JP2004254656A - 酵素活性測定方法、その方法に用いる固相及びその製造方法、酵素阻害剤の阻害能評価方法、並びに酵素活性測定用キット - Google Patents
酵素活性測定方法、その方法に用いる固相及びその製造方法、酵素阻害剤の阻害能評価方法、並びに酵素活性測定用キット Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004254656A JP2004254656A JP2003051882A JP2003051882A JP2004254656A JP 2004254656 A JP2004254656 A JP 2004254656A JP 2003051882 A JP2003051882 A JP 2003051882A JP 2003051882 A JP2003051882 A JP 2003051882A JP 2004254656 A JP2004254656 A JP 2004254656A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- angiotensin
- linker
- peptide
- solid phase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
【課題】アンジオテンシン変換酵素の活性を高精度に測定でき、高感度で簡便に測定可能な、アンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法を提供すること。
【解決手段】固相担体にリンカーを介してアンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列を有する第１のペプチドが連結した第１の固相に、アンジオテンシン変換酵素を所定時間接触させ、前記固相担体に前記リンカーを介してアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を有する第２のペプチドが連結した第２の固相と、前記第１のペプチドに由来するペプチド断片とを得る酵素反応工程と、前記第２の固相に存在する前記ペプチド断片を除去する洗浄工程と、前記アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列に標識物質を結合させる標識工程と、前記標識物質を検出する検出工程と、を備えるアンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法。
【選択図】 図２
【解決手段】固相担体にリンカーを介してアンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列を有する第１のペプチドが連結した第１の固相に、アンジオテンシン変換酵素を所定時間接触させ、前記固相担体に前記リンカーを介してアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を有する第２のペプチドが連結した第２の固相と、前記第１のペプチドに由来するペプチド断片とを得る酵素反応工程と、前記第２の固相に存在する前記ペプチド断片を除去する洗浄工程と、前記アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列に標識物質を結合させる標識工程と、前記標識物質を検出する検出工程と、を備えるアンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法。
【選択図】 図２
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法、その方法に用いる固相及びその製造方法、アンジオテンシン変換酵素阻害剤の阻害能評価方法、並びに酵素活性測定用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
レニン−アンジオテンシン系は生体内における昇圧（血圧上昇）系の一つであり、血圧−体液電解質の重要な調節系である。血中には肝臓で生合成された糖タンパク質のアンジオテンシノーゲンがあり、この物質にレニンが作用してアンジオテンシン−Ｉを産生する。また、アンジオテンシン−Ｉは主に肺血管内皮細胞に存在するアンジオテンシン変換酵素によりアンジオテンシン−ＩＩとなる。アンジオテンシン−ＩＩは、末梢血管の平滑筋を直接収縮させ強い昇圧活性を発現すると共に、副腎皮質球状層に作用しアルドステロンの分泌を促進し血圧を上昇させる。
【０００３】
高血圧症、糖尿病、肥満は生活習慣病と呼ばれ、これらの疾患の予防や治療に対する関心がますます高まっているが、ヒトの本態性高血圧症にはレニン−アンジオテンシン系の亢進は認められない場合が多い。しかし、レニン−アンジオテンシン系が異常に亢進する高血圧として、ヒトでは腎血管性高血圧や悪性高血圧があり、また、希にレニン産生腫瘍による高血圧がある。
【０００４】
このようなレニン−アンジオテンシン系における酵素の作用を明らかにするためには、酵素活性測定方法が用いられる。また、これら高血圧の予防や治療に対してアンジオテンシン変換酵素阻害剤が広く用いられ効果を挙げており、創薬の大きなターゲットとなっている。
【０００５】
創薬における最初のステップとして酵素阻害剤の探索がある。目的の酵素に対して阻害剤の有効性を確かめる場合、その酵素に固有の活性測定方法を用い阻害剤の有無の条件で活性測定を行う。そして、その結果を比較検討することで阻害剤の有効性を判断できる。
【０００６】
従来、アンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法として、アンジオテンシンの昇圧作用や平滑筋収縮作用を利用するバイオアッセイ、血漿中のアンジオテンシン−ＩＩを測定するラジオイムノアッセイがあった（非特許文献１）。また、最も一般的な方法として、合成基質のｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅにアンジオテンシン変換酵素を作用させ、合成基質のＣ末端からジペプチド（Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ）を遊離させ生じた馬尿酸により酵素活性を測定する方法があった（非特許文献１、２及び３）。
【０００７】
【非特許文献１】
日和田邦夫、他２名「レニン・アンジオテンシン系と高血圧」先端医学社発行、ｐ．１３８−１４３，４０４−４０８
【非特許文献２】
丸尾文治、田宮信夫監修「酵素ハンドブック」朝倉書店発行、ｐ．５４０
【非特許文献３】
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２０， ｐｐ． １６３７−１６４８
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、バイオアッセイで測定する方法は、アンジオテンシン−ＩＩの昇圧作用や平滑筋収縮作用を利用するものであることから活性測定を高精度に行うことが困難であった。また、ラジオイムノアッセイで測定する方法は、測定に際し血中の各種アンジオテンシナーゼによるアンジオテンシン−ＩＩの分解を防止するために各種アンジオテンシナーゼ阻害薬を添加する必要があり、この阻害薬がアンジオテンシン変換酵素に対しても作用を及ぼすため真のアンジオテンシン変換酵素の活性測定を行うことができず、酵素活性の測定を高精度に行うことが困難であった。
【０００９】
さらに、合成基質を用いる方法は、アンジオテンシン変換酵素の合成基質に対する基質特異性が低いという問題がある。すなわち酵素の基質特異性を表すＫｍ値がアンジオテンシン−Ｉは０．０７ｍＭ、合成基質は２．６ｍＭである（非特許文献２）ことからもわかるように、血中のアンジオテンシン−Ｉに対するアンジオテンシン変換酵素の作用とは異なることから、この方法においても、酵素活性の測定を高精度に行うことが困難であった。
【００１０】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、アンジオテンシン変換酵素本来のアンジオテンシン−Ｉに対する活性を高精度に測定でき、高感度で簡便に測定可能な、アンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討の結果、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列を有するペプチドを固相担体に固定し、そのペプチドにアンジオテンシン変換酵素を作用させることにより血中のアンジオテンシン−Ｉに対する基質特異性と同等の基質特異性を発現させ、上記問題点を解決して、アンジオテンシン変換酵素の活性を高精度に測定できることが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、（１）固相担体にリンカーを介してアンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列を有する第１のペプチドが連結した第１の固相に、アンジオテンシン変換酵素を所定時間接触させ、上記第１のペプチドを切断することにより、上記固相担体に前記リンカーを介してアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を有する第２のペプチドが連結した第２の固相と、上記第１のペプチドに由来するペプチド断片とを得る酵素反応工程と、（２）上記第２の固相に存在する上記ペプチド断片を除去する洗浄工程と、（３）上記ペプチド断片が除去された上記第２の固相における、上記アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列に、標識物質を結合させる標識工程と、（４）上記標識物質を検出する検出工程と、を備えることを特徴とする酵素活性測定方法を提供するものである。
【００１３】
本発明の方法では、ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ等の合成基質と異なって、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列を有するペプチドを酵素基質として用いることから、アンジオテンシン変換酵素本来のアンジオテンシン−Ｉに対する活性を高精度に測定できる。また、固相担体に上記ペプチドが固定化されていることから、標識物質を結合させる対象物であるアンジオテンシン−ＩＩを固相担体に固定させることができ、標識物質の結合対象とはならない酵素反応により生じた上記ペプチドの断片は洗浄により除去できるため、アンジオテンシン−ＩＩを高感度に測定することが可能である。さらに、従来の酵素活性測定方法では血中のアンジオテンシン−ＩＩを定量していたため採血後に血漿分離を迅速に行い、各種アンジオテンシナーゼ阻害薬を添加する必要があったが、本発明ではそのような必要がなく簡便に測定することが可能である。
【００１４】
上記標識物質としては、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を認識する一次抗体であって標識された一次抗体や、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を認識する一次抗体と該抗体を抗原として認識し免疫複合体を形成する標識された二次抗体とからなる複合体を用いることができる。この場合において、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を認識する上記一次抗体は、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列におけるＰｒｏ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列を抗原決定基として認識する一次抗体であることが好ましい。
【００１５】
上記第１のペプチドは、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列及びリンカー結合性アミノ酸残基（好ましくは、システイン残基）を有しており、該リンカー結合性アミノ酸残基において、上記固相担体と上記第１のペプチドとが連結していることが好適であり、リンカー結合性アミノ酸残基は、上記第１のペプチドのＮ末端に存在し、上記リンカー結合性アミノ酸残基のアミノ基がアセチル化されていることが特に好ましい。リンカー結合性アミノ酸残基のアミノ基がアセチル化されていることにより、第１の固相における第１のペプチドの環化を効果的に防止できるため、アンジオテンシン変換酵素の活性測定をより高精度に行うことができるようになる。
【００１６】
上記酵素反応工程においては、前記アンジオテンシン変換酵素の阻害剤を添加することにより、上記第１のペプチドの切断を所定時間で停止させて、酵素反応の時間を任意に調節することが可能となる。この場合において、阻害剤はキレート試薬が好適である。
【００１７】
本発明はまた、固相担体と、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列及びリンカー結合性アミノ酸残基（好ましくは、システイン残基）を有するペプチドと、上記固相担体と上記リンカー結合性アミノ酸残基とを連結するリンカーとを備え、上記本発明の酵素活性測定方法に好適に適用可能な固相を提供する。かかる固相において上記リンカー結合性アミノ酸残基は、上記ペプチドのＮ末端に存在し、上記リンカー結合性アミノ酸残基のアミノ基がアセチル化されていることが好ましい。なお、上記固相は、固相担体とリンカーとを結合させるリンカー結合工程と、Ｎ末端にリンカー結合性アミノ酸残基（アミノ基がアセチル化されたリンカー結合性アミノ酸残基が好ましく、当該残基はシステイン残基が好ましい。）を有しアンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列を含むペプチドの、上記リンカー結合性アミノ酸残基を上記リンカーと結合させるペプチド結合工程と、を備える固相の製造方法により得ることができる。
