CN1761682A - 单克隆抗体与产生该单克隆抗体的杂交瘤 - Google Patents
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Abstract
本发明建立了一种简单且高灵敏度的hEPR检测方法，并提供了一种检测表达hEPR的人肿瘤的新方法。特别地，本发明提供了一种特异性识别人表皮调节素(hEPR)的单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤，以及使用该单克隆抗体检测hEPR的高灵敏度的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种特异性识别人表皮调节素(epiregulin，hEPR)的单克隆抗体(MoAb)，一种产生该MoAb的杂交瘤，以及一种通过使用能识别hEPR的多克隆抗体(hEPR-PoAb)及MoAb来特异性检测样品中hEPR的免疫测量法。
技术背景
已知在癌细胞中会特异性地及高频率地发生某些基因异常，如果找到某种由基因异常产生的蛋白(或多个蛋白)，则该蛋白可用作癌症诊断及治疗的靶分子。在这些蛋白中，属于表皮生长因子(EGF)家族的一类分子与其受体ErbB家族分子由于与癌细胞生长关系密切并同恶性肿瘤相关，已在癌症诊断与治疗中用作靶分子(J.Clin.Oncol.，17，2639-2648(1999)；Biochem.Biophys.Acta.，1198，165-184(1994)；Science，244，707-712(1989)；Anticancer Res.，20：91-95(2000)；Front.Biosci..，1；6：D685-707(2001))。
已有报道表明表皮调节素(EPR)作为EGF家族的一个成员，在体外具有促进正常细胞生长并抑制某些癌细胞生长的双功能特征；而且在除胎盘与单核细胞之外的正常细胞中EPR(mRNA)的表达水平非常低，但在某些癌细胞中则很高(参见，例如，The Journal ofBiological Chemistry，1995，Vol.270，p.7495-7500；The BiochemicalJournal，1997，Vol.326，p.69-75)。
进一步地，在临床领域，已表明由于表皮调节素在膀胱癌与胰腺癌中的表达量很高，因此它可以作为癌症诊断中的有用标记(参见，例如，Biochemical and Biophysical Research Communications，2000，Vol.14，273(3)，p.1019-1024；AntiCancer Research，2000，Jan-Feb，201A9：p.91-95；Cancer Research，2001，Vol.61，p.6227-6233)。
到目前为止，已有使用识别人表皮调节素(hEPR)的多克隆抗体(hEPR-PoAb)检测EPR多肽的报道(参见，例如，The Journal ofBiological Chemistry，1995，Vol.270，p.7495-7500；The BiochemicalJournal，1997，Vol.326，p.69-75)，但由于需要浓缩操作、使用放射性同位素标记及其他类似操作，这些报道并不是高灵敏度及高通量方法；而且也没有在活体中检测EPR多肽的报道。因此，建立一种简单且具高灵敏度的检测hEPR的方法，作为一种癌症诊断方法，可以为癌症早期检测提供有用的手段。
发明的简要描述
已知在EPR与其它EGF家族成员蛋白之间氨基酸序列同源性为24至50％(参见The Journal of Biological Chemistry，1995，Vol.270，p.7495-7500)。而且，EPR序列的同源性在种间非常高，例如，人与小鼠的EPRs在46个氨基酸残基中仅有6个不同。使用前文描述的多克隆抗体来检测EPR的方法需要复杂的程序，而且不能区分人与小鼠的EPR。此外，传统检测方法的灵敏度为至多1ng/ml，因此不可能在活体中检测EPR。
