CN108291915A - Ed-b蛋白在诊断组织增生中的应用 - Google Patents

Ed-b蛋白在诊断组织增生中的应用 Download PDF

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Abstract

公开了血液中ED‑B蛋白作为组织增生例如肿瘤标志物的应用、ED‑B蛋白的检测方法和包含ED‑B蛋白的诊断试剂盒，本发明的试剂盒包括抗肿瘤标志物ED‑B的基因工程抗体。

Description

ED-B蛋白在诊断组织增生中的应用 发明领域
本发明涉及一种新的检测组织增生的方法，属于医学和生物技术领域。特别地，本发明涉及可用于肿瘤诊断或筛查的含ED-B结构域的蛋白质或其片段，ED-B结构域作为肿瘤和组织增生类疾病的标志物，可用于肿瘤诊断、肿瘤预后评估、普通人群肿瘤早期预防与筛查等。
发明背景
肿瘤是目前世界非传染类疾病第二大死因。肿瘤研究专家认为，肿瘤是可以预防的，早期肿瘤是可以治愈的，晚期肿瘤患者也可以通过规范化治疗提高生存质量。但是，尽管现代医学技术取得很大进展，但对晚期肿瘤患者尤其是当肿瘤发生扩散之后，对肿瘤治疗的预后很差。在临床实践中，肿瘤的早期发现、早期治疗是关键，这需要有效的诊断方法和诊断技术提供支持。
肿瘤的诊断方法有：1、病史和身体检查；2、内窥镜检查；3、影像学检查如X射线检查、超声波检查、放射性核素扫描等；4、病理检查，如细胞学检查、活体组织检查等；5、实验室的酶学或免疫学检查等。通过实验室免疫学检查肿瘤标志物或相关物质，可以提高肿瘤早期检查的灵敏度和特异性，利于肿瘤的发现和治疗。由于部分肿瘤标志物存在于患者的血液中，这些肿瘤血液标志物为肿瘤早期诊断和普通人群的筛查提供了便利：少量采血具有很好的安全性和便利性；免疫学检查不需要大型仪器设备，便于普及；所得样本可异地检测分析等；相较内窥镜检查和影像学检查，血液标志物的免疫学检查的患者依从性好。因此肿瘤标志物或肿瘤相关物质的发现及应用，是提高肿瘤诊断效率的有效方法。
针对肿瘤标志物特异的单克隆抗体与灵敏的免疫学检测技术(ELISA、RIA、IRMA、CLIA、IFA、TRFIA等)相结合，产生一系列用于肿瘤标志物检测的方法并应用于临床实践，成为肿瘤临床诊断的得力手段。肿瘤标志物的诊断应用越来越广泛，如：人群的肿瘤普查、筛选；肿瘤诊断和确认以及进展阶段判断；用于分析病症的生物特征；治疗效果监测与预后判断；判定继发肿瘤与原发肿瘤；多项肿瘤标志物的 联合应用，提高检测效率等。
肿瘤标志物是指在肿瘤发生发展过程中由肿瘤细胞或组织产生的特异性分子，这些分子在健康人体内较低甚至难以检测到，但伴随肿瘤的发生和发展，其含量会大幅增加或发生显著变化。这些分子可以为蛋白质、多肽、核酸、小分子化合物等。目前发现的具有临床意义的肿瘤标志物近百种，比较常用的有CEA、AFP、CYFRA21-1、CA125、CA15-3等十几种。理想的肿瘤标志物应具有很高的灵敏度和特异性、一定的器官特异性、与肿瘤的生长大小或进展有关、与预后有关、利于监测肿瘤的复发等特点，目前所发现的肿瘤标志物往往仅具备上述若干特点，远未达到理想水平，需要进一步的研究去寻找。
纤维连接蛋白(fibronectin，FN)是一种多功能的糖蛋白，由上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、蜕膜细胞及绒毛外滋养细胞等表达。FN有两类：以可溶的形式存在于血浆和各种体液中，称为血浆纤维连接蛋白(plasma FN，pFN)，参与凝血等功能；以不溶的纤维存在于细胞外基质、细胞之间及某些细胞表面，称为细胞纤维连接蛋白(cellular FN，cFN)，参与细胞的粘附、变形与分布，及血管的形成等。FN的应用日渐广泛，已应用于伤口的修复与愈合、败血症和休克的急救辅助与治疗，在血液系统和心脑血管系统疾病以及糖尿病等发病过程中扮演重要角色。
FN的基因约有75kb，约含50个外显子，相对分子质量约250kDa，主要由I，II，III型三类同源重复的球形结构域单元构成，各结构域之间由对胰蛋白酶敏感的肽链连接。每个FN亚基上有与胶原、细胞表面受体、血纤蛋白和硫酸蛋白多糖高亲和结合的位点。血浆FN是二聚体，由两条相似的两个亚基组成，各单链在C末端形成两个二硫键交联，整个分子成V形。细胞FN是多聚体，其不同来源的FN亚基结构相似，但并不相同。
血浆纤维连接蛋白(plasma FN，pFN)在健康人血液中为277～513mg/L，其浓度增高见于急性和慢性肝炎、脂肪肝、肝硬化、阻塞性黄疸、脑血管病变、妊娠晚期、胰腺癌、肺癌、癌性腹水、腺癌广泛转移等；浓度降低见于急性白血病、暴发性肝衰竭、烧伤、创伤、休克、细菌性或病毒性感染、急性呼吸窘迫综合症、糖尿病并发酮症酸中毒、 尿毒症、急性循环衰竭、绝经期妇女以及部分化疗耐受差的患者。
FN均为同一基因的表达产物，只是转录后在RNA的剪接上有所不同，因而产生不同的mRNA，生成不同的FN异构体，在翻译后的修饰上也有差异。因而在FN基因表达过程中，有含ED-B结构域的FN(B+)(或简写为B-FN或FN(ED-B))和不含ED-B结构域的FN(B-)两种形式。这两种形式被认为在个体发育过程中发挥着重要作用。
ED-B(Extradomain B)是包含在FN的III型重复序列中，由单个外显子编码的包含91个氨基酸的完整结构域。FN(B+)在成人正常组织中表达量极少，但在伤口愈合组织和肿瘤组织等快速增生的组织中表达量增高，特别是肿瘤生长过程中又重新高表达，故又称癌胚基因，如胃癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌等细胞中高表达含ED-B结构域的FN(B+)。几乎所有的人类实体肿瘤，其原发病灶及转移位点都能检测到FN(B+)的高表达，FN(B+)在肿瘤侵袭和转移过程中，也可能发挥重要的作用。基于上述事实，FN(B+)被作为肿瘤新生血管的标志物(Carnemolla，Balza et al.(1989).J Cell Biol.108：1139-1148.)。但是对于人ED-B蛋白结构域或者含ED-B结构域的纤维连接蛋白FN(ED-B)的研究很不充分，其生物学特征有待进一步探索。
对于ED-B的血液样本或组织匀浆的检测目前鲜有报道，相应的检测方法也需要进一步完善，且目前还没有关于血液中含有ED-B的报道。目前已公开的信息是血液中的FN不含ED-B结构域(Zardi，Carnemolla et al.(1987).EMBO J.6：2337-2342.)。例如通过酶联免疫吸附法(ELLISA)检测pFN，未检出ED-B存在(Carnemolla，Neri et al.(1996).Int J Cancer.68：397-405.)，通过Western Blot检测也同样显示pFN中ED-B阴性(Viti，Tarli et al.(1999).Cancer Res.59：347-352.)，至今尚无血液中检测到ED-B的报道。
发明概述
在一个方面，本发明提供了在哺乳动物例如人中检测组织增生的方法，包括在所述哺乳动物的生物学样品例如体液样品、优选来自血液的样品中检测ED-B蛋白并与对照样品中ED-B蛋白的水平比较，其中检测样品中所述ED-B蛋白水平升高是所述哺乳动物中存在增生的指征。
在一个实施方案中，所述方法可用于诊断肿瘤的存在或者患病风险、对肿瘤预后、诊断肿瘤的发生或进展情况、进行肿瘤筛查或监测肿瘤治疗疗效。
在一个方面，本发明提供了特异性检测ED-B蛋白的物质在制备用于通过检测哺乳动物的生物学样品例如体液样品、优选来自血液的样品中ED-B蛋白的水平来诊断哺乳动物中组织增生的组合物或试剂盒中的应用。