【００１８】
本発明はさらに、（１）固相担体にリンカーを介してアンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列を有する第１のペプチドが連結した第１の固相に、アンジオテンシン変換酵素阻害剤により酵素活性が阻害されたアンジオテンシン変換酵素を所定時間接触させ、上記第１のペプチドを切断することにより、上記固相担体に上記リンカーを介してアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を有する第２のペプチドが連結した第２の固相と、上記第１のペプチドに由来するペプチド断片とを得る酵素反応工程と、（２）上記第２の固相に存在する上記ペプチド断片を除去する洗浄工程と、（３）上記ペプチド断片が除去された上記第２の固相における、上記アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列に、標識物質を結合させる標識工程と、（４）上記標識物質を検出する検出工程と、を備えることを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤の阻害能評価方法を提供する。かかる方法により、アンジオテンシン変換酵素に対して阻害能の高い阻害剤を容易にスクリーニングすることが可能となる。
【００１９】
本発明はまた、上記固相とアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を認識する抗体とを少なくとも備える、本発明の酵素活性測定方法並びに酵素阻害剤の阻害能評価方法を簡便に実施することが可能な、酵素活性測定用キットを提供する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面を参照して、本発明のアンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法、その方法に用いる固相及びその製造方法、アンジオテンシン変換酵素阻害剤の阻害能評価方法、並びに酵素活性測定用キットの好適な実施形態について詳細に説明する。なお、同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明は省略する。
【００２１】
（固相及び固相の製造方法）
先ず、図１を参照して本発明に係る固相について説明する。図１は、本発明に係る固相の一実施形態を示す模式図である。同図に示す固相１は、固相担体１０とリンカー１２と第１のペプチド３０とを備えており、固相担体１０はリンカー１２を介して第１のペプチド３０と連結している。固相１において、第１のペプチド３０は、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列２０と当該配列のＮ末端側に結合したリンカー結合性アミノ酸残基２６とを備えており、リンカー結合性アミノ酸残基２６においてリンカー１２と結合している。そして、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列２０は、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２と当該配列のＣ末端側に隣接するジペプチド２４とから構成される。本実施形態において、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列２０の配列、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２及びジペプチド２４の配列は、それぞれ、Ｎ末端側から記載して、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（配列表の配列番号１に記載の配列）、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列表の配列番号２に記載の配列）及びＨｉｓ−Ｌｅｕで表される。なお、本発明におけるペプチドは、オリゴペプチド及びポリペプチドを包含する。
【００２２】
固相担体１０としては、例えば、ガラス、セラミックス、金属酸化物等の無機物質、天然高分子、合成高分子等からなり、粒状、ブロック状、フィルム状、シート状等の形状のものが挙げられる。かかる固相担体１０は、表面がアミノ基（−ＮＨ２）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）等の官能基で修飾されていることが好ましく、特に、表面にアミノ基を有するマイクロプレートやビーズが好ましい。
【００２３】
第１のペプチド３０のＮ末端に存在するリンカー結合性アミノ酸残基２６は、システイン残基が好ましく、第１のペプチド３０の環化を防止するため、システイン残基におけるアミノ基はアセチル化されていることが好ましい。そして、システイン残基におけるメルカプト基（−ＳＨ）がリンカー１２と化学結合することで固相担体１０と第１のペプチド３０とが連結することが好ましい。好適な第１のペプチド３０の配列としては、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列２０（配列表の配列番号１に記載の配列）のＮ末端側にシステイン残基が結合した、配列表の配列番号３に記載の配列が挙げられる。
【００２４】
リンカー１２は、固相担体１０表面上の官能基に反応性の官能基とリンカー結合性アミノ酸残基２６の官能基に反応性の官能基とを有するものが好ましく、固相担体１０表面上のアミノ基（−ＮＨ２）に反応性の官能基（例えば、カルボキシル基）とシステイン残基（リンカー結合性アミノ酸残基２６）におけるメルカプト基（−ＳＨ）に反応性の官能基（例えば、ヨウ素基）とを有するものが特に好ましい。かかるリンカーとしては、モノヨード酢酸Ｎ−オキシコハク酸イミドエステルが挙げられる。
【００２５】
なお、リンカー結合性アミノ酸残基２６とアンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列２０との間には複数個（１〜３個が好ましい）のアミノ酸残基が存在していてもよく、リンカー結合性アミノ酸残基２６のＮ末端には更に複数個（１〜３個が好ましい）のアミノ酸残基が存在していてもよい。また、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列２０におけるアミノ酸残基の一つをリンカー結合性アミノ酸残基２６として用いてもよい。しかしながら、アンジオテンシン変換酵素の活性測定をより高精度に行う観点からは、本実施形態のように、第１のペプチド３０は、Ｎ末端側やＣ末端側、リンカー結合性アミノ酸残基２６とアンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列２０との間には、アミノ酸残基を有しないことが好ましく、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列２０のＮ末端側にはリンカー結合性アミノ酸残基２６であるシステイン残基を設けて、当該残基においてリンカー１２と結合させることが好ましい。
【００２６】
図１に示す固相１は、固相担体１０とリンカー１２とを結合させた後に、液相法や固相法等の一般的な合成方法（例えば、「ペプチド合成の基礎と実験（泉谷信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、丸善１９８５年）」に記載の方法）により合成した、Ｎ末端にリンカー結合性アミノ酸残基２６を有し且つアンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列３０を含む第１のペプチド３０を結合することにより製造可能である。この場合において、リンカー結合性アミノ酸残基２６とリンカー１２との間で結合を生じさせる。
【００２７】
（アンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法）
次に、図２を参照して本発明に係るアンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法について説明する。図２（ａ）〜（ｄ）は、本発明に係るアンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法の一実施形態を示す工程図であり、図２（ａ）及び（ｂ）が酵素反応工程に相当し、図２（ｃ）及び（ｄ）が、それぞれ、洗浄工程及び標識工程に相当する。
【００２８】
本実施形態においては、先ず、固相担体１０がリンカー１２を介して第１のペプチド３０と連結した、上述の固相１を準備する（図２（ａ））。この第１の固相１に、アンジオテンシン変換酵素を所定時間接触させると、第１のペプチド３０が切断され、固相担体１０にリンカー１２を介してアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２を有する第２のペプチド３２が連結した第２の固相２と、第１のペプチド３０に由来するペプチド断片４０，４２が得られる（図２（ｂ））。なお、ジペプチド２４もペプチド断片として得られる。ここで、第２の固相２における第２のペプチド３２は、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２と当該配列のＮ末端側に結合したリンカー結合性アミノ酸残基２６とを備えており、リンカー結合性アミノ酸残基２６においてリンカー１２と結合している。図２（ｂ）においては、第１のペプチド３０から、ペプチド断片であるジペプチド２４の他に、種々のペプチド断片（ペプチド断片４０，４２）が生じているが、これは、アンジオテンシン変換酵素の活性を測定するため被検者や被検動物から血漿を採取すると、各種アンジオテンシナーゼが混在するからである。
【００２９】
上記に引き続いて、第２の固相２に存在するペプチド断片４０，４２やペプチド断片であるジペプチド２４の除去を行う（図２（ｃ））。これらの除去は、上記断片が混在した第２の固相２を、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０等）を含有するリン酸バッファー（Ｐｈｏｓｏｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅｓ， ＰＢＳ）で洗浄することにより実施することが好ましい。ペプチド断片の除去により、標識物質を結合させる対象物（アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２）以外の断片が第２の固相２から除かれるため、検出工程において、精度よく酵素活性を測定できるようになる。
【００３０】
ペプチド断片を除去した後に、第２の固相２におけるアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２に、標識物質６０を結合させる（図２（ｄ））。本実施形態では、標識物質６０は、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２を認識する一次抗体５０に標識５２を付加させたものである。また、標識物質６０は、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２におけるＰｒｏ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列を認識する。測定感度の観点から一次抗体５０は、モノクローナル抗体であることが好ましい。標識５２としては、放射性同位体、蛍光物質、酵素（ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、ＡＬＰ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）等）を用いることができ、これらの標識５２を公知の方法にしたがって一次抗体５０に付加させることができる。
【００３１】
以上のようにして、酵素反応工程、洗浄工程及び標識工程を実施した後に、標識物質６０を検出する検出工程を実施する。標識物質６０が標識５２として放射性同位体を備える場合はラジオイムノアッセイ法に準じて標識物質６０が検出可能であり、標識５２として蛍光物質を備える場合は、公知の蛍光検出法を適用して標識物質６０が検出可能である。また、標識物質６０が標識５２として酵素であるＨＲＰを備える場合は、例えば、ｏ−フェニレンジアミンを更に反応させて４９０ｎｍの吸光度を測定することにより標識物質６０を検出可能である。
【００３２】
本発明に係る酵素活性測定方法を適用するに当たり、酵素反応工程において、アンジオテンシン変換酵素の阻害剤（ＥＤＴＡ等のキレート剤が好ましい。）を添加することにより、第１のペプチドの切断を所定時間で停止させることができる。この場合において、第１のペプチドの切断を停止させるまでの時間は、アンジオテンシン変換酵素の阻害剤の量を変化させること等により容易に制御可能であることから、所定の時間でどの程度の酵素活性が発揮されるかを測定することができる。また、種々の時間で酵素活性を測定することにより、酵素反応の進行を経時的に調べることも可能になる。また、上記結果に基づいて検量線を作製しておけば、１回の測定により酵素活性の度合いを評価することができる。
【００３３】
本実施形態においては、標識工程において、標識物質６０として、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２を認識する一次抗体５０に標識５２を付加させたものを用いたが、図３に示すように、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２を認識する一次抗体５０と標識５２で標識された二次抗体５４とからなる複合体を標識物質６０として用いてもよい。なお、二次抗体５４は一次抗体５０を抗原として認識し免疫複合体を形成する抗体である。