本发明的目标是建立一种简单且具高灵敏度的检测hEPR的方法，并将该方法应用于人类肿瘤的检测。特别地，本发明提供了一种在皮克级水平上检测hEPR的简单方法，可用于检测肿瘤等。
本发明作者通过认真研究解决了前文所述问题并最终获得两株能够产生特异性识别hEPR的单克隆抗体(MoAb)的杂交瘤(1C3，3E8)。此外，通过MoAb与hEPR-PolyAb的结合建立了夹心酶联免疫反应方法(S-ELISA)，其是一种高灵敏度及高通量的检测系统。
因此，本发明提供了下面所述的(1)至(9)的内容。
(1)产生能特异性识别人表皮调节素(hEPR)的单克隆抗体的杂交瘤。
(2)(1)中所述的杂交瘤，其保藏号为FERM BP-08647。
(3)(1)中所述的杂交瘤，其保藏号为FERM BP-08648。
(4)(1)至(3)任何一项中的杂交瘤所产生的单克隆抗体。
(5)一种单克隆抗体，它能识别(2)或(3)中的杂交瘤产生的单克隆抗体所识别的表位，并特异性地识别hEPR。
(6)一种体外特异性地检测样品中hEPR的方法，其特征是使用了(4)中的单克隆抗体及识别hEPR的多克隆抗体(hEPR-PoAb)。
(7)一种体外检测hEPR表达细胞的方法，其特征是使用了(4)中的单克隆抗体。
(8)(7)中的方法，其中hEPR表达细胞是人肿瘤。
(9)一种包含(4)中的单克隆抗体的用来检测人肿瘤的试剂盒。
作为本申请优先权基础的日本专利申请No.2003-070864中的详述和/或附图的内容，全部引入本文作为参考。
附图的简要描述
图1显示的是本发明中的杂交瘤所产生的抗-hEPR单克隆抗体在ELISA方法中滴度测量结果。
图2显示的是生物素化抗hEPR多克隆抗体滴度测量结果。
图3显示的是使用逐步法和同步法夹心ELISA(S-ELISA)系统的检测灵敏度。
图4显示的是本方法中使用1C3单克隆抗体作为一抗的特异性检验结果。在本系统中，单克隆抗体仅同hEPR反应，不与EGF家族分子或者小鼠EPR反应，。
图5显示的是人血清中的hEPR进行Western blot分的析结果。分子量标记(kDa)的位置在左侧表示。
图6显示的是使用S-ELISA检测人血清中的hEPR。
图7显示的是检测多种细胞培养基中的hEPR。
实现本发明的优选实施例
在本发明下文的详细描述中，本领域的技术人员能够使用本领域中的已知技术在不同的实施方案中实现本发明，此外本发明并不局限于以下所列举的实施方案。
本文所用的术语“hEPR”，除非另有说明，指的是人表皮调节素的前体、成熟形式或片段。“前体”是指酶剪切之前的膜结合型，“成熟形式”指从细胞膜释放的具有46个氨基酸残基的多肽(SEQ IDNO：1)。片段包含20或者更多个氨基酸残基，或者优选地，带有多肽的30个或更多的氨基酸残基，而且必须包含人表皮调节素的特异序列。人表皮调节素的特异序列不意味着限定，而是包括，例如，包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的第2、第11、第26至29以及第39位的氨基酸的序列，已知当人表皮调节素与小鼠表皮调节素相比较时这些位点是不同的。在相同申请人的专利申请WO94/29340中描述了人与小鼠之间在这些位点上的氨基酸是不同的这个事实。当来源于人和小鼠的EPR片段相比较时，具有含这些位点在内的氨基酸序列的片段的高级结构不同。“人表皮调节素”和“小鼠表皮调节素”分别指在人与小鼠中与天然存在的EPR具有相同氨基酸序列的多肽。不过，它们并不一定限定于从自然来源中提取的蛋白，还意指包括，例如，重组体及合成的多肽。
