JP2011038952A - 特定の糖鎖構造を有する糖タンパク質を検出することにより癌を検出する方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】当該課題は、生体由来の試料と抗シアリルTn抗体及び抗MUC1抗体とを接触させることにより、前記抗体がともにシアリルTnを有するMUC1糖タンパク質を特異的に検出する手段により解決することができる。
【選択図】なし
Description
(1)生体由来の試料と抗シアリルTn抗体及び抗MUC1抗体とを接触させることを含む、癌を検出する方法であって、前記抗体がともにシアリルTnを有するMUC1糖タンパク質を特異的に検出することを特徴とする、前記方法。
(2)方法がELISA法である、(1)記載の方法。
(3)癌が胃癌又は肺癌である、(1)又は(2)記載の方法。
(4)試料が腹腔洗浄液由来である、(3)記載の胃癌を検出する方法。
(5)肺癌が肺腺癌である、(3)記載の方法。
(6)(1)記載の方法に用いるための、抗シアリルTn抗体及び抗MUC1抗体とを含む、癌検出試薬。
本発明の癌の検出方法
本発明の癌の検出方法は、癌組織で強く発現するsTnを有するMUC1糖タンパク質を精度よく検出することに関し、具体的には抗sTn抗体及び抗MUC1抗体を用いて、当該タンパク質をより感度よく検出することを特徴とする。
本発明の方法に関する「sTnを有するMUC1糖タンパク質」とは、シアリルTnで修飾されたMUC1糖タンパク質をいう。「MUC1糖タンパク質」とは、MUC1コアペプチドに、セリン又はトレオニン残基を介して多数のO型糖鎖が付加されているムチン性の膜結合型糖タンパク質、又は前記膜結合型糖タンパク質が細胞外部分で切断されて生じた分泌型あるいは可溶化型糖タンパク質である。MUC1コアタンパク質遺伝子の塩基配列は公知であり、例えば、GENEBANKにアクセッション番号NM_002456として登録されている。MUC1コアタンパク質はI型膜タンパク質であり、短いN末端領域、20アミノ酸の反復配列(ムチンリピート)からなる中央領域、ムチンリピートよりC末側の短い細胞外領域、膜貫通領域、細胞質側の短いC末端領域からなる。細胞外領域全体にわたって多数のセリンとトレオニンが存在し、特にムチンリピートを構成する20アミノ酸のうち5アミノ酸がセリンとトレオニンで占められる。少なくともムチンリピート内では5カ所のセリンとトレオニンのほぼ全てにO型糖鎖が付加していると報告されている。ムチンリピートの繰り返し回数は著しい多型を示し、21から125回に及ぶ。それゆえその分子量は300kDa以上と長大になる。
ここで、Siaはシアル酸を、GalNAcはN-アセチルガラクトサミンを、Ser/Thrはセリン又はトレオニンを表す。O型糖鎖を有する多数のタンパク質がsTnで修飾されうる。sTnは、より初期段階での糖鎖合成異常に由来する。すなわち、前記コア1構造のGalNAcに対しシアル酸(Sia)がα2-6結合で結合している(Siaa2→6GalNAca→Ser/Thr)。しかし、この結合様式は正常組織では見出されない。重要なことは、このシアル酸付加により、当該糖鎖にこれ以上の付加・伸長が起きなくなることであり、結果的にsTn糖鎖抗原が蓄積する。sTn糖鎖抗原は、良性疾患における偽陽性率が低く、癌特異性が高いことを特徴とし、胃癌、膵癌、大腸癌、胆道癌等の消化器癌や卵巣癌、子宮頸癌等で認められ、これらの癌の組織マーカーとして用いられる他、血中癌マーカーの1つとしても用いられる。
本発明の方法は、抗sTn抗体及び抗MUC1抗体を用いることを特徴とする。
本発明において「抗sTn抗体」とはsTn糖鎖抗原に結合し得る抗体分子全体を意味し、「抗MUC1抗体」は、種々の糖鎖で修飾されたMUC1糖タンパク質又は糖鎖修飾を受けていないMUC1コアタンパク質又はそれらの部分断片に結合し得る抗体分子全体を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。さらに、その断片、すなわち抗原抗体反応活性を有する活性フラグメント、具体的には、Fab、F(ab’)2、Fv、組換えFv体、1本鎖Fvも含まれる。
