JP5345059B2 - 婦人科癌の検出方法 - Google Patents
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Description
本発明は、β１−３ガラクトース転移酵素−５及び／又はβ１−３ガラクトース転移酵素−４、あるいはＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２を分析することを特徴とする婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌の検出方法に関する。なお、本明細書における前記「分析」には、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。
婦人科癌には、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、子宮肉腫、絨毛癌（絨毛性疾患）などが含まれる。これらの多くは、症状による早期発見が困難であるが、早期に手術などの外科療法を行うことにより、５年生存率は顕著に上昇する。そのため、これらの婦人科癌を早期に発見することのできる腫瘍マーカーの開発が望まれている。
例えば、卵巣癌は、腹部の卵巣にできる癌であるため、腫瘍ができても初期にはほとんど自覚症状がみられない。そのため、卵巣癌患者は転移が起こった後の病期の進んだ段階、例えばIII期又はIV期で発見されることが多く、このような患者では治療を行っても５年生存率は低くなっている。卵巣癌患者の治療は、手術により卵巣や大網を切除する外科療法、放射線療法、及び抗癌剤を使用する化学療法が行われている。卵巣癌の病期の進んでないＩ期又はII期では、外科療法により卵巣やその周囲の組織を切除することにより、完全に治療することも可能である。一方、病期の進んだIII期又はIV期では、リンパ節や肝臓への転移も起こっているため、手術により完全に癌細胞を取り除くことはできず、放射線療法や化学療法を併用することになる。しかしながら、転移した癌を放射線療法や化学療法により、完全に抑えることは困難であり、５年生存率は、Ｉ期又はII期に発見された患者と比較すると極端に低くなっている。従って、病期の初期の段階で、卵巣癌患者を発見することが望まれている。
例えば、卵巣癌は、腹部の卵巣にできる癌であるため、腫瘍ができても初期にはほとんど自覚症状がみられない。そのため、卵巣癌患者は転移が起こった後の病期の進んだ段階、例えばIII期又はIV期で発見されることが多く、このような患者では治療を行っても５年生存率は低くなっている。卵巣癌患者の治療は、手術により卵巣や大網を切除する外科療法、放射線療法、及び抗癌剤を使用する化学療法が行われている。卵巣癌の病期の進んでないＩ期又はII期では、外科療法により卵巣やその周囲の組織を切除することにより、完全に治療することも可能である。一方、病期の進んだIII期又はIV期では、リンパ節や肝臓への転移も起こっているため、手術により完全に癌細胞を取り除くことはできず、放射線療法や化学療法を併用することになる。しかしながら、転移した癌を放射線療法や化学療法により、完全に抑えることは困難であり、５年生存率は、Ｉ期又はII期に発見された患者と比較すると極端に低くなっている。従って、病期の初期の段階で、卵巣癌患者を発見することが望まれている。
さて、前記のように卵巣癌は、初期にはほとんど自覚症状がないため、病期の進んだ段階で超音波等の画像診断で診断されることが多かった。更に、卵巣癌患者を診断する卵巣癌の診断マーカーとしては、ＣＡ１２５という糖タンパクの測定が最も広く用いられている。ＣＡ１２５は、卵巣癌の４つの組織型（漿液性卵巣癌、粘液性卵巣癌、類内膜性卵巣癌、明細胞性卵巣癌）のうち、特に漿液性腺癌での陽性率が高いことが知られており、卵巣癌に特異性の高いマーカーであり、病期の進んだ段階では、多くの患者がＣＡ１２５陽性を示す。しかしながら、早期癌での陽性率は低く、欧米においては、健康診断においてＣＡ１２５の血液検査による早期診断の試みも行われているが、その有効性は証明されていない。
また、子宮体癌は、子宮の内側の子宮内膜に発生する癌であり、通常の婦人科検診で行われている細胞診テストでは発見することはできない。子宮体癌の治療も、手術により癌部を取り除く外科療法、放射線療法、抗癌剤を使用する化学療法、及びホルモン療法が行われている。子宮体癌の病期は、癌の拡がり方により、Ｉ〜IV期に分けられるが、Ｉ〜III期の病期では外科療法が行われ、初期に治療を行うことにより、５年生存率が高くなっている。従って、病期の初期の段階で、子宮体癌患者を発見することが望まれている。
このような子宮体癌の診断マーカーとしては、ＣＡ１２５及びＣＡ６０２という糖タンパクや、すい臓癌のマーカーとしても使用されているＣＡ１９−９が用いられている。しかしながら、これらの腫瘍マーカーによる子宮体癌の検出率は、非常に低く有効なものではなかった。
一方、様々な癌細胞及び癌組織において、種々のタンパク質の発現が亢進あるいは低下することが報告されている。例えば、糖鎖のタイプ１鎖の合成に係わっている糖転移酵素であるβ１−３ガラクトース転移酵素−５（以下、β３Ｇａｌ−Ｔ５と称する）が大腸癌細胞及び膵臓癌細胞、又は大腸癌組織において発現していることが報告されている（特許文献１又は非特許文献１）。更に、Ｌ−セレクチンリガンドの合成に係わっている糖転移酵素であるＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２（以下、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２と称する）が、粘液性大腸癌に異所性に発現していること（非特許文献２）、及び粘液性卵巣癌及び明細胞性卵巣癌に異所性に発現していること（非特許文献３）が報告されている。
しかしながら、これらの報告は前記の糖転移酵素が、癌細胞又は癌組織において、発現していることを示しているのみであって、具体的に血液中の癌マーカーとして、有用であることを示すものではない。特に、糖転移酵素は、通常、細胞外に分泌されるものではなく、特に血液を用いる癌マーカーとして有用である可能性は低いと考えられていた。また、β３Ｇａｌ−Ｔ５と卵巣癌及び子宮体癌との関連、並びにＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２と子宮体癌との関連を示す報告はなく、更に、β１−３ガラクトース転移酵素ファミリーの１つであるβ１−３ガラクトース転移酵素−４（以下、β３Ｇａｌ−Ｔ４と称する）については、卵巣癌及び子宮体癌との関連は報告されていなかった。
本発明者らは、婦人科癌、特には、卵巣癌患者又は子宮体癌患者を早期に発見することのできる検出マーカーを探索するため様々な細胞内のタンパク質について卵巣癌マーカーとしての可能性を鋭意研究した。その結果、驚くべきことに、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５、あるいはＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２が、初期の病期の卵巣癌患者の血液中において高率に検出されることを見出した。特に、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５は、卵巣癌の全ての組織型（漿液性卵巣癌、粘液性卵巣癌、類内膜性卵巣癌、明細胞性卵巣癌）において高い陽性率を示した。更に、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５を分泌する癌細胞及びＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を分泌する癌細胞は完全に重なっておらず、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５、並びにＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の検出を組み合わせることによって、卵巣癌の検出率が顕著に上昇することを見出した。
更に、子宮体癌患者においても、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５、あるいはＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２が、子宮体癌患者の血液中において高率に検出されることを見出した。特に、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５は、従来の子宮体癌のマーカーであるＣＡ１２５、ＣＡ６０２、及びＣＡ１９−９と比較すると高い陽性率を示した。更に、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５を分泌する癌組織及びＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を分泌する癌組織は完全に重なっておらず、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５、並びにＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の検出を組み合わせることによって、子宮体癌患者の検出率が顕著に上昇することを見出し、本発明を完成させた。
なお、前記非特許文献３には、粘液性卵巣癌及び明細胞性卵巣癌の組織においてＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２が異所性的に発現していることが開示されている。しかしながら、非特許文献３では、漿液性卵巣癌、類内膜性卵巣癌の癌組織においては、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の発現が、確認できなかったことが報告されている。すなわち、非特許文献３には、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２が粘液性卵巣癌及び明細胞性卵巣癌の組織において特異的に発現していることが開示されているのみであり、卵巣癌患者の血液中から、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２が検出されることは予想外であった。更に、漿液性卵巣癌及び類内膜性卵巣癌の癌組織からは、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２は組織染色で検出することのできなかったにもかかわらず、漿液性卵巣癌、及び類内膜性卵巣癌の患者の血液中からは、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２が高率に検出されることは、当業者にとっても予期せぬことであった。