【００３４】
（アンジオテンシン変換酵素阻害剤の阻害能評価方法）
本発明に係るアンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法は、アンジオテンシン変換酵素阻害剤の阻害能評価方法としても適用可能である。かかる評価方法を実施する場合は、酵素反応工程において、アンジオテンシン変換酵素にアンジオテンシン変換酵素阻害剤を加えることにより得られる、酵素活性が阻害されたアンジオテンシン変換酵素を用いればよい。アンジオテンシン変換酵素阻害剤の阻害能が高ければ、酵素反応工程で第１のペプチドが切断され難いため、検出工程で検出される標識物質の量が減少する。したがって、検出量の減少でアンジオテンシン変換酵素阻害剤の阻害能の高さが評価できる。また、同一構成の第１の固相に対して種類の異なる阻害剤を添加し、標識物質の検出量を比較することにより、アンジオテンシン変換酵素に対する活性の高い阻害剤をスクリーニングすることも可能である。
【００３５】
（酵素活性測定用キット）
本発明に係る酵素活性測定用キットは、上述した本発明に係る固相とアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を認識する抗体を少なくとも備えるものである。アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を認識する上記抗体は、標識されていない一次抗体であっても、標識された一次抗体であってもよい。また、一次抗体と、これを抗原として認識し免疫複合体を形成する二次抗体と、からなる複合体（当該二次抗体は標識されていてもよい。）も適用できる。なお、酵素活性測定用キットには、洗浄液、酵素反応停止溶液、検体希釈液、緩衝液、標識物質に対する基質（基質錠等）、標識二次抗体等を更に備えていてもよい。
【００３６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３７】
以下の実施例では、先ず、アンジオテンシン−ＩＩアミノ酸配列におけるＰｒｏ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列を認識する一次抗体（以下、単に「一次抗体」という。）を調製し、この一次抗体を、固相担体に連結させた（以下、「固相化した」という。）アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列を有するペプチド（当該ペプチドを以下「酵素基質」という。）並びに固相化したアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を有するペプチド（当該ペプチドを以下「酵素産物」という。）に反応させた。これにより、酵素産物に対してのみ一次抗体が基質特異性を発現することを確認した。次に、固相化した酵素基質にアンジオテンシン変換酵素を反応させ、酵素活性を測定した（実施例１）。更に、酵素阻害剤としてＥＤＴＡを用い、その酵素阻害能を評価した（実施例２）。
【００３８】
［一次抗体の調製］
６０μｇ／０．３ｍｌに調製したアンジオテンシン−ＩＩ抗原液（キャリアタンパク質（ウシサイログロブリン）結合アンジオテンシン−ＩＩ、ＳｙｎＰｅｐ社製）にアジュバントを１：１で加え、２本のガラス製注射器を用いて十分乳化した。この乳液を注射針２７Ｇを用いてＢａｌｂ／ｃマウスへ皮下・皮内注射を行い、７日毎に４回免疫を行った。４回免疫後、尾静脈より少量採血し、その抗体力価を測定した。なお、抗体力価の測定は、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社製、イムノプレート）へアンジオテンシン−ＩＩ（上記抗原と同様のもの）を５０ｎｇ／ｗｅｌｌ固相化した酵素免疫測定法（ＥＩＡ）にて行った。
【００３９】
抗体力価の上昇したＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞を常法に従い培養マウス骨髄細胞Ｘ−６３ Ａｇｅ８（（株）免疫生物研究所製）と細胞融合させ、スクリーニングを行った。各クローンについては１次クローニング後、更に２次クローニングを行い、最終的に３種類のクローンを得た。得られたクローンのうち１種類のクローン（５４Ｂ１）を大量培養し、培養上清からプロティンＡカラム（ファルマシアバイオテク社製）を用いたアフィニティクロマトグラフィーによりＩｇＧ画分を精製し、一次抗体を得た。
【００４０】
［酵素基質及び酵素産物の調製］
アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列（配列表の配列番号１に記載の配列）を有するペプチドのＮ末端にシステイン（Ｃｙｓ）を付加したペプチド（配列表の配列番号３に記載の配列）を合成し、Ｎ−末端アミノ酸残基（Ｃｙｓ）のα−アミノ基をアセチル化し酵素基質（配列表の配列番号５に記載の配列）とした。同様に、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列（配列表の配列番号２に記載の配列）を有するペプチドのＮ末端にシステインを付加したペプチド（配列表の配列番号４に記載の配列）を合成し、Ｎ−末端アミノ酸残基（Ｃｙｓ）のα−アミノ基をアセチル化し酵素産物（配列表の配列番号６に記載の配列）とした。
【００４１】
なお、上記ペプチドは、ペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いＢｏｃ法（例えば、新生化学実験講座１、タンパク質ＶＩ、日本生化学会編、１９９２年を参照）に基づいて合成し、得られたペプチドは高速液体クロマトグラフィーにより精製することにより得た。高速液体クロマトグラフィーはＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ（ワイエムシー社製、３０ｍｍ内径×２５０ｍｍ全長）を用い、流速２０ｍＬ／分、検出波長２２０ｎｍ、移動相アセトニトリル勾配−０．１％トリフルオロ酢酸で、１０〜６０％の条件で行った。
【００４２】
［酵素基質及び酵素産物の固相化］
表面にアミノ基を有するマイクロプレートであるＮｕｎｃ社製ＣｏｖａＬｉｎｋ Ｍｏｄｕｌｅプレートの各ウエルに０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）を４５μＬ添加した。これに２０ｍＭモノヨード酢酸Ｎ−オキシコハク酸イミドエステルのジメチルホルムアミド溶液５μｌを添加し、４℃、一昼夜反応させた。１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） を各ウエルに１５０μｌ加え、室温にて約２時間半攪拌しながら反応させた。反応後、５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ含有０．１Ｍリン酸・Ｎａ 緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄し、同緩衝液に１７７ｎｇ／５０μＬとなるよう溶解した酵素基質あるいは産物を各ウエル５０μｌとなるよう加え、４℃にて一昼夜反応させた。反応後、同緩衝液に溶解した１００ｍＭ Ｌ−システイン溶液を各ウエル５０μＬとなるよう加え、室温にて約３時間攪拌しながら反応させた。その後、ダルベッコリン酸緩衝液（以下Ｄ−ＰＢＳ（−））にて２回洗浄し、０．１％ウシ血清アルブミン含有Ｄ−ＰＢＳ（−）を各ウエル２００μｌずつ添加し、４℃、一昼夜反応させた。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）にて５回洗浄し、実験に供するまで乾燥状態で−８０℃にて保存した。以上により、固相担体（表面にアミノ基を有する上記マイクロプレート）にリンカー（モノヨード酢酸Ｎ−オキシコハク酸イミドエステル）を介して上記酵素基質（配列表の配列番号５に記載の配列）が結合した固相と、固相担体（表面にアミノ基を有する上記マイクロプレート）にリンカー（モノヨード酢酸Ｎ−オキシコハク酸イミドエステル）を介して上記酵素産物（配列表の配列番号６に記載の配列）が結合した固相とが得られた。なお、リンカーであるモノヨード酢酸Ｎ−オキシコハク酸イミドエステルは、上記酵素基質又は酵素産物のＮ末端システインのメルカプト基、並びに、上記固相担体のアミノ基、において結合を生じた。
【００４３】
［固相化した酵素基質及び酵素産物に対する抗体の反応性］
酵素基質又は酵素産物を固相化したマイクロプレートの各ウエルへ、３１．２５ｎｇ／５０μＬとなるように０．１％ウシ血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）に溶解した抗体溶液を各ウエルへ５０μＬずつ添加し、３７℃にて攪拌しながら３０分間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）にて５回洗浄した。ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギＩｇＧ Ｆａｂ’抗体（（株）免疫生物研究所製）を２５ｎｇ／５０μＬとなるように０．１％ウシ血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）に溶解し、各ウエルへ５０μＬずつ添加し、３７℃にて攪拌しながら３０分間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）にて５回洗浄した。０−フェニレンジアミン（ＳＩＧＭＡ社製）を０．１％過酸化水素含有リン酸水素カリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．１）に４０μＬ／１００μＬとなるよう溶解し、各ウエルへ１００μＬずつ添加し、遮光下、室温にて１５分間反応させた。反応後、１Ｎ 硫酸を各ウエルへ１００μＬずつ添加し、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社製、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０）を用いて４９０ｎｍの吸光度を測定した。酵素基質固相化プレート及び酵素産物固相化プレートのそれぞれについて、以上の測定を４回行い、各回の測定で得られた吸光度の値からそれぞれ平均値及び標準偏差値を求めた。表１にこのようにして求めた平均値及び標準偏差値を「平均値±標準偏差値」として示す。表１の結果から、抗体は酵素基質とは結合せず、酵素産物とのみ結合することが証明された。
【００４４】
【表１】
【００４５】
［酵素活性の測定］
（実施例１）
アンジオテンシン変換酵素はＳＩＧＭＡ社製ウサギ肺由来のものを用いた。３００ｍＭ ＮａＣｌ含有０．１Ｍりん酸・Ｎａ 緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解後、実験に供するまで−８０℃にて保存した。９．５ｎｇ／５０μＬとなるよう調製したアンジオテンシン変換酵素溶液を、酵素基質を固相化したマイクロプレートのウエルへ５０μＬずつ添加し、３７℃にて攪拌しながらそれぞれ１０分間、２０分間、３０分間反応させた。反応は、０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）を各ウエルへ１００μＬずつ添加することにより停止させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）にて５回洗浄し、３１．２５ｎｇ／５０μＬとなるように０．１％ウシ血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）に溶解した抗体溶液を各ウエルへ５０μＬずつ添加し、３７℃にて攪拌しながら３０分間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）にて５回洗浄した。 ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギＩｇＧ Ｆａｂ’抗体（（株）免疫生物研究所製）を２５ｎｇ／５０μＬとなるように０．１％ウシ血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）に溶解し、各ウエルへ５０μＬずつ添加し、３７℃にて攪拌しながら３０分間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）にて５回洗浄した。
【００４６】
０−フェニレンジアミン（ＳＩＧＭＡ社製）を０．１％過酸化水素含有リン酸水素カリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．１）に４０μｌ／１００μｌとなるよう溶解し、各ウエルへ１００μＬずつ添加し、遮光下、室温にて１５分間反応させた。反応後、１Ｎ 硫酸を各ウエルへ１００μＬずつ添加し、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社製、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０）を用いて４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４７】
（比較例１）
実施例１における、アンジオテンシン変換酵素溶液の代わりに、３００ｍＭ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸・Ｎａ 緩衝液（ｐＨ８．３）を実施例１と同じ条件の３個のウエルへ５０μＬずつ添加し、３７℃で攪拌しながらそれぞれ１０分間、２０分間、３０分間反応させたこと以外は、実施例１と同様にして４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４８】
