて室温で２時間
インキユベーシヨンした。蒸留水で５回洗浄した後、酵
素に適する基質緩衝液を添加し、そして生ずる着色した
生成物の濃度をマイクロタイター平板に適する光メータ
ーで決定した。
トリオペプチンＩＩとの複合体（５μｇ／ｍｌ）を室温
で３時間吸収させ、次いで水で５回洗浄したマイクロタ
イター平板に、１００μｌの培養上澄み液を添加した。
ペルオキシダーゼに結合したウサギ抗−マウス免疫グロ
ブリンを次いで添加した；平板を引続いて室温で２時間
インキユベーシヨンした。蒸留水で５回洗浄した後、酵
素に適する基質緩衝液を添加し、そして生ずる着色した
生成物の濃度をマイクロタイター平板に適する光メータ
ーで決定した。
【００３１】実施例２ 心房ナトリウム排泄増加性ペプチドに対するモノクロー
ナル抗体の特性づけモノクローナル抗体の型決定 ここの記載するモノクローナル抗体のクラスおよびサブ
クラスを分析した。抗体を培養上澄み液から濃縮し、そ
して硫酸アンモニウム（４０％の飽和）で沈殿させるこ
とによつて部分的に精製した。免疫グロブリンのクラス
をオウチタロニー（Ouchterlony）ゲル拡散試験におい
てクラス特異的抗−マウス免疫グロブリン抗血清を使用
して決定した。ヒトＡＮＰに対するモノクローナル抗体
２３Ｍ−Ｄ９はＩｇＧ1クラスに属する。アトリオペプ
チンＩＩに対するモノクローナル抗体１１Ａ−Ａ１１は
同様にＩｇＧ1クラスに属する。
ナル抗体の特性づけモノクローナル抗体の型決定 ここの記載するモノクローナル抗体のクラスおよびサブ
クラスを分析した。抗体を培養上澄み液から濃縮し、そ
して硫酸アンモニウム（４０％の飽和）で沈殿させるこ
とによつて部分的に精製した。免疫グロブリンのクラス
をオウチタロニー（Ouchterlony）ゲル拡散試験におい
てクラス特異的抗−マウス免疫グロブリン抗血清を使用
して決定した。ヒトＡＮＰに対するモノクローナル抗体
２３Ｍ−Ｄ９はＩｇＧ1クラスに属する。アトリオペプ
チンＩＩに対するモノクローナル抗体１１Ａ−Ａ１１は
同様にＩｇＧ1クラスに属する。
【００３２】抗体と種々の他のペプチドおよびホルモン
との交差反応 ヒトＡＮＰに対するモノクローナル抗体と種々のペプチ
ドとの交差反応性を、放射線免疫学的結合阻害検定によ
り決定した。この検定は特別の検定緩衝液中で実施する
（０.０２モルのリン酸ナトリウム；０.１５モルのＮａ
Ｃｌ；０.０１％のチオメルサル（thiomersal）；０.１
％のゼラチン；０.０１％のＢＳＡおよび０.１％のトリ
トン−Ｘ １００、ｐＨ７.４）。ヒトからの放射線標識
125ヨウ素−α−ヒト−ＡＮＰ（アミノ酸１〜２８）ま
たはラツトの125−アトリオペプチンＩＩ［アメルシヤ
ム・フヒラー（Amersham Buchler）］を抗体と一緒に適
当な希釈で４℃において１６〜４８時間インキユベーシ
ヨンした。合計の体積は５００μｌである。結合阻害検
定において、検定混合物は、同体積で、標識されない抗
原または種々の阻害剤を異なる濃度でさらに含有する。
インキユベーシヨンの終りにおいて、抗体に結合しない
放射線標識125ヨウ素−抗原（１〜２８アミノ酸をもつ
ヒトα−ＡＮＰまたはラツトのアトリオペプチンＩＩ
Ｉ）活性炭の懸濁液（０.２モルのリン酸ナトリウム；
２％のノリト（norit）Ａ活性炭；０.０２％のデキスト
ラン６０；０.１％のＢＳＡおよび１０ミリモルのＮａ2
ＥＤＴＡ、ｐＨ７.４）を添加し、次いで氷上で２０分
間インキユベーシヨンすることにより活性炭上に吸着さ
せる。次いで活性炭を３,０００ｇで１０分間遠心する
ことにより沈降させ、そして上澄み液中の放射能を決定
する。測定は抗体から125ヨウ素−抗原の５０％を置換
するために必要な種々のペプチドの濃度で実施した。図
１および図２から明らかなように、抗体は高度に特異的
にヒトおよびラツトからの心房ナトリウム排泄増加性ペ
プチドと反応する。塩−水のバランスの調整に参加する
他の仲介因子との交差反応は検出することができなかつ