更に、子宮体癌患者においても、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５、あるいはＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２が、子宮体癌患者の血液中において高率に検出されることを見出した。特に、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５は、従来の子宮体癌のマーカーであるＣＡ１２５、ＣＡ６０２、及びＣＡ１９−９と比較すると高い陽性率を示した。更に、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５を分泌する癌組織及びＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を分泌する癌組織は完全に重なっておらず、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５、並びにＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の検出を組み合わせることによって、子宮体癌患者の検出率が顕著に上昇することを見出し、本発明を完成させた。
なお、前記非特許文献３には、粘液性卵巣癌及び明細胞性卵巣癌の組織においてＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２が異所性的に発現していることが開示されている。しかしながら、非特許文献３では、漿液性卵巣癌、類内膜性卵巣癌の癌組織においては、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の発現が、確認できなかったことが報告されている。すなわち、非特許文献３には、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２が粘液性卵巣癌及び明細胞性卵巣癌の組織において特異的に発現していることが開示されているのみであり、卵巣癌患者の血液中から、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２が検出されることは予想外であった。更に、漿液性卵巣癌及び類内膜性卵巣癌の癌組織からは、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２は組織染色で検出することのできなかったにもかかわらず、漿液性卵巣癌、及び類内膜性卵巣癌の患者の血液中からは、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２が高率に検出されることは、当業者にとっても予期せぬことであった。
従って、本発明の課題は、婦人科癌、特には、卵巣癌又は子宮体癌患者の検出方法及び検出用キットを提供することにある。
本発明は、β１−３ガラクトース転移酵素−５及び／又はβ１−３ガラクトース転移酵素−４、並びにＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２を分析することを特徴とする婦人科癌の検出方法に関する。
また、本発明は、β１−３ガラクトース転移酵素−５及び／又はβ１−３ガラクトース転移酵素−４を分析することを特徴とする婦人科癌の検出方法に関する。
更に、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２を分析することを特徴とする婦人科癌の検出方法に関する。
本発明の検出方法の好ましい態様においては、β１−３ガラクトース転移酵素−５及びβ１−３ガラクトース転移酵素−４に特異的に結合する抗体を用いる。
本発明の検出方法の好ましい態様においては、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２に特異的に結合する抗体を用いる。
本発明の検出方法の好ましい態様においては、前記婦人科癌が、卵巣癌又は子宮体癌である。
本発明の婦人科癌の検出方法における被検試料としては、ヒトの生体から分離された生体試料又は生体由来試料例えば、尿、血液、血清、血漿、髄液、唾液、細胞、組織、若しくは器官、又はそれらの調整物（例えば、生検標本、特には、卵巣の生検標本）等を用いることができる。前記のヒトの生体から分離された被検試料から、β１−３ガラクトース転移酵素−５及び／又はβ１−３ガラクトース転移酵素−４、又はＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２を検出することによって、本発明の検出方法は、婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌のｉｎ ｖｉｔｒｏでの診断方法として用いることが可能である。
また、本発明はβ１−３ガラクトース転移酵素−５及びβ１−３ガラクトース転移酵素−４に特異的に結合する抗体又はその断片、並びにＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、婦人科癌の検出用キットにも関する。
また、本発明はβ１−３ガラクトース転移酵素−５及びβ１−３ガラクトース転移酵素−４に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、婦人科癌の検出用キットに関する。
また、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、婦人科癌の検出用キットに関する。
本発明の検出用キットの好ましい態様においては、前記婦人科癌が、卵巣癌又は子宮体癌である。
また、本発明は、β１−３ガラクトース転移酵素−５及び／又はβ１−３ガラクトース転移酵素−４を分析することを特徴とする婦人科癌の検出方法に関する。
更に、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２を分析することを特徴とする婦人科癌の検出方法に関する。
本発明の検出方法の好ましい態様においては、β１−３ガラクトース転移酵素−５及びβ１−３ガラクトース転移酵素−４に特異的に結合する抗体を用いる。
本発明の検出方法の好ましい態様においては、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２に特異的に結合する抗体を用いる。
本発明の検出方法の好ましい態様においては、前記婦人科癌が、卵巣癌又は子宮体癌である。
本発明の婦人科癌の検出方法における被検試料としては、ヒトの生体から分離された生体試料又は生体由来試料例えば、尿、血液、血清、血漿、髄液、唾液、細胞、組織、若しくは器官、又はそれらの調整物（例えば、生検標本、特には、卵巣の生検標本）等を用いることができる。前記のヒトの生体から分離された被検試料から、β１−３ガラクトース転移酵素−５及び／又はβ１−３ガラクトース転移酵素−４、又はＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２を検出することによって、本発明の検出方法は、婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌のｉｎ ｖｉｔｒｏでの診断方法として用いることが可能である。
また、本発明はβ１−３ガラクトース転移酵素−５及びβ１−３ガラクトース転移酵素−４に特異的に結合する抗体又はその断片、並びにＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、婦人科癌の検出用キットにも関する。
また、本発明はβ１−３ガラクトース転移酵素−５及びβ１−３ガラクトース転移酵素−４に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、婦人科癌の検出用キットに関する。
また、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、婦人科癌の検出用キットに関する。
本発明の検出用キットの好ましい態様においては、前記婦人科癌が、卵巣癌又は子宮体癌である。
本発明は、β１−３ガラクトース転移酵素−５及び／又はβ１−３ガラクトース転移酵素−４、並びにＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２を分析することを特徴とする卵巣癌の検出方法に関する。
また、本発明は、β１−３ガラクトース転移酵素−５及び／又はβ１−３ガラクトース転移酵素−４を分析することを特徴とする卵巣癌の検出方法に関する。
更に、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２を分析することを特徴とする卵巣癌の検出方法に関する。
本発明の検出方法の好ましい態様においては、β１−３ガラクトース転移酵素−５及びβ１−３ガラクトース転移酵素−４に特異的に結合する抗体を用いる。
本発明の検出方法の好ましい態様においては、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２に特異的に結合する抗体を用いる。
また、本発明はβ１−３ガラクトース転移酵素−５及びβ１−３ガラクトース転移酵素−４に特異的に結合する抗体又はその断片、並びにＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、卵巣癌の検出用キットにも関する。
また、本発明はβ１−３ガラクトース転移酵素−５及びβ１−３ガラクトース転移酵素−４に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、卵巣癌の検出用キットに関する。
また、本発明はＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、卵巣癌の検出用キットに関する。
また、本発明は、β１−３ガラクトース転移酵素−５及び／又はβ１−３ガラクトース転移酵素−４を分析することを特徴とする卵巣癌の検出方法に関する。
更に、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２を分析することを特徴とする卵巣癌の検出方法に関する。
本発明の検出方法の好ましい態様においては、β１−３ガラクトース転移酵素−５及びβ１−３ガラクトース転移酵素−４に特異的に結合する抗体を用いる。
本発明の検出方法の好ましい態様においては、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２に特異的に結合する抗体を用いる。
また、本発明はβ１−３ガラクトース転移酵素−５及びβ１−３ガラクトース転移酵素−４に特異的に結合する抗体又はその断片、並びにＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、卵巣癌の検出用キットにも関する。
また、本発明はβ１−３ガラクトース転移酵素−５及びβ１−３ガラクトース転移酵素−４に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、卵巣癌の検出用キットに関する。
また、本発明はＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、卵巣癌の検出用キットに関する。