在一个方面，本发明提供了用于诊断哺乳动物中组织增生的存在的试剂盒，所述试剂盒包括用于特异性检测所述哺乳动物的生物学样品例如体液样品、优选来自血液的样品中ED-B蛋白的存在的物质。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括特异性检测ED-B蛋白的结合物，优选所述ED-B蛋白包含如下序列：(a)SEQ ID NO：1，或(b)与(a)中的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性的序列。
附图简述
图1：SDS-PAGE检测健康人和肿瘤患者血液中pED-B的含量。四个泳道从左至右分别是牛血清白蛋白(BSA)、ED-B抗体(B5-Fc)，肿瘤pED-B和健康pED-B；其中BSA、B5-Fc为对照。肿瘤患者血浆中pED-B显著高于健康人中的pED-B。
图2：Western Blot检测通过pull down方法获得的pED-B蛋白。四个泳道从左至右分别是牛血清白蛋白(BSA)、ED-B抗体(B5-Fc)，肿瘤pED-B和健康pED-B；其中第三和第四泳道均显pED-B阳性，并显B5-Fc阳性。第二泳道仅显B5-Fc(约55kD)阳性。第一泳道显阴性。
图3：ED-B检测试剂盒检测不同类型样品的效果。
图4A-J：健康人和肿瘤患者以及其它疾病患者血液中pED-B的浓度。
图5：使用B5与L19抗体检测pED-B试验中的标准曲线。
发明详细描述
除非特别指出，本文使用的科学和技术术语应具有本领域技术人员通常已知的含义。另外除非特别需要，则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。前述技术和方法通常根据本领域熟知的及在本说明书引用的参考文献所述的常规方法进行。见例如并入作参考的Sambrook et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001))所述。本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、文章、教科书等及其中引用的参考文献在此均以其全部并入本文作参考。
本发明的目的在于提供一种新的组织增生标志物及其相关的检测方法和应用例如人体的组织增生筛查和诊断。在一个实施方案中，所述标志物可以作为肿瘤血液标志物，为肿瘤的筛查、诊断、治疗和预后的判断提供依据。
本发明基于两个新的发现，一个新发现是血液中含有ED-B蛋白，包括血液中的部分血浆纤维连接蛋白(pFN)含有ED-B结构域，或者FN的水解片段中含有ED-B结构域，血液中含有的可溶性ED-B蛋白，简称为pED-B(Plasma ED-B)；另一个新发现是血液中的ED-B蛋白水平与多种组织增生例如肿瘤的发生及恶性程度有关。
因此，在一个方面，本发明提供了检测哺乳动物中组织增生的方法，包括在所述哺乳动物的生物学样品例如体液样品、优选来自血液的样品中检测ED-B蛋白并与对照样品中ED-B蛋白的水平比较，其中检测样品中ED-B蛋白水平升高是所述哺乳动物中存在组织增生的指征。在一个实施方案中，所述哺乳动物是人。在一个实施方案中，所述组织增生是实体肿瘤。
本文所述“水平升高”是指通过检测样品获得的测定值与参照值例如在未患肿瘤的患者或者正常人中观察到的中间值或者平均值相比升高，例如升高至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或更多。
在一个实施方案中，本发明所述方法用于诊断哺乳动物中与增生相关的疾病例如肿瘤的存在或者患病风险的方法，其中检测样品中ED-B 蛋白水平升高是所述哺乳动物中肿瘤的存在或者患病风险的指征。
在一个实施方案中，本发明所述方法用于对哺乳动物中与增生相关的疾病例如肿瘤的预后，其中检测样品中ED-B蛋白水平升高是所述哺乳动物中肿瘤预后不良的指征。
在一个实施方案中，本发明所述方法用于确定肿瘤的发生或进展情况、用于肿瘤筛查或用于监测肿瘤治疗疗效，或者用于个体化用药。
如本文所用，术语“ED-B蛋白”是指含有ED-B氨基酸序列的蛋白，其中ED-B氨基酸序列具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列或与SEQ ID No.1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性的序列。如本文所用，术语“ED-B蛋白结构域”或“ED-B结构域”是指由SEQ ID No.1的氨基酸序列形成的蛋白质三级结构，所述ED-B结构域作为蛋白的一个部分存在。如本文所用，术语“ED-B蛋白片段”是指包含ED-B结构域的蛋白在物理、化学、生物等条件作用下变性、断裂、降解、水解形成的含有ED-B氨基酸序列的蛋白片段。ED-B蛋白为上述包含ED-B氨基酸序列的蛋白、结构域和片段的统称，包括但不限于包含ED-B结构域的蛋白或包含ED-B肽段的蛋白。
如本文所用，术语“pED-B”为来源于血液例如血浆中的ED-B蛋白的简称。pED-B是指血液中含有ED-B氨基酸序列的蛋白，它可以在血液中单独游离的存在，也可以作为FN或FN水解片段中的一个结构域存在，也可以与其他血液中的细胞外蛋白相结合的形式存在。pED-B蛋白为血液中的成分，但也可能是来源于细胞FN(B+)的水解片段。
另外，基于SEQ ID No.1氨基酸序列的人工合成肽段或随机突变，或通过基因重组方式获得的包含ED-B氨基酸序列的蛋白，也属于本发明所述的ED-B蛋白。但由于通过人工方式获得的ED-B蛋白并非直接来源于生物体，因此不属于pED-B。
本发明所述的蛋白或蛋白片段可以是磷酸化或糖基化的蛋白，也可以是变性的蛋白或多肽片段。在一个实施方案中，本发明所述ED-B蛋白由SEQ ID No.1的氨基酸序列或与SEQ ID No.1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性的序列组成，或者含有SEQ ID No.1或与SEQ ID No.1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性的序列的部分连续序 列。在一个实施方案中，本发明所述的ED-B蛋白或蛋白片段是含ED-B结构域的FN(B+)，以及FN(B+)的多聚体，二聚体，单体，异构体，亚型，水解片段等。
本发明还涉及核苷酸序列，其编码包含SEQ ID No.1的氨基酸序列或与SEQ ID No.1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性的序列的肽，或编码由SEQ ID No.1的氨基酸序列或与SEQ ID No.1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性的序列组成的肽。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID No.2的序列或由SEQ ID No.2的序列组成。
“组织增生”是指器官、组织内的细胞数目的增多，产生赘生物，肿瘤或癌症。组织增生有生理性增生和病理性增生，其中生理性增生，如结缔组织增生是创伤愈合过程中的一个重要反应，对机体适应反应起积极作用。而病理性增生多因内分泌激素或局部致炎因子过度刺激所致，如乳腺增生、前列腺增生、子宫内膜增生、肠粘膜性息肉等。