た。種々の脈管活性物質は等しく不活性であつた（表１
および２）。
との交差反応 ヒトＡＮＰに対するモノクローナル抗体と種々のペプチ
ドとの交差反応性を、放射線免疫学的結合阻害検定によ
り決定した。この検定は特別の検定緩衝液中で実施する
（０.０２モルのリン酸ナトリウム；０.１５モルのＮａ
Ｃｌ；０.０１％のチオメルサル（thiomersal）；０.１
％のゼラチン；０.０１％のＢＳＡおよび０.１％のトリ
トン−Ｘ １００、ｐＨ７.４）。ヒトからの放射線標識
125ヨウ素−α−ヒト−ＡＮＰ（アミノ酸１〜２８）ま
たはラツトの125−アトリオペプチンＩＩ［アメルシヤ
ム・フヒラー（Amersham Buchler）］を抗体と一緒に適
当な希釈で４℃において１６〜４８時間インキユベーシ
ヨンした。合計の体積は５００μｌである。結合阻害検
定において、検定混合物は、同体積で、標識されない抗
原または種々の阻害剤を異なる濃度でさらに含有する。
インキユベーシヨンの終りにおいて、抗体に結合しない
放射線標識125ヨウ素−抗原（１〜２８アミノ酸をもつ
ヒトα−ＡＮＰまたはラツトのアトリオペプチンＩＩ
Ｉ）活性炭の懸濁液（０.２モルのリン酸ナトリウム；
２％のノリト（norit）Ａ活性炭；０.０２％のデキスト
ラン６０；０.１％のＢＳＡおよび１０ミリモルのＮａ2
ＥＤＴＡ、ｐＨ７.４）を添加し、次いで氷上で２０分
間インキユベーシヨンすることにより活性炭上に吸着さ
せる。次いで活性炭を３,０００ｇで１０分間遠心する
ことにより沈降させ、そして上澄み液中の放射能を決定
する。測定は抗体から125ヨウ素−抗原の５０％を置換
するために必要な種々のペプチドの濃度で実施した。図
１および図２から明らかなように、抗体は高度に特異的
にヒトおよびラツトからの心房ナトリウム排泄増加性ペ
プチドと反応する。塩−水のバランスの調整に参加する
他の仲介因子との交差反応は検出することができなかつ
た。種々の脈管活性物質は等しく不活性であつた（表１
および２）。
【００３３】実施例３ 心房ナトリウム排泄増加性ペプチドに対するモノクロー
ナル抗体の使用モノクローナル抗体を使用する生物学的流体および組織
におけるＡＮＰ免疫活性の検出 高度の希釈における抗原は、放射免疫検定により量的に
決定することができる。高度に特異的の抗体および放射
線標識抗原は、この検定に必要である。放射線標識抗原
の抗体への結合は、非放射性抗原により線量依存的に阻
害することができる。種々の濃度の非放射性抗原を一定
濃度の抗体および放射線標識抗原とともにインキユベー
シヨンすると、このようにして特性検量線を引くことが
可能である。図１はこのタイプの検量線を示し、これは
とくに種々のアトリオペプチン類またはそれらの誘導体
によるｍＡｂ ２３Ｍ−Ｄ９からの放射線標識抗原（125
ヨウ素−ヒト−アルフアーＡＮＰ、アミノ酸１〜２８）
の置換についてのものである。これは放射性抗原の抗体
への結合（％）を伴ない、この結合は非標識抗原または
その断片の濃度（ｆｍｏｌ／ｍｌ）に対してプロツトさ
れている。この図面において、 −・− はヒトα−ＡＮＰ（１ー２８）を表わす。
ナル抗体の使用モノクローナル抗体を使用する生物学的流体および組織
におけるＡＮＰ免疫活性の検出 高度の希釈における抗原は、放射免疫検定により量的に
決定することができる。高度に特異的の抗体および放射
線標識抗原は、この検定に必要である。放射線標識抗原
の抗体への結合は、非放射性抗原により線量依存的に阻
害することができる。種々の濃度の非放射性抗原を一定
濃度の抗体および放射線標識抗原とともにインキユベー
シヨンすると、このようにして特性検量線を引くことが
可能である。図１はこのタイプの検量線を示し、これは
とくに種々のアトリオペプチン類またはそれらの誘導体
によるｍＡｂ ２３Ｍ−Ｄ９からの放射線標識抗原（125
ヨウ素−ヒト−アルフアーＡＮＰ、アミノ酸１〜２８）
の置換についてのものである。これは放射性抗原の抗体
への結合（％）を伴ない、この結合は非標識抗原または