これまで、卵巣癌の検出マーカーとしては糖タンパク質であるＣＡ１２５又はＣＡ５４６の検出が広く用いられている。本発明の検出方法によれば、これらの従来の卵巣癌の検出マーカーと比較して、卵巣癌の病期の初期のステージであるＩ期及びII期において、高率に卵巣癌患者を検出することが可能である。すなわち、本発明の検出方法は、比較的小さな癌から分泌されるβ３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５、あるいはＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を検出することが可能であり、従って、健康診断において自覚症状の見られないＩ期の卵巣癌を発見することも可能である。また、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５を分析する本発明の検出方法によれば、従来法と比較して、粘液性卵巣癌、類内膜性卵巣癌、及び明細胞性卵巣癌を高率に検出することが可能であり、特には、化学療法に対して難治性（抵抗性）である粘液性卵巣癌及び明細胞性卵巣癌を高率に検出することができる。
更に、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５を分析する本発明の検出方法、並びにＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を分析する本発明の検出方法を組み合わせることによって、卵巣癌患者の検出率を、顕著に上昇させることができる。特には、卵巣癌の病期の初期のステージであるＩ期及びII期の患者において、組合せの効果が著しく、また組織型としては、類内膜性卵巣癌及び明細胞性卵巣癌において、組合せにより検出率を、顕著に上昇させることができる。
また、子宮体癌においては、検出マーカーとしてＣＡ１２５、ＣＡ６０２、及びＣＡ１９−９が用いられていたが、本発明の検出方法によれば、これらの従来の子宮体癌の検出マーカーと比較して、病期の初期のステージであるＩ期において、子宮体癌患者を高率に検出することが可能である。すなわち、本発明の検出方法は、比較的小さな癌から分泌されるβ３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５、あるいはＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を検出することが可能であり、従って、婦人科検診における細胞診テストでは発見することの困難な子宮体癌患者を発見することができる。
更に、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５を分析する本発明の検出方法、並びにＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を分析する本発明の検出方法を組み合わせることによって、子宮体癌患者の検出率を、顕著に上昇させることができる。
また、本発明の検出方法は、手術後の再発のモニタリング、放射線療法及び化学療法の治療効果のモニタリングに用いることも可能である。
更に、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５を分析する本発明の検出方法、並びにＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を分析する本発明の検出方法を組み合わせることによって、卵巣癌患者の検出率を、顕著に上昇させることができる。特には、卵巣癌の病期の初期のステージであるＩ期及びII期の患者において、組合せの効果が著しく、また組織型としては、類内膜性卵巣癌及び明細胞性卵巣癌において、組合せにより検出率を、顕著に上昇させることができる。
また、子宮体癌においては、検出マーカーとしてＣＡ１２５、ＣＡ６０２、及びＣＡ１９−９が用いられていたが、本発明の検出方法によれば、これらの従来の子宮体癌の検出マーカーと比較して、病期の初期のステージであるＩ期において、子宮体癌患者を高率に検出することが可能である。すなわち、本発明の検出方法は、比較的小さな癌から分泌されるβ３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５、あるいはＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を検出することが可能であり、従って、婦人科検診における細胞診テストでは発見することの困難な子宮体癌患者を発見することができる。
更に、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５を分析する本発明の検出方法、並びにＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を分析する本発明の検出方法を組み合わせることによって、子宮体癌患者の検出率を、顕著に上昇させることができる。
また、本発明の検出方法は、手術後の再発のモニタリング、放射線療法及び化学療法の治療効果のモニタリングに用いることも可能である。
［１］婦人科癌の検出方法
婦人科癌には、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、子宮肉腫、絨毛癌（絨毛性疾患）などが含まれ、本発明の検出方法は、これらの婦人科癌患者を検出することのできるものである。特に検出率の高い癌としては、卵巣癌、及び子宮体癌を挙げることができ、以下の説明において卵巣癌、及び子宮体癌を例として記載するが、本発明はこの２つの癌に限定されるものではない。
婦人科癌には、子宮頸癌、子宮体癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、子宮肉腫、絨毛癌（絨毛性疾患）などが含まれ、本発明の検出方法は、これらの婦人科癌患者を検出することのできるものである。特に検出率の高い癌としては、卵巣癌、及び子宮体癌を挙げることができ、以下の説明において卵巣癌、及び子宮体癌を例として記載するが、本発明はこの２つの癌に限定されるものではない。
［１−１］卵巣癌について
卵巣は子宮の両脇にある親指大の楕円形の臓器であり、卵巣癌とはその卵巣に発生する癌であり、多くは上皮性である。卵巣癌をその進行度によって病期（ステージ）を分類すると、以下のようにＩ期〜IV期に分類することができる。
Ｉ期：癌が卵巣に限局している。すなわち、癌が片側、又は両側の卵巣にだけとどまっている状態である。
II期：癌が片側又は両側にあって骨盤内に進展している。すなわち、癌が卵巣の周囲、つまり卵管、子宮、直腸、膀胱などの腹膜に転移している状態である。
III期：（１）癌が腹膜幡種を伴って骨盤腔を越えて進展、（２）腔腹膜リンパ節、鼠径リンパ節転移、（３）肝表面への転移、（４）小・大腸への組織学的転移。前記（１）〜（４）のいずれかがみられるものである。すなわち、癌が卵巣の周囲（骨盤内の腹膜だけでなく上腹部にも転移しているか、又は後腹膜リンパ節に転移している状態である。
IV期：（１）癌の遠隔転移、（２）胸水中への癌細胞の証明、（３）肝実質への転移。前記（１）〜（３）のいずれかが認められるものである。すなわち、癌が腹腔外に転移しているか、あるいは肝臓に転移している状態である。
卵巣は子宮の両脇にある親指大の楕円形の臓器であり、卵巣癌とはその卵巣に発生する癌であり、多くは上皮性である。卵巣癌をその進行度によって病期（ステージ）を分類すると、以下のようにＩ期〜IV期に分類することができる。
Ｉ期：癌が卵巣に限局している。すなわち、癌が片側、又は両側の卵巣にだけとどまっている状態である。
II期：癌が片側又は両側にあって骨盤内に進展している。すなわち、癌が卵巣の周囲、つまり卵管、子宮、直腸、膀胱などの腹膜に転移している状態である。
III期：（１）癌が腹膜幡種を伴って骨盤腔を越えて進展、（２）腔腹膜リンパ節、鼠径リンパ節転移、（３）肝表面への転移、（４）小・大腸への組織学的転移。前記（１）〜（４）のいずれかがみられるものである。すなわち、癌が卵巣の周囲（骨盤内の腹膜だけでなく上腹部にも転移しているか、又は後腹膜リンパ節に転移している状態である。
IV期：（１）癌の遠隔転移、（２）胸水中への癌細胞の証明、（３）肝実質への転移。前記（１）〜（３）のいずれかが認められるものである。すなわち、癌が腹腔外に転移しているか、あるいは肝臓に転移している状態である。
卵巣癌は、初期においては自覚症状がないため、Ｉ期及びII期に発見されるのは、約１／３程度であり、２／３はIII期又はIV期に発見される。III期又はIV期に発見された場合は、骨盤腔以外への転移があるため、外科療法で癌を完全に取り除くことができず、完全な治療は困難である。
一方、卵巣癌の組織型は多様であるが、大きくは、漿液性卵巣癌、粘液性卵巣癌、類内膜性卵巣癌、明細胞性卵巣癌に分類することができる。これらの卵巣癌のうち、漿液性卵巣癌が最も多いと言われており、従来の卵巣癌マーカーは、この漿液性卵巣癌を検出するものが多かった。また、化学療法への感受性の点からは、粘液性卵巣癌及び明細胞性卵巣癌が、抗癌剤への抵抗性が高いと言われている。
［１−２］子宮体癌について
子宮体癌は、子宮の上皮である子宮の内膜にできる癌であり、上皮性の癌である。子宮体癌をその進行度によって病期（ステージ）を分類すると、以下のようにＩ期〜IV期に分類することができる。
Ｉ期：癌が子宮体部にのみ認められる。すなわち、子宮頸部、その他には癌は認められない。
II期：癌が子宮体部を越えて子宮頸部に拡がっている。すなわち、子宮の外には拡がっていない。
III期：癌が子宮外に拡がっているが、骨盤を越えては拡がっていない。骨盤内、又は大動脈周囲のリンパ節に転移を認める。
IV期：癌が骨盤を越えて体の他の部位へ拡がるか、又は膀胱若しくは腸の内腔を侵すものである。
子宮体癌は、子宮の上皮である子宮の内膜にできる癌であり、上皮性の癌である。子宮体癌をその進行度によって病期（ステージ）を分類すると、以下のようにＩ期〜IV期に分類することができる。
Ｉ期：癌が子宮体部にのみ認められる。すなわち、子宮頸部、その他には癌は認められない。
II期：癌が子宮体部を越えて子宮頸部に拡がっている。すなわち、子宮の外には拡がっていない。
III期：癌が子宮外に拡がっているが、骨盤を越えては拡がっていない。骨盤内、又は大動脈周囲のリンパ節に転移を認める。
IV期：癌が骨盤を越えて体の他の部位へ拡がるか、又は膀胱若しくは腸の内腔を侵すものである。
子宮体癌は、婦人科検診で行われる子宮頸癌のための細胞診テストでは見つけることができない。しかし、Ｉ期〜III期に発見することができれば、手術による外科療法が可能であり、早期であるほど治療効果が高くなる。
［１−３］β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５の分析
本発明の検出方法では、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５を分析することにより、婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌を検出する。すなわち、本発明の検出方法では、β３Ｇａｌ−Ｔ４を分析することにより、婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌を検出することもできる。また、本発明の検出方法では、β３Ｇａｌ−Ｔ５を分析することにより、婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌を検出することもできる。更に、本発明の検出方法では、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５を分析することにより、婦人科癌、特には卵巣癌を又は子宮体癌検出することも可能である。
