KR101974583B1 - 링커 폴리펩티드 및 이를 이용한 표적 물질 분석 방법 - Google Patents

링커 폴리펩티드 및 이를 이용한 표적 물질 분석 방법 Download PDF

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Abstract

링커 폴리펩티드, 이를 포함하는 조성물 또는 키트, 이를 이용한 표적 물질 분석 방법에 관한 것이다. 상기 링커 폴리펩티드를 이용하면, 표적 물질의 분석시 마이크로파티클에 의해 유발될 수 있는 신호 왜곡을 방지함으로써, 진단의 정확도와 신뢰도를 증가시키는데 유용할 수 있다.

Description

링커 폴리펩티드 및 이를 이용한 표적 물질 분석 방법{Linker polypeptides and metod for analyzing target material using the same}
링커 폴리펩티드, 이를 포함하는 조성물 또는 키트, 이를 이용한 표적 물질 분석 방법에 관한 것이다.
암 전이는 원발암에서 떨어져 나온 악성 세포가 혈액을 통해 이동하여 멀리 떨어진 조직으로 전이되는 과정을 거친다. 혈액 중에 존재하여 체내를 순환하는 희소의 종양세포인 혈중 종양 세포(circulating tumor cells, CTCs)는 원발암(primary cancer)의 전이에 관여하는 인자로 알려져 있다. 전이가 진행된 환자의 경우에서 조차 혈액 중 CTC는 극히 적은 양이 존재하고, CTC를 효율적으로 분리하기 어렵다.
환자의 체내에 존재하는 암세포를 검출 및 분리하기 위해, 암세포와의 친화도를 기반으로 하는 암세포 분리 또는 크기 여과를 기반으로 하는 암세포 분리 연구가 진행되고 있다. 그러나, 친화도를 기반으로 하는 분리 기술은 분리 과정이 복잡하여 암세포가 손실되거나 초기 검출의 한계가 있을 수 있다. 또한, 크기 여과에 기반한 CTC 분리 기술은 크기가 작은 암세포를 분리할 수 없다는 한계가 있을 수 있다. 또한, 암세포를 이용한 암 진단은 단순히 암세포의 분리 및 계수에 그치는 것이 아니라 생물학적 시료 중에 포함된 종양 세포를 효율적으로 분리하여 세포 분석, 의학 연구, 제약 연구 및 질병 진단에 의미가 있는 임상적 데이터를 제시할 수 있는 응용분야로의 확장이 요구되고 있다. 검출 및 측정을 위한 전처리 뿐만 아니라 암 치료의 목적으로 암세포의 단백질, 유전자 분석 등을 통한 진단, 처방을 위한 데이터가 필요하다.
그러나, 폴리머 또는 자성 비드를 이용하여 분리된 암세포의 단백질 정량 과정에서 형광 면역 반응을 이용하는 경우, 비드에 의한 형광 시그널이 왜곡되는 현상이 발생하므로, 신뢰성 있는 분석을 위해 비드 제거 단계가 필요하다. 비드와 암세포를 분리하기 위해서는 항원과 항체의 결합 자체를 제거하거나, 그 사이에 존재하는 링커를 제거하는 방법을 활용할 수 있다. 암세포가 포함되어 있는 용액의 pH 를 변화시켜 항체의 결합력을 떨어뜨리는 등의 물리적인 방법은 암세포에 손상을 줄 수 있으며, 화합물을 처리하는 방법 또한 분자 분석이 요구되는 진단에 부적합한 방법이다.
따라서, 링커 폴리펩티드 및 제한 효소를 이용한 선택적 비드 제거를 통해, CTC 에 영향을 끼치지 않으면서 CTC 표면 단백질 및 세포 내 유전자 분석을 수행할 수 있는 방법이 여전히 요구되고 있다.
항체에 결합할 수 있는 영역 및 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역을 포함하는 링커 폴리펩티드를 제공한다.
항체에 결합할 수 있는 영역 및 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역을 포함하는 링커 폴리펩티드를 포함하는 시료 중 표적 물질 분석용 조성물을 제공한다.
항체에 결합할 수 있는 영역 및 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역을 포함하는 링커 폴리펩티드를 포함하는 시료 중 표적 물질 분석용 키트를 제공한다.
항체에 결합할 수 있는 영역 및 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역을 포함하는 링커 폴리펩티드를 이용하여 시료 중 표적 물질을 분석하는 방법을 제공한다.