実施例１及び比較例１の結果を図４に示す。図４よりアンジオテンシン変換酵素を添加した実施例１は、時間の変化と共に酵素産物の生成量が増加しており、酵素活性を測定できた。他方、アンジオテンシン変換酵素を添加しなかった比較例１は、酵素産物は生成していないことが確認された。このように本発明の酵素活性測定方法によれば、アンジオテンシン変換酵素の酵素活性を測定でき、酵素基質として一部にアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を有するペプチドを用いることから、酵素の高い基質特異性が発現し酵素活性を高精度に測定することが可能になる。
【００４９】
［酵素阻害剤の阻害能の評価］
先ず、３００ｍＭ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸・Ｎａ緩衝液（ｐＨ８．３）に５０μｇ／５μＬとなるようアンジオテンシン変換酵素（ＳＩＧＭＡ社製、ウサギ肺由来）を溶解した。次に、阻害剤である０．５Ｍ ＥＤＴＡを含有し、３００ｍＭ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸・Ｎａ緩衝液（ｐＨ８．３）を用いて９．５ｎｇ／５０μＬとなるよう調製した（ａ）阻害剤含有アンジオテンシン変換酵素溶液と、３００ｍＭ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸・Ｎａ緩衝液（ｐＨ８．３）を用い９．５ｎｇ／５０μＬとなるよう調製した（ｂ）アンジオテンシン変換酵素溶液（酵素阻害剤非存在）を用いて、上記酵素活性の測定と同様の方法にて酵素反応を行った。
【００５０】
（実施例２）
３００ｍＭ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸・Ｎａ 緩衝液（ｐＨ８．３）に５０μｇ／５μＬとなるようアンジオテンシン変換酵素（ＳＩＧＭＡ社製、ウサギ肺由来）を溶解した。０．５Ｍ ＥＤＴＡを含有する３００ｍＭ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸・Ｎａ 緩衝液（ｐＨ８．３）にて９．５ｎｇ／５０μＬとなるように調製したアンジオテンシン変換酵素溶液（酵素阻害剤存在）を用いて、実施例１と同様の方法にて酵素反応を行った
【００５１】
酵素基質を固相化したマイクロプレートのウエルへ５０μＬずつ添加し、３７℃にて攪拌しながら３０分間反応させた。反応後、０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）を各ウエルへ１００μＬずつ添加した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）にて５回洗浄し、３１．２５ｎｇ／５０μＬとなるように０．１％ウシ血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）に溶解した抗体溶液を各ウエルへ５０μＬずつ添加し、３７℃にて攪拌しながら３０分間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）にて５回洗浄した。 ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギＩｇＧ Ｆａｂ’抗体（（株）免疫生物研究所製）を２５ｎｇ／５０μｌとなるように０．１％ウシ血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）に溶解し、各ウエルへ５０μＬずつ添加し、３７℃にて攪拌しながら３０分間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）にて５回洗浄した。０−フェニレンジアミン（ＳＩＧＭＡ社製）を０．１％過酸化水素含有リン酸水素カリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．１）に４０μｌ／１００μＬとなるよう溶解し、各ウエルへ１００μＬずつ添加し、遮光下、室温にて１５分間反応させた。反応後、１Ｎ 硫酸を各ウエルへ１００μＬずつ添加し、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社製、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０）を用いて４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５２】
（実施例３）
０．５Ｍ ＥＤＴＡを含有する３００ｍＭ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸・Ｎａ 緩衝液（ｐＨ８．３）にて９．５ｎｇ／５０μＬとなるように調製したアンジオテンシン変換酵素溶液（酵素阻害剤存在）に代えて、３００ｍＭ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸・Ｎａ 緩衝液（ｐＨ８．３）にて９．５ｎｇ／５０μＬとなるように調製したアンジオテンシン変換酵素溶液（酵素阻害剤非存在）を用いた以外は、実施例２と同様にして４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５３】
実施例２及び３のそれぞれについて測定を４回行い、各回の測定で得られた吸光度の値からそれぞれ平均値及び標準偏差値を求めた。表２にこのようにして求めた平均値及び標準偏差値を「平均値±標準偏差値」として示す。表２の結果から、阻害剤である０．５Ｍ ＥＤＴＡを含有している実施例２では酵素の活性が阻害されたことが確認され、他方、阻害剤の存在しない実施例３では酵素は活性であることが確認され、アンジオテンシン変換酵素の阻害剤の作用を評価することができることが証明された。
【００５４】
【表２】
【００５５】
【発明の効果】
以上示したとおり、本発明のアンジオテンシン変換酵素の活性測定方法によれば、アンジオテンシン変換酵素の活性を高精度に測定でき、更に高感度で簡便に測定することが可能となる。また、本発明の固相を用いることにより酵素活性を高精度に測定でき、本発明の酵素阻害剤の阻害能評価方法によりアンジオテンシン変換酵素阻害剤のスクリーニングを容易に行うことができる。さらに、本発明の酵素活性測定用キットによれば、アンジオテンシン変換酵素の活性測定を容易に行うことができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る固相の一実施形態を示す模式図である。
【図２】本発明に係るアンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法の一実施形態を示す工程図である。
【図３】一次抗体と標識された二次抗体とからなる複合体を用いて標識工程を実施したときの模式図である。
【図４】実施例１及び比較例１で得られた吸光度を示す図である。
【符号の説明】
１・・・第１の固相、２・・・第２の固相、１０・・・固相担体、１２・・・リンカー、２０・・・アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列、２２・・・アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列、２４・・・ジペプチド、２６・・・リンカー結合性アミノ酸残基、３０・・・第１のペプチド、３２・・・第２のペプチド、４０，４２・・・ペプチド断片、５０・・・一次抗体、５２・・・標識、５４・・・二次抗体、６０・・・標識物質。
【発明の属する技術分野】
本発明は、アンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法、その方法に用いる固相及びその製造方法、アンジオテンシン変換酵素阻害剤の阻害能評価方法、並びに酵素活性測定用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
レニン−アンジオテンシン系は生体内における昇圧（血圧上昇）系の一つであり、血圧−体液電解質の重要な調節系である。血中には肝臓で生合成された糖タンパク質のアンジオテンシノーゲンがあり、この物質にレニンが作用してアンジオテンシン−Ｉを産生する。また、アンジオテンシン−Ｉは主に肺血管内皮細胞に存在するアンジオテンシン変換酵素によりアンジオテンシン−ＩＩとなる。アンジオテンシン−ＩＩは、末梢血管の平滑筋を直接収縮させ強い昇圧活性を発現すると共に、副腎皮質球状層に作用しアルドステロンの分泌を促進し血圧を上昇させる。
【０００３】
高血圧症、糖尿病、肥満は生活習慣病と呼ばれ、これらの疾患の予防や治療に対する関心がますます高まっているが、ヒトの本態性高血圧症にはレニン−アンジオテンシン系の亢進は認められない場合が多い。しかし、レニン−アンジオテンシン系が異常に亢進する高血圧として、ヒトでは腎血管性高血圧や悪性高血圧があり、また、希にレニン産生腫瘍による高血圧がある。
【０００４】
このようなレニン−アンジオテンシン系における酵素の作用を明らかにするためには、酵素活性測定方法が用いられる。また、これら高血圧の予防や治療に対してアンジオテンシン変換酵素阻害剤が広く用いられ効果を挙げており、創薬の大きなターゲットとなっている。
【０００５】
創薬における最初のステップとして酵素阻害剤の探索がある。目的の酵素に対して阻害剤の有効性を確かめる場合、その酵素に固有の活性測定方法を用い阻害剤の有無の条件で活性測定を行う。そして、その結果を比較検討することで阻害剤の有効性を判断できる。
【０００６】
従来、アンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法として、アンジオテンシンの昇圧作用や平滑筋収縮作用を利用するバイオアッセイ、血漿中のアンジオテンシン−ＩＩを測定するラジオイムノアッセイがあった（非特許文献１）。また、最も一般的な方法として、合成基質のｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅにアンジオテンシン変換酵素を作用させ、合成基質のＣ末端からジペプチド（Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ）を遊離させ生じた馬尿酸により酵素活性を測定する方法があった（非特許文献１、２及び３）。
【０００７】
【非特許文献１】
日和田邦夫、他２名「レニン・アンジオテンシン系と高血圧」先端医学社発行、ｐ．１３８−１４３，４０４−４０８
【非特許文献２】
丸尾文治、田宮信夫監修「酵素ハンドブック」朝倉書店発行、ｐ．５４０
【非特許文献３】
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２０， ｐｐ． １６３７−１６４８
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、バイオアッセイで測定する方法は、アンジオテンシン−ＩＩの昇圧作用や平滑筋収縮作用を利用するものであることから活性測定を高精度に行うことが困難であった。また、ラジオイムノアッセイで測定する方法は、測定に際し血中の各種アンジオテンシナーゼによるアンジオテンシン−ＩＩの分解を防止するために各種アンジオテンシナーゼ阻害薬を添加する必要があり、この阻害薬がアンジオテンシン変換酵素に対しても作用を及ぼすため真のアンジオテンシン変換酵素の活性測定を行うことができず、酵素活性の測定を高精度に行うことが困難であった。
【０００９】
さらに、合成基質を用いる方法は、アンジオテンシン変換酵素の合成基質に対する基質特異性が低いという問題がある。すなわち酵素の基質特異性を表すＫｍ値がアンジオテンシン−Ｉは０．０７ｍＭ、合成基質は２．６ｍＭである（非特許文献２）ことからもわかるように、血中のアンジオテンシン−Ｉに対するアンジオテンシン変換酵素の作用とは異なることから、この方法においても、酵素活性の測定を高精度に行うことが困難であった。
【００１０】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、アンジオテンシン変換酵素本来のアンジオテンシン−Ｉに対する活性を高精度に測定でき、高感度で簡便に測定可能な、アンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意検討の結果、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列を有するペプチドを固相担体に固定し、そのペプチドにアンジオテンシン変換酵素を作用させることにより血中のアンジオテンシン−Ｉに対する基質特異性と同等の基質特異性を発現させ、上記問題点を解決して、アンジオテンシン変換酵素の活性を高精度に測定できることが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は、（１）固相担体にリンカーを介してアンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列を有する第１のペプチドが連結した第１の固相に、アンジオテンシン変換酵素を所定時間接触させ、上記第１のペプチドを切断することにより、上記固相担体に前記リンカーを介してアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を有する第２のペプチドが連結した第２の固相と、上記第１のペプチドに由来するペプチド断片とを得る酵素反応工程と、（２）上記第２の固相に存在する上記ペプチド断片を除去する洗浄工程と、（３）上記ペプチド断片が除去された上記第２の固相における、上記アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列に、標識物質を結合させる標識工程と、（４）上記標識物質を検出する検出工程と、を備えることを特徴とする酵素活性測定方法を提供するものである。