本発明の検出方法では、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５を分析することにより、婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌を検出する。すなわち、本発明の検出方法では、β３Ｇａｌ−Ｔ４を分析することにより、婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌を検出することもできる。また、本発明の検出方法では、β３Ｇａｌ−Ｔ５を分析することにより、婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌を検出することもできる。更に、本発明の検出方法では、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５を分析することにより、婦人科癌、特には卵巣癌を又は子宮体癌検出することも可能である。
β３Ｇａｌ−Ｔ４は、β１−３ガラクトース転移酵素ファミリーに属し、ガングリオシドＧＡ１、ＧＭ１又はＧＤ１ｂを合成する酵素である。一方、β３Ｇａｌ−Ｔ５は、β３Ｇａｌ−Ｔ４と基質特異性が異なっており、Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を合成することができる。
後述の実施例に示すように、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５のｍＲＮＡは、多くの卵巣癌の細胞株において発現しており、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５のｍＲＮＡの発現する卵巣癌細胞株は、完全に重複するわけではないが、調べた卵巣癌細胞株においては、いずれかのｍＲＮＡの発現が見られた。更に、本発明者は５人の卵巣癌患者の卵巣癌組織において、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５の酵素活性を測定し、全ての患者の卵巣癌組織から、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５の酵素活性を検出することができた。
一方、後述の実施例におけるβ３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質を免疫して得られたモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清について、他のβ１−３ガラクトース転移酵素との反応性を検討したところ、このモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清によって構築されたＥＬＩＳＡ系は、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５の両方の酵素を検出することが可能であることがわかった。
卵巣癌には、血液中にβ３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５を放出している卵巣癌細胞、β３Ｇａｌ−Ｔ４のみを放出している卵巣癌細胞、及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５のみを放出している卵巣癌細胞があると考えられ、前記ＥＬＩＳＡ系によって、測定された卵巣癌患者の血清中に存在するβ１−３ガラクトース転移酵素は、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５であると考えられる。
子宮体癌にも、血液中にβ３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５を放出している子宮体癌細胞、β３Ｇａｌ−Ｔ４のみを放出している子宮体癌、及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５のみを放出している子宮体癌があると考えられ、前記ＥＬＩＳＡ系によって、測定された子宮体癌患者の血清中に存在するβ１−３ガラクトース転移酵素は、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５であると考えられる。
一方、後述の実施例におけるβ３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質を免疫して得られたモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清について、他のβ１−３ガラクトース転移酵素との反応性を検討したところ、このモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清によって構築されたＥＬＩＳＡ系は、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５の両方の酵素を検出することが可能であることがわかった。
卵巣癌には、血液中にβ３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５を放出している卵巣癌細胞、β３Ｇａｌ−Ｔ４のみを放出している卵巣癌細胞、及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５のみを放出している卵巣癌細胞があると考えられ、前記ＥＬＩＳＡ系によって、測定された卵巣癌患者の血清中に存在するβ１−３ガラクトース転移酵素は、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５であると考えられる。
子宮体癌にも、血液中にβ３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５を放出している子宮体癌細胞、β３Ｇａｌ−Ｔ４のみを放出している子宮体癌、及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５のみを放出している子宮体癌があると考えられ、前記ＥＬＩＳＡ系によって、測定された子宮体癌患者の血清中に存在するβ１−３ガラクトース転移酵素は、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５であると考えられる。
本発明の検出方法において、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５を分析する方法としては、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５を定量的又は半定量的に決定することができるか、あるいは、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５の存在の有無を判定することができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５に対する抗体又はその断片を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロット等）、生化学的手法（例えば、酵素学的測定法）、又はｍＲＮＡ量を測定する分子生物学的手法などを挙げることができる。
β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５の分析方法として、免疫学的分析方法を用いる場合には、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５に結合するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いることができる。あるいは、β３Ｇａｌ−Ｔ４に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体と、β３Ｇａｌ−Ｔ５に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体とを、組み合わせて用いることもできる。
β３Ｇａｌ−Ｔ４の分析方法として、免疫学的分析方法を用いる場合には、β３Ｇａｌ−Ｔ４に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いることもでき、また、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５に結合するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いることも可能である。
更に、β３Ｇａｌ−Ｔ５の分析方法として、免疫学的分析方法を用いる場合には、β３Ｇａｌ−Ｔ５に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いることもでき、また、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５に結合するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いることも可能である。
β３Ｇａｌ−Ｔ４の分析方法として、免疫学的分析方法を用いる場合には、β３Ｇａｌ−Ｔ４に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いることもでき、また、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５に結合するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いることも可能である。
更に、β３Ｇａｌ−Ｔ５の分析方法として、免疫学的分析方法を用いる場合には、β３Ｇａｌ−Ｔ５に特異的に結合するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いることもでき、また、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５に結合するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いることも可能である。
モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、免疫抗原としてβ３Ｇａｌ−Ｔ４又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５を用いること以外は、公知の方法によって作成することが可能であり、例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７，１９７５）に従って、作成することができる。また、ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギの皮内に、β３Ｇａｌ−Ｔ４又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５のタンパク質を単独もしくはＢＳＡ、ＫＬＨなどと結合させた抗原として、単純あるいはフロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で採血し、そのまま抗血清として、又は抗体を公知の方法で精製して使用することができる。また、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５に結合するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を取得するためには、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５を、同じマウスやウサギに免疫して抗体を取得することも可能である。