本文所用术语“多肽”，“肽”和“蛋白”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物，其包含经肽键结合的9个或更多个氨基酸。聚合物可以是线性的，分枝的或环状的，可包含天然存在的和/或氨基酸类似物，它可被非氨基酸间断。通常，若氨基酸聚合物是长的(例如超过50个氨基酸残基)，其优选称为多肽或蛋白质，但是若其是50个氨基酸长或更短，优选称为“肽”。
在本文中，术语“核酸”，“核酸分子”，“多核苷酸”和“核苷酸序列”可互换使用，定义任何长度的多聚物，如聚脱氧核糖核苷酸(DNA)(例如cDNA，基因组DNA，质粒，载体，病毒基因组，分离的DNA，探针，引物和其任何混合物)或聚核糖核苷酸(RNA)分子(例如mRNA，反义RNA)或混合的聚核糖-聚脱氧核糖核苷酸。它们包含单链或双链，线性或圆形，天然或合成的多核苷酸。此外，多核苷酸可包括非-天然存在的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物和可被非核苷酸组分间断。如果存在，在聚合之前或之后可进行核苷酸修饰。
在一个实施方案中，本发明所述的ED-B蛋白是指在血液中或血清中或血浆中的含有ED-B氨基酸序列的蛋白或含有ED-B氨基酸序列的蛋白水解片段或仅包含一个ED-B结构域的蛋白水解片段。
在一个实施方案中，本发明所述组织增生是肿瘤。在一个实施方案中，本发明所述肿瘤是实体肿瘤。在一个实施方案中，本发明所述实体肿瘤可以是良性肿瘤、恶性肿瘤或交界瘤。在一个实施方案中，本发明所述实体肿瘤是上消化道肿瘤。本发明所述上消化道肿瘤包括但不限于食管癌、贲门癌、喉癌及胃癌。
本文所述“恶性肿瘤”是指除了表现为肿瘤本身细胞的失去控制的异常繁殖，还对邻近正常组织的侵犯及经血管、淋巴管和体腔转移到身体其他部位，往往致死的肿瘤或癌症。在一个实施方案中，本发明所述肿瘤是恶性肿瘤，例如癌症或肉瘤，例如各类鳞癌、腺癌、肉瘤。在一个实施方案中，本发明所述肿瘤选自例如食管癌、贲门癌、喉癌、头颈癌、胃癌、肝癌、胆道癌、胆囊癌、结肠癌、十二指肠癌、肺癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌和前列腺癌。在一个实施方案中，本发明所述肿瘤是上消化道癌症，例如选自食管癌、贲门癌、喉癌、胃癌。在一个实施方案中，所述肿瘤是鼻咽癌、食管癌、胃癌、肺癌或胰腺癌。
本文所述生物学样品是来自被测动物的任意生物学样品，尤其是包括核酸或者多肽的任意样品。有利地，可以包括下列样品：血液，血浆，血小板，唾液，痰，尿液等等，更一般来说包括核酸或者多肽的任意组织、器官或者有利地是生物体液。在本发明的体外方法中用于检测的样品通常应以临床可接受的方式收集，例如以保护核酸或蛋白质的方式收集。待测样品可以是血液样品例如血清样品及其它类型样品。在一个实施方案中，所述样品是源自血液的样品，如全血、血清或者血浆样品。还可以预处理所述样品以增加靶分子的可接近性，如通过裂解(机械、化学、酶裂解等等)、纯化、离心、分离等等。还可以标记所述样品以便于靶分子存在的检测(荧光、放射性、发光、化学、酶标记等等)。
在一个实施方案中，本发明所述生物学样品是体液样品，包括但不限于血液、唾液、组织液样本、尿液、淋巴液和脑脊液。各种来源的液体样品可直接用于检测或经过离心、沉淀、过滤等方式预处理后检测。
在一个实施方案中，本发明所述生物学样品是血液样品。在一个实施方案中，所述血液样品是全血样品，即还没有经过分离步骤的血液，其任选可以被稀释。在一个实施方案中，本发明所述血液样品是血浆或 血清样品。本发明所述的“血浆”是指离体的全血经抗凝处理后，通过离心沉淀所获得的不含细胞成分的液体。本发明所述的“血清”是指离体的全血静止凝固后，经血凝块聚缩释出的液体，血清不含纤维蛋白原。由于FN参与血小板的黏附、聚集以及血栓的形成，所以血清中的FN含量一般认为会低于血浆。在一个实施方案中，本发明所述血液样品为血浆样品。
在进一步的实施方案中，血液样品以枸橼酸钠为抗凝剂。在一个实施方案中，血液样品采集采用硅化注射器或塑料注射器或涂硅处理的玻璃制品，避免激活凝血反应。在一个实施方案中，血液样品为新鲜标本或低温冻存样本。在一个实施方案中，新鲜采集的血液样品直接稀释在10倍体积的生理盐水或缓冲液中，取不含细胞的上清为样本。各类血液样品的处理方法和/或处理后所获得样品中含有pED-B的含量与全血中pED-B的含量的转换关系为本领域内的技术人员熟知。
可通过任何合适的方法检测生物学样品中本发明所述的ED-B蛋白。所述方法包括直接或间接测定本发明的ED-B蛋白例如pED-B在生物学样品例如血液样品如血浆中的水平。在一个实施方案中，可通过本发明所述的ED-B蛋白的特异性结合物例如配体、适配体等测定所述ED-B蛋白的含量。在一个实施方案中，所述特异性结合物为抗体。在一个实施方案中，所述特异性结合物为核酸适配体。在一个实施方案中，可通过利用本发明所述的ED-B蛋白的物理特征或化学特征或氨基酸序列特征来测定所述ED-B蛋白的含量，例如通过蛋白质组学方法来定量分析血液中所述ED-B蛋白的含量。
本领域技术人员熟知可以通过免疫学技术检测血液中的ED-B蛋段，免疫学技术包括例如酶联免疫吸附法(ELISA)、AlphaLISA、免疫印迹法、斑点印迹法、免疫共沉淀、胶体金免疫层析法等。
ELISA全称是酶联免疫吸附法。基于ELISA的应用方法类型很多，例如直接法、间接法、双抗体夹心法等，为本领域技术人员熟知。其中的一个应用是，在测定时，受检标本(也称抗原)与固相载体表面的捕获抗体起反应，在固相载体表面形成捕获抗体-抗原复合物。洗涤去除游离抗原后，再加入酶标记的检测抗体，酶标记检测抗体结合在固相载体表面的受检标本上，此时形成捕获抗体-抗原-酶标记检测抗体双抗体 夹心复合物，固相上的酶量与标本中受检标本的量呈正相关。加入底物后，在酶催化作用下生成有色产物，产物的量与标本中受检物质的量也呈相关性，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。另一种应用是，在固相载体表面形成抗体-抗原复合物的基础上，加入未标记的检测抗体形成捕获抗体-抗原-检测抗体双抗体夹心复合物，再加入酶标记的二抗抗体，形成捕获抗体-抗原-检测抗体-酶标抗体的复合物，然后通过酶催化底物完成后续检测。另一种应用是，在测定时，将抗原固化在固相载体表面，加入酶标记检测抗体形成抗原-酶标记检测抗体复合物，然后通过酶催化底物完成检测。另一种应用是，在测定时，将抗原固化在固相载体表面，加入检测抗体形成抗原-检测抗体复合物，再加入酶标的二抗抗体，形成抗原-检测抗体-酶标抗体复合物，然后通过酶催化底物完成检测。捕获抗体用于捕获待测抗原，检测抗体是用来检测被捕获抗体捕获到的抗原的总量。检测抗体可以直接用酶进行标记，也可通过对抗检测抗体的二抗进行酶标记。酶标记物是酶与抗体或与抗原或与半抗原在交联剂作用下联结的产物，是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。免疫技术常用的酶有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶等。免疫技术常用的酶的底物有邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、硝基苯磷酸盐(pNPP)、二氨基联苯胺(DAB)等。
ELISA所用抗体可以是单克隆来源或多克隆来源，可以通过动物免疫获得抗体，也可以通过基因工程技术和计算机辅助技术获得抗体。优选的，单克隆抗体具有更高的特异性。ELISA方法可用于检测血液、吐液、细胞培养液、尿液、组织液、脑脊液等液体样本，也可检测动物组织、固定化组织、细胞等样本。比如，将动物组织或细胞加入液氮研磨等方法破碎匀浆后可用于ELISA检测。
在一个实施方案中，通过双抗体夹心酶联免疫方法来检测所述ED-B蛋白或ED-B蛋白片段的浓度或含量。通过包被在酶标板上的ED-B特异性捕获抗体捕获生物学样品例如血液样品中的ED-B蛋白或ED-B蛋白片段，使ED-B蛋白或ED-B蛋白片段高度富集以利于酶标的ED-B特异性检测抗体结合，提高检测的灵敏度。FN蛋白在血液中一般 以二聚体形式存在，双抗体夹心法检测血液FN所用的所述“包被在酶标板上的ED-B捕获抗体”和“酶标的抗ED-B特异性检测抗体”可以是不同的抗体，也可以是可识别相同抗原表位的抗体，也可以是同一种抗体。
通过双抗体夹心ELISA方法可检测血液样本中的FN(B+)，可采用两个可识别含FN(B+)的抗体，如可直接或间接识别ED-B的抗体CGS-1、CGS-2、L19、B5、BC-1、C6中的任意两个非竞争性抗体。另外，通过夹心ELISA方法可检测血液样本中的FN(B+)，也可采用一个ED-B特异性抗体和一个FN特异性抗体。
通过本发明的双抗体夹心ELISA方法可检测出血液中的ED-B蛋白或ED-B蛋白片段或ED-B结构域，也可以用于在组织匀浆或细胞破碎液中检测ED-B蛋白片段。由于FN是长纤维状蛋白，有多个蛋白酶水解位点，容易断裂成多个小片段，因此通过两个直接作用在ED-B上的抗体来检测ED-B或含ED-B的蛋白，可提高检测ED-B的灵敏度和准确性。
在一个实施方案中，所述ED-B蛋白或ED-B蛋白片段包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或与SEQ ID No.1具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性的序列。在一个实施方案中，ED-B氨基酸序列由SEQ ID NO：2所示的DNA序列编码。在一个优选的实施方案中，ED-B氨基酸序列可由SEQ ID NO：3所示的DNA序列编码。在一个实施方案中，所述ED-B蛋白是含有ED-B结构域的FN。
在另一个实施方案中，还可以通过AlphaLISA方法来检测所述ED-B蛋白或ED-B蛋白片段的浓度或含量。AlphaLISA技术是基于生物分子物质的相互作用的原理发展起来的，例如抗原与抗体可产生相互作用，抗体可与微珠通过分子之间的相互作用形成微珠复合物，其中一个抗体与含有光敏剂的微珠结合形成供体微珠，另一个抗体与含有可与单体氧反应的二甲噻吩衍生物的微珠结合形成受体微珠，在有抗原存在的情况下形成供体微珠-抗原-受体微珠复合物。使用激光激发供体微珠释放单线态氧分子，引发能量转移级联反应，使受体微珠发射光波，该光波具有较强的抗淬灭能力，可被检测器接收。若生物分子不存在特异的相互作用，不能形成供体微珠-抗原-受体微珠复合物，导致单体氧无 法扩散到受体微珠，则不会有光信号的产生。AlphaLISA技术与双抗体夹心法ELISA技术一样需要形成双抗体夹心复合物，但AlphaLISA比ELISA具有更高的灵敏度，均一性和更广泛的动态检测范围，样品需求量低，操作简单，无需洗涤。本发明所述的ED-B蛋白可以通过AlphaLISA进行更快速、高效、灵敏的检测。
在另一个实施方案中，通过Pull-Down方法来检测所述ED-B蛋白或ED-B蛋白片段的浓度或含量。Pull-down技术基本原理是将一种与目的蛋白有亲和作用的配基固相化于基质上(如Sepharose)，当含目的蛋白的溶液经过该基质时，目的蛋白与固相化的亲和配基相互作用而被基质吸附，而非目的蛋白则随洗脱液流出，目的蛋白可以通过改变洗脱条件而回收下来。具体的说，通过将ED-B特异性抗体结合于合成树脂上，将处理后的样品例如血液样品流过该树脂，树脂上的抗体捕获样品中的ED-B蛋白，而非ED-B蛋白则流穿，通过洗涤等方式可进一步除去树脂上非特异性蛋白。树脂上吸附的ED-B蛋白可通过SDS-PAGE方法，或Western blot方法，或ELISA方法，或紫外检测方法等实现对ED-B例如pED-B的定量测定。
在另一个实施方案中，ED-B蛋白的检测包括非特异性浓缩液体中含有ED-B蛋白结构域的蛋白，通过先富集蛋白再检测的方法检测。
在另一个实施方案中，通过蛋白的斑点杂交(Dot blot)方法来检测所述ED-B蛋白或ED-B蛋白片段的浓度或含量。斑点杂交(Dot blot)是将被检标本点到膜上，通过晾干、烘烤、紫外照射等方式使蛋白质固定在膜上或其他固相材质，然后通过检测抗体和相应的酶和底物进行显色，进行定性或定量分析。本方法可以在膜上富集大量且高浓度的蛋白质，能使目的蛋白高度富集，利于检测。本方法耗时较Western blot短，且一张膜上可同时检测多个样品，可作为基因芯片使用。尽管Western blot也可作为pED-B的检测方法之一，因为SDS-PAGE等电泳方法会使不同分子量或不同电荷分布的蛋白分离开，且检测时可加载的样本量有限，在检测pED-B蛋白时会使pED-B的检测灵敏度降低，尤其是pED-B蛋白分子量可能差异较大，在做Westem blot时会呈不同的条带分布。而本检测方法可以通过多次样本点样到膜上并干燥的方法，使样本得到浓缩，利于提高检测的灵敏度，也可通过多次样本点样-风干的 操作，使所点样本进一步富集浓缩，以检测低浓度蛋白。本发明涉及的Dot blot和Westem blot为本领域内的研究人员所熟知。
在另一个实施方案中，通过血液涂片方法来检测所述ED-B蛋白或ED-B蛋白片段的浓度或含量。操作步骤类似于Dot blot。血液涂片的制作方法为本领域的专业人员熟知。
在另一个实施方案中，通过胶体金免疫层析法检测所述ED-B蛋白或ED-B蛋白片段的浓度或含量。胶体金免疫层析法将特异性的抗体(或抗原)以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗体(或抗原)区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。基于本方法已设计成诊断试纸条，使用十分方便。
本领域技术人员熟知，所使用的抗ED-B抗体例如抗体pED-B抗体可以偶联辣根过氧化物酶，也可以偶联碱性磷酸酶；也可以通过偶联上述过氧化物酶或碱性磷酸酶的二抗实现间接检测ED-B例如pED-B目的。反应底物包括DAB、TMB或荧光底物等。
在另一方面，本发明也涉及pED-B的检测方法。由于pED-B在血液中首次被发现，已被验证的可用于pED-B检测的方法很少，如文献报道的Western blot方法未能检测出pED-B(Viti，Tarli et al.1999.Cancer Res.59：347-352.)。推测由于pED-B的含量较低，且FN在血液中容易凝集沉淀析出，给检测带来困难。本发明的pED-B检测方法采用了pED-B蛋白富集技术和提高pED-B的检测灵敏度。pED-B的富集方法一种是采用特异性方法将pED-B捕获富集在固相载体上，而非pED-B蛋白可以通过洗涤等方式去除，如用pED-B的特异性抗体来捕获pED-B；另一种是采用非特异性方法将pED-B和非pED-B蛋白混合物共同固定在固相载体的表面，但通过特异性抗体来检测pED-B的含量；另外还可以对pED-B直接进行质谱检测。
在一个实施方案中，本发明提供了一种检测样品例如来自血液的样品中ED-B蛋白例如pED-B蛋白的水平，包括：
-将第一ED-B蛋白结合物例如抗体与待测样品接触，任选所述第 一ED-B蛋白结合物固定在固体支持物例如酶标板上；
-加入第二ED-B蛋白结合物例如抗体，任选是标记的，例如酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶)标记的，任选所述第二ED-B蛋白结合物与第一ED-B蛋白结合物结合ED-B蛋白上不同的表位；
-任选地，加入抗第二ED-B蛋白结合物的抗体，任选是标记的，例如酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶)标记的，以及
-检测形成的复合物。
在一个实施方案中，所述检测可以是本领域已知的显色反应，例如使用底物邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、硝基苯磷酸盐(pNPP)、二氨基联苯胺(DAB)等。在一个实施方案中，所述第一和第二ED-B蛋白结合物是ED-B蛋白特异性结合物，例如独立选自B5和L19。
在另一个方面，本发明提供了特异性检测ED-B蛋白的物质在检测哺乳动物例如人的生物学样品例如体液样品、优选来自血液的样品中ED-B蛋白的水平而诊断哺乳动物中组织增生、实体肿瘤的存在或者患病风险、对实体肿瘤预后、确定实体肿瘤的发生或进展情况、进行实体肿瘤筛查或监测实体肿瘤治疗疗效的应用。在一个实施方案中，所述哺乳动物是人。
在另一个方面，本发明提供了特异性检测ED-B蛋白的物质在制备用于通过检测哺乳动物例如人的生物学样品例如体液样品、优选来自血液的样品中ED-B蛋白的水平而诊断哺乳动物中组织增生、实体肿瘤的存在或者患病风险、对实体肿瘤预后、确定实体肿瘤的发生或进展情况、进行实体肿瘤筛查或监测实体肿瘤治疗疗效的组合物或试剂盒中的应用。在一个实施方案中，所述哺乳动物是人。
在另一个方面，本发明提供了用于诊断哺乳动物中组织增生、实体肿瘤的存在或者患病风险、对实体肿瘤预后、确定实体肿瘤的发生或进展情况、进行实体肿瘤筛查或监测实体肿瘤治疗疗效的试剂盒，所述试剂盒包括用于特异性检测所述哺乳动物的生物学样品例如体液样品、优选来自血液的样品中ED-B蛋白的物质。在一个实施方案中，所述哺乳 动物是人。
在一个实施方案中，本发明所述特异性检测ED-B蛋白的物质是ED-B蛋白例如pED-B的特异性结合物，通过检测生物学样品例如体液样品优选血液、血浆或血清中的ED-B蛋白例如pED-B水平而辅助确定肿瘤的发生或进展情况，或对高危人群进行肿瘤筛查，或对肿瘤患者的预后进行判断，或判断对肿瘤病人的治疗是否有效，或用于个体化用药。
辅助诊断是指通过血清学、影像学、病理学等手段，辅助医师对疾病类型和严重程度的判断，提高诊断的准确率。
预后是指预测疾病的可能病程和结局。它包括判断疾病的特定后果和预测某段时间内发生某种结局的可能性。
个体化用药是指药物治疗是根据每个患者的特点，如遗传因素、性别、年龄、体重、生理、病理特征以及正在服用的其它药物等综合情况的基础上制定安全、合理、有效、经济的药物治疗方案。
本发明所述的“ED-B蛋白的特异性结合物”是指能识别并结合本发明所述的ED-B蛋白或ED-B蛋白片段的分子，该分子对本发明所述的ED-B蛋白或ED-B蛋白片段具有特异性和高亲和力，也包括以高亲和力和特异性识别细胞表面或细胞外基质的ED-B蛋白或片段的分子。特异性结合物可以是蛋白质或核酸。
在一个实施方案中，本发明所述ED-B蛋白的特异性结合物是对ED-B蛋白例如pED-B特异的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体或抗体的抗原结合片段，例如含有抗体可变区或可变区序列的多肽、scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2。在一个实施方案中，本发明所述的抗体可以是通过免疫动物获得的抗体，例如免疫小鼠、大鼠或兔。在一个实施方案中，本发明所述的抗体可以通过计算机模拟设计或在免疫获得的抗体基础上进行人工辅助设计或者通过基因合成方式获得。
由于ED-B结构域在不同种属中高度保守，人、小鼠、大鼠、狗、兔的ED-B氨基酸序列完全一致，与鸡ED-B也高度同源。本发明所述的ED-B在哺乳动物中高度同源，因此在不同物种中也具有相似的生物学特征，直接识别ED-B表面抗原的特异性抗体一般不具有物种特异性，如CGS-1、CGS-2(PCT/GB97/01412；Nissim，Hoogenboom et al. (1994).EMBO J.13：692-698)、L19(Pini，Viti et al.(1998).J Biol Chem.273：21769-21776)、B5(CN201480001324.5)等，基于上述抗体开发的试剂盒也可用于不同的物种来源的样本。而间接识别ED-B的特异性抗体可能具有物种特异性，如BC-1(Carnemolla，Balza et al.(1989).J Cell Biol.108：1139-1148.)、C6(Ventura，Sassi et al.(2010).PLoS One.5：e9145.)等抗体，可识别人的ED-B相邻结构域上的抗原表位。
本发明所述的试剂盒可用于检测生物学样品例如体液样品、优选来自血液的样品中的本发明所述的蛋白片段的含量。在一个实施方案中，本发明所述的试剂盒包括至少两种ED-B蛋白的抗体。本发明所述的试剂盒包括ED-B特异性抗体，例如L19和/或B5。在一个实施方案中，L19和B5抗体分别为捕获抗体和酶标抗体，用于ED-B蛋白或ED-B蛋白片段的检测。两个抗体中任一个抗体与ED-B结合时不影响另一个抗体与ED-B的结合，提示L19和B5抗体与ED-B结合的抗原表位是不相同的。由于FN(B+)也有形成二聚体的生物学特点，因此，即使采用识别同一个抗原表位的抗体也可以用于试剂盒的开发。
在一个实施方案中，本发明的组合物或试剂盒可用于通过检测生物学样品例如体液样品、优选来自血液的样品中的本发明所述的ED-B蛋白例如pED-B的水平而对高危人群进行肿瘤筛查，通过测定疑似肿瘤患者样品中的ED-B蛋白例如pED-B含量，与健康对照进行对比来判断样本提供者罹患肿瘤的可能性。ED-B蛋白例如pED-B水平比正常水平升高幅度越大则样本提供者罹患肿瘤的概率越大。在另一个实施方案中，本方法也可用于确定个体是否存在肿瘤。
在一个实施方案中，本发明的组合物或试剂盒可用于通过检测生物学样品例如体液样品、优选来自血液的样品中的ED-B蛋白例如pED-B的水平而对肿瘤患者的预后进行判断，通过测定肿瘤患者样品中ED-B蛋白例如pED-B含量，与健康对照或患者先前的对应样品中ED-B蛋白例如pED-B含量进行对比来判断样品提供者的预后。ED-B蛋白例如pED-B持续维持较高水平可能与不利的预后相关。
在一个实施方案中，本发明的组合物或试剂盒可用于通过检测生物学样品例如体液样品、优选来自血液的样品中的本发明所述的ED-B蛋白例如pED-B水平而判断对肿瘤患者的治疗效果，通过测定肿瘤患者 样品中的ED-B蛋白例如pED-B含量，与健康对照或患者先前的对应样品中ED-B蛋白例如pED-B含量进行对比来判断样本提供者的治疗效果。根据ED-B蛋白例如pED-B的水平来辅助判断治疗是否维持或改变治疗策略。
在一个实施方案中，本发明的组合物或试剂盒可用于通过检测生物学样品例如体液样品、优选来自血液的样品中的本发明所述的蛋白ED-B例如pED-B水平而进行个体化用药，通过测定肿瘤患者的样品中的ED-B蛋白例如pED-B含量，与健康对照或患者先前的对应样品中ED-B蛋白例如pED-B含量进行对比来判断样本提供者的治疗效果。根据ED-B蛋白例如pED-B的水平来辅助判断治疗是否维持或改变治疗策略，进行个体化治疗。
在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤为实体肿瘤。实体肿瘤可以是良性肿瘤、恶性肿瘤、交界瘤。恶性肿瘤可以是癌症或肉瘤，例如各类鳞癌、腺癌、肉瘤。在一个实施方案中，所述肿瘤选自食管癌、鼻咽癌、贲门癌、喉癌、头颈癌、胃癌、肝癌、胆道癌、胆囊癌、结肠癌、十二指肠癌、肺癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌和前列腺癌。在一个实施方案中，所述肿瘤是上消化道癌症，例如选自食管癌、贲门癌、喉癌、胃癌。在一个实施方案中，所述肿瘤是鼻咽癌、食管癌、胃癌、肺癌或胰腺癌。
在一个实施方案中，本发明所述的试剂盒包括单克隆抗体B5或L19抗体，该抗体可以特异性识别FN的ED-B结构域，且具有高亲和力、高灵敏度。本发明还根据血液中pED-B的检测方法开发了ELISA检测试剂盒。ELISA是常用的蛋白质免疫检测方法，但由于符合ELISA试剂盒开发需求的ED-B抗体种类少、抗体商业化程度低获取等困难，一直未能建立有效方法检测血液中的ED-B，也鲜有pED-B方面的数据报道。在一个实施方案中，本发明的试剂盒同时包括B5和L19抗体作为双抗体夹心法ELISA的候选抗体。
在一个实施方案中，本发明所述的试剂盒还包括能够阻止血液凝固的抗凝剂，如天然抗凝剂肝素、水蛭素等，二价钙离子鳌合剂柠檬酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA)等。经抗凝剂处理后的血液制品或血浆均可用于本发明所述的ED-B检测方法检测。优选地，本发明在获取血浆时采 用柠檬酸钠作为抗凝剂，以减少FN的沉淀损失。
由于本发明发现ED-B蛋白在健康人体相对稳定，而在肿瘤患者和组织增生患者血液中大幅升高，提示pED-B与肿瘤的发生、发展密切相关。因此，本发明所述的ED-B蛋白可以作为组织增生和肿瘤标志物。pED-B作为肿瘤血液标志物可广泛应用于医学诊断、治疗及科学研究过程中。通过检测本发明所述的标志物在血液中的水平，有助于判断体内是否有肿瘤发生，用于对高危人群进行肿瘤筛查中的用途，或有助于判断肿瘤进展情况，或有助于判断肿瘤治疗的预后情况，或有助于个体化用药与精准治疗，或用于肿瘤的生物学研究。
实施例
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
实施例1：血清标志物标准品和抗体的表达
1、载体构建
A)血清标志物标准品载体构建。合成SEQ ID NO：3所示的DNA序列，该DNA序列可编码FN的3个结构域FN(7B8)，其编码的氨基酸序列参见文献(Schiefner，Gebauer et al.(2012).J Biol Chem.287：17578-17588.)。除编码FN(7B8)外，DNA序列还在FN(7B8)的N端编码一个信号肽和在C端的6个组氨酸标签，其中信号肽利于FN在哺乳动物细胞中的蛋白分泌表达，组氨酸标签利于蛋白纯化。该序列N端和C端分别通过Nhe I和Not I限制性内切酶识别位点克隆至pCI-neo载体(Promega Corporation)中，形成pCI-neo-7B8载体。
B)B5、L19抗体的蛋白表达。分别通过基因合成B5、L19的单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)结构的DNA序列(参见专利申请号CN201480001324.5，Pini，Viti et al.(1998).J Biol Chem.273： 21769-21776和Borsi，Balza et al.(2002).Int J Cancer.102：75-85)。在抗体的DNA序列5’端添加一个编码信号肽的DNA序列和在3’端添加一个编码IgG1 Fc标签的DNA序列，其中信号肽用于在哺乳动物细胞中的蛋白分泌表达，IgG1 Fc利于抗体蛋白的稳定性和蛋白纯化(Cao，Cao et al.(2009).Appl Biochem Biotechnol.157：562-574.)。该序列N端和C端分别通过Nhe I和Not I限制性内切酶酶切并克隆至pCI-neo载体中，形成pCI-neo-B5-Fc载体、pCI-neo-L19-Fc载体。本实施例所述的抗体均采用单链抗体形式，抗体Fc片段含有铰链区，获得的抗体分子量约为52kD。本发明的实施例中所述的抗体一般均含有Fc蛋白结构。抗体蛋白的载体构建和表达方式是本技术领域常用的(Borsi，Balza et al.(2002).Int J Cancer.102：75-85.)。
C)L19-IL2的表达和纯化方法参照文献(Carnemolla，Borsi et al.(2002).Blood.99：1659-1665.)。
2、蛋白表达
将获得的含抗体融合蛋白的质粒大量提取后，利用Invitrogen的脂质体试剂2000将质粒转染至CHO-K1细胞，借助pCI-neo质粒载体的neo基因在含G418的选择性培养基(Davies and Jimenez(1980).Am J Trop Med Hyg.29：1089-1092.)中进行连续4周的选择培养后，经有限稀释法进行克隆化培养，将获得的单克隆细胞继续克隆化培养以获得稳定株。
获得的细胞株用Hyclone CD4CHO悬浮表达。FN(7B8)蛋白用镍柱亲和纯化，带Fc标签的抗体蛋白用Protein A纯化。纯化获得的蛋白通过SDS-PAGE电泳检测纯化获得样本纯度，通过紫外分光光度计检测样本浓度，通过ELISA可评估FN(7B8)与抗体的结合能力。
实施例2：使用L19-IL2抗体融合蛋白和B5-Fc抗体(夹心法ELISA)检测血浆中FN(B+)
通过夹心ELISA方法可检测血液样本中的FN(B+)，可采用两个可识别含FN(B+)的抗体，如可直接或间接识别ED-B的抗体CGS-1、CGS-2、L19、B5中的任意两个非竞争性抗体。另外，通过夹心ELISA方法可检测血液样本中的FN(B+)，也可采用一个FN特异性抗体和一个 ED-B特异性抗体。
采用L19-IL2和B5-Fc抗体进行FN(7B8)标准品和血液样本检测的操作流程简述如下：
1.包被：在酶标板上包被L19-IL2，5个平行样品。将捕获抗体L19-IL2用pH＝9.6的碳酸盐缓冲液(Na2CO31.59g/L，NaHCO3 2.93g/L)稀释至浓度为2ng/μl，按100μl/孔包被酶标板。将酶标板放置37℃生化培养箱中孵育2h。用PBST(NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na2HPO4 1.42g/L，KH2PO4 0.27g/L，pH＝7.4，0.5‰ Tween-20)洗涤包被后的酶标板3次，每次5min，300μl/孔。以含4％BSA的PBS溶液(NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na2HPO4 1.42g/L，KH2PO4 0.27g/L，pH＝7.4)封闭酶标板，300μl/孔，37℃封闭1h。用PBST洗涤酶标板3次，每次3min，300μl/孔。
2.加标准品：加入蛋白质量分别为0.25、0.5、1、2、4、8、16、32ng/孔的FN(7B8)标准品各100μl到酶标板样品孔中。
加待检样品：50倍PBS稀释后的血清样品按100μl/孔加入到酶标板样品孔中。同时以BSA为阴性对照。将酶标板置于37℃孵育1h。
3.加一抗：以PBST洗涤酶标板3次，每次3min，300μl/孔。一抗为B5-Fc，以PBST将各抗体稀释至2ng/μl，按100μl/孔加入到酶标板样品孔中，37℃孵育1h。
4.加二抗：以PBST洗涤酶标板3次，每次3min，300μl/孔。二抗为HRP标记小鼠抗人IgG抗体(Boster BA1070)，用PBST作5000倍稀释，100μl/孔加入到酶标板样品孔中，37℃孵育1h。
5.加底物显色：以PBST洗涤酶标板5次，每次3min，300μl/孔。向样品孔中加入100μl/孔的TMB显色液，室温孵育5min。
6.终止反应：用2mol/L的H2SO4终止反应，向样品孔中加入100μl/孔的终止液，终止反应，样品孔颜色由蓝色立刻变为黄色。
7.吸光值检测：用酶标仪选择OD450nm和OD630nm双波长检测。扣除空白对照孔的本底值，即为样品检测吸光值。
经酶标小鼠抗人抗体间接方法检测获得的吸光值判断，B5与L19组合的显色数值显著高于阴性对照，即B5与L19抗体组合的灵敏度满足pED-B的浓度检测需求。结果见图5
实施例3：小鼠肿瘤模型建立及FN(B+)检测
健康balb/c nu裸鼠在SPF级屏障系统中饲养至20g/只，共12只，其中实验组6只，在每只小鼠背部皮下植入人咽鳞癌细胞FaDu(Rangan(1972).Cancer.29：117-121.)约200万细胞，继续饲养。当小鼠肿瘤直径生长至平均2cm(约4周)时，取小鼠全血，以枸橼酸钠为抗凝剂，于4℃、3000g离心2分钟，取血浆上清弃沉淀，重复一次，采用ELISA方法检测血浆中ED-B的含量。
以6只健康balb/c nu小鼠血浆样本为对照组样本，检测小鼠血液中FN(B+)的含量。
小鼠血液中FN(B+)的含量检测方法，概括的说，用L19-Fc抗体(2ng/μl，100μl/孔)包被COSTER 96孔酶标板于37℃孵育2小时，用BSA的PBS溶液于4℃封闭过夜后用PBS洗涤3次，加入100μl用PBS稀释10倍的小鼠血浆，室温孵育2小时，充分洗涤后加入HRP标记的B5-Fc抗体(2ng/μl，100μl/孔)，用TMB法显色。
结果显示健康小鼠血液中ED-B的含量是0.35±0.15mg/L，提示健康小鼠血液中含有ED-B，或者健康小鼠血液样本含有FN(B+)。
荷瘤小鼠血液中ED-B含量是0.66±0.25mg/L，与健康小鼠相比，荷瘤小鼠血浆中ED-B的含量升高。
实施例4：人血浆样本采集、pull-down方法测定pED-B及肿瘤恶性程度
取健康人血液、肿瘤患者血液经枸橼酸钠抗凝剂处理后于4℃、3000g离心2分钟后取血浆，弃沉淀，重复一次。
将50μl Protein A(Genscript Co.)填料用Binding wash buffer预处理后移入1.5ml离心管中，加入0.2mg的B5-Fc抗体，在4℃中颠倒混合1hr，形成Protein A与B5-Fc抗体二聚复合物。离心去除上清，再用Binding wash buffer洗涤Protein A三次，弃去上清洗涤液，将Protein A与B5-Fc抗体二聚复合物均分为3份，然后分别加入三种样本中，其中A)100μl健康血浆，B)100μl食管癌患者血浆，C)BSA溶液，阴性对照。在4℃中颠倒混合1hr，PBS洗涤三次。然后取复合物沉淀进行样本处理用于SDS-PAGE检测。
SDS-PAGE所用分离胶浓度为8％，浓缩胶浓度为5％，上样量体积为20μL，电流为30mA，考马斯亮蓝染色。通过SDS-PAGE检测结果分析，健康人血浆与所选肿瘤患者血浆中均有B5-Fc捕获的蛋白出现，且从肿瘤患者血浆样本中捕获的蛋白浓度显著高于健康人血浆。见图1。
另外，在上述SDA-PAGE实验基础上进行Western blot分析，以BSA为阴性对照。以抗ED-B的抗体L19-Fc为一抗，以辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体为二抗，通过底物DAB显色。Western blot检测结果提示，Protein A与B5-Fc抗体二聚复合物捕获的蛋白为含ED-B结构域的蛋白。Protein A与B5-Fc抗体二聚复合物不能与BSA溶液中的蛋白质结合。见图2。
实施例5：血液中ED-B的含量测定与肿瘤发生的关系
通过实施例2所述的ELISA方法检测健康人和初诊肿瘤患者(含鼻咽癌、食管癌、胃癌、肺癌、胰腺癌、白血病、淋巴瘤患者，后经病理学或影像学诊断确诊)、良性组织增生(含乳腺增生、良性肿瘤)和一些慢性病(含高血脂、类风湿、肺炎)患者血浆ED-B的含量(见图4A-J)。
结果显示健康人血液中ED-B含量较稳定，实体肿瘤患者血液中ED-B水平显著升高，且不同肿瘤类型对ED-B升高水平的影响有不同特点。例如食管癌、胃癌、鼻咽癌、肺癌患者血液中pED-B的水平显著升高，与健康人相比差异具有显著统计学意义。白血病、淋巴瘤、高血脂、肺炎和类风湿患者血液中的pED-B水平与健康人相比差异无统计学意义。良性肿瘤患者和乳腺增生患者血液中pED-B水平也有升高，与健康人相比差异有显著统计学意义。统计方法是Mann-Whitney test。
实施例6：检测ED-B的酶联免疫试剂盒的制备
ED-B的酶联免疫试剂盒，其组成为：包被有L19-Fc抗体的酶标板；辣根过氧化物酶(HRP)标记的B5-Fc抗体；ED-B标准品；样品稀释液；洗涤液；显色剂；终止液。
上述溶液的制备方法如下：
1.包被有L19-Fc抗体的酶标板
1)包被：捕获抗体为L19-Fc，将捕获抗体用pH＝9.6的碳酸盐缓冲液稀释至浓度为2ng/μl，100μl/孔(200ng/孔)，包被酶标板。将酶标板放置37℃生化培养箱中孵育2h，再放置4℃冰箱，孵育8-10h。
2)洗涤：用PBST洗涤包被后的酶标板5次，每次3min，300μl/孔。
3)封闭：以4％的BSA封闭酶标板，300μl/孔，37℃封闭1h。
4)洗涤：用PBST洗涤酶标板5次，每次3min，300μl/孔。
5)风干：最后将酶标板置于阴凉处风干，放置4℃冰箱保存备用。
2.辣根过氧化物酶(HRP)标记的B5-Fc抗体：用NaIO4将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后HRP再与抗体上的氨基相结合，该方法所获酶标记抗体的产率高，酶与抗体的活性无重大损失(Tsang，Greene et al.(1995).J Immunoassay.16：395-418.)。
3.ED-B标准品：FN(7B8)标准品
4.样品稀释液
PBS：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.42g，KH2PO4 0.27g，蒸馏水定容至1L，调pH＝7.4，过滤处理。
5.洗涤液
PBST：1L，即向PBS中加入体积比为0.5‰的Tween-20，混匀。
6.显色剂制备
底物显色液包括A液和B液，使用前等体积混合A液和B液，避光显色。
A液的制备过程为：将过氧化脲1g，磷酸氢二钠35.8g，柠檬酸10.2g加ddH2O避光溶解后加入Tween-20100μl，定容至1L，4℃避光保存；
B液的制备过程为：TMB 0.7g，柠檬酸10.3g，用DMSO 40ml避光溶解后加ddH2O定容至1L，4℃避光保存。
7.终止液制备将98％浓硫酸与超纯水按体积比为1∶8的比例混合得到2mol/L硫酸溶液。
pH＝9.6碳酸盐包被液：0.05M碳酸盐缓冲液，配方是Na2CO3 1.59g和NaHCO3 2.93g溶于1L去离子水中？。
实施例7：本发明的ELISA试剂盒检测多种样本中ED-B的含量
1、检测样品及处理
1)血清获得：采集20周龄Bal B/C小鼠新鲜血液，于1.5mL离心管中，倾斜或平放于37℃生化培养箱中1h，待析出血清后，离心(3000g，5min)2次，用移液器吸取上清，注意不要吸到红细胞。取上清液用于ELISA检测。待检测样品短期放置于冰上或4℃冰箱中，长期放置需冻存于-20℃或更低温条件下。
2)血浆获得：采集20周龄Bal B/C小鼠新鲜血液时需要加入适量枸橼酸钠抗凝剂，将采血管垂直放置1h，使血液自然沉淀，然后用离心管离心，离心(3000g，5min)2次，分离血浆用于检测。待检测样品短期放置于冰上或4℃冰箱中，长期放置需冻存于-20℃或更低温条件下。
3)血液样品获得：采集20周龄Bal B/C小鼠新鲜血液，用PBS稀释100倍，离心(3000g，5min)2次，取上清液用于ELISA检测。待检测样品短期放置于冰上或4℃冰箱中，长期放置需冻存于-20℃或更低温条件下。
4)细胞样品处理：贴壁培养的FaDu细胞刮落后移入离心管，悬浮细胞则直接移入离心管，1000g离心5min，用PBS洗涤3次弃去PBS，加入液氮并用研磨棒研磨，然后再加入适量PBS，离心(3000g，5min)2次，取上清液用于ELISA检测。待检测样品短期放置于冰上或4℃冰箱中，长期放置需冻存于-20℃或更低温条件下。总蛋白浓度采用BCA法测定。
5)组织样品处理：将采集到的人咽鳞癌细胞(FaDu)Bal b/c裸鼠移植瘤新鲜样本，洗去血渍，根据需要加入蛋白酶抑制剂，将动物组织剪碎后加入液氮，并在研钵里研磨至组织成细粉末。加入适量PBS，离心(3000g，5min)2次，取上清液用于ELISA检测。待检测样品短期放置于冰上或4℃冰箱中，长期放置需冻存于-20℃或-80℃条件下。总蛋白浓度采用BCA法测定。
2、检测步骤：
1)加待检样品：稀释后的样品按100μl/孔加入到ELISA板样品孔中，同时加入标准蛋白EDB(2倍比稀释，32-0.25ng/孔)，用作建立标 准曲线；同时做阴性和空白对照；ELISA板置于37℃孵育1h。
2)洗涤：以PBST洗涤ELISA板5次，每次3min，300μl/孔。
3)加酶标抗体：以PBST将该抗体稀释至2ng/μl，100μl/孔加入到ELISA样品孔中，37℃孵育1h。
4)洗涤：以PBST洗涤ELISA板5次，每次3min，300μl/孔。
5)加底物显色：向样品孔中加入100μl/孔的TMB显色液，室温孵育5-6min。
6)终止反应：用2M的H2SO4终止反应，向样品空中加入100μl/孔的终止液，终止反应，样品空颜色由蓝色立刻变为黄色。
7)吸光值检测：建议酶标仪选择450nm和630nm双波长检测。扣除空白对照孔的本底值，即为样品检测吸光值。
8)数据处理。用均值+方差表示。
结果表明，(1)本发明所述的ELISA提供了定量测定ED-B含量的方法，(2)可检测的样本有：血液样品，包括血清、血浆、新鲜血液稀释样品，以及细胞和组织样本等，结果见图3。

Claims (16)

  1. 一种在哺乳动物例如人中检测组织增生、诊断实体肿瘤的存在或者患病风险、对实体肿瘤预后、确定实体肿瘤的发生或进展情况、进行实体肿瘤筛查或监测实体肿瘤治疗疗效的方法，包括：
    -在所述哺乳动物的生物学样品例如血液样品中检测ED-B蛋白的水平，以及
    -与对照样品中ED-B蛋白的水平比较，
    其中检测样品中所述ED-B蛋白的水平升高是所述哺乳动物中存在组织增生、存在实体肿瘤或患病风险、或预后不良的指征。
  2. 权利要求1的方法，其中所述生物学样品得自血液、唾液、组织液、尿液、淋巴液和脑脊液，优选所述生物学样品是血液样品例如全血样品、血浆样品或血清样品。
  3. 权利要求1或2的方法，其中所述组织增生是乳腺增生，和/或所述实体肿瘤是良性肿瘤或恶性肿瘤，例如鳞癌、腺癌或肉瘤。
  4. 权利要求1-3任一项的方法，其中所述实体肿瘤选自鼻咽癌、头颈癌、肝癌、胆道癌、胆囊癌、结肠癌、十二指肠癌、肺癌、膀胱癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾癌、前列腺癌和上消化道癌症例如食管癌、贲门癌、喉癌或胃癌，优选选自鼻咽癌、食管癌、胃癌、肺癌和胰腺癌。
  5. 权利要求1-4任一项的方法，其中所述实体肿瘤是上消化道癌症，例如选自食管癌、贲门癌、喉癌和胃癌。
  6. 权利要求1-5任一项的方法，其中通过使用特异性检测ED-B蛋白的结合物检测所述生物学样品中ED-B蛋白的水平，所述ED-B蛋白 包含如下序列：(a)SEQ ID NO：1，或(b)与(a)中的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列相同性的序列。
  7. 权利要求6的方法，其中所述特异性检测ED-B蛋白的结合物是ED-B蛋白的抗体，例如单克隆抗体或多克隆抗体。
  8. 权利要求7的方法，其中所述ED-B蛋白的抗体选自CGS-1、CGS-2、L19、B5、BC-1和C6，优选B5和/或L19抗体。
  9. 权利要求7的方法，其中所述ED-B蛋白的抗体是选自CGS-1、CGS-2、L19、B5、BC-1和C6中的至少两种抗体，优选B5和L19抗体。
  10. 权利要求1-9任一项的方法，包括：
    -将第一ED-B蛋白特异性结合物例如抗体与待测样品例如来自血液的样品接触，任选所述第一ED-B蛋白特异性结合物固定在固体支持物例如酶标板上，
    -加入第二ED-B蛋白特异性结合物，任选是标记的，例如酶标记的，以及任选所述第二ED-B蛋白特异性结合物与第一ED-B蛋白特异性结合物结合ED-B蛋白上不同的表位，
    -任选地，加入抗第二ED-B蛋白特异性结合物的抗体，任选是标记的，例如酶标记的，
    以及
    -检测形成的复合物，
    优选其中所述第一和第二ED-B蛋白特异性结合物是抗体，任选独立选自CGS-1、CGS-2、L19、B5、BC-1和C6，例如B5和L19。
  11. 用于通过权利要求1-10任一项的方法检测哺乳动物例如人的 生物学样品例如血液样品中ED-B蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求6-9中任一项所限定的用于特异性检测所述哺乳动物的生物学样品例如血液样品中ED-B蛋白的结合物或其组合。
  12. 权利要求11的试剂盒，其中所述结合物是ED-B蛋白特异性抗体，任选是标记的和/或是单克隆或多克隆抗体，例如选自CGS-1、CGS-2、L19、B5、BC-1和C6。
  13. 权利要求12的试剂盒，包括至少两种ED-B蛋白特异性抗体，例如B5和L19，任选是标记的，以及任选其中一种固定在固体支持物例如酶标板上。
  14. 权利要求11-13任一项的试剂盒，还包括抗凝剂如肝素、水蛭素、柠檬酸钠或乙二胺四乙酸(EDTA)，优选柠檬酸钠；和/或ED-B蛋白标准品，例如SEQ ID NO：3所编码的FN(7B8)。
  15. 特异性检测ED-B蛋白的结合物在制备检测哺乳动物例如人的生物学样品例如血液样品中ED-B蛋白的试剂盒或组合物中的应用。
  16. 权利要求15的应用，其中所述结合物如权利要求6-9中任一项所限定和/或其中所述试剂盒如权利要求11-14中任一项所限定。
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