本文所用的术语“特异性识别”指hEPR被识别(或者结合)，但是EGF家族的其它蛋白或者诸如小鼠EPR等的非人类EPR基本上不被识别(结合)。这意味着，例如，hEPR的前体、成熟蛋白与片段多肽可被识别(结合)，但是EGF、TGF-α、小鼠EPR等基本上不被识别(不结合)。特别地。这意味着特异性识别的结合亲和力，比EGF家族的其它蛋白或者诸如小鼠EPR的非人类EPR的结合亲和力要高100倍或者更高，优选地为1000倍或者更高，更优选地是10000倍以上。
本文所用的术语“基本上不被识别(结合)”是指通过本领域中或者本发明的常规检测手段无法确认发生结合。特别地，这表示hEPR的前体、成熟蛋白及片段多肽在夹心ELISA(S-ELISA)方法、Westernblot方法或其他类似方法中表现出阳性反应，但是EGF家族的EGF与TGF-α以及其他非人类哺乳动物，例如小鼠来源的EPR，表现为没有反应(没有检测到)。
本文所用的术语“抗体”是指能够与完整的全长度的hEPR分子或者hEPR片段特异性结合的多克隆抗体(PoAb)或者单克隆抗体(MoAb)，或者是这些抗体的部分片段(例如，通过使用木瓜蛋白酶或者胃蛋白酶，或者其他类似酶的消化所获得的片段(Fab或F(ab’)2或者Fab’))，它们可以通过下文所述的生产方法来产生。
本发明中的杂交瘤与单克隆抗体可以通过下文所述的方法生产。进一步地，本领域中的熟练人员可以使用那些根据下文描述及本领域中已知技术改造过的更适合的方法。
(1)抗原的制备
在WO94/29340中描述了hEPR抗原的氨基酸序列及编码该抗原的核酸序列。氨基酸序列与核酸序列分别在SEQ ID NO：1与SEQ IDNO：2中给出。进一步地，EPR在WO94/29340中描述为一种肿瘤细胞生长抑制因子。
可以按照WO94/29340中所描述的、通过构建含有编码hEPR的DNA片段(SEQ ID NO：2)的表达载体并通过在宿主细胞，例如，虽不限于但是优选的，短芽孢杆菌(Bacillus brevis)导入及表达该载体的方式来获得重组人EPR。使用短芽孢杆菌表达后，用超滤膜(1000kDa)将培养基浓缩20倍，用1M的Tris-HCl(pH8.0)将pH调节至7.4并使用阴离子交换柱，例如，Q-琼脂糖柱进行纯化。在本例中，洗脱片段的pH值调节为5.0并使用阳离子交换柱，例如，S-琼脂糖柱进一步纯化。然后，通过反相柱层析(C4柱)进行纯化以在电泳中获得单一条带。
基于SEQ ID NO：1中给出的氨基酸序列，hEPR也可以通过固相方法(Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，Vol.85，p2185(1963))来进行化学合成。固相方法的化学合成通常通过使用自动多肽合成仪的标准方法来完成。
(2)多克隆抗体的制备
单独或者同载体及稀释剂一起用抗原多肽溶液免疫接种温血动物4至6次。所用的温血动物的例子包括，例如，兔子、狗、豚鼠、小鼠、大鼠及其它类似动物。优选地，在第三次皮下免疫接种后收集血液样本测量抗体滴度。血清中抗体滴度的测量是通过将作为抗原的多肽固定在96孔微滴定板上使用ELISA方法来完成的。在确认抗体滴度已经升至足够高后，收集全血，通过标准方法分离并纯化抗体。纯化方法包括，例如，硫胺沉淀、使用诸如DEAE纤维素与其类似物作为阴离子交换剂的离子交换层析、凝胶过滤、使用诸如蛋白A/G等作为活性吸附剂的亲和层析、以及其它纯化方法。进一步地，通过使用将hEPR固定于固相的柱子可以在纯化中提高对hEPR的特异性。
(3)单克隆抗体的制备
从免疫的温血动物中选择一只抗体滴度升高的动物，在最后一次免疫接种2至5天后收集脾或淋巴结，将这些组织中的产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合后选择产MoAb的杂交瘤，从而制备产单克隆抗体的细胞。融合按照诸如Kohler等方法(Nature，256，495(1975))的已知方法进行。骨髓瘤细胞包括但并不局限于，例如，PAI，P3U1(Health Science Research Resources，HSRRB，日本，目录号为JCRB0113与JCRB0708)等。融合促进试剂包括聚乙二醇(PEG)和仙台病毒(HVJ)，不过优选的是分子量在1000至6000的PEG。通过添加浓度至约10到80％的促进试剂并在20至40℃温育可以实现有效的细胞融合。
单克隆抗体的选择可以根据已知的方法进行。一般地，它是在添加HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)的用于动物细胞的细胞培养基中进行的。用于选择与培养的培养基可以包括，例如，含有10至20％胎牛血清等的PRMI1640培养基。细胞一般在5％CO2气体的环境中于20至40℃的温度下培养5天至3周。
从培养杂交瘤的孔格中收集培养物的上清液，与抗原多肽反应的抗体可通过ELISA方法来选择。首先，抗原多肽被固定在96孔板上并用牛血清封闭。杂交瘤的上清液与小鼠免疫球蛋白/HRP(Amersham-Pharmacia)于37℃反应1小时后，使用四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(TMB；Funakoshi)作为底物进行显色。用酸中止反应后，测量450/540nm的吸光度。选取吸光度为3左右的抗体，通过有限稀释法进行克隆。
培养所获得的靶杂交瘤，可以从培养基中获得单克隆抗体。此外，杂交瘤细胞可以腹膜内接种至，例如，鼠(Balb/c)，从腹水中可获得单克隆抗体。
单克隆抗体的纯化可以按照常规分离及与上文所述的PoAb纯化相类似的方式来进行。
进一步地，本发明人于2002年9月25日向独立行政法人产业技术综合研究所(AIST)的国际专利保藏机构(Chuoh No.6，1-1-1 Higashi，Tsukuba City，Ibaragi-Ken)提交了两种杂交瘤，保藏号为FERM P-19033及FERM P-19034。更进一步地，基于国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约，它们于2004年2月27日转为国际保藏，保藏号为FERM BP-08647及FERM BP-08648。
此外，本发明的单克隆抗体包括了特异性识别由上文所述的杂交瘤——特别地，保藏号为BP-08647及FERM BP-08648的杂交瘤——所产生的单克隆抗体能够识别的表位的单克隆抗体，而且也能够识别hEPR。这些单克隆抗体所识别的表位，含有上文所述的hEPR序列所特有氨基酸残基。
本发明提供了一种体外特异性检测样品中hEPR的方法，其特征是使用了本发明上文所述的识别hEPR的多克隆抗体(hEPR-PoAb)与单克隆抗体。样品包括从受试者收集的血液、体液、组织提取物等。尽管没有限定，但优选的方法是S-ELISA检验法，它包括将可能含有hEPR抗原的样品与本发明的单克隆抗体相接触的步骤，以及将在上一个步骤中形成的抗原-抗体复合物与多克隆抗体接触的步骤。上面所述的步骤可以是顺序完成(逐步法)或者同时完成(同步法)。S-ELISA方法已有详述，譬如，参见“单克隆抗体、杂交瘤与ELISA”(Iwasaki，Tatsuo等Kodansha Scientific)；本领域的技术人员可以根据本发明的的描述来实现本发明的方法。由于本发明的检测方法非常灵敏，能够检测出10pg/ml或者以上的hEPR，足以检出在活体中表达的hEPR的浓度(约20至30pg/ml)。
本发明还提供了一种体外检测hEPR表达细胞，尤其是人体肿瘤的方法，其特征是使用了上文所述的本发明的单克隆抗体。由于在细胞中表达后，hEPR会从细胞膜分泌出来，因此可以在细胞外液中检测hEPR，样品不必含有细胞。
上面所述的方法包括将人源样品与本发明的单克隆抗体相接触的步骤，以及通过将判断单克隆抗体是否与hEPR结合作为指示物的检测hEPR存在的步骤。靶人体肿瘤包括，例如，肺、大肠、膀胱、子宫、结肠等处的恶性肿瘤，但并不局限于这些。
由于本发明检测方法的特点是高灵敏度，因此检测可以简单快速地进行，而不必经过浓缩或类似的样品处理。在本方法中，含有hEPR的样品在浓度为10pg/ml或者更高时可以通过S-ELISA方法或类似方法检出，但为了确保检出，含有25pg/ml或更高的样品是优选的。
施用本发明的方法可以检测特定肿瘤细胞等是否表达hEPR，如果表达则可测定其表达水平。进一步地，这可能用来解释hEPR表达与肿瘤发生机制之间的关系。更进一步地，基于高水平表达hEPR的肿瘤细胞与正常细胞中表达水平的数据，可以检测到特定的患者中肿瘤的存在。
本发明还提供了包括本发明的单克隆抗体在内的用于检测人类肿瘤的试剂盒。
除了本发明上文描述中提及的单克隆抗体之外，本发明的试剂盒可以适当包括多克隆抗体、缓冲液、着色剂、标记试剂、稀释剂等。优选地，本发明的试剂盒是用来进行S-ELISA的试剂盒。
下文将就本发明通过下述实施方案给出更为具体的说明，但同上文一样，本发明并不局限于这些例子。
实施例1杂交瘤的制备
100μl重组hEPR(1mg/ml)(通过WO94/29340中描述的方法制备)盐溶液与等体积的弗氏完全佐剂混合，乳化后接种至小鼠背部(Balb/c，6周龄)。2周后，使用经超声处理进行乳化的50μl抗原多肽盐溶液与弗氏不完全佐剂的混合物再次免疫接种小鼠之后，每周均进行追加的免疫接种。在免疫接种后的第40天，将脾取出，于PRM1640培养基(添加了青霉素与链霉素)中收集淋巴细胞，使用0.17M氯化铵处理除去血红细胞。分离的淋巴细胞与来源于小鼠骨髓肿瘤的骨髓瘤细胞株P3U1通过聚乙二醇法(PEG4000)进行融合以获得杂交瘤细胞。所获得的杂交瘤细胞悬浮在含有饲养细胞的HAT培养基中，然后加入到96孔板中培养15天。
实施例2单克隆抗体筛选
从培养实施例1中所获得的杂交瘤细胞的孔格中回收培养基的上清液，选取在ELISA方法中与抗原多肽反应的单克隆抗体。
首先，将100μl浓度为10μg/ml的抗原多肽加到96孔板的每个孔格中，于4℃过夜后使其固定于固相，然后用200μl浓度为10％的牛血清于37℃过夜进行封闭。将100μl杂交瘤细胞的培养基上清液加入到每个孔格中，于37℃反应2小时，然后加入稀释1000倍的辣根过氧化物酶偶联的抗-小鼠抗体(Amersham-Pharmacia)于37℃反应1小时。使用四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(TMB；Funakoshi)作为底物进行显色。
添加100μl浓度为4N的硫酸终止反应后，测量450比540nm的吸光度，选出吸光度大约为3的MoAbs--1C3及3E8，并通过有限稀释法进行克隆。
在用0.5ml降植烷对小鼠(Balb/c)进行腹腔内注射7天与3天之前，使用选定的能够产生MoAb的1C3或者3E8杂交瘤细胞对其进行腹腔内接种，并在大约10天后收集腹水。收集的腹水在室温下放置30分钟，于4℃过夜，在15000rpm条件下离心10分钟，然后回收上清液。
所选的两种MoAb的滴度通过ELISA方法来测定，结果如图1所示。水平轴所表示的是固定在微孔板上的重组hEPR的量，加入1C3或者3E8(1μg/ml)，在反应后，使用辣根过氧化物酶偶联的抗-小鼠抗体与TMB进行显色。结果表明两种MoAbs均以浓度依赖型的方式进行反应。
进一步地，能够产生MoAb 1C3与3E8的两种杂交瘤于2002年9月25日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所(AIST)的国际专利保藏机构(Center No.6，1-1-1 Higashi，Tsukuba City，Ibaragi-Ken)，保藏号为FERM P-19033和FERM P-19034。
实施例3多克隆抗体的制备
将1ml重组hEPR盐溶液(1mg/ml)与1ml弗氏完全佐剂(Difco)进行混合并用超声处理使其乳化，免疫接种兔(日本白兔，重2.7公斤，雄性；Japan Clea)背部10处或者更多部位。一个月之后，将0.5ml重组hEPR盐溶液(1mg/ml)与0.5ml弗氏不完全佐剂(Sigma)进行混合并用超声处理使其乳化，按照与第一次免疫接种相类似的方式进行第二次免疫接种。第二次免疫接种后，每周均使用通过超声处理而乳化的1ml重组hEPR盐溶液(1mg/ml)与1ml弗氏不完全佐剂进行追加的免疫接种。免疫接种后一周收集血液样品，用巴斯德管振荡后置于室温下1小时，在4℃静置过夜，然后5000×g离心10分钟以获得抗血清。
抗血清使用40％的硫酸铵进行沉淀，于50mM Tris-HCl(pH8.0)中透析过夜并通过蛋白-G柱(Amersham-Pharmacia)进行纯化以获得IgG片段。为了进一步纯化抗体，按照基于厂商说明书的常规方法，通过将1mg重组hEPR与大约1ml NHS-活化的Sepharose 4 Fast Flow(Amersham-Pharmacia)结合来制备柱子。调节通过上文所述而获得的IgG片段的pH值至8.0，在这个柱子中过柱10小时或者更长时间，结合到柱子上的抗体使用50mM Glysine-HCl(pH2.5)/0.15M NaCl来洗脱。洗脱下来的抗体立即用1M Tris调节pH至中性，并在50mM磷酸缓冲液(pH7.4)/0.15M中透析以获得hEPR的特异性抗体。
特异性抗体使用生物素化试剂(Amersham-Pharmacia)的常规方法进行生物素化。生物素化hEPR-PoAb的滴度通过下面的方法测定。最高浓度为200ng/ml的hEPR溶液稀释5倍后，固定在96孔微板上(100μl/孔)。使用25％的Block Ace(Dainippon PharmaceuticalCo.；200μl/孔)封闭后，加入生物素化抗hEPR-PoAb(0.125μg/ml至1μg/ml(使用50％Block Ace(Dainippon Pharmaceutical Co.)稀释：100μl/孔)于室温下反应2小时，然后以100μl/孔的量加入稀释1000倍的亲和素-HRP(Amersham-Pharmacia)并于室温下反应30分钟。添加TMB后，反应在室温下进行30分钟，用4N的硫酸中止反应。测量在450比540nm的吸光度，按实施例2中的方式获得针对固定在固相中的抗原的滴度。结果表明这些不同浓度抗体都表现出抗原浓度依赖性反应，从而证实它们均具有有效的滴度(图2)。
实施例4夹心ELISA系统
使用实施例2中的单克隆抗体与实施例3中的多克隆抗体构建了一个ELISA系统。
1μg/ml的单克隆抗体1C3以100μl/孔的量加到微孔板上，于4℃温育24小时固定于固相。孔格使用含有0.1％Tween 20的pH值为7.5的50mM Tris-HCl(TBST)以200μl/孔的量洗3次。以200μl/孔的量加入25％的Block Ace并于4℃温育24小时进行封闭。
在逐步法中，孔格用TBST以200μl/孔的量洗3次，加入由起始浓度1ng/ml连续两倍稀释的hEPR，于室温温育2小时，然后加入生物素化抗hEPR-PoAb(1μg/ml；100μl/孔)并于室温温育2小时。
在同步法中，同时加入hEPR抗原与生物素化抗hEPR-PoAb并于室温反应2小时。
使用TBST洗孔格5次后，以100μl/孔的量加入稀释1000倍的生物素-HPR(Amersham-Pharmacia)并在室温下温育30分钟。加入4N的硫酸来中止反应并测量450/540nm的吸光度。结果表明逐步法与同步法之间在检测灵敏度方面没有差异，两种方法都具备可对活体进行定量检测的足够的灵敏度(25pg/ml)(图3)。使用3E8作为一抗也进行了相似检验，结果是相同的。
实施例5夹心ELISA系统的特异性
本系统的特异性通过实施例4中的方法(同步法)来确认。
1C3 MoAb(1μg/ml，100μl/孔)作为一抗固定在微孔板的孔格中，在使用25％的Block Ace(200μl/孔)封闭后，以横轴所示的量，同生物素化抗hEPR-PoAb(2μg/ml，50μl/孔；最终1μg/ml)一起，加入EPR所属的EGF家族成员的一组分子(6个因子；表皮生长因子(EGF)，转化生长因子-α(TGF-α)，肝素结合EGF样生长因子(B-EGF)，β细胞素(BTC)，双调素(AR)，heregulin-α(HRG-a)：均购自R&D公司或者Sigma公司)、小鼠EPR(以与人EPR相似的方式制备)或者人EPR。EGF家族的6个成员与小鼠EPR连续稀释4次，每次稀释5倍，起始浓度为200ng/ml，以100ul/孔的量添加。与之类似，人EPR连续稀释4次，每次稀释5倍，起始浓度为200pg/ml。与亲和素-HPR反应后，使用TMB显色。
如图4所示，hEPR的检测具有高灵敏度，EGF家族分子中的其它分子及小鼠EPR即便浓度高出1000倍也不被检出，进一步证实了本夹心ELISA系统的特异性。在使用3E8作为一抗的类似检验中获得了相似结果。
实施例6人血清中人EPR的Western blot分析
使用pH值为7.4的50mM Tris-HCl缓冲液(Gibco BRL)将人血清(Rockland INC.)稀释10倍。将重组hEPR加入到稀释的人血清中，以制备5倍连续稀释的试验样品，这样最终浓度分别为泳道1：0pg/ml，泳道2：8pg/ml，泳道3：40pg/ml，泳道4：200pg/ml，泳道5：1000pg/ml。这样获得的试验样品经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转移至PVDF膜(Daiichi Pure Chemical公司)上，然后通过使用诸如抗-hEPR-PoAb、MoAb 1C3和3E8(1μg/ml)这类能识别hEPR的抗体的免疫印记方法(J.Biol.Chem.，270，7459-7500)来进行分析。结果表明每种抗体均能特异性地检测3.7至8.2kDa区域的hEPR(图5)。尽管PoAb及1C3 MoAb检出了一条约为28kDa的条带，但由于在抗原(-)的泳道也检出了相同的条带，因此它被认为是非特异性带。
实施例7通过ELISA方法检测人血清中的人EPR
浓度为1μg/ml的单克隆抗体1C3或者3E8以100μl/孔的量加到微孔板的孔格中，于4℃温育24小时固定于固相。板子用含有0.1Tween 20的pH为7.5的50mM Tris-HCl(TBST)以200μl/孔的量洗3次，并以200μl/孔的量加入Block Ace于4℃温育24小时进行封闭。使用TBST以200μl/孔的量清洗孔格3次后，2倍稀释人血清中的hEPR由起始浓度400pg/ml连续稀释两倍，并以50μl/孔的量加入。同时还以50μl/孔的量加入生物素化抗hEPR-PoAb(2μg/ml)，室温下温育2小时。使用TBST洗5次后，以100μl/孔的量加入稀释1000倍的生物素-HRP(Amersham-Pharmacia)，于室温反应30分钟。用浓度为4N的硫酸中止反应，使用TMB显色并测量450/540nm的吸光度。图6所示的结果表明浓度为25pg/ml的hEPR可被1C3与3E8中的任何一个充分检出。
实施例8培养的人肿瘤细胞所产生的EPR的检测
来源于小鼠的多种培养细胞(IC38、RAW264.7、NIH3T3 cloneT7、MoAb3)及来源于人的多种培养细胞(T-24、A-549、HCT116、colo205、colo201、HeLa、NB69、A431、SK-BR-3、MDA-MB-468、KB、TR-13)，在含有10％胎牛血清的培养基中以起始量106细胞/10ml/平皿培养3天，通过S-ELISA方法来检测培养基中的hEPR。