本発明の方法は、sTnを有するMUC1糖タンパク質を特異的に検出することにより、癌を検出する方法に関する。特異的に検出する方法としては、免疫学的に検出する方法があげられる。免疫学的方法としては、一般に普及している多くの手法があげられ、免疫沈降及びウェスタンブロッティングのほか、競合法、イムノメトリック法、ネフェロメトリー(nephelometry)、サンドイッチ法などが好適に用いられるが、感度及び特異性の見地から、サンドイッチ法がとくに好ましい。サンドイッチ法としては、例えば、酵素免疫測定法(ELISA(enzyme−linked immunosorbent assay)又はEIA(enzyme immunoassay))、放射性免疫測定法(RIA(radioimmuno assay))等が含まれるが、これらに限定されない。
本発明では、上記の免疫学的方法により得られた検出結果を指標として癌の状態を評価することにより癌を検出することができる。具体的には、(i)生体由来の試料と本発明の抗sTn抗体及び抗MUC1抗体とを反応させて、試料中に存在する癌マーカーであるsTnを有するMUC1糖タンパク質を特異的に検出する工程;及び(ii)工程(i)の検出結果を、癌と関連付ける工程;を含む癌の検出方法である。
本発明の癌の検出方法には、生体由来の試料を用いることができる。本発明で用いる生体由来の試料としては、体液、組織、細胞、血液、尿及び手術等で採取される液体等があげられるがこれらに限定されない。手術等で採取される液体としては、例えば、腹腔洗浄液や腹水があげられる。腹腔洗浄液とは、手術時に腹腔を洗浄する腹腔洗浄法により得られる液体をいい、洗浄には生理食塩水等が用いられる。腹腔洗浄法には、腹腔内貯留液の有無や性状などを検査するための診断的腹腔洗浄法と消化管穿孔時の腹腔内洗浄、腹腔内細菌の排除及び術中の出血による凝血塊の除去、臓器の乾燥予防などを目的とした治療的腹腔洗浄法などがあげられ、このような方法により得られた液体であれば本発明で用いることができる。特に、胃癌腹腔洗浄液は、従来から、腹腔内の遊離胃癌細胞を検出して胃癌の腹膜転移の有無を検査するために採取されてきた試料である。本発明の方法で用いる生体由来の試料として当該胃癌腹腔洗浄液を用いると、高感度かつ迅速に腹腔内遊離胃癌細胞を検出することができるため、胃癌腹腔洗浄液は本発明の生体由来の試料として好ましい。
本発明の方法により検出できる癌の適用部位は特に限定されず、胃癌、肺癌、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、乳癌、食道癌、膵癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、皮膚癌、各種白血病(例えば急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型T細胞白血病、悪性リンパ腫)、等を対象として適用される。上記癌は、原発巣であっても、転移したものであっても、他の疾患と併発したものであってもよい。特に、本発明の方法には、肺癌及び胃癌の検出に適する。ここで、本発明の方法は、肺癌の検出のうち、肺腺癌の検出に好適である。また、本発明の方法は、胃癌の検出のうち、胃癌の検出のほか、胃癌の腹膜転移の検出にも好適である。胃癌の腹膜転移とは、胃壁を超えて腹腔内に広がった遊離癌細胞から生ずる癌で、胃癌の再発の主因である。本発明の方法を胃癌の腹膜転移の検出に用いる場合は、腹腔洗浄液を用いて腹膜播種を検出することにより、癌の予後や再発の有無を早期に診断することできるため、好ましい。
本発明の上記癌を検出する方法には、抗シアリルTn抗体及び抗MUC1抗体とを含む、癌検出試薬を用いることができる。
本実施例は、sTn陽性癌細胞株を樹立することを目的とする。
肺腺癌細胞株として、A549、ABC1、EHHA−9、NCI−H358、NCI−H441、NCI−H838、NCI−H1355、NCI−H1819、NCI−H1975、NCI−H3255、HAL8、HAL24、HCC827、LX−1、PC−9、及びRERF−LC−MSの16種類の細胞を用いて以下の実験に供した。
本実施例は、sTn陽性癌細胞株を用いて免疫沈降及びウェスタンブロッティングにより、本発明のタンパク質を解析することを目的とする。
しかしながら、銀染色では、ウェスタンブロッティング解析で得られた分子量のバンド又はスメアに対応するバンド又はスメアを検出することができなかった(図3A)。
本実施例は、癌組織用いて免疫沈降及びウェスタンブロッティングにより、本発明のタンパク質を解析することを目的とする。
上記のように得られた肺腺癌組織試料をRIPAバッファーで溶解した後、10,000gで5分間遠心分離し、上清を細胞ライセートとして回収した。タンパク定量後、タンパク質量が100μg/mlになるように細胞ライセートをRIPAバッファーで希釈し、1mLを1.5ml試験チューブに分注した。その後、実施例2で記載した10μlのB72.3セファロースビーズを添加し、4℃で終夜インキュベートした。免疫沈降物をRIPAバッファーで3回洗浄し、1×SDSサンプルバッファー(100mM Tris−HCl、pH6.8、10%グリセロール、2%SDS、0.005%BPB)で懸濁した後、95℃で5分間のインキュベーションで溶出した。溶出した免疫沈降物について、銀染色(図4、A)並びにB72.3及び抗MUC1抗体を用いたウェスタンブロッティングにより解析した。その結果、図4で示されるように、MUC1は癌部でのみ検出され、非癌部では検出されなかった(図4、B)。一方、抗MUC1抗体(クローンVU4H5,SantaCruz)で免疫沈降し、得られた免疫沈降物を、抗sTn抗体を用いて検出した場合にも、癌部でのみ250kDaより上の位置に特異的なバンドが得られた(図4、B)。したがって、この系で検出されるMUC1が肺腺癌を検出する良好なマーカーとなることが示された。
本実施例は、癌組織ライセートを用いて免疫沈降及びウェスタンブロッティングを行い、本発明のタンパク質を解析することを目的とする。
上記肺癌組織試料をRIPAバッファーで溶解した後、10,000gで5分間遠心分離し、上清を細胞ライセートとして回収した。タンパク定量後、タンパク質量が100μg/mlになるように細胞ライセートをRIPAバッファーで希釈し、1mlを1.5ml試験チューブに分注した。その後、実施例2で記載した10μlのB72.3セファロースビーズを添加し、4℃で終夜インキュベートした。免疫沈降物をRIPAバッファーで3回洗浄し、1×SDSサンプルバッファー(100mM Tris−HCl、pH6.8、10%グリセロール、2%SDS、0.005%BPB)で懸濁した後、95℃で5分間のインキュベーションで溶出した。溶出した免疫沈降物についてMUC1抗体を用いたウェスタンブロッティングで解析した。その結果、図5A及びBで示されるように、肺腺癌34症例中29症例(85.3%)においてMUC1が検出され(図5B)、この系で検出されるMUC1が肺腺癌を検出する良好なマーカーとなることが示された。
本実施例は、肺癌細胞株ライセート及び培養上清を用いたサンドイッチELISAで肺腺癌の存在を予測することができるか否かの検討を行うことを目的とする。
本実施例は、肺癌患者組織ライセートを用いたサンドイッチELISAで肺癌の存在を予測することができるか否かの検討を行うことを目的とする。
以下の実験には、肺腺癌患者の癌部由来の組織ライセート(AD)、ならびにその他の肺癌患者の癌部又は罹患部由来の組織ライセート(SQ、SCLC、Fibrosis)を用いた。上記組織ライセートを用いて、以下のように、サンドイッチELISA法を用いてsTN−MUC1を検出及び測定した。
本実施例は、癌細胞を移植したマウスモデルを用いて、sTn発現と癌の腹膜転移及び予後の悪化の相関関係を検討することを目的とする。
本実施例は、抗sTn抗体であるB72.3モノクローナル抗体を精製し、固相化することを目的とする。B72.3モノクローナル抗体はsTnに対する特異性が確認されている抗体である。
本実施例は、sTn陽性GCIY/6Lを用いた免疫沈降とウェスタンブロッティングを行い、sTnキャリアタンパク質を同定することを目的とする。
本実施例は、ヒト胃癌組織ライセートにおいてsTn−MUC1の存在を確認することを目的とする。
すなわち、薄切した胃癌凍結組織(厚さ16μm、面積約1cm2)4枚をマイクロチューブに移し、プロテアーゼ阻害剤としてcomplete Mini、EDTA−free(Roche)を添加した0.4ml RIPAバッファーとガラスビーズを加えて組織を破砕・溶解し、マイクロチューブに移して遠心分離後、上清をライセート(lysate)として回収した。タンパク質100μgを含むライセートを分取し、ProteinG Sepharoseビーズ15μlを加えてプレクリアした後、実施例9と同一の方法で、免疫沈降−ウェスタンブロット解析を行った。
本実施例は、胃癌腹腔洗浄液においてsTn−MUC1を検出することを目的とする。