その断片の濃度（ｆｍｏｌ／ｍｌ）に対してプロツトさ
れている。この図面において、 −・− はヒトα−ＡＮＰ（１ー２８）を表わす。
【００３４】-- -- はヒトα−ＡＮＰ（７−２８）を
表わす。
表わす。
【００３５】− − はＡＮＰ断片（１８−２８）を表
わす。
わす。
【００３６】この検定は最終希釈１：１,５００,０００
において腹水を使用してここに記載されるようにして実
施した。培養上澄み液を使用する検定は同様な結果を与
え、単に使用できる希釈は５００〜１,０００倍以下で
ある。この実験が明瞭に示すように、ＡＮＰ断片（アミ
ノ酸１８−２８）は抗体から放射線標識抗原を置換する
ことができない。こうして、抗体はこの断片と交差反応
性をもたない。溶液中の未知量の抗原はこの検量線を使
用して決定することができる。ここに記載するモノクロ
ーナル抗体およびトレーサーとして125ヨウ素−ヒト−
α−ＡＮＰ（アミノ酸１−２８）に基づく放射線免疫検
定は生物学的流体および組織の抽出物の検出を２０ｐｇ
／ｍｌの濃度まで低下させることを可能とし、この濃度
はほぼ６ｆｍｏｌ／ｍｌの量に相当する（図１参照）。
において腹水を使用してここに記載されるようにして実
施した。培養上澄み液を使用する検定は同様な結果を与
え、単に使用できる希釈は５００〜１,０００倍以下で
ある。この実験が明瞭に示すように、ＡＮＰ断片（アミ
ノ酸１８−２８）は抗体から放射線標識抗原を置換する
ことができない。こうして、抗体はこの断片と交差反応
性をもたない。溶液中の未知量の抗原はこの検量線を使
用して決定することができる。ここに記載するモノクロ
ーナル抗体およびトレーサーとして125ヨウ素−ヒト−
α−ＡＮＰ（アミノ酸１−２８）に基づく放射線免疫検
定は生物学的流体および組織の抽出物の検出を２０ｐｇ
／ｍｌの濃度まで低下させることを可能とし、この濃度
はほぼ６ｆｍｏｌ／ｍｌの量に相当する（図１参照）。
【００３７】図２は、ラツトのアトリオペプチンと特異
的に反応するｍＡｂ１１Ａ−Ａ１１についての同一方法
で実施した実験を示す。この図面において、 −□− アトリオペプチンＩを表わす。
的に反応するｍＡｂ１１Ａ−Ａ１１についての同一方法
で実施した実験を示す。この図面において、 −□− アトリオペプチンＩを表わす。
【００３８】−■− アトリオペプチンＩＩを表わす。
【００３９】−△− アトリオペプチンＩＩＩを表わ
す。
す。
【００４０】−▲− ＡＮＰ断片（１３−２８）を表わ
す。
す。
【００４１】プツトの方式は図１と同一である。
【００４２】この検定は最終希釈濃度１：１,２５０,０
００で腹水を使用してここの記載するようにして実施し
た。培養上澄み液を使用する検定は同様な結果を与え、
単に使用できる希釈は５００〜１,０００倍以下であ
る。この実験が明瞭に示すように、ＡＮＰ断片（アミノ
酸１３−２８）は抗体から放射線標識抗原を置換するこ
とができない。こうして、抗体はこの断片と交差反応性
をもたない。溶液中の未知量の抗原はこの検量線を使用
して決定することができる。ここに記載するモノクロー
ナル抗体およびトレーサーとして125ヨウ素−アトリオ
ペプチンＩＩＩに基づく放射線免疫検定は生物学的流体
および組織の抽出物の検出を２０ｐｇ／ｍｌの濃度まで
低下させることを可能とし、この濃度はほぼ６ｆｍｏｌ
／ｍｌの量に相当する（図２参照）。ここに説明した免
疫学的方法に加えて、ここに記載するモノクローナル抗
体を使用して他の型の免疫検定（例えば、ＥＬＩＳＡ、
化学ルミネセンス、蛍光）を使用して実施することも可
能である。
００で腹水を使用してここの記載するようにして実施し
た。培養上澄み液を使用する検定は同様な結果を与え、
単に使用できる希釈は５００〜１,０００倍以下であ
る。この実験が明瞭に示すように、ＡＮＰ断片（アミノ
酸１３−２８）は抗体から放射線標識抗原を置換するこ
とができない。こうして、抗体はこの断片と交差反応性
をもたない。溶液中の未知量の抗原はこの検量線を使用
して決定することができる。ここに記載するモノクロー
ナル抗体およびトレーサーとして125ヨウ素−アトリオ
ペプチンＩＩＩに基づく放射線免疫検定は生物学的流体
および組織の抽出物の検出を２０ｐｇ／ｍｌの濃度まで
低下させることを可能とし、この濃度はほぼ６ｆｍｏｌ
／ｍｌの量に相当する（図２参照）。ここに説明した免
疫学的方法に加えて、ここに記載するモノクローナル抗
体を使用して他の型の免疫検定（例えば、ＥＬＩＳＡ、
化学ルミネセンス、蛍光）を使用して実施することも可
能である。
【００４３】実施例４ ラツトのアトリオペプチンの生体内作用の拮抗 実験の前の夕方から断食したが、飲料水を自由に飲ませ
た雄のウイスター（Wistar）ラツト（体重２４０〜２７
０ｇ）を使用した。準備および実験はイナクチン麻酔
（１００ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）のもとに実施した。気
管切除しそして１ｍｇ／ｋｇのアトロピン（ｉ．ｐ．）
を注射した後、プラスチツクカテーテルを大腿動脈の中
に固定して血圧を測定し、プラスチツクカテーテルを頸
静脈中に固定して溶液を注射または注入し、そして膀胱
のカテーテルを挿入した。準備が完結したとき、ラツト
に５ｍｌ／ｋｇの０.９％強度のＮａＣｌ溶液を注入
し、次いで、実験の期間の間、同一溶液を注入した
（１.２ｍｌ／時間）。実験動物の直腸の温度をヒート
ランプにより３７±１℃に維持した。１時間の平衡時間
が経過した後、尿を予備軽量した容器内に集め、この容
器を１０分または２０分毎に交換した。尿中のＮａ+ま
たはＫ+の濃度を火炎光測定［インスツルメンテイシヨ
ン・ラボラトリー（Instrumentation Laboratory）、米
国マサチユセツツ州レキシトン］により決定した。抗体
の流体は１ｍｌの０.９％強度のＮａＣｌ溶液中に１０
０μｌの滅菌濾過した腹水および０.１％のウシ血清ア
ルブミンを含有した。合成アトリオペプチンＩＩ［ベイ
チエム（Bachem）により供給される）を、同様に０.９
％のＮａＣｌおよび０.１％のウシ血清アルブミンを含
有する水溶液中に注入した。注入体積は、すべての場合
において１ｍｌ／ｋｇ体重であつた。予備実験による
と、０.１％のウシ血清アルブミンを含有する０.９％強
度のＮａＣｌ溶液の１ｍｌ／ｋｇ体重の全量の１度の注
入は尿の体積およびナトリウムの分泌にほんのわずかの
作用しかもたないことが示された。実験の完結後、動脈
血液の試料を各ラツトから採取して酸−塩基の状態を検
査した。
た雄のウイスター（Wistar）ラツト（体重２４０〜２７
０ｇ）を使用した。準備および実験はイナクチン麻酔
（１００ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）のもとに実施した。気
管切除しそして１ｍｇ／ｋｇのアトロピン（ｉ．ｐ．）
を注射した後、プラスチツクカテーテルを大腿動脈の中
に固定して血圧を測定し、プラスチツクカテーテルを頸
静脈中に固定して溶液を注射または注入し、そして膀胱
のカテーテルを挿入した。準備が完結したとき、ラツト
に５ｍｌ／ｋｇの０.９％強度のＮａＣｌ溶液を注入
し、次いで、実験の期間の間、同一溶液を注入した
（１.２ｍｌ／時間）。実験動物の直腸の温度をヒート
ランプにより３７±１℃に維持した。１時間の平衡時間
が経過した後、尿を予備軽量した容器内に集め、この容
器を１０分または２０分毎に交換した。尿中のＮａ+ま
たはＫ+の濃度を火炎光測定［インスツルメンテイシヨ
ン・ラボラトリー（Instrumentation Laboratory）、米
国マサチユセツツ州レキシトン］により決定した。抗体
の流体は１ｍｌの０.９％強度のＮａＣｌ溶液中に１０
０μｌの滅菌濾過した腹水および０.１％のウシ血清ア
ルブミンを含有した。合成アトリオペプチンＩＩ［ベイ
チエム（Bachem）により供給される）を、同様に０.９
％のＮａＣｌおよび０.１％のウシ血清アルブミンを含
有する水溶液中に注入した。注入体積は、すべての場合
において１ｍｌ／ｋｇ体重であつた。予備実験による
と、０.１％のウシ血清アルブミンを含有する０.９％強
度のＮａＣｌ溶液の１ｍｌ／ｋｇ体重の全量の１度の注
入は尿の体積およびナトリウムの分泌にほんのわずかの
作用しかもたないことが示された。実験の完結後、動脈
血液の試料を各ラツトから採取して酸−塩基の状態を検
査した。
【００４４】１０μｇ／ｋｇのアトリオペプチンＩＩ
は、静脈内へ全量の１度の注入後、最初の１０分で、尿
の体積およびナトリウム分泌が大きく増加する（図３、
４、５および６参照）。引続く収集期間において、これ
は急速に減少し、そして、１時間後、１０μｇ／ｋｇ体
重のＡＮＰの全量の１度の注入を更新することにより良
好に再現される。尿の体積およびナトリウム分泌の大き
い増加は、第２のＡＮＰの注入前の５分に、１００μｇ
／ｋｇ体重の抗体含有腹水（抗体１１Ａ−Ａ１１）の全
量の１度の注入によりほとんど完全に抑制することがで
きる。
は、静脈内へ全量の１度の注入後、最初の１０分で、尿
の体積およびナトリウム分泌が大きく増加する（図３、
４、５および６参照）。引続く収集期間において、これ
は急速に減少し、そして、１時間後、１０μｇ／ｋｇ体
重のＡＮＰの全量の１度の注入を更新することにより良
好に再現される。尿の体積およびナトリウム分泌の大き
い増加は、第２のＡＮＰの注入前の５分に、１００μｇ
／ｋｇ体重の抗体含有腹水（抗体１１Ａ−Ａ１１）の全
量の１度の注入によりほとんど完全に抑制することがで
きる。
【００４５】図３〜６は、結果を詳細に示す。収集時間
（収集期間）（分）が、縦軸に尿の分泌（μｌ／分）
（図３および４）およびナトリウムの分泌（μｍｏｌ／
分）（図５および６）に対してプロツトされている。
（収集期間）（分）が、縦軸に尿の分泌（μｌ／分）
（図３および４）およびナトリウムの分泌（μｍｏｌ／
分）（図５および６）に対してプロツトされている。
【００４６】図３ １０μｌ／ｋｇのアトリオペプチン
ＩＩ（ＡＮＰ）の全量の１度の注入を２回実施した後の
尿の体積、ｎ＝４。
ＩＩ（ＡＮＰ）の全量の１度の注入を２回実施した後の
尿の体積、ｎ＝４。
【００４７】図４ ＡＮＰに対するｍＡｂによる１０μ
ｇ／ｋｇのアトリオペプチンＩＩの作用の拮抗：第２回
目のＡＮＰの注入の前５分に、１００μｌ／ｋｇの抗体
含有腹水（Ａｂ）の全量の１度の注入を実施した、ｎ＝
４。
ｇ／ｋｇのアトリオペプチンＩＩの作用の拮抗：第２回
目のＡＮＰの注入の前５分に、１００μｌ／ｋｇの抗体
含有腹水（Ａｂ）の全量の１度の注入を実施した、ｎ＝
４。
【００４８】図５ １０μｌ／ｋｇのアトリオペプチン
ＩＩ（ＡＮＰ）の全量の１度の注入を２回実施した後の
ナトリウムの体積、ｎ＝４。
ＩＩ（ＡＮＰ）の全量の１度の注入を２回実施した後の
ナトリウムの体積、ｎ＝４。
【００４９】図６ ＡＮＰに対するｍＡｂによる１０μ
ｇ／ｋｇのアトリオペプチンＩＩの作用の拮抗：第２回
目のＡＮＰの注入の前５分に、１００μｌ／ｋｇの抗体
含有腹水（Ａｂ）の全量の１度の注入を実施した、ｎ＝
４。
ｇ／ｋｇのアトリオペプチンＩＩの作用の拮抗：第２回
目のＡＮＰの注入の前５分に、１００μｌ／ｋｇの抗体
含有腹水（Ａｂ）の全量の１度の注入を実施した、ｎ＝
４。
【００５０】こうして、抗体は生体内のアトリオペプチ
ンＩＩのナトリウム排泄増加に拮抗する。
ンＩＩのナトリウム排泄増加に拮抗する。
【００５１】
【表１】 表 １ ｍＡｂ ２３ Ｍ−Ｄ９と脈管活性または塩−水のバランスへの作用を有する他 の内因性仲介物質との交差反応性の研究 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 物 質 試験最大濃度 交差反応性 （pmol/ml） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ アンギオテンシンＩＩ（ヒト） １４ − ロイシン−エンケフアリン ２６ − サブスタンスＰ １０ − アルドステロン ４４ − ＡＣＴＨ（ブタ） ４ − ブラジキニン １３ − γ−ＭＳＨ １０ − インシユリン（ラツト） ３ − バソプレツシン １５ − レニン（ブタ） ０.５ − ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００５２】
【表２】 表 ２ ｍＡｂ １１Ａ−Ａ１１と脈管活性または塩−水のバランスへの作用を有する他 の内因性仲介物質との交差反応性の研究 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 物 質 試験最大濃度 交差反応性 （pmol/ml） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ アンギオテンシンＩＩ（ヒト） １４ − ロイシン−エンケフアリン ２６ − サブスタンスＰ １０ − アルドステロン ４４ − ＡＣＴＨ（ブタ） ４ − ブラジキニン １３ − γ−ＭＳＨ １０ − インシユリン（ラツト） ３ − バソプレツシン １５ − レニン（ブタ） ０.５ − ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【図１】検量線を示し、これはとくに種々のアトリオペ
プチン類またはそれらの誘導体によるｍＡｂ ２３Ｍ−
Ｄ９からの放射線標識抗原（125ヨウ素−ヒト−アルフ
ア−ＡＮＰ、アミノ酸１〜２８）の置換についてのもの
である。
プチン類またはそれらの誘導体によるｍＡｂ ２３Ｍ−
Ｄ９からの放射線標識抗原（125ヨウ素−ヒト−アルフ
ア−ＡＮＰ、アミノ酸１〜２８）の置換についてのもの
である。
【図２】ラツトのアトリオペプチンと特異的に反応する
ｍＡｂ１１Ａ−Ａ１１についての実験の結果を示す。
ｍＡｂ１１Ａ−Ａ１１についての実験の結果を示す。
【図３】ラツトへのＡＮＰの投与による尿分泌に対する
作用を示す図である。収集時間を横軸に、尿の分泌量を
縦軸にプロツトしている。
作用を示す図である。収集時間を横軸に、尿の分泌量を
縦軸にプロツトしている。
【図４】ラツトへのＡＮＰおよびＡＫの投与による尿分
泌に対する作用を示す図である。プロツトは図３と同様
に行つている。
泌に対する作用を示す図である。プロツトは図３と同様
に行つている。
【図５】ラツトへのＡＮＰの投与によるＮａ+分泌に対
する作用を示す図である。収集時間を横軸に、Ｎａ+の
分泌量を縦軸にプロツトしている。
する作用を示す図である。収集時間を横軸に、Ｎａ+の
分泌量を縦軸にプロツトしている。
【図６】ラツトへのＡＮＰおよびＡＫの投与によるＮａ
+分泌に対する作用を示す図である。プロツトは図５と
同様に行つている。
+分泌に対する作用を示す図である。プロツトは図５と
同様に行つている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｆ 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 デイーター・ノイザー ドイツ連邦共和国デー5603ビユルフラー ト・アムブラーケン49 (72)発明者 ヨハネス−ペーター・シユタツシユ ドイツ連邦共和国デー5600ブツペルタール １・シユネービトヘンベーク37
Claims (8)
- 【請求項１】 哺乳動物の心房ナトリウム排泄増加性ペ
プチドに対するモノクローナル抗体であつて、血管作動
性を示すかまたは塩−水の平衡に影響を及ぼす他の内因
性メデイエイタと交差反応性をもたないモノクローナル
抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ細胞
系。 - 【請求項２】 心房ナトリウム排泄増加性ペプチドに対
する抗体を産生する哺乳動物からの細胞と骨髄腫細胞を
融合することを特徴とする哺乳動物の心房ナトリウム排
泄増加性ペプチドに対するモノクローナル抗体であつ
て、血管作動性を示すかまたは塩−水の平衡に影響を及
ぼす他の内因性メデイエイタと交差反応性をもたないモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の調製
方法。 - 【請求項３】 心房ナトリウム排泄増加性ペプチドに対
して免疫化した哺乳動物からの脾細胞を骨髄腫細胞と融
合することを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の方
法。 - 【請求項４】 心房ナトリウム排泄増加性ペプチドに対
して免疫化したマウスからの脾細胞を骨髄腫細胞と融合
することを特徴とする特許請求の範囲第２項または第３
項記載の方法。 - 【請求項５】 マウスの骨髄腫細胞を使用することを特
徴とする特許請求の範囲第２〜４項のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項６】 骨髄腫細胞は非分泌型であることを特徴
とする特許請求の範囲第２〜５項のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項７】 免疫化を免疫原担体に結合した心房ナト
リウム排泄増加性ペプチドを使用して実施することを特
徴とする特許請求の範囲第２〜６項のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項８】 免疫化の担体が蛋白質であることを特徴
とする特許請求の範囲第２〜７項のいずれかに記載の方
法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853509958 DE3509958A1 (de) | 1985-03-20 | 1985-03-20 | Monoklonale antikoerper gegen atriale, natriuretische peptide vom menschen |
| DE3509958.5 | 1985-03-20 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61061055A Division JPH0648994B2 (ja) | 1985-03-20 | 1986-03-20 | ヒトの心房ナトリウム排泄増加性ペプチドに対するモノクローナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06339393A JPH06339393A (ja) | 1994-12-13 |
| JPH0746999B2 true JPH0746999B2 (ja) | 1995-05-24 |
Family
ID=6265723
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61061055A Expired - Lifetime JPH0648994B2 (ja) | 1985-03-20 | 1986-03-20 | ヒトの心房ナトリウム排泄増加性ペプチドに対するモノクローナル抗体 |
| JP6014950A Expired - Lifetime JPH0746999B2 (ja) | 1985-03-20 | 1994-01-14 | ヒトの心房ナトリウム排泄増加性ペプチドに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| KR (1) | KR940010021B1 (ja) |
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| AT (1) | ATE75754T1 (ja) |
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| CA (1) | CA1340391C (ja) |
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| DK (1) | DK165955C (ja) |
| ES (1) | ES8801945A1 (ja) |
| FI (1) | FI90988C (ja) |
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| IL (1) | IL78172A (ja) |
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| PT (1) | PT82215B (ja) |
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| JP2724315B2 (ja) * | 1988-02-29 | 1998-03-09 | 塩野義製薬株式会社 | α−ＡＮＰを認識するモノクローナル抗体およびα−ＡＮＰの免疫学的測定法 |
| CA1339210C (en) * | 1988-05-31 | 1997-08-05 | John Lewicki | Recombinant techniques for production of novel natriuretic and vasodilator peptides |
| JP2561513B2 (ja) * | 1988-07-04 | 1996-12-11 | 塩野義製薬株式会社 | γ−ＡＮＰを認識するモノクローナル抗体 |
| JP2665850B2 (ja) * | 1991-11-14 | 1997-10-22 | 塩野義製薬株式会社 | ｈＢＮＰのＣ端を認識するモノクロ−ナル抗体 |
| AU2493499A (en) * | 1998-02-03 | 1999-08-16 | Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The | Determination of the amount of hlhbeta core fragment in a sample from a subject and uses thereof |
| RU2218568C2 (ru) * | 1999-01-29 | 2003-12-10 | Роше Диагностикс Гмбх | Способ обнаружения n-концевого про-мнп |
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| WO2017218911A1 (en) | 2016-06-17 | 2017-12-21 | Abbott Laboratories | BIOMARKERS TO PREDICT NEW ONSET HEART FAILURE WITH PRESERVED EJECTION FRACTION (HFpEF) |
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| US4451570A (en) * | 1981-03-26 | 1984-05-29 | The Regents Of The University Of California | Immunoglobulin-secreting human hybridomas from a cultured human lymphoblastoid cell line |
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| JPH0780907B2 (ja) * | 1984-04-19 | 1995-08-30 | シオス・ノバ・インク | 新規な心房性ナトリウム尿排泄亢進性及び血管拡張性ポリペプチド |
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1994
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