항체에 결합할 수 있는 영역 및 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역을 포함하는 링커 폴리펩티드가 제공된다.
상기 항체에 결합할 수 있는 영역은 항체의 Fc 영역에 결합할 수 있는 영역일 수 있다. Fc 영역에 결합할 수 있는 영역은 Fc-결합 펩티드로 기재될 수 있다.항체의 Fc(fragment crystallizable) 영역은 Fc 수용체라고 불리는 세포 표면 수용체 및 보체의 단백질과 상호 작용하는 항체의 꼬리 영역이다. 항체의 Fc 영역은 중쇄에서 각각 두번째 불변 도메인(CH2) 및 세번째 불변 도메인(CH3)으로부터 유래된, 단백질 단편을 말한다. 항체의 Fc 영역에 결합할 수 있는 영역은 예를 들면, Fc 수용체의 단편일 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역은 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 영역일 수 있다. 용어 "프로테아제(protease)"는 용어 "펩티다제(peptidase)" 또는 "프로테이나제(proteinase)"와 혼용될 수 있다. 프로테아제는 아미노산의 펩티드 결합을 절단시키는 효소를 말한다. 프로테아제는 예를 들면, 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 메탈로프로테아제, 글루탐산 프로테아제 또는 그의 조합일 수 있다. 또한, 프로테아제는 예를 들면, TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제, 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, 펩신, 엔테로펩티다제 또는 그의 조합일 수 있다. 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역은 효소에 따라 달라질 수 있고, 당업자에게 알려진 것일 수 있다. 예를 들면, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 링커 폴리펩티드는 N 말단으로부터 항체에 결합할 수 있는 영역, 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역의 순서로 배열될 수 있다. 또는, 상기 링커 폴리펩티드는 N 말단으로부터 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역, 항체에 결합할 수 있는 영역의 순서로 배열될 수 있다.
상기 링커 폴리펩티드는 스페이서 폴리펩티드를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 스페이서 폴리펩티드는 항체에 결합할 수 있는 영역과 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역의 사이에 위치하거나, 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역의 말단에의 배열된 것일 수 있다. 스페이서 폴리펩티드는 예를 들면, 1개 내지 100개, 1개 내지 80개, 1개 내지 60개, 1개 내지 40개, 1개 내지 20개 또는 1개 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들면, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 링커 폴리펩티드는 유비퀴틴을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 스페이서 폴리펩티드는 항체에 결합할 수 있는 영역과 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역의 사이에 위치하거나, 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역의 말단에의 배열된 것일 수 있다. 유비퀴틴은 효소의 접근성을 높여 링커 펩티드의 절단 효율을 높일 수 일 수 있다. 유비퀴틴은 예를 들면, 서열번호 5의 아미노산을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
항체에 결합할 수 있는 영역 및 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역을 포함하는 링커 폴리펩티드를 포함하는 시료 중 표적 물질 분석용 조성물이 제공된다.
링커 폴리펩티드는 전술한 바와 같다.
시료는 생물학적 시료, 혈액, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 뇨, 점막액, 양수 또는 이들의 조합일 수 있다. 생물학적 시료는 예를 들면, 세포, 세포 배양액 또는 이들의 조합일 수 있다.
표적 물질은 표적 세포에 포함된 것일 수 있다. 예를 들면, 표적 물질은 표적 세포의 세포 표면 단백질, 세포내 단백질, 세포 내 핵산 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 표적 세포는 종양 세포일 수 있다. 종양 세포는 예를 들면, 원발암, 혈중 종양 세포(circulating tumor cells, CTCs), 전이암 또는 이들의 조합일 수 있다.
항체에 결합할 수 있는 영역 및 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역을 포함하는 링커 폴리펩티드를 포함하는 시료 중 표적 물질 분석용 키트가 제공된다.
링커 폴리펩티드, 시료 및 표적 물질은 전술한 바와 같다.
시료, 표적 물질에 결합할 수 있는 항체, 항체에 결합할 수 있는 영역 및 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역을 포함하는 링커 폴리펩티드, 및 마이크로파티클을 인큐베이션시켜 시료 중 표적 물질, 항체, 링커 폴리펩티드, 마이크로파티클의 복합체를 형성하는 단계; 및
상기 복합체와 상기 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역을 인식하는 효소를 인큐베이션시켜 링커 폴리펩티드를 절단하는 단계를 포함하는, 시료 중 표적 물질을 분석하는 방법이 제공된다.
상기 방법은 시료, 표적 물질에 결합할 수 있는 항체, 항체에 결합할 수 있는 영역 및 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역을 포함하는 링커 폴리펩티드, 및 마이크로파티클을 인큐베이션시켜 시료 중 표적 물질, 항체, 링커 폴리펩티드, 마이크로파티클의 복합체를 형성하는 단계를 포함한다.
시료, 표적물질 및 링커 폴리펩티드는 전술한 바와 같다.
상기 항체는 전체 항체, 항체의 부분, 항체의 단편 또는 그의 조합일 수 있다.
전체 항체는 폴리클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있다. 상기 폴리클론 항체는 당업자에 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 바이오 마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유 동물을 사용할 수 있다. 상기 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사 방법으로 주사되는 경우, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 투여될 수 있다. 이후, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리, 정제할 수 있다. 상기 단일클론 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술에 의해 제조될 수 있다. 단일클론 항체의 제조 방법에 대해 간단히 설명하면, 상기 단백질을 정제하여 적당량(약 10㎍)을 Balb/C 마우스에 면역화를 시키거나, 상기 단백질의 폴리펩티드 단편을 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화시킨 다음, 마우스에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, ELISA 방법을 사용하여 원하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 단일클론 항체를 분리, 정제할 수 있다.
항체의 부분 또는 항체의 단편은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 예를 들면, scFv, (scFv)2, Fab, Fab', F(ab')2 또는 그의 조합일 수 있다. Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-C 말단hain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-C 말단hain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
상기 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 표지를 가질 수 있다. 상기 표지는 예를 들면, 화학물질(예를 들어, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예를 들어, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예를 들어, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent), FRET(fluorescence resonance energy transfer) 또는 이들의 조합일 수 있다.
인큐베이션은 인 비트로에서 수행될 수 있다.
마이크로파티클은 폴리머 입자 또는 자성 입자일 수 있다. 예를 들면, 탄화수소 폴리머(예를 들어, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 겔일 수 있다. 마이크로파티클은 선형, 구형, 또는 다각형의 입자일 수 있다. 선형의 마이크로파티클은 비드일 수 있다.
상기 방법은 상기 복합체와 상기 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역을 인식하는 효소를 인큐베이션시켜 링커 폴리펩티드를 절단하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 효소는 전술한 바와 같다.
인큐베이션은 인 비트로에서 수행될 수 있다.
상기 방법은 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 시료 중 표적 물질, 항체, 링커 폴리펩티드, 마이크로파티클의 복합체를 형성하는 단계, 링커 폴리펩티드를 절단하는 단계 또는 이들의 조합 후에 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 방법은 표적 물질의 분석시 마이크로파티클에 의해 유발될 수 있는 신호 왜곡을 방지함으로써, 진단의 정확도와 신뢰도를 증가시키는데 유용할 수 있다.
도 1a는 Fc에 결합할 수 있는 영역, TEV 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 영역 및 스페이서를 포함하는 링커 폴리펩티드의 모식도이다. 도 1b는 암세포, 항체, 상기 링커 폴리펩티드 및 비드의 복합체를 형성하는 모식도이다.
도 2는 링커 폴리펩티드에 유비퀴틴을 결합한 링커의 모식도이다.
도 3a는 암세포 결합 전, 비드와 링커 폴리펩티드의 절단을 형광으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 3b 및 3c는 암세포 분리 후, TEV 프로테아제를 사용하여 링커 폴리펩티드의 절단 및 비드의 제거를 형광으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 암세포주에 결합된 비드의 제거 전/후의 모습을 나타낸 그림이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 링커 폴리펩티드의 제조
Fc 결합 영역, TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제 절단 영역 및 스페이서를 포함하는 링커 폴리펩티드를 제조하였다(펩트론)(도 1a).
Fc 결합 영역 : N 말단-EPIHRSTLTALL-C 말단(서열 번호 1)
TEV 프로테아제 절단 영역: N 말단-ENLYFQ-C 말단(서열 번호 2)
스페이서: N 말단-GS-C 말단(서열 번호 3) 또는 N 말단-GSSG-C 말단(서열 번호 4)
링커 폴리펩티드: N 말단-EPIHRSTLTALLGSSGENLYFQGSSGK-C 말단(서열 번호 5)
링커 폴리펩티드의 C 말단의 리신(K)은 비드와의 화학적 결합(1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC) 커플링)을 위해 추가하였다.
한편, Fc 결합 영역, TEV 절단 영역, 스페이서, 유비퀴틴, 및 히스티딘 태그를 암호화하는 핵산 서열을 제조하고(서열 번호 6), 그로부터 유비퀴틴을 포함하는 링커 폴리펩티드(재조합 단백질)를 제조하였다(제노텍 Corp.)(도 3).
Fc 결합 영역, TEV 절단 영역, 스페이서의 아미노산 서열은 전술한 바와 같다.
유비퀴틴: N 말단-MQIFVRTLTGRTITLEVEPSDTIENVRARIQDREGIPPDQQRLIFAGRQLED
GRTLSDYNIQRESTLHLVLRLRGA-C 말단(서열 번호 7)
유비퀴틴을 포함하는 링커 폴리펩티드: N 말단-MRGSEPIHRSTLTALLENLYFQGSG
SSGMQIFVRTLTGRTITLEVEPSDTIENVRARIQDREGIPPDQQRLIFAGRQLEDGRTLSDYNIQREST
LHLVLRLRGAGGHHHHHHGGC-C 말단(서열 번호 8)
실시예 2. TEV 프로테아제를 이용한 링커 폴리펩티드의 절단
링커 폴리펩티드는 N 말단에 플루오레신 이소티오-시아네이트(FITC)로 표지하였다(PEPTRON).
FITC 표지된 링커 폴리펩티드와 비드의 복합체는 1-에틸-3(3-디메틸 아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)/N 말단-히드록시숙신이미드(NHS) 커플링 방법으로 제조하였다. 구체적으로, 비드, 375 ug/ml EDC, 575 ug/ml N 말단-히드록시숙신이미드(NHS) 및 1 mg/ml FITC 표지된 링커 폴리펩티드를 순환시키면서 상온에서 3시간 이상 인큐베이션시켰다. PBS로 3회 세척하고, 2%(w/v) BSA 용액에 현탁시킨 다음 냉장 보관하였다.
FITC 표지된 링커 폴리펩티드와 비드의 복합체의 초기 형광 신호를 현광 현미경으로 측정하였다(도 3a). 링커 폴리펩티드와 비드의 복합체에 TEV 프로테아제를 링커 폴리펩티드의 질량 대비 1:1 또는 1:2로 첨가하였다. 상온에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 현광 현미경으로 형광 신호를 측정하였다(도 3b 및 3c). 큰 형광은 비드 응집에 의해 신호가 증폭 또는 왜곡된 것이다.
TEV 프로테아제의 농도에 따른 링커 폴리펩티드의 절단 효율을 표 1에 기재하였다.
배경 신호 신호 강도 신호/ 배경신호 비율
초기 형광 신호 4.14 7.33 1.77
1:1 TEV 프로테아제 8.35 10.33 1.24
1:2 TEV 프로테아제 8.31 9 1.08
그 결과, 링커 폴리펩티드의 질량 대비 2배의 효소를 첨가한 경우 대부분의 링커 폴리펩티드가 절단됨을 확인하였다.
실시예 3. 링커 폴리펩티드를 이용한 비드와 항체의 결합
유방암 세포주(MCF7)에 과량으로 발현되는 EpCAM 단백질을 인지할 수 있는 마우스 유래 항체를 실시예 1에서 제조한 링커 폴리펩티드와 결합시켰다.
구체적으로, 비드, 375 ug/ml EDC, 575 ug/ml N 말단-히드록시숙신이미드(NHS) 및 1 mg/ml 링커 폴리펩티드를 순환시키면서 상온에서 2시간 이상 인큐베이션시켰다. PBS로 3회 세척하였다. 200 ug/500 ul PBS의 항-EpCAM 항체(R&D systems)를 첨가한 후 상온에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 냉장 상태에서 밤새 인큐베이션하였다. PBS로 3회 세척하였다. 5%(w/v) BSA로 블로킹한 후 2%(w/v) BSA 용액에 현탁시키고 냉장 보관하였다.
실시예 4. TEV 프로테아제를 이용하여 암세포주로부터 비드 제거
실시예 3에서 제조한 링커 폴리펩티드, 비드 및 항체의 복합체와 5×105 개/ml의 MCF7 암세포를 상온에서 10분 동안 인큐베이션시켰다.
비드 결합이 확인된 암세포에 TEV 프로테아제를 링커 폴리펩티드와 동량으로 첨가하고, 상온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. TEV 프로테아제로 비드를 제거하고 암세포 표면에 남아 있는 비드를 현미경으로 확인하였다(도 4a 및 4b).
그 결과, 비드가 암세포 표면으로부터 제거된 것을 확인하였다.
<110> SAM SUNG ELECTRONICS <120> SAM SUNG ELECTRONICS <130> PN097726 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc binding region <400> 1 Glu Pro Ile His Arg Ser Thr Leu Thr Ala Leu Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV protease cleavage region <400> 2 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 <210> 3 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 3 Gly Ser 1 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Spacer <400> 4 Gly Ser Ser Gly 1 <210> 5 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker polypeptide <400> 5 Glu Pro Ile His Arg Ser Thr Leu Thr Ala Leu Leu Gly Ser Ser Gly 1 5 10 15 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Ser Gly Lys 20 25 <210> 6 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding Linker polypeptide <400> 6 atgagaggat cggaaccaat ccatcgtagt acgcttacgg cactcctaga aaacctgtat 60 tttcagggat ctggtagtag cggcatgcag attttcgtga gaacccttac ggggaggacc 120 atcaccctcg aagttgaacc ctcggatacg atagaaaatg taagggccag aatccaggat 180 gaaccctcgg atacgataga aaatgtaagg gccagaatcc aggataggca gctggaagat 240 ggacgtactt tgtctgacta caatattcaa agggagtcta ctcttcatct tgtgttgaga 300 cttcgtggtg ctggaggtca tcaccatcac catcacggag gttgctaa 348 <210> 7 <211> 76 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ubiquitin <400> 7 Met Gln Ile Phe Val Arg Thr Leu Thr Gly Arg Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Arg Ala Arg Ile Gln Asp 20 25 30 Arg Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Arg 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Arg Glu 50 55 60 Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Ala 65 70 75 <210> 8 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker polypeptide <400> 8 Met Arg Gly Ser Glu Pro Ile His Arg Ser Thr Leu Thr Ala Leu Leu 1 5 10 15 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Gly Ser Ser Gly Met Gln Ile Phe 20 25 30 Val Arg Thr Leu Thr Gly Arg Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser 35 40 45 Asp Thr Ile Glu Asn Val Arg Ala Arg Ile Gln Asp Arg Glu Gly Ile 50 55 60 Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Arg Gln Leu Glu Asp 65 70 75 80 Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Arg Glu Ser Thr Leu His 85 90 95 Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Ala Gly Gly His His His His His His 100 105 110 Gly Gly Cys 115

Claims (20)

  1. 시료, 표적 물질에 결합할 수 있는 항체, 및 상기 항체의 Fc 영역에 결합하는 영역 및 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역을 포함하는 링커 폴리펩티드로서 마이크로파티클이 결합된 링커 폴리펩티드를 인큐베이션시켜 시료 중 표적 물질, 항체, 링커 폴리펩티드, 마이크로파티클의 복합체를 형성하는 단계로서, 상기 항체는 검출 가능한 신호를 발생시키는 표지를 가진 것인 단계;
    상기 복합체와 상기 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역을 인식하는 효소를 인큐베이션시켜 링커 폴리펩티드를 절단하고, 이에 의해 상기 복합체로부터 마이크로파티클을 분리하는 단계; 및
    마이크로파티클이 제거된 표적 물질, 항체, 및 링커 폴리펩티드의 복합체를 검출하여 표적 물질을 검출하는 단계를 포함하는, 시료 중 표적 물질을 분석하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 시료는 생물학적 시료, 혈액, 골수액, 림프액, 타액, 누액, 뇨, 점막액, 양수 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 항체는 전체 항체, 항체의 부분, 항체의 단편 또는 그의 조합인 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 효소에 의하여 절단될 수 있는 영역은 프로테아제에 의해 절단되는 것인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 프로테아제는 TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제, 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, 펩신, 엔테로펩티다제 또는 그의 조합인 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 링커 폴리펩티드는 스페이서 폴리펩티드를 더 포함하는 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 링커 폴리펩티드는 유비퀴틴을 더 포함하는 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 표적 물질은 표적 세포에 포함된 것인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 표적 세포는 종양 세포인 것인 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 표적 세포는 혈중 종양 세포인 것인 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 마이크로파티클은 폴리머 또는 자성 입자인 것인 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 시료 중 표적 물질, 항체, 링커 폴리펩티드, 마이크로파티클의 복합체를 형성하는 단계, 링커 폴리펩티드를 절단하는 단계 또는 이들의 조합 후에 세척하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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