β３Ｇａｌ−Ｔ４又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５の分析方法として、酵素学的測定法を用いる場合は、例えば、Miyazakiら〔Miyazaki et al., J. Biol. Chem.,
(1997) 272, 24794-24799〕及び瀬古ら〔Seko et al.,
Cancer Res., (1996) 56, 3468-3473〕の方法に従って、β３Ｇａｌ−Ｔ４又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５酵素活性を測定することにより、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の量又は存在の有無を分析することが可能である。
β３Ｇａｌ−Ｔ４又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５の分析方法として、酵素学的測定法を用いる場合は、例えば、Miyazakiら〔Miyazaki et al., J. Biol. Chem.,
(1997) 272, 24794-24799〕及び瀬古ら〔Seko et al.,
Cancer Res., (1996) 56, 3468-3473〕の方法に従って、β３Ｇａｌ−Ｔ４又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５酵素活性を測定することにより、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の量又は存在の有無を分析することが可能である。
β３Ｇａｌ−Ｔ５に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を取得するために用いることのできる免疫抗原は、配列番号３３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の全部又は一部のペプチドを免疫抗原として用いることができる。具体的には、生体試料から精製した抗原、遺伝子工学的に作成した組換え抗原、又は化学的に合成した部分ペプチドなど用いることが可能である。大腸菌や酵母などで発現させる組換え抗原を用いる場合は、発現を容易にするため、他のタンパク質、例えば、ＳＯＤやＴｒｐＥとの融合抗原とすることも可能である。また、精製を容易にするため、Ｈｉｓ−Ｔａｇなどを結合させて発現させることもできる。特には、β３Ｇａｌ−Ｔ５の細胞質内領域及び膜貫通領域を除いて、発現させることが好ましく、例えば、前記配列番号３３で表されるアミノ酸配列の２７番〜３１０番のアミノ酸からなるペプチドを組換え抗原として発現させることが好ましい。この２７番〜３１０番のアミノ酸からなるペプチドを組換え抗原として用いて免疫することによってβ３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５に結合することのできるモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を取得することが可能である。
本発明の婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌の検出方法に用いることのできるβ３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５に結合する抗体は、少なくともβ３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５に結合する抗体であれば、限定されず、その他のβ１−３ガラクトース転移酵素に結合する抗体でもよいが、好ましくは、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５に特異的に結合する抗体である。また、本発明の婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌の検出方法に用いることのできるβ３Ｇａｌ−Ｔ４に結合する抗体は、少なくともβ３Ｇａｌ−Ｔ４に結合する抗体であれば、限定されず、その他のβ１−３ガラクトース転移酵素に結合する抗体でもよいが、好ましくは、β３Ｇａｌ−Ｔ４に特異的に結合する抗体である。また、本発明の婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌の検出方法に用いることのできるβ３Ｇａｌ−Ｔ５に結合する抗体は、少なくともβ３Ｇａｌ−Ｔ５に結合する抗体であれば、限定されず、その他のβ１−３ガラクトース転移酵素に結合する抗体でもよいが、好ましくは、β３Ｇａｌ−Ｔ５に特異的に結合する抗体である。
β３Ｇａｌ−Ｔ４に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を取得するために用いることのできる免疫抗原は、配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の全部又は一部のペプチドを免疫抗原として用いることができる。
［１−４］ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の分析
更に、本発明の検出方法では、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を分析することにより、婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌を検出する。ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２は、糖質６−Ｏ−硫酸転移酵素ファミリーに属し、アデノシン−３’−ホスフェート−５’ホスホサルフェートから、硫酸基を様々な糖タンパク質のＧｌｃＮＡｃ残基に転移させる酵素である。健常者では、末梢リンパ節の高内皮細胞に特異的に発現しており、Ｌ−セレクチンリガンドの合成に関わっている酵素である。
本発明者は５人の卵巣癌患者の卵巣癌組織において、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の酵素活性を測定した。全ての患者の卵巣癌組織から、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２活性を検出することができた。
更に、本発明の検出方法では、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を分析することにより、婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌を検出する。ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２は、糖質６−Ｏ−硫酸転移酵素ファミリーに属し、アデノシン−３’−ホスフェート−５’ホスホサルフェートから、硫酸基を様々な糖タンパク質のＧｌｃＮＡｃ残基に転移させる酵素である。健常者では、末梢リンパ節の高内皮細胞に特異的に発現しており、Ｌ−セレクチンリガンドの合成に関わっている酵素である。
本発明者は５人の卵巣癌患者の卵巣癌組織において、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の酵素活性を測定した。全ての患者の卵巣癌組織から、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２活性を検出することができた。
本発明の検出方法において、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を分析する方法としては、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を定量的又は半定量的に決定することができるか、あるいは、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の存在の有無を判定することができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、抗ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２抗体又はその断片を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロット等）、生化学的手法（例えば、酵素学的測定法）、又はｍＲＮＡ量を測定する分子生物学的手法などを挙げることができる。
ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の分析方法として、免疫学的分析方法を用いる場合には、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２に対するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いることができる。モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、免疫抗原としてＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を用いること以外は、公知の方法によって作成することが可能であり、例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７，１９７５）に従って、作成することができる。また、ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギの皮内に、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２のタンパク質を単独もしくはＢＳＡ、ＫＬＨなどと結合させた抗原として、単純あるいはフロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で採血し、そのまま抗血清として、又は抗体を公知の方法で精製して使用することができる。
ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の分析方法として、酵素学的測定法を用いる場合は、例えば、瀬古ら〔Seko et al., Glycobiology (2002) 12, 379-388〕の方法に従って、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２酵素活性を測定することにより、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の量又は存在の有無を分析することが可能である。
ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の分析方法として、酵素学的測定法を用いる場合は、例えば、瀬古ら〔Seko et al., Glycobiology (2002) 12, 379-388〕の方法に従って、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２酵素活性を測定することにより、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の量又は存在の有無を分析することが可能である。
モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を取得するために用いることのできる免疫抗原は、配列番号３５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の全部又は一部のペプチドを免疫抗原として用いることができる。具体的には、生体試料から精製した抗原、遺伝子工学的に作成した組換え抗原、又は化学的に合成した部分ペプチドなど用いることが可能である。大腸菌や酵母などで発現させる組換え抗原を用いる場合は、発現を容易にするため、他のタンパク質、例えば、ＳＯＤやＴｒｐＥとの融合抗原とすることも可能である。また、精製を容易にするため、Ｈｉｓ−Ｔａｇなどを結合させて発現させることもできる。また、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の細胞質内領域及び膜貫通領域を除いて、発現させることが好ましく、例えば、前記配列番号３５で表されるアミノ酸配列の２８番〜３８６番のアミノ酸からなるペプチドを組換え抗原として発現させることが好ましい。
本発明の婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌の検出方法に用いることのできるＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２に結合する抗体は、少なくともＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２に結合する抗体であれば、限定されず、その他のＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素に結合する抗体でもよいが、好ましくは、Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２に特異的に結合する抗体である。
［１−５］免疫学的分析方法
免疫学的分析方法として、酵素免疫測定方法、サンドイッチ法を用いる場合には、以下のように行うことが可能である。ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の場合を例として説明する。
まず、マイクロプレートやビーズなどの不溶性担体に、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２に結合する抗体（捕捉抗体、又は一次抗体）を固相化する。次に、捕捉抗体や不溶性担体への非特異的な吸着を防ぐために、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）で不溶性担体のブロッキングを行う。捕捉抗体が固相化されたプレートやビーズに、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２が含まれる被検試料を一次反応液と一緒に加え、捕捉抗体とＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を接触させ、結合させる（一次反応工程）。この後、捕捉抗体に結合しなかった抗原や夾雑物を適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含むリン酸緩衝液）で洗浄する。次に、捕捉されたＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２と結合する抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素とが結合した標識抗体（２次抗体）を添加し、捕捉された抗原に標識抗体を結合させる（二次反応工程）。この反応により、捕捉抗体−ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２−標識抗体の免疫複合体がマイクロプレート等の担体上に形成される。結合しなかった標識抗体を洗浄液で洗浄し、標識抗体の酵素に対する発色基質や発光基質を添加し、酵素と基質を反応させることによりシグナルを検出する。また、２次抗体を直接標識せずに、２次抗体に結合する抗体を標識しシグナルを検出することも可能である。
抗体を標識する酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼなどを挙げることができる。また酵素以外にも、標識物質として、アクリジニウム誘導体などの発光物質、ユーロピウムなどの蛍光物質、Ｉ１２５などの放射性物質などを使用することができる。また、標識物質に合わせて基質や発光誘導物質を適宜選択することができる。更に、本発明における標識抗体は、検出マーカーとしてハプテンや低分子量のペプチド、レクチンなどの抗原抗体反応のシグナルの検出に利用できる物質を結合させた抗体も含むことができる。
β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５のサンドイッチ法では、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２に結合する抗体を、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５に結合する抗体に置き換えることにより、同様の方法で、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５の免疫学的分析方法を構築することが可能である。
免疫学的分析方法として、酵素免疫測定方法、サンドイッチ法を用いる場合には、以下のように行うことが可能である。ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の場合を例として説明する。
まず、マイクロプレートやビーズなどの不溶性担体に、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２に結合する抗体（捕捉抗体、又は一次抗体）を固相化する。次に、捕捉抗体や不溶性担体への非特異的な吸着を防ぐために、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）で不溶性担体のブロッキングを行う。捕捉抗体が固相化されたプレートやビーズに、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２が含まれる被検試料を一次反応液と一緒に加え、捕捉抗体とＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を接触させ、結合させる（一次反応工程）。この後、捕捉抗体に結合しなかった抗原や夾雑物を適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含むリン酸緩衝液）で洗浄する。次に、捕捉されたＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２と結合する抗体と西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素とが結合した標識抗体（２次抗体）を添加し、捕捉された抗原に標識抗体を結合させる（二次反応工程）。この反応により、捕捉抗体−ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２−標識抗体の免疫複合体がマイクロプレート等の担体上に形成される。結合しなかった標識抗体を洗浄液で洗浄し、標識抗体の酵素に対する発色基質や発光基質を添加し、酵素と基質を反応させることによりシグナルを検出する。また、２次抗体を直接標識せずに、２次抗体に結合する抗体を標識しシグナルを検出することも可能である。
抗体を標識する酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼなどを挙げることができる。また酵素以外にも、標識物質として、アクリジニウム誘導体などの発光物質、ユーロピウムなどの蛍光物質、Ｉ１２５などの放射性物質などを使用することができる。また、標識物質に合わせて基質や発光誘導物質を適宜選択することができる。更に、本発明における標識抗体は、検出マーカーとしてハプテンや低分子量のペプチド、レクチンなどの抗原抗体反応のシグナルの検出に利用できる物質を結合させた抗体も含むことができる。
β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５のサンドイッチ法では、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２に結合する抗体を、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５に結合する抗体に置き換えることにより、同様の方法で、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５の免疫学的分析方法を構築することが可能である。
サンドイッチＥＬＩＳＡに用いる抗体は、一次抗体又は二次抗体のいずれかが、分析するタンパク質に特異的に結合する抗体であれば、もう一方の抗体は、分析するタンパク質以外のタンパク質と結合する（交差反応を有する）抗体でもよい。例えば、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５を分析する場合、一次抗体又は二次抗体のいずれかが、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５に特異的に結合する抗体であれば、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５を特異的に分析することが可能である。また、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を分析する場合、一次抗体又は二次抗体のいずれかが、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２特異的に結合する抗体であれば、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を特異的に分析することが可能である。更に、β３Ｇａｌ−Ｔ４を分析する場合、一次抗体又は二次抗体のいずれかが、β３Ｇａｌ−Ｔ４に特異的に結合する抗体であれば、β３Ｇａｌ−Ｔ４を特異的に分析することが可能であり、β３Ｇａｌ−Ｔ５を分析する場合、一次抗体又は二次抗体のいずれかが、β３Ｇａｌ−Ｔ５に特異的に結合する抗体であれば、β３Ｇａｌ−Ｔ５を特異的に分析することが可能である。
前記のサンドイッチ法に用いる一次抗体又は２次抗体の種類は、特に限定されないが、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、又はそれらの抗体の抗体フラグメントなどを挙げることができる。抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、又はＦｖ等を挙げることができる。これらの抗体フラグメントは、例えば、抗体を常法によりタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化し、続いて、常法のタンパク質の分離精製の方法により精製することにより、得ることができる。
本発明の婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌の検出方法において、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５、あるいはＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の分析に用いる被検試料としては、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５、あるいはＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２を含有する可能性のある生体試料又は生体由来試料を挙げることができ、例えば、尿、血液、血清、血漿、髄液、唾液、細胞、組織、若しくは器官、又はそれらの調整物（例えば、生検標本、特には、卵巣の生検標本）等を挙げることができ、血液、血清、血漿、又は卵巣の生検標本が好ましく、特には血液、血清、又は血漿（以下、血液等と称することがある）が好ましい。健常者の血液、血清、又は血漿中には、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５、あるいはＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２は、ほとんど存在しておらず、卵巣癌患者又は子宮体癌患者においては、病期の初期から血液中に放出されるために、卵巣癌又は子宮体癌を検出するための被検試料として適当であるからである。
本発明の検出方法では、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５、あるいはＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の存在の有無、あるいはβ３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５の量又はＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の量を測定することにより、卵巣癌又は子宮体癌を検出することが可能である。例えば、被検試料として卵巣又は子宮の生検試料を用いる場合には、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた免疫組織染色法により、卵巣又は子宮でのβ３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５、あるいはＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の発現を確認することにより、卵巣癌又は子宮体癌であるか否かを判定することができる。
また、被検試料として血液等を用いる場合、卵巣癌又は子宮体癌の疑いのある患者から血液を採取し、全血のままか、あるいは血清又は血漿とし、その中のＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の量を測定し、健常者から採取した血液等中のＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の量と比較することにより、前記患者が卵巣癌又は子宮体癌であるか否かを判定することができる。より具体的には、健常者のＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の量と比べて、前記患者のＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の量が有意に多い場合に前記患者は卵巣癌であると判定することができる。また、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５、β３Ｇａｌ−Ｔ４、又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５についても、同様に健常者と比較することにより、卵巣癌の判定が可能である。
例えば、後述のサンドイッチ法によるＥＬＩＳＡの場合、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５、あるいはＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の健常者の平均値を求め、標準偏差（ＳＤ）を求める。癌患者の検出のためのカットオフ値は、それぞれの癌を検出することのできる値であれば、限定されない。例えば、癌によっては、平均値を超える検体を陽性と判定することも可能であるし、平均値±ＳＤ、平均値±２ＳＤ、又は平均値±３ＳＤをカットオフ値とすることもできる。
また、被検試料として血液等を用いる場合、卵巣癌又は子宮体癌の疑いのある患者から血液を採取し、全血のままか、あるいは血清又は血漿とし、その中のＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の量を測定し、健常者から採取した血液等中のＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の量と比較することにより、前記患者が卵巣癌又は子宮体癌であるか否かを判定することができる。より具体的には、健常者のＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の量と比べて、前記患者のＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の量が有意に多い場合に前記患者は卵巣癌であると判定することができる。また、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５、β３Ｇａｌ−Ｔ４、又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５についても、同様に健常者と比較することにより、卵巣癌の判定が可能である。
例えば、後述のサンドイッチ法によるＥＬＩＳＡの場合、β３Ｇａｌ−Ｔ４及び／又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５、あるいはＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の健常者の平均値を求め、標準偏差（ＳＤ）を求める。癌患者の検出のためのカットオフ値は、それぞれの癌を検出することのできる値であれば、限定されない。例えば、癌によっては、平均値を超える検体を陽性と判定することも可能であるし、平均値±ＳＤ、平均値±２ＳＤ、又は平均値±３ＳＤをカットオフ値とすることもできる。
本発明の検出方法により、婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌を検出する場合、婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌を特異的に検出することが最も望ましい。しかしながら、例えば、健康診断において、血液検査により卵巣癌の早期診断を行う場合、卵巣癌患者又は子宮体癌患者を一次スクリーニングすることのできるマーカーであることが好ましく、すなわち、卵巣癌患者又は子宮体癌患者のうちのできるだけ多くの患者を検出することのできるマーカーであることが好ましい。本発明の検出方法は、後述の実施例で示すように、手術によって卵巣癌であることが確認された卵巣癌患者（他の癌を併発しているものは含まれていない）又は子宮体癌であることが確認された子宮体癌患者を高率に検出することが可能であり、癌マーカーとしての有用性を備えている。
［２］婦人科癌の検出用キット
本発明の婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌の検出用キットは、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５に特異的に結合する抗体、並びにＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２に特異的に結合する抗体又はその断片を含む。前記抗体としては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれを用いることもできる。前記抗体断片としては、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５への特異的結合能を有する限り、あるいはＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２への特異的結合能を保持する限り、特に限定されるものではなく、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖを用いることができる。
また、本発明の検出用キットは、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５に特異的に結合する抗体又はその断片、β３Ｇａｌ−Ｔ４に特異的に結合する抗体又はその断片、β３Ｇａｌ−Ｔ５に特異的に結合する抗体又はその断片、又はＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２に特異的に結合する抗体又はその断片を含むこともできる。
更に、本発明の検出用キットは、前記β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５に特異的に結合する抗体の代わりに、あるいは一緒に、β３Ｇａｌ−Ｔ４に特異的に結合する抗体又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５に特異的に結合する抗体を含むことも可能である。
本発明の婦人科癌、特には卵巣癌又は子宮体癌の検出用キットは、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５に特異的に結合する抗体、並びにＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２に特異的に結合する抗体又はその断片を含む。前記抗体としては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれを用いることもできる。前記抗体断片としては、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５への特異的結合能を有する限り、あるいはＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２への特異的結合能を保持する限り、特に限定されるものではなく、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖを用いることができる。
また、本発明の検出用キットは、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５に特異的に結合する抗体又はその断片、β３Ｇａｌ−Ｔ４に特異的に結合する抗体又はその断片、β３Ｇａｌ−Ｔ５に特異的に結合する抗体又はその断片、又はＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２に特異的に結合する抗体又はその断片を含むこともできる。
更に、本発明の検出用キットは、前記β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５に特異的に結合する抗体の代わりに、あるいは一緒に、β３Ｇａｌ−Ｔ４に特異的に結合する抗体又はβ３Ｇａｌ−Ｔ５に特異的に結合する抗体を含むことも可能である。
本発明の検出用キットは、用いる免疫学的手法に応じて、所望の形態でβ３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５に特異的に結合する抗体、又はＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２に特異的に結合する抗体、あるいはその断片を含むことができる。
例えば、標識化抗体を用いる免疫学的手法、例えば、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、又は放射免疫測定法などの場合には、標識物質で標識した標識化抗体又は標識化抗体断片の形態で含むことができる。標識物質の具体例としては、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を、蛍光物質としてフルオレセインイソチアネート又は希土類金属キレート等を、放射性同位体として３Ｈ、１４Ｃ、又は１２５Ｉ等を、その他、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質等を挙げることができる。酵素又は化学発光物質等の場合には、それ自体単独では測定可能なシグナルをもたらすことはできないことから、それぞれ対応する適当な基質等を選択して含むことが好ましい。
例えば、標識化抗体を用いる免疫学的手法、例えば、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、又は放射免疫測定法などの場合には、標識物質で標識した標識化抗体又は標識化抗体断片の形態で含むことができる。標識物質の具体例としては、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を、蛍光物質としてフルオレセインイソチアネート又は希土類金属キレート等を、放射性同位体として３Ｈ、１４Ｃ、又は１２５Ｉ等を、その他、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質等を挙げることができる。酵素又は化学発光物質等の場合には、それ自体単独では測定可能なシグナルをもたらすことはできないことから、それぞれ対応する適当な基質等を選択して含むことが好ましい。
以下に実施例及び比較例を示し本発明の具体的な説明を行うが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《実施例１：抗β３Ｇａｌ−Ｔ５抗体の作製》
（Ａ）可溶性β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質の調製（免疫用抗原の調製）
（Ａ−１）β３Ｇａｌ−Ｔ５発現ベクターの構築
ＰＣＲにより、ヒト大腸ｃＤＮＡライブラリーより、下記のForward primer for b3Gal-T5及びReverse primer
for b3Gal-T5を用いて、細胞質及び膜貫通領域を欠如したペプチドをコードしたｃＤＮＡフラグメントを増幅した。得られたｃＤＮＡフラグメントは、β３Ｇａｌ−Ｔ５の２７番から３１０番のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするｃＤＮＡである。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ｂ３Ｇａｌ−Ｔ５：5’-tttgtcgacAGTCTAAATCCTTTCAAAG-3’（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ｂ３Ｇａｌ−Ｔ５：5’-tttaagcttCAGACAGGCGGACAATC-3’（配列番号２）
配列中において、小文字で記載されている配列は、発現ベクターへ連結するための制限酵素サイトを含む配列である。得られたｃＤＮＡを、ｐＱＥ９ベクター（キアゲン社）のクローニングサイトにクローニングし、クローニングされたベクターにより大腸菌Ｍ１５を形質転換した。得られたプラスミドのヌクレオチド配列を、Prism 310Genetic Analyzer（アプライド・バイオシステムズ社）で決定した。
（Ａ）可溶性β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質の調製（免疫用抗原の調製）
（Ａ−１）β３Ｇａｌ−Ｔ５発現ベクターの構築
ＰＣＲにより、ヒト大腸ｃＤＮＡライブラリーより、下記のForward primer for b3Gal-T5及びReverse primer
for b3Gal-T5を用いて、細胞質及び膜貫通領域を欠如したペプチドをコードしたｃＤＮＡフラグメントを増幅した。得られたｃＤＮＡフラグメントは、β３Ｇａｌ−Ｔ５の２７番から３１０番のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするｃＤＮＡである。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ｂ３Ｇａｌ−Ｔ５：5’-tttgtcgacAGTCTAAATCCTTTCAAAG-3’（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ｂ３Ｇａｌ−Ｔ５：5’-tttaagcttCAGACAGGCGGACAATC-3’（配列番号２）
配列中において、小文字で記載されている配列は、発現ベクターへ連結するための制限酵素サイトを含む配列である。得られたｃＤＮＡを、ｐＱＥ９ベクター（キアゲン社）のクローニングサイトにクローニングし、クローニングされたベクターにより大腸菌Ｍ１５を形質転換した。得られたプラスミドのヌクレオチド配列を、Prism 310Genetic Analyzer（アプライド・バイオシステムズ社）で決定した。
（Ａ−２）β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質の発現及び精製
組換えβ３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質は、以下のように調製した。１５ＬのＬＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍＬ及びカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む）に、一晩培養した形質転換大腸菌Ｍ１５を、１／１００に希釈して加え、激しく撹拌しながら、３０℃で３時間培養した。培養液にイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと称する）を最終濃度０．１ｍＭで添加し、１８℃で１６時間の間、発現を誘導した。遠心により、大腸菌を集菌し、ＢｕｆｆｅｒＡ〔２００ｍＬの６Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、及び２０ｍＭｉｍｉｄａｚｏｌｅ〕中で、超音波で破砕した。得られたホモジネートは、２５℃で１６時間静置した。５，０００ｇで２０分遠心後に、上清を３ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン社）にアプライし、時々混合しながら、３０分置いた。樹脂をプラスチックのカラムに詰め６０ｍＬのＢｕｆｆｅｒＡで洗浄した。その後、組換えタンパク質は、０．２５Ｍのイミダゾールを含むｂｕｆｆｅｒＡで溶出した。溶出物を８Ｍ尿素−ＰＢＳに透析し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１０（ミリポア社）で濃縮した。最終的に２．５ｍｇの組換えタンパク質を得た。得られたタンパク質を変性大腸菌β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質と称した。
組換えβ３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質は、以下のように調製した。１５ＬのＬＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍＬ及びカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む）に、一晩培養した形質転換大腸菌Ｍ１５を、１／１００に希釈して加え、激しく撹拌しながら、３０℃で３時間培養した。培養液にイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと称する）を最終濃度０．１ｍＭで添加し、１８℃で１６時間の間、発現を誘導した。遠心により、大腸菌を集菌し、ＢｕｆｆｅｒＡ〔２００ｍＬの６Ｍ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、及び２０ｍＭｉｍｉｄａｚｏｌｅ〕中で、超音波で破砕した。得られたホモジネートは、２５℃で１６時間静置した。５，０００ｇで２０分遠心後に、上清を３ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン社）にアプライし、時々混合しながら、３０分置いた。樹脂をプラスチックのカラムに詰め６０ｍＬのＢｕｆｆｅｒＡで洗浄した。その後、組換えタンパク質は、０．２５Ｍのイミダゾールを含むｂｕｆｆｅｒＡで溶出した。溶出物を８Ｍ尿素−ＰＢＳに透析し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１０（ミリポア社）で濃縮した。最終的に２．５ｍｇの組換えタンパク質を得た。得られたタンパク質を変性大腸菌β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質と称した。
（Ｂ）非変性可溶性β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質の調製（スクリーニング用抗原の調製）
実施例１で作製した形質転換大腸菌Ｍ１５を用いて、非変性β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質を調製した。大腸菌の培養３００ｍＬを、０．１ｍＭＩＰＴＧにより発現誘導した後に、菌体を集菌し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）（０．３Ｍ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含む）２５ｍＬ中で超音波破砕した。得られたホモジネートに、５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を２．５ｍＬ添加し、