【００１３】
本発明の方法では、ｈｉｐｐｕｒｙｌ−Ｌ−ｈｉｓｔｉｄｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ等の合成基質と異なって、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列を有するペプチドを酵素基質として用いることから、アンジオテンシン変換酵素本来のアンジオテンシン−Ｉに対する活性を高精度に測定できる。また、固相担体に上記ペプチドが固定化されていることから、標識物質を結合させる対象物であるアンジオテンシン−ＩＩを固相担体に固定させることができ、標識物質の結合対象とはならない酵素反応により生じた上記ペプチドの断片は洗浄により除去できるため、アンジオテンシン−ＩＩを高感度に測定することが可能である。さらに、従来の酵素活性測定方法では血中のアンジオテンシン−ＩＩを定量していたため採血後に血漿分離を迅速に行い、各種アンジオテンシナーゼ阻害薬を添加する必要があったが、本発明ではそのような必要がなく簡便に測定することが可能である。
【００１４】
上記標識物質としては、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を認識する一次抗体であって標識された一次抗体や、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を認識する一次抗体と該抗体を抗原として認識し免疫複合体を形成する標識された二次抗体とからなる複合体を用いることができる。この場合において、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を認識する上記一次抗体は、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列におけるＰｒｏ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列を抗原決定基として認識する一次抗体であることが好ましい。
【００１５】
上記第１のペプチドは、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列及びリンカー結合性アミノ酸残基（好ましくは、システイン残基）を有しており、該リンカー結合性アミノ酸残基において、上記固相担体と上記第１のペプチドとが連結していることが好適であり、リンカー結合性アミノ酸残基は、上記第１のペプチドのＮ末端に存在し、上記リンカー結合性アミノ酸残基のアミノ基がアセチル化されていることが特に好ましい。リンカー結合性アミノ酸残基のアミノ基がアセチル化されていることにより、第１の固相における第１のペプチドの環化を効果的に防止できるため、アンジオテンシン変換酵素の活性測定をより高精度に行うことができるようになる。
【００１６】
上記酵素反応工程においては、前記アンジオテンシン変換酵素の阻害剤を添加することにより、上記第１のペプチドの切断を所定時間で停止させて、酵素反応の時間を任意に調節することが可能となる。この場合において、阻害剤はキレート試薬が好適である。
【００１７】
本発明はまた、固相担体と、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列及びリンカー結合性アミノ酸残基（好ましくは、システイン残基）を有するペプチドと、上記固相担体と上記リンカー結合性アミノ酸残基とを連結するリンカーとを備え、上記本発明の酵素活性測定方法に好適に適用可能な固相を提供する。かかる固相において上記リンカー結合性アミノ酸残基は、上記ペプチドのＮ末端に存在し、上記リンカー結合性アミノ酸残基のアミノ基がアセチル化されていることが好ましい。なお、上記固相は、固相担体とリンカーとを結合させるリンカー結合工程と、Ｎ末端にリンカー結合性アミノ酸残基（アミノ基がアセチル化されたリンカー結合性アミノ酸残基が好ましく、当該残基はシステイン残基が好ましい。）を有しアンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列を含むペプチドの、上記リンカー結合性アミノ酸残基を上記リンカーと結合させるペプチド結合工程と、を備える固相の製造方法により得ることができる。
【００１８】
本発明はさらに、（１）固相担体にリンカーを介してアンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列を有する第１のペプチドが連結した第１の固相に、アンジオテンシン変換酵素阻害剤により酵素活性が阻害されたアンジオテンシン変換酵素を所定時間接触させ、上記第１のペプチドを切断することにより、上記固相担体に上記リンカーを介してアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を有する第２のペプチドが連結した第２の固相と、上記第１のペプチドに由来するペプチド断片とを得る酵素反応工程と、（２）上記第２の固相に存在する上記ペプチド断片を除去する洗浄工程と、（３）上記ペプチド断片が除去された上記第２の固相における、上記アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列に、標識物質を結合させる標識工程と、（４）上記標識物質を検出する検出工程と、を備えることを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤の阻害能評価方法を提供する。かかる方法により、アンジオテンシン変換酵素に対して阻害能の高い阻害剤を容易にスクリーニングすることが可能となる。
【００１９】
本発明はまた、上記固相とアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を認識する抗体とを少なくとも備える、本発明の酵素活性測定方法並びに酵素阻害剤の阻害能評価方法を簡便に実施することが可能な、酵素活性測定用キットを提供する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
以下、添付図面を参照して、本発明のアンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法、その方法に用いる固相及びその製造方法、アンジオテンシン変換酵素阻害剤の阻害能評価方法、並びに酵素活性測定用キットの好適な実施形態について詳細に説明する。なお、同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明は省略する。
【００２１】
（固相及び固相の製造方法）
先ず、図１を参照して本発明に係る固相について説明する。図１は、本発明に係る固相の一実施形態を示す模式図である。同図に示す固相１は、固相担体１０とリンカー１２と第１のペプチド３０とを備えており、固相担体１０はリンカー１２を介して第１のペプチド３０と連結している。固相１において、第１のペプチド３０は、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列２０と当該配列のＮ末端側に結合したリンカー結合性アミノ酸残基２６とを備えており、リンカー結合性アミノ酸残基２６においてリンカー１２と結合している。そして、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列２０は、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２と当該配列のＣ末端側に隣接するジペプチド２４とから構成される。本実施形態において、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列２０の配列、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２及びジペプチド２４の配列は、それぞれ、Ｎ末端側から記載して、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（配列表の配列番号１に記載の配列）、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（配列表の配列番号２に記載の配列）及びＨｉｓ−Ｌｅｕで表される。なお、本発明におけるペプチドは、オリゴペプチド及びポリペプチドを包含する。
【００２２】
固相担体１０としては、例えば、ガラス、セラミックス、金属酸化物等の無機物質、天然高分子、合成高分子等からなり、粒状、ブロック状、フィルム状、シート状等の形状のものが挙げられる。かかる固相担体１０は、表面がアミノ基（−ＮＨ２）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）等の官能基で修飾されていることが好ましく、特に、表面にアミノ基を有するマイクロプレートやビーズが好ましい。
【００２３】
第１のペプチド３０のＮ末端に存在するリンカー結合性アミノ酸残基２６は、システイン残基が好ましく、第１のペプチド３０の環化を防止するため、システイン残基におけるアミノ基はアセチル化されていることが好ましい。そして、システイン残基におけるメルカプト基（−ＳＨ）がリンカー１２と化学結合することで固相担体１０と第１のペプチド３０とが連結することが好ましい。好適な第１のペプチド３０の配列としては、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列２０（配列表の配列番号１に記載の配列）のＮ末端側にシステイン残基が結合した、配列表の配列番号３に記載の配列が挙げられる。
【００２４】
リンカー１２は、固相担体１０表面上の官能基に反応性の官能基とリンカー結合性アミノ酸残基２６の官能基に反応性の官能基とを有するものが好ましく、固相担体１０表面上のアミノ基（−ＮＨ２）に反応性の官能基（例えば、カルボキシル基）とシステイン残基（リンカー結合性アミノ酸残基２６）におけるメルカプト基（−ＳＨ）に反応性の官能基（例えば、ヨウ素基）とを有するものが特に好ましい。かかるリンカーとしては、モノヨード酢酸Ｎ−オキシコハク酸イミドエステルが挙げられる。
【００２５】
なお、リンカー結合性アミノ酸残基２６とアンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列２０との間には複数個（１〜３個が好ましい）のアミノ酸残基が存在していてもよく、リンカー結合性アミノ酸残基２６のＮ末端には更に複数個（１〜３個が好ましい）のアミノ酸残基が存在していてもよい。また、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列２０におけるアミノ酸残基の一つをリンカー結合性アミノ酸残基２６として用いてもよい。しかしながら、アンジオテンシン変換酵素の活性測定をより高精度に行う観点からは、本実施形態のように、第１のペプチド３０は、Ｎ末端側やＣ末端側、リンカー結合性アミノ酸残基２６とアンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列２０との間には、アミノ酸残基を有しないことが好ましく、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列２０のＮ末端側にはリンカー結合性アミノ酸残基２６であるシステイン残基を設けて、当該残基においてリンカー１２と結合させることが好ましい。
【００２６】
図１に示す固相１は、固相担体１０とリンカー１２とを結合させた後に、液相法や固相法等の一般的な合成方法（例えば、「ペプチド合成の基礎と実験（泉谷信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、丸善１９８５年）」に記載の方法）により合成した、Ｎ末端にリンカー結合性アミノ酸残基２６を有し且つアンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列３０を含む第１のペプチド３０を結合することにより製造可能である。この場合において、リンカー結合性アミノ酸残基２６とリンカー１２との間で結合を生じさせる。
【００２７】
（アンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法）
次に、図２を参照して本発明に係るアンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法について説明する。図２（ａ）〜（ｄ）は、本発明に係るアンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法の一実施形態を示す工程図であり、図２（ａ）及び（ｂ）が酵素反応工程に相当し、図２（ｃ）及び（ｄ）が、それぞれ、洗浄工程及び標識工程に相当する。
【００２８】
本実施形態においては、先ず、固相担体１０がリンカー１２を介して第１のペプチド３０と連結した、上述の固相１を準備する（図２（ａ））。この第１の固相１に、アンジオテンシン変換酵素を所定時間接触させると、第１のペプチド３０が切断され、固相担体１０にリンカー１２を介してアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２を有する第２のペプチド３２が連結した第２の固相２と、第１のペプチド３０に由来するペプチド断片４０，４２が得られる（図２（ｂ））。なお、ジペプチド２４もペプチド断片として得られる。ここで、第２の固相２における第２のペプチド３２は、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２と当該配列のＮ末端側に結合したリンカー結合性アミノ酸残基２６とを備えており、リンカー結合性アミノ酸残基２６においてリンカー１２と結合している。図２（ｂ）においては、第１のペプチド３０から、ペプチド断片であるジペプチド２４の他に、種々のペプチド断片（ペプチド断片４０，４２）が生じているが、これは、アンジオテンシン変換酵素の活性を測定するため被検者や被検動物から血漿を採取すると、各種アンジオテンシナーゼが混在するからである。
【００２９】
上記に引き続いて、第２の固相２に存在するペプチド断片４０，４２やペプチド断片であるジペプチド２４の除去を行う（図２（ｃ））。これらの除去は、上記断片が混在した第２の固相２を、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０等）を含有するリン酸バッファー（Ｐｈｏｓｏｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅｓ， ＰＢＳ）で洗浄することにより実施することが好ましい。ペプチド断片の除去により、標識物質を結合させる対象物（アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２）以外の断片が第２の固相２から除かれるため、検出工程において、精度よく酵素活性を測定できるようになる。
【００３０】
ペプチド断片を除去した後に、第２の固相２におけるアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２に、標識物質６０を結合させる（図２（ｄ））。本実施形態では、標識物質６０は、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２を認識する一次抗体５０に標識５２を付加させたものである。また、標識物質６０は、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２におけるＰｒｏ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列を認識する。測定感度の観点から一次抗体５０は、モノクローナル抗体であることが好ましい。標識５２としては、放射性同位体、蛍光物質、酵素（ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、ＡＬＰ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）等）を用いることができ、これらの標識５２を公知の方法にしたがって一次抗体５０に付加させることができる。
【００３１】
以上のようにして、酵素反応工程、洗浄工程及び標識工程を実施した後に、標識物質６０を検出する検出工程を実施する。標識物質６０が標識５２として放射性同位体を備える場合はラジオイムノアッセイ法に準じて標識物質６０が検出可能であり、標識５２として蛍光物質を備える場合は、公知の蛍光検出法を適用して標識物質６０が検出可能である。また、標識物質６０が標識５２として酵素であるＨＲＰを備える場合は、例えば、ｏ−フェニレンジアミンを更に反応させて４９０ｎｍの吸光度を測定することにより標識物質６０を検出可能である。
【００３２】
本発明に係る酵素活性測定方法を適用するに当たり、酵素反応工程において、アンジオテンシン変換酵素の阻害剤（ＥＤＴＡ等のキレート剤が好ましい。）を添加することにより、第１のペプチドの切断を所定時間で停止させることができる。この場合において、第１のペプチドの切断を停止させるまでの時間は、アンジオテンシン変換酵素の阻害剤の量を変化させること等により容易に制御可能であることから、所定の時間でどの程度の酵素活性が発揮されるかを測定することができる。また、種々の時間で酵素活性を測定することにより、酵素反応の進行を経時的に調べることも可能になる。また、上記結果に基づいて検量線を作製しておけば、１回の測定により酵素活性の度合いを評価することができる。
【００３３】
本実施形態においては、標識工程において、標識物質６０として、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２を認識する一次抗体５０に標識５２を付加させたものを用いたが、図３に示すように、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列２２を認識する一次抗体５０と標識５２で標識された二次抗体５４とからなる複合体を標識物質６０として用いてもよい。なお、二次抗体５４は一次抗体５０を抗原として認識し免疫複合体を形成する抗体である。
【００３４】
（アンジオテンシン変換酵素阻害剤の阻害能評価方法）
本発明に係るアンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法は、アンジオテンシン変換酵素阻害剤の阻害能評価方法としても適用可能である。かかる評価方法を実施する場合は、酵素反応工程において、アンジオテンシン変換酵素にアンジオテンシン変換酵素阻害剤を加えることにより得られる、酵素活性が阻害されたアンジオテンシン変換酵素を用いればよい。アンジオテンシン変換酵素阻害剤の阻害能が高ければ、酵素反応工程で第１のペプチドが切断され難いため、検出工程で検出される標識物質の量が減少する。したがって、検出量の減少でアンジオテンシン変換酵素阻害剤の阻害能の高さが評価できる。また、同一構成の第１の固相に対して種類の異なる阻害剤を添加し、標識物質の検出量を比較することにより、アンジオテンシン変換酵素に対する活性の高い阻害剤をスクリーニングすることも可能である。
【００３５】
（酵素活性測定用キット）
本発明に係る酵素活性測定用キットは、上述した本発明に係る固相とアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を認識する抗体を少なくとも備えるものである。アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を認識する上記抗体は、標識されていない一次抗体であっても、標識された一次抗体であってもよい。また、一次抗体と、これを抗原として認識し免疫複合体を形成する二次抗体と、からなる複合体（当該二次抗体は標識されていてもよい。）も適用できる。なお、酵素活性測定用キットには、洗浄液、酵素反応停止溶液、検体希釈液、緩衝液、標識物質に対する基質（基質錠等）、標識二次抗体等を更に備えていてもよい。
【００３６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３７】
以下の実施例では、先ず、アンジオテンシン−ＩＩアミノ酸配列におけるＰｒｏ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列を認識する一次抗体（以下、単に「一次抗体」という。）を調製し、この一次抗体を、固相担体に連結させた（以下、「固相化した」という。）アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列を有するペプチド（当該ペプチドを以下「酵素基質」という。）並びに固相化したアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を有するペプチド（当該ペプチドを以下「酵素産物」という。）に反応させた。これにより、酵素産物に対してのみ一次抗体が基質特異性を発現することを確認した。次に、固相化した酵素基質にアンジオテンシン変換酵素を反応させ、酵素活性を測定した（実施例１）。更に、酵素阻害剤としてＥＤＴＡを用い、その酵素阻害能を評価した（実施例２）。
【００３８】
［一次抗体の調製］
６０μｇ／０．３ｍｌに調製したアンジオテンシン−ＩＩ抗原液（キャリアタンパク質（ウシサイログロブリン）結合アンジオテンシン−ＩＩ、ＳｙｎＰｅｐ社製）にアジュバントを１：１で加え、２本のガラス製注射器を用いて十分乳化した。この乳液を注射針２７Ｇを用いてＢａｌｂ／ｃマウスへ皮下・皮内注射を行い、７日毎に４回免疫を行った。４回免疫後、尾静脈より少量採血し、その抗体力価を測定した。なお、抗体力価の測定は、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社製、イムノプレート）へアンジオテンシン−ＩＩ（上記抗原と同様のもの）を５０ｎｇ／ｗｅｌｌ固相化した酵素免疫測定法（ＥＩＡ）にて行った。
【００３９】
抗体力価の上昇したＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞を常法に従い培養マウス骨髄細胞Ｘ−６３ Ａｇｅ８（（株）免疫生物研究所製）と細胞融合させ、スクリーニングを行った。各クローンについては１次クローニング後、更に２次クローニングを行い、最終的に３種類のクローンを得た。得られたクローンのうち１種類のクローン（５４Ｂ１）を大量培養し、培養上清からプロティンＡカラム（ファルマシアバイオテク社製）を用いたアフィニティクロマトグラフィーによりＩｇＧ画分を精製し、一次抗体を得た。
【００４０】
［酵素基質及び酵素産物の調製］
アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列（配列表の配列番号１に記載の配列）を有するペプチドのＮ末端にシステイン（Ｃｙｓ）を付加したペプチド（配列表の配列番号３に記載の配列）を合成し、Ｎ−末端アミノ酸残基（Ｃｙｓ）のα−アミノ基をアセチル化し酵素基質（配列表の配列番号５に記載の配列）とした。同様に、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列（配列表の配列番号２に記載の配列）を有するペプチドのＮ末端にシステインを付加したペプチド（配列表の配列番号４に記載の配列）を合成し、Ｎ−末端アミノ酸残基（Ｃｙｓ）のα−アミノ基をアセチル化し酵素産物（配列表の配列番号６に記載の配列）とした。
【００４１】
なお、上記ペプチドは、ペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いＢｏｃ法（例えば、新生化学実験講座１、タンパク質ＶＩ、日本生化学会編、１９９２年を参照）に基づいて合成し、得られたペプチドは高速液体クロマトグラフィーにより精製することにより得た。高速液体クロマトグラフィーはＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ（ワイエムシー社製、３０ｍｍ内径×２５０ｍｍ全長）を用い、流速２０ｍＬ／分、検出波長２２０ｎｍ、移動相アセトニトリル勾配−０．１％トリフルオロ酢酸で、１０〜６０％の条件で行った。
【００４２】
［酵素基質及び酵素産物の固相化］
表面にアミノ基を有するマイクロプレートであるＮｕｎｃ社製ＣｏｖａＬｉｎｋ Ｍｏｄｕｌｅプレートの各ウエルに０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）を４５μＬ添加した。これに２０ｍＭモノヨード酢酸Ｎ−オキシコハク酸イミドエステルのジメチルホルムアミド溶液５μｌを添加し、４℃、一昼夜反応させた。１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） を各ウエルに１５０μｌ加え、室温にて約２時間半攪拌しながら反応させた。反応後、５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ含有０．１Ｍリン酸・Ｎａ 緩衝液（ｐＨ７．５）にて洗浄し、同緩衝液に１７７ｎｇ／５０μＬとなるよう溶解した酵素基質あるいは産物を各ウエル５０μｌとなるよう加え、４℃にて一昼夜反応させた。反応後、同緩衝液に溶解した１００ｍＭ Ｌ−システイン溶液を各ウエル５０μＬとなるよう加え、室温にて約３時間攪拌しながら反応させた。その後、ダルベッコリン酸緩衝液（以下Ｄ−ＰＢＳ（−））にて２回洗浄し、０．１％ウシ血清アルブミン含有Ｄ−ＰＢＳ（−）を各ウエル２００μｌずつ添加し、４℃、一昼夜反応させた。その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）にて５回洗浄し、実験に供するまで乾燥状態で−８０℃にて保存した。以上により、固相担体（表面にアミノ基を有する上記マイクロプレート）にリンカー（モノヨード酢酸Ｎ−オキシコハク酸イミドエステル）を介して上記酵素基質（配列表の配列番号５に記載の配列）が結合した固相と、固相担体（表面にアミノ基を有する上記マイクロプレート）にリンカー（モノヨード酢酸Ｎ−オキシコハク酸イミドエステル）を介して上記酵素産物（配列表の配列番号６に記載の配列）が結合した固相とが得られた。なお、リンカーであるモノヨード酢酸Ｎ−オキシコハク酸イミドエステルは、上記酵素基質又は酵素産物のＮ末端システインのメルカプト基、並びに、上記固相担体のアミノ基、において結合を生じた。
【００４３】
［固相化した酵素基質及び酵素産物に対する抗体の反応性］
酵素基質又は酵素産物を固相化したマイクロプレートの各ウエルへ、３１．２５ｎｇ／５０μＬとなるように０．１％ウシ血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）に溶解した抗体溶液を各ウエルへ５０μＬずつ添加し、３７℃にて攪拌しながら３０分間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）にて５回洗浄した。ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギＩｇＧ Ｆａｂ’抗体（（株）免疫生物研究所製）を２５ｎｇ／５０μＬとなるように０．１％ウシ血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）に溶解し、各ウエルへ５０μＬずつ添加し、３７℃にて攪拌しながら３０分間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）にて５回洗浄した。０−フェニレンジアミン（ＳＩＧＭＡ社製）を０．１％過酸化水素含有リン酸水素カリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．１）に４０μＬ／１００μＬとなるよう溶解し、各ウエルへ１００μＬずつ添加し、遮光下、室温にて１５分間反応させた。反応後、１Ｎ 硫酸を各ウエルへ１００μＬずつ添加し、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社製、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０）を用いて４９０ｎｍの吸光度を測定した。酵素基質固相化プレート及び酵素産物固相化プレートのそれぞれについて、以上の測定を４回行い、各回の測定で得られた吸光度の値からそれぞれ平均値及び標準偏差値を求めた。表１にこのようにして求めた平均値及び標準偏差値を「平均値±標準偏差値」として示す。表１の結果から、抗体は酵素基質とは結合せず、酵素産物とのみ結合することが証明された。
【００４４】
【表１】
［酵素活性の測定］
（実施例１）
アンジオテンシン変換酵素はＳＩＧＭＡ社製ウサギ肺由来のものを用いた。３００ｍＭ ＮａＣｌ含有０．１Ｍりん酸・Ｎａ 緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解後、実験に供するまで−８０℃にて保存した。９．５ｎｇ／５０μＬとなるよう調製したアンジオテンシン変換酵素溶液を、酵素基質を固相化したマイクロプレートのウエルへ５０μＬずつ添加し、３７℃にて攪拌しながらそれぞれ１０分間、２０分間、３０分間反応させた。反応は、０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）を各ウエルへ１００μＬずつ添加することにより停止させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）にて５回洗浄し、３１．２５ｎｇ／５０μＬとなるように０．１％ウシ血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）に溶解した抗体溶液を各ウエルへ５０μＬずつ添加し、３７℃にて攪拌しながら３０分間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）にて５回洗浄した。 ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギＩｇＧ Ｆａｂ’抗体（（株）免疫生物研究所製）を２５ｎｇ／５０μＬとなるように０．１％ウシ血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）に溶解し、各ウエルへ５０μＬずつ添加し、３７℃にて攪拌しながら３０分間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）にて５回洗浄した。
【００４６】
０−フェニレンジアミン（ＳＩＧＭＡ社製）を０．１％過酸化水素含有リン酸水素カリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．１）に４０μｌ／１００μｌとなるよう溶解し、各ウエルへ１００μＬずつ添加し、遮光下、室温にて１５分間反応させた。反応後、１Ｎ 硫酸を各ウエルへ１００μＬずつ添加し、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社製、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０）を用いて４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４７】
（比較例１）
実施例１における、アンジオテンシン変換酵素溶液の代わりに、３００ｍＭ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸・Ｎａ 緩衝液（ｐＨ８．３）を実施例１と同じ条件の３個のウエルへ５０μＬずつ添加し、３７℃で攪拌しながらそれぞれ１０分間、２０分間、３０分間反応させたこと以外は、実施例１と同様にして４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４８】
実施例１及び比較例１の結果を図４に示す。図４よりアンジオテンシン変換酵素を添加した実施例１は、時間の変化と共に酵素産物の生成量が増加しており、酵素活性を測定できた。他方、アンジオテンシン変換酵素を添加しなかった比較例１は、酵素産物は生成していないことが確認された。このように本発明の酵素活性測定方法によれば、アンジオテンシン変換酵素の酵素活性を測定でき、酵素基質として一部にアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を有するペプチドを用いることから、酵素の高い基質特異性が発現し酵素活性を高精度に測定することが可能になる。
【００４９】
［酵素阻害剤の阻害能の評価］
先ず、３００ｍＭ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸・Ｎａ緩衝液（ｐＨ８．３）に５０μｇ／５μＬとなるようアンジオテンシン変換酵素（ＳＩＧＭＡ社製、ウサギ肺由来）を溶解した。次に、阻害剤である０．５Ｍ ＥＤＴＡを含有し、３００ｍＭ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸・Ｎａ緩衝液（ｐＨ８．３）を用いて９．５ｎｇ／５０μＬとなるよう調製した（ａ）阻害剤含有アンジオテンシン変換酵素溶液と、３００ｍＭ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸・Ｎａ緩衝液（ｐＨ８．３）を用い９．５ｎｇ／５０μＬとなるよう調製した（ｂ）アンジオテンシン変換酵素溶液（酵素阻害剤非存在）を用いて、上記酵素活性の測定と同様の方法にて酵素反応を行った。
【００５０】
（実施例２）
３００ｍＭ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸・Ｎａ 緩衝液（ｐＨ８．３）に５０μｇ／５μＬとなるようアンジオテンシン変換酵素（ＳＩＧＭＡ社製、ウサギ肺由来）を溶解した。０．５Ｍ ＥＤＴＡを含有する３００ｍＭ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸・Ｎａ 緩衝液（ｐＨ８．３）にて９．５ｎｇ／５０μＬとなるように調製したアンジオテンシン変換酵素溶液（酵素阻害剤存在）を用いて、実施例１と同様の方法にて酵素反応を行った
【００５１】
酵素基質を固相化したマイクロプレートのウエルへ５０μＬずつ添加し、３７℃にて攪拌しながら３０分間反応させた。反応後、０．５Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）を各ウエルへ１００μＬずつ添加した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）にて５回洗浄し、３１．２５ｎｇ／５０μＬとなるように０．１％ウシ血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）に溶解した抗体溶液を各ウエルへ５０μＬずつ添加し、３７℃にて攪拌しながら３０分間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）にて５回洗浄した。 ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ヤギＩｇＧ Ｆａｂ’抗体（（株）免疫生物研究所製）を２５ｎｇ／５０μｌとなるように０．１％ウシ血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）に溶解し、各ウエルへ５０μＬずつ添加し、３７℃にて攪拌しながら３０分間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｄ−ＰＢＳ（−）にて５回洗浄した。０−フェニレンジアミン（ＳＩＧＭＡ社製）を０．１％過酸化水素含有リン酸水素カリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ５．１）に４０μｌ／１００μＬとなるよう溶解し、各ウエルへ１００μＬずつ添加し、遮光下、室温にて１５分間反応させた。反応後、１Ｎ 硫酸を各ウエルへ１００μＬずつ添加し、プレートリーダー（モレキュラーデバイス社製、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ２５０）を用いて４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５２】
（実施例３）
０．５Ｍ ＥＤＴＡを含有する３００ｍＭ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸・Ｎａ 緩衝液（ｐＨ８．３）にて９．５ｎｇ／５０μＬとなるように調製したアンジオテンシン変換酵素溶液（酵素阻害剤存在）に代えて、３００ｍＭ ＮａＣｌ含有０．１Ｍリン酸・Ｎａ 緩衝液（ｐＨ８．３）にて９．５ｎｇ／５０μＬとなるように調製したアンジオテンシン変換酵素溶液（酵素阻害剤非存在）を用いた以外は、実施例２と同様にして４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５３】
実施例２及び３のそれぞれについて測定を４回行い、各回の測定で得られた吸光度の値からそれぞれ平均値及び標準偏差値を求めた。表２にこのようにして求めた平均値及び標準偏差値を「平均値±標準偏差値」として示す。表２の結果から、阻害剤である０．５Ｍ ＥＤＴＡを含有している実施例２では酵素の活性が阻害されたことが確認され、他方、阻害剤の存在しない実施例３では酵素は活性であることが確認され、アンジオテンシン変換酵素の阻害剤の作用を評価することができることが証明された。
【００５４】
【表２】
【発明の効果】
以上示したとおり、本発明のアンジオテンシン変換酵素の活性測定方法によれば、アンジオテンシン変換酵素の活性を高精度に測定でき、更に高感度で簡便に測定することが可能となる。また、本発明の固相を用いることにより酵素活性を高精度に測定でき、本発明の酵素阻害剤の阻害能評価方法によりアンジオテンシン変換酵素阻害剤のスクリーニングを容易に行うことができる。さらに、本発明の酵素活性測定用キットによれば、アンジオテンシン変換酵素の活性測定を容易に行うことができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る固相の一実施形態を示す模式図である。
【図２】本発明に係るアンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法の一実施形態を示す工程図である。
【図３】一次抗体と標識された二次抗体とからなる複合体を用いて標識工程を実施したときの模式図である。
【図４】実施例１及び比較例１で得られた吸光度を示す図である。
【符号の説明】
１・・・第１の固相、２・・・第２の固相、１０・・・固相担体、１２・・・リンカー、２０・・・アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列、２２・・・アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列、２４・・・ジペプチド、２６・・・リンカー結合性アミノ酸残基、３０・・・第１のペプチド、３２・・・第２のペプチド、４０，４２・・・ペプチド断片、５０・・・一次抗体、５２・・・標識、５４・・・二次抗体、６０・・・標識物質。
Claims (17)
- 固相担体にリンカーを介してアンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列を有する第１のペプチドが連結した第１の固相に、アンジオテンシン変換酵素を所定時間接触させ、前記第１のペプチドを切断することにより、前記固相担体に前記リンカーを介してアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を有する第２のペプチドが連結した第２の固相と、前記第１のペプチドに由来するペプチド断片とを得る酵素反応工程と、
前記第２の固相に存在する前記ペプチド断片を除去する洗浄工程と、
前記ペプチド断片が除去された前記第２の固相における、前記アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列に、標識物質を結合させる標識工程と、
前記標識物質を検出する検出工程と、を備えることを特徴とするアンジオテンシン変換酵素の酵素活性測定方法。 - 前記標識物質は、前記アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を認識する一次抗体であって標識された一次抗体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
- 前記標識物質は、前記アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を認識する一次抗体と該抗体を抗原として認識し免疫複合体を形成する標識された二次抗体とからなる複合体であることを特徴とする請求項１記載の方法。
- 前記アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を認識する一次抗体は、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列におけるＰｒｏ−Ｐｈｅで表されるアミノ酸配列を認識する一次抗体であることを特徴とする請求項２又は３記載の方法。
- 前記第１のペプチドは、アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列及びリンカー結合性アミノ酸残基を有しており、該リンカー結合性アミノ酸残基において、前記固相担体と前記第１のペプチドとが連結していることを特徴とする請求項１〜４記載のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リンカー結合性アミノ酸残基が前記第１のペプチドのＮ末端に存在し、前記リンカー結合性アミノ酸残基のアミノ基がアセチル化されていることを特徴とする請求項５記載の方法。
- 前記リンカー結合性アミノ酸残基は、システイン残基であることを特徴とする請求項５又は６記載の方法。
- 前記酵素反応工程において、前記アンジオテンシン変換酵素の阻害剤を添加することにより、前記第１のペプチドの切断を所定時間で停止させることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記阻害剤がキレート試薬であることを特徴とする請求項８記載の方法。
- 固相担体と、
アンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列及びリンカー結合性アミノ酸残基を有するペプチドと、
前記固相担体と前記リンカー結合性アミノ酸残基とを連結するリンカーと、
を備えることを特徴とする固相。 - 前記リンカー結合性アミノ酸残基が前記ペプチドのＮ末端に存在し、前記リンカー結合性アミノ酸残基のアミノ基がアセチル化されていることを特徴とする請求項１０記載の固相。
- 前記リンカー結合性アミノ酸残基は、システイン残基であることを特徴とする請求項１０又は１１記載の固相。
- 固相担体とリンカーとを結合させるリンカー結合工程と、
Ｎ末端にリンカー結合性アミノ酸残基を有しアンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列を含むペプチドの、前記リンカー結合性アミノ酸残基を前記リンカーと結合させるペプチド結合工程と、を備えることを特徴とする固相の製造方法。 - 前記リンカー結合性アミノ酸残基がアセチル化されたリンカー結合性アミノ酸残基であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
- 前記リンカー結合性アミノ酸残基は、システイン残基であることを特徴とする請求項１３又は１４記載の方法。
- 固相担体にリンカーを介してアンジオテンシン−Ｉのアミノ酸配列を有する第１のペプチドが連結した第１の固相に、アンジオテンシン変換酵素阻害剤により酵素活性が阻害されたアンジオテンシン変換酵素を所定時間接触させ、前記第１のペプチドを切断することにより、前記固相担体に前記リンカーを介してアンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を有する第２のペプチドが連結した第２の固相と、前記第１のペプチドに由来するペプチド断片とを得る酵素反応工程と、
前記第２の固相に存在する前記ペプチド断片を除去する洗浄工程と、
前記ペプチド断片が除去された前記第２の固相における、前記アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列に、標識物質を結合させる標識工程と、
前記標識物質を検出する検出工程と、を備えることを特徴とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤の阻害能評価方法。 - 請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の固相と、アンジオテンシン−ＩＩのアミノ酸配列を認識する抗体とを少なくとも備えることを特徴とする酵素活性測定用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003051882A JP4374201B2 (ja) | 2003-02-27 | 2003-02-27 | 酵素活性測定方法、その方法に用いる固相及びその製造方法、酵素阻害剤の阻害能評価方法、並びに酵素活性測定用キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003051882A JP4374201B2 (ja) | 2003-02-27 | 2003-02-27 | 酵素活性測定方法、その方法に用いる固相及びその製造方法、酵素阻害剤の阻害能評価方法、並びに酵素活性測定用キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004254656A true JP2004254656A (ja) | 2004-09-16 |
| JP4374201B2 JP4374201B2 (ja) | 2009-12-02 |
Family
ID=33116920
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003051882A Expired - Fee Related JP4374201B2 (ja) | 2003-02-27 | 2003-02-27 | 酵素活性測定方法、その方法に用いる固相及びその製造方法、酵素阻害剤の阻害能評価方法、並びに酵素活性測定用キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4374201B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008007482A (ja) * | 2006-06-30 | 2008-01-17 | Univ Of Miyazaki | 昇圧作用を有する新規ポリペプチド |
| CN111024960A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-04-17 | 广州阳普医疗科技股份有限公司 | 用于高血压血样检测的添加剂、试剂盒和应用 |
-
2003
- 2003-02-27 JP JP2003051882A patent/JP4374201B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008007482A (ja) * | 2006-06-30 | 2008-01-17 | Univ Of Miyazaki | 昇圧作用を有する新規ポリペプチド |
| CN111024960A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-04-17 | 广州阳普医疗科技股份有限公司 | 用于高血压血样检测的添加剂、试剂盒和应用 |
| CN111024960B (zh) * | 2019-12-27 | 2023-02-17 | 广州阳普医疗科技股份有限公司 | 用于高血压血样检测的添加剂、试剂盒和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4374201B2 (ja) | 2009-12-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7264939B2 (en) | Method of detecting native proBNP | |
| AU2003282194B2 (en) | Specific proBNP(1-108) antibodies for diagnosing heart failure | |
| US5296354A (en) | Kit for the specific assay of angiotensin II | |
| RU2009143671A (ru) | Высокочувствительные иммуноанализы и наборы для определения представляющих интерес пептидов и белков | |
| CN102482348B (zh) | 胶原新表位抗体 | |
| JP2735233B2 (ja) | 合成ペプチドおよびそれに対する抗体 | |
| US6210901B1 (en) | Specific binding substances for antibodies and their use for immunoassays or vaccines | |
| KR101974583B1 (ko) | 링커 폴리펩티드 및 이를 이용한 표적 물질 분석 방법 | |
| CA1341014C (en) | Hcg peptides for use in antibody purification procedures | |
| JP4374201B2 (ja) | 酵素活性測定方法、その方法に用いる固相及びその製造方法、酵素阻害剤の阻害能評価方法、並びに酵素活性測定用キット | |
| DK168710B1 (da) | Monoklont antistof eller fragment deraf, immunogen, immunanalysefremgangsmåde til bestemmelse af glycosyleret nativt humant albumin, peptid samt immunanalysesæt | |
| Liang et al. | Antibody binding to a peptide but not the whole protein by recognition of the C-terminal carboxy group | |
| JPH08291197A (ja) | Ｉ型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチドに対する抗体およびそれを用いるアッセイ法 | |
| JPH09249699A (ja) | 抗ヒトｐｉｖｋａ−ｉｉモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いた測定試薬及び測定方法 | |
| JPH05103689A (ja) | ヒトカルシトニンのｎ末端部分を特異的に認識するモノクローナル抗体 | |
| CA2038030C (en) | Synthetic peptides which contain sequences from factor viia, and the use thereof | |
| JP2648855B2 (ja) | ペプチド、その抗体およびエンドセリンの定量 | |
| JPH06157592A (ja) | ペプチドもしくはその誘導体、それらとタンパク質との結合体、及びこれらを免疫源とする抗エンドセリン−１抗体の製造方法 | |
| WO1998049556A1 (fr) | Anticoprs reconnaissant des fragments de collagene | |
| JP2628336B2 (ja) | ブラジキニン誘導体およびその定量 | |
| JPS63225400A (ja) | フイブリン特異性抗体、モノクロナール抗体の取得法及びフイブリンの測定法及び測定試薬 | |
| JP4612922B2 (ja) | 新規のモノクローナル抗体並びにｅ−Ｄモノマー、ｅ−Ｄダイマー、及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の免疫学的分析方法 | |
| JP2003502672A (ja) | 軟骨吸収アッセイ | |
| JPH0570484A (ja) | ペプチドおよびその塩 | |
| JP4436972B2 (ja) | 軟骨吸収アッセイ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20051115 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20051214 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Effective date: 20051214 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20051214 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20080610 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080811 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20080811 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20090106 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Effective date: 20090901 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Effective date: 20090907 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Year of fee payment: 3 Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120911 |
|
| R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130911 Year of fee payment: 4 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |