CN86101671A - 抗人心房钠尿肽的单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
抗心房钠尿肽的单克隆抗体是由保存号为850314/1和859314/2的杂交瘤系产生的。杂交瘤是通过同产生抗心房钠尿肽抗体的哺乳动物细胞融合得到的。因此,这种抗体可以用于测定诸如血液、血浆、血清、尿、淋巴或脑脊髓液等生物样品中的心房钠尿肽水平。
Description
本发明关系到一般的新杂交瘤细胞株,特别是产生对人和大鼠心房钠尿肽(ANP)有特异性的单克隆抗体(mAb)的细胞株,采用这种方法无论在体内还是体外产生mAb,可以有助于诊断和用于研究目的。
将骨髓瘤细胞和免疫小鼠的脾细胞进行融合(Koehler和Milstein,自然,256,495-497(1975)),首次表明可以得到产生均一抗体(称为“单克隆”抗体)的传代细胞株。此后,科学工作者作了种种努力以制备多种杂交细胞(称为“杂交瘤”),并且利用形成的抗体进行了许多科学研究(例如:微生物学和免疫学的当前课题,Vol.81-“淋巴细胞杂交瘤”,F.Melchers et al.,Springer Verlag,1978,附有参考文献;C.Barn-stable等,细胞14,9-20(1978);P.Parham,W.F.Bodmer,自然276,397-399,实验免疫学手册,第三版,第2卷,D.M.Wier,编辑,Blackwell 1978,25章;化学工程新闻,15-17(1979)9)。这些发表的文章叙述了利用杂交瘤产生单克隆抗体的主要技术。
已经得到了抗组织相容性抗原,抗半抗原,旦白质和酶的单克隆抗体。但是还没有高度选择性的同哺乳动物,例如人或大鼠心房钠尿肽类反应的单克隆抗体。
心房钠尿肽是一类具有不同链长的肽类,它的最低限度活度序列由23种氨基酸组成。含有其他N-未端和C-未端的氨基酸的肽类活性也是相同的。这种肽是在心房中由一种大约152个氨基酸组成的前体分子通过酶的作用而形成的。编码ANP的基因已进行了克隆,DNA已进行了序列分析。
ANPs诱导持续期短,但有效的钠尿作用至今尚不能表明这种物质作用的精确管状位点。此外,ANPs是有效的血管扩张剂,换言之,它对正肾上腺素,血管紧张素Ⅱ,组织胺和5-羟色胺对血管的活性有拮抗作用。ANPs的作用不被消炎痛所抑制,关于其作用是通过内源前列腺素合成进行的看法似不可靠。对于ANP对two-clip低血压大鼠和SH大鼠的降血压作用已进行了叙述。
在分离的细胞中,对醛固酮和后叶加压素分泌的抑制作用已进行了测定。可以采用常规的抗体放射免疫学方法测定ANP的血浆水平,这取决于特定实验动物的体积大小,采用磺125标记的ANP衍生物可以测定对分离层血管球细胞的特异结合。最初的实验表明,在肾中,ANP可以诱导激肽释放酶的释放。在一定情况下,这种肽对肾的活性可以由于用氟
丁苯(haloperidol)予处理而失效(见Segn-ella和MacGregor,自然399,666-668,1984)。ANP的活性谱表明,这些肽可能与循环失调(高血压、低血压、动脉硬化),心脏功能失调(急性和亚急性心脏功能不全,心肌梗塞、心律不齐、冠心病)以及肾功能失调(各种基础紊乱过程中的急性和亚急性肾功能不全,尿毒症)是相关的,因此,定量测定不同生物体液中的ANP(例如,血液、血浆、血清、尿、淋巴液或脑脊髓液)对于上述各种症状是十分重要的。
采用常规抗血清测定某些ANP在血浆中的水平是十分高的,这可以通过这些抗体的交叉反应或缺少特异性来予以解释。利用高特异性的(单克隆)抗体可以避免心房钠尿肽在血浆中错误高水平的冒险测定。因此,这种类型的抗体适用于诊断与ANP水平变化有关的所有失调症。
本发明关系到制备能够合成和分泌抗心房钠尿肽的杂交瘤细胞系。本发明还关系到能够合成和分泌抗哺乳动物特别是抗人或大鼠的那些心房钠尿肽的特异单克隆抗体的杂交瘤系。采用介绍部分Koehler和Milstein所叙述的方法制备杂交瘤。用结合于一种免疫载体例如旦白质的心房钠尿肽免疫小鼠后,将这些鼠的脾细胞同一种鼠骨髓瘤细胞系进行融合。对这样产生的杂交瘤系统地检验了选择性同心房钠尿肽反应的抗体。采用这种方法分离了产生抗心房钠尿肽抗体的杂交瘤,本发明也与这些抗体有关。
产生这些抗体的杂交瘤已储于国立动物细胞培养收集中心和英国Porton Down,Salisbury SP4OJG应用微生物和研究PHLS中心,保存号为850314/1(产生mAb 11A-A11的杂交瘤细胞系)和850314/2(产生mAb 23M-09的杂交瘤细胞系)。
根据本发明,这些抗体可以用于例如测定心房钠尿肽在生物体液如血,血浆、血清、尿,淋巴液或脑脊髓液中的含量水平。按照本发明,这些抗体特别适于进行免疫学实验,而且,利用免疫吸附层析法,它们也可以用于分离心房钠尿肽。
对于深入研究在不同生理和病生理条件下,ANP的意义而言,动物实验是绝对必须的。对于这些研究以及对于ANP,所有药学研究的予定要求是进行适宜于在体液定量测定的特异和敏感实验。
根据本发明,这些抗体可以用于例如测定实验动物血清的心房钠尿肽水平以达到诊断目的。按照本发明,这些抗体也十分适用于生理学或药理学实验。
一般而言,制备杂交瘤包括步骤如下:
A)用例如结合于一种免疫载体,特别是结合于一种免疫载体旦白(例如主
形血青旦白)(KLH-ANP)的人或大鼠的心房钠尿肽免疫哺乳动物。雌性BaLb/c小鼠适于这种实验目的,但是采用其他种鼠也是可能的。对于KLH-ANP的浓度和免疫方式需要进行选择,从而可以形成适当数量的刺激淋巴细胞抗原。以14天为间隔,注射三次含100微克KLH-ANP的磷酸盐生理缓冲液,对小鼠是有效的。
B)得到免疫哺乳动物的脾脏(例如小鼠),并且在适当的培养基中制备脾细胞悬液。一个脾脏,大约1毫升培养液就够了。有关实验技术是已知的。
C)采用一种适当的融合促进剂,(例如聚乙二醇)将是浮的脾细胞和适当细胞系的骨髓瘤细胞进行融合(例如小鼠骨髓瘤P×63Ag8)。采用的最好融合促进剂是平均分子量1000和4000之间的聚乙二醇(例如商业提供PEG 1000等)。但是也可以采用其他已知的融合剂。脾细胞/骨髓瘤细胞的比例最好大约为10。对于108脾细胞总体积为0.5-1.0毫升融合培养基已足够。已经知道有多种小鼠骨髓瘤细胞,而且可以从研究所或细胞保存研究所得到。采用的细胞系最好具有一种遗传缺陷,这样一来,在选择培养基中非融合骨髓瘤细胞死亡,而杂种存活。经常利用的是抗8-吖乌嘌呤的细胞系,这种细胞系缺少次黄嘌呤,乌嘌呤磷酸核糖转移酶,因此不能在HAT培养基中生长。(次黄嘌呤,氨基蝶呤,胸腺嘧啶)(科学,145:709,1964)。
采用的细胞系最好也是非必泌类型的,这样它本身便不会形成抗体或免疫球旦白的H或C-链。但是在某些情况下,采用分泌的骨髓瘤细胞也可能是有益的。
D)将融合混合液(脾细胞和骨髓瘤细胞)进行稀释,在单个容器的选择性培养基中进行培养,这样一来非融合的细胞则不会增殖,并且在1-2周内死亡。通过调节稀释液的体积可以分离得到单个的融合细胞,从而使得一定数目的细胞(大约1-4个)可以置于每一容器中(例如一种微量滴定度平板的每一小孔)。
E)测定每一小孔中抗心房钠尿肽的抗体。
F)选择并克隆产生所需抗体的杂交瘤(例如采用有限的稀释)。
一旦选择得到所需杂交瘤并进行了克隆,则可能通过两种不同的方法得到抗体。当杂交瘤培养在适当培养基中一定时间则可以得到十分高纯度的单克隆抗体,这种抗体是从上清液中获得的。为了测定,要采用适当的培养基和适宜的培养时间。这种体外技术提供的单克隆抗体只被少量异源血清来源的旦白所污染(例如胎牛血清)。
为了制备一种纯度略低,十分浓的单克隆抗体,有可能通过对小鼠腹腔注射选择的杂交瘤来达到。这种小鼠最好是同源的或半同源的。经过培养,一定时间后,导致小鼠形成一种肿瘤。这种瘤在宿主动物血和腹膜渗出液(腹水)中,释放出高浓度的抗体(5-20毫克/毫升)。甚至即或这些小鼠在血和腹水中具有正常的抗体,然而它们的浓度与mAb相比仍是十分低的。这样得到的单克隆抗体滴定度很高(稀释10-3或更低时,仍有活性),特异和非特异免疫球旦白比为20∶1。
例1
制备抗人体和大鼠的心房钠尿肽单克隆抗体
制备用于免疫的抗原
采用的抗原是人-α-ANP或大鼠artripeptinⅡ(Bachem提供)和主
形血清蛋白的结合物(KLH,太平洋生物海洋供应公司)。为了制备,将KLH和人-α-ANP或atriopeptineⅡ以克分子比1∶1混合,在磷酸盐生理缓冲液中加入2毫克/毫升戊二醛。反应混合液中戊二醛最终浓度为0.25%。室温保温1小时后,蛋白结合物对磷酸盐生理缓冲液透析若干次,在4℃。
Balb/C小鼠的免疫
用溶在0.2毫升完全的Freund佐剂的100微克KLH-ANP结合物腹腔免疫雌性BaLb/C小鼠。14天后,再次用溶于不完全Freund佐剂的100微克抗原对动物进行免疫。然后,以14天为间隔再进行两次静脉免疫注射,每次注射每只动物磷酸生理缓冲液100微克,其中含50微克抗原。在最后一次注射抗原3天后,摘除动物的脾脏。
制备脾脏细胞悬液
使器管强行通过一种不锈钢筛孔,可以从摘除的脾脏得到不同的细胞悬液。将细胞转入Dulbecco最低必须培养基(DMEM),这种培养基每升含有4.5克葡萄糖,100单位青霉素和每毫升100微克链霉素。用DMEM洗涤细胞3次,然后按所需浓度再悬浮于同样培养基中。一般而言,从每一脾脏可以得到108细胞。
制备骨髓瘤细胞
本实验用的骨髓瘤细胞系X63Ag8.653是不表达任何免疫球蛋白重链或轻链的小鼠骨髓瘤系P3-X63-Ag8的亚克隆。(免疫学杂志123:1543-1550(1980))。这种细胞对于20微克/毫升8-吖乌嘌呤敏感,并且在含有次黄嘌呤,氨基碟呤和胸腺嘧啶的培养基中不能生长(HAT)。将它们培养在补加有每升4.5克葡萄糖,20mM谷氨酸胺,每毫升1000单位青霉素,100微克链霉素和10%胎牛血清(完全培养基)的DMEM培养基中。在融合时,骨髓瘤细胞正处于细胞增殖的对数生长阶段。
细胞融合
向不加血清的DMEM培养基中以与骨髓瘤10∶1的比例加入脾细胞,用园底离心杯以200g离心10分钟。当细胞沉降后,仔细地倒去上清液,将细胞与2毫升分子量2000聚乙二醇(用DMEM稀释至30%(w/w)PH7.6)37℃,保温1分钟。然后加入20毫升DMEM,这样再仔细地悬浮细胞若干分钟。再以200g离心5分钟,将细胞体再度以106细胞/毫升浓度悬浮于HAT培养基中,再将它们按每份1毫升分布于Costar平板上。
杂交瘤的选择和培养
细胞融合后于37℃在含有5%二氧化碳的湿气中,将细胞用HAT培养基进行培养(次黄嘌呤,氨基蝶呤,胸腺嘧啶)。几周后,采用适当的酶学免疫实验(见后)测定杂交瘤细胞培养得到的上清液中,存在的抗-ANP活性。挑选抗ANP实验阳性的杂交瘤细胞系进行克隆。
有必要对杂交瘤采用一种有限稀释方法,利用这种方法按每孔平均0.5细胞分布在96个微滴定度孔中,作为“喂养细胞”,将105小鼠胸腺细胞加至每一孔中。将这种克隆过程后仍然产生抗ANP抗体的细胞在含有25%胎牛血清和7.5%。二甲基亚砜的完全培养基中进行增殖,并在液氮中进行冷冻保存。
制备大量单克隆抗体
为了在10-15天后能够获得含有抗体的腹水液,对已经腹腔注射过0.5毫升鲨肝油烷的小鼠再腹腔注射克隆的杂交瘤。采用放射性结合抑制实验,(见例3),可以测定腹水液中抗体的活性。
在培养悬液中测定抗ANP的活性
将100微升培养悬液加至微滴定度平板上,平板上,一种牛血清清蛋白和人-α-ANP或大鼠artripeptinⅡ(5微克/毫升)的结合物已在室温下吸附了3小时,然后用水洗涤5次。加入同过氧化物酶结合的免抗-鼠免疫球蛋白,然后在室温下将平板保温培养2小时。用蒸馏水洗涤5次后,加入一种对酶适合的底物,再采用适用于微滴定平板的分光光度法测定生成颜色产物的浓度。
例2
抗心房钠尿肽单克隆抗体的定性
单克隆抗体的类型
分析本发明叙述的单克隆抗体分类及亚分类,从培养的上清液浓缩抗体,并采用硫酸铵(40%饱和)沉淀来部分进行提纯。采用专用于分类型的抗小鼠免疫球蛋白,抗血清进行Ouchterlong凝胶扩散实验,来确定免疫球蛋白的类型。抗人ANP的单克隆抗体23M-D9属于IgG1型。抗atriopeptinⅡ的单克隆抗体11A-A11也属于IgG1型。
抗体同多种其它肽和激素的交叉反应
采用放射免疫结合抑制实验确定了抗人ANP的单克隆抗体同多种其它肽的交叉反应。实验用一种特殊的实验缓冲液进行(0.02M磷酸钠,0.15氯化钠,0.01%乙基汞硫代水杨酸钠,0.1%明胶,0.01%牛血清清蛋白和0.1%曲拉通-X100,pH7.4)。在4℃,于合适的稀释液中,将放射性标记的碘125-α-人ANP(氨基酸1-28),或大鼠的碘125-atriopeptinⅡ(Amersham Buch-ler)同抗体一起进行保温16-28小时。总体积为500微升。在进行结合抑制实验时,在同样体积条件下,实验混合液中还要加入不同浓度的非标记抗原和多种抑制剂。保温结束时,没有同抗体结合的放射性标记碘125-抗原(具有1-28氨基酸的人-α-ANP或大鼠的atriopeptinⅡ)可以通过加入活性炭悬液而被活性炭所吸附(0.2M磷酸钠;2%桦木活性炭;0.02%葡聚糖60;0.1%牛血清清蛋白和10mM乙二胺四乙酸钠,pH7.4)。然后,在冰中保温20分钟,3600g进行离心10分钟以沉降活性炭,测定上清液的放射活性。测定了多种肽的浓度,这些肽对于显示出50%来自抗体的碘125-抗原是必要的。正如图1和图2所示,这些抗体同来源于人和大鼠的心房肽能够十分特异地进行反应。没有发现同包含于盐-水平衡调节的介质有交叉反应。多种血管活性物质也同样失活(见表1和表2)。
例3
抗心房钠尿肽单克隆抗体的应用
采用单克隆抗体测定生物液体和组织的ANP免疫活性
采用放射免疫实验能定量测定大量稀释的抗原。这种实验需要特异性高的抗体和一种放射标记抗原。放射活性标记抗原同抗体的结合可以被非放射活性抗原以剂量依赖方式进行抑制。如果不同浓度的非放射活性抗原同恒定浓度的抗体以及放射活性标记的抗原一起保温,采用这种方法则可以得到一条特征校准曲线。图1表示了这种类型的一条校准曲线并显示出采用不同atriopeptins或它们的衍生物,来自mAb 23M-D9放射活性标记抗原特异性(碘125-人-αANP,氨基酸1-28)。将抗体与放射活性抗原结合的百分比对非标记抗原的浓度或其片段以8mol/ml进行作图。
在本图中-人-αANP符号(1-28)
┅┅人-ANP片段符号(7-28)
-ANP片段符号(18-28)
如本文所叙,采用腹水,在最终稀释浓度为1∶1,500,000的条件下,进行实验。采用培养上清液进行实验也得到类似结果,不过可采用的稀释比例可以是500-1000或更低。实验清楚表明,ANP片段(18-28氨基酸)不能代替来源于抗体的放射活性标记抗原。因此,抗体同这种片段没有交叉反应性。采用这种校准曲线可以测出溶液中未知含量的抗原。基于此外所叙单克隆抗体的放射免疫实验,以及用碘125-人-αANP(氨基酸1-28)作为示踪物,则可以在浓度低至20pg/ml时仍可以在生物液体和组织提取物中进行测定。这大约相当于6fmol/ml数量。(见图1)。
图2表明以同样条件进行的mAb11A-A11特异地与大鼠atr-iopeptin进行反应。在本图中
-□-atriopeptinⅠ符号
-■-atriopeptinⅡ符号
-△-atriopeptinⅢ符号
-▲-ANP片段(13-28)
给图方式与图1同。
如本文所叙,用腹水进行实验最终稀释度为1∶1,250,000。利用培养上清液进行实验,所得结果类似,但是可以采用的稀释比例为500-1000或更低。这个实验结果清楚表明,ANP片段(氨基酸13-28)不能代替来自抗体的放射性标记抗原。因此,抗体和这种片段没有交叉反应。溶液中未知量的抗原可以利用校准曲线来确定。基于本文这里所叙述的单克隆抗体以及用碘125-atriopeptinⅢ作为示踪物则使得有可能在生物体液和组织提取物中插测浓度可以低至20pg/ml,这大约相当于6fmol/ml(见图2)。除了这里所列出的放射免疫操作外,也可以利用所提到的这种单克隆抗体其他类型免疫实验(例如ELISA,化学发光,荧光)。
例4
大鼠atriopeptin体内拮抗作用
实验用雄性Wistar大鼠(体重240-270克),在实验进行前晚上开始禁食,但可以喂水。准备和实验在inaetin麻醉下进行(100毫克/公升腹腔注射)。气管切开后,腹腔注射1毫克/毫升阿托品,将一根塑料管插入股动脉以测量血压,一根塑料管插入颈静脉以注射或输入溶液,并且固定一根囊形管。当准备工作完成后,对大鼠注射5毫升/公斤0.9氯化钠溶液,然后,在实验期间,输入同样的溶液(1.2毫升/小时)。利用热灯维持动物直肠温度在37℃±1℃。在1小时平衡后,用予先称过重量的容器收集尿液,每10或20分钟换一个容器。用火焰光度计测定尿中的钾离子和钠离子浓度。(实验仪器,Lixington,Mass/USA)。在1毫升0.9%氯化钠抗体液体中含有100微升无菌过滤的腹水和0.1%牛血清清蛋白。注射的合成atriopeptinⅡ(Bachem提供)同样溶在含有0.9%氯化钠和0.1%牛血清清蛋白的水溶液中。在所有情况下,注射体积为1毫升/公斤体重。初步实验表明,以1毫升/公斤体重含有0.1%牛血清清蛋白的0.9%氯化钠溶液进行微丸注射,则对于尿体积和钠排泄只有轻微影响。实验完成后,从每只大鼠取动脉血样品以检查其酸碱性。
在静脉进行微丸注射后,前10分钟按每公斤10微克给动物atriopeptinⅡ以增加尿和钠排泄体积(见图3和4),导致在连续收集中,这种增加迅速变为减少,1小时后,再静脉注射ANP每公斤10微克,则可以重新增加。在第二次注射ANP前5分钟,微丸注入100微升/公斤体重含腹水的抗体(抗体11A-A11),则几乎可以完全抑制尿的体积和钠的排泄。
图3和图4表明了详细的结果。
以分表示的收集时间(收集期间)为纵坐标,对以微升/分(图3a和3b)表示的尿排泄量和以μM/分表示的钠排泄量作图。(图4a和4b)。
图3a:两次微丸注入10微克/公斤atriopeptinⅡ(ANP)后尿的体积 n=4
图3b:抗ANP的nAb对10微克/公斤atriopeptinⅡ的拮抗
作用:在第二次注射ANP5分钟前,微丸注入含有腹水(Ab)的抗体100微升/公斤 n=4
图4a:两次微丸注入10微克/公斤atriopeptinⅡ(ANP)后,钠的排泄 n=4
图4b:抗ANP的mAb对20微克/公斤atriopeptinⅡ的拮抗
作用:在第二次注射ANP5分钟前,微丸注入含有腹水(Ab)的抗体100微升/公斤,n=4
因此抗体在体内拮抗atriopeptrinⅡ的钠尿作用。
表1 mAb 23 M-D9同其他具有血管活性作用的内源介质或对盐-水平衡作用的交叉反应研究
物质 最大实验浓度 交叉反应
(PM/ml)
血管紧张素Ⅱ 14 -
(人)
leu-脑啡肽 26 -
底物P 10 -
醛固酮 44 -
促肾上腺皮质激素(猪) 4 -
血管舒缓激肽 13 -
μ-促黑激素 10 -
胰岛素(大鼠) 3 -
后叶加压素 15 -
凝乳酶(猪) 0.5 -
表2 mAb 11A-A11同其他具有血管活性的内源介质及同盐-水平衡效应交叉反应的研究
物质 最大实验浓度 交叉反应性
(pmol/ml)
血管紧张素Ⅱ 14 -
(人)
leu-脑啡肽 26 -
底物P 10 -
醛固酮 44 -
促肾上腺及质激素(猪) 4 -
血管舒缓激肽 13 -
μ-促黑激素 10 -
胰岛素(鼠) 3 -
后叶加压素 15 -
凝乳酶(猪) 0.5 -
Claims (21)
1、单克隆抗体抗心房钠尿肽。
2、根据权利要求1,单克隆抗体抗哺乳动物的心房钠尿肽。
3、根据权利要求1和2,单克隆抗体抗大鼠的心房钠尿肽。
4、根据权利要求1和2,单克隆抗体抗人的心房钠尿肽。
5、根据权利要求1-4,杂交瘤系其特征是它们产生单克隆抗体。
6、根据权利要求1-4,进行制备单克隆抗体;根据权利要求5,其特征是杂交瘤系的被应用。
7、根据权利要求6,该过程特征是杂交瘤系培养在一种适当的培养基中,并从上清液得到抗体。
8、根据权利要求6,该过程特征是对小鼠注射同源或半同源杂交瘤,而从血或腹腔渗出液中得到抗体。
9、根据权利要求5,进行杂交瘤制备,其特征是骨髓瘤细胞同产生抗心房钠尿肽抗体的哺乳动物细胞融合。
10、根据权利要求9,该过程特征是免疫过的哺乳动物抗心房钠尿肽的脾细胞同骨髓瘤细胞融合。
11、根据权利要求9和10,该过程特征是免疫过的小鼠抗心房钠尿肽脾细胞同骨髓瘤细胞融合。
12、根据权利要求9至11,该过程特征是小鼠骨髓瘤细胞被应用。
13、根据权利要求9至12,该过程特征是骨髓瘤细胞是非分分泌型的。
14、根据权利要求9至13,该过程特征是采用同免疫载体相结合的心房钠尿肽进行免疫。
15、根据权利要求9至14,该过程特征是免疫载体是一种蛋白质。
16、根据权利要求1-4,利用单克隆抗体来测定生物体液的心房钠尿肽。
17、根据权利要求1-4,利用单克隆抗体测定血液、血浆、血清、尿、淋巴液或脑脊液中的心房钠尿肽。
18、根据权利要求1-4,利用单克隆抗体进行免疫实验。
19、根据权利要求1-4,利用单克隆抗体通过免疫吸附层析,来分离心房钠尿肽。
20、根据权利要求1-4,利用单克隆抗体进行动物实验研究。
21、根据权利要求1-4,利用单克隆抗体进行生理学和药理学研究。
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