1C3 MoAb(1μg/μl)以100μl/孔的量固定于固相，封闭后，在单个孔格中同时加入50μl的多种细胞培养基与50μl的生物素化hEPR-PoAb(2μg/ml)并于室温下温育2小时。此后的操作同实施例4中的操作类似。作为对照，在含有或不含额外的hEPR(10％FBS、人血清、0.1％BSA(hEPR 1ng/ml)、人血清(EPR 1ng/ml))的血清中进行类似操作。
结果表明诸如能够产生小鼠EPR的NIH3T3 clone T7细胞及其它小鼠细胞的培养基中没有观察到A450nm，而在诸如A-549(人肺癌细胞)、HCT116(人结肠癌)、colo201(人结肠癌)、colo205(人结肠癌)及T-24(人膀胱癌)的人肿瘤细胞中证实有高产量的hEPR(图7)，确证了培养基中的hEPR可以被特异性地检出。然而，在诸如HeLa(人子宫癌)、NB69(人神经细胞瘤)、KB(人皮肤癌(口腔))、A431(人皮肤癌(表皮))SK-BR-3(人乳腺癌)、MDA-MB-468(人乳腺癌)及TR-13(人肾癌)的人肿瘤细胞中没有检测到hEPR。
工业适用性
根据本发明，可能提供一种能高特异性及高灵敏度地检测人血液、组织以及其他类似物中hEPR的系统，该系统可通过检测表达hEPR的肿瘤细胞而用于癌症诊断等方面。进一步地，可以预期本发明方法的应用将有助于说明hEPR表达存在与否并阐释hEPR表达与肿瘤形成机制间的关系。
本文所涉及的所有出版物、专利及专利申请均引入本文作为参考。
序列表
<110>TAISHO PHARMACEUTICAL CO.LTD.
<120>单克隆抗体与产生该单克隆抗体的杂交瘤
<130>PH-2008-PCT
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<151>2003-03-14
<160>2
<210>1
<211>46
<212>PRT
<213>智人
<400>1
Val Ser Ile Thr Lys Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Gly Gln Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys
20 25 30
Glu Val Gly Tyr Thr Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu
35 40 45
<210>2
<211>138
<212>DNA
<213>智人
<400>2
gtgtcaataa caaagtgtag ctctgacatg aatggctatt gtttgcatgg acagtgcatc 60
tatctggtgg acatgagtca aaactactgc aggtgtgaag tgggttatac tggtgtccga 120
tgtgaacact tcttttta 138
Claims (9)
1.一种能产生特异性识别人表皮调节素(hEPR)的单克隆抗体的杂交瘤。
2.权利要求1所述的杂交瘤，其保藏号为FERM BP-08647。
3.权利要求1所述的杂交瘤，其保藏号为FERM BP-08648。
4.一种根据权利要求1至3所述任一项所述的杂交瘤所产生的单克隆抗体。
5.一种单克隆抗体，它可以识别由权利要求2或3所述的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体所识别的表位，并特异性地识别hEPR。
6.一种体外特异性检测样品中hEPR的方法，其特征在于使用权利要求4所述的单克隆抗体及能够识别hEPR的多克隆抗体(hEPR-PoAb)。
7.一种体外检测表达hEPR的细胞的方法，其特征在于使用权利要求4所述的单克隆抗体。
8.权利要求7所述的方法，其中hEPR表达细胞是人肿瘤。
9.一种用于检测人肿瘤的试剂盒，其包含权利要求4所述的单克隆抗体。
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