本実施例では、愛知県がんセンター病院においてインフォームドコンセントが得られた胃癌患者から採取された腹腔洗浄液を用いた。全ての腹腔洗浄液のCA72-4濃度をCA72-4ELISAキット(DRG社製)を用いて測定した。腹膜転移を伴う進行胃癌でCA72-4濃度が100U/mlより大きい腹腔洗浄液3例(高CA72-4群)と腹膜転移を伴う進行胃癌でCA72-4濃度が30U/mlより小さい腹腔洗浄液1例(低CA72-4)及び腹膜播種を認めない初期癌でCA72-4陰性の腹腔洗浄液1例(CA72-4陰性)に対して、2mgのタンパク質を含む腹腔洗浄液から実施例5と同一の方法でB72.3モノクローナル抗体レジンを用いた免疫沈降を行い、抗MUC1抗体(VU4H5)を用いてウェスタンブロット解析を行った。
Claims (6)
- 生体由来の試料と抗シアリルTn抗体及び抗MUC1抗体とを接触させることを含む、癌を検出する方法であって、前記抗体がともにシアリルTnを有するMUC1糖タンパク質を特異的に検出することを特徴とする、前記方法。
- 方法がELISA法である、請求項1記載の方法。
- 癌が胃癌又は肺癌である、請求項1又は2記載の方法。
- 試料が腹腔洗浄液由来である、請求項3記載の胃癌を検出する方法。
- 肺癌が肺腺癌である、請求項3記載の方法。
- 請求項1記載の方法に用いるための、抗シアリルTn抗体及び抗MUC1抗体とを含む、癌検出試薬。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015068851A1 (ja) * | 2013-11-11 | 2015-05-14 | 東ソー株式会社 | 前立腺癌と前立腺肥大症との識別方法 |
JP2017072523A (ja) * | 2015-10-08 | 2017-04-13 | 学校法人東京医科大学 | 子宮頸がんの試験方法およびそれに用いる試験試薬 |
CN111537744A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-14 | 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 | 一种基于乳脂肪球膜特性的乳凝集素或粘蛋白1的elisa定量检测方法 |
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Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
JPN6013023377; 第29回日本糖質学会年会要旨集 , 20090810, p132 P-123 * |
JPN6013023378; 第29回日本糖質学会年会要旨集 , 20090810, p138 P-136 * |
JPN6013023379; 胆と膵 Vol.26、No.5, 2005, p451-457 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015068851A1 (ja) * | 2013-11-11 | 2015-05-14 | 東ソー株式会社 | 前立腺癌と前立腺肥大症との識別方法 |
JP2017072523A (ja) * | 2015-10-08 | 2017-04-13 | 学校法人東京医科大学 | 子宮頸がんの試験方法およびそれに用いる試験試薬 |
WO2017061152A1 (ja) * | 2015-10-08 | 2017-04-13 | 学校法人東京医科大学 | 子宮頸がんの試験方法およびそれに用いる試験試薬 |
CN111537744A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-14 | 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 | 一种基于乳脂肪球膜特性的乳凝集素或粘蛋白1的elisa定量检测方法 |
CN111537744B (zh) * | 2020-05-26 | 2023-04-07 | 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 | 一种基于乳脂肪球膜特性的乳凝集素或粘蛋白1的elisa定量检测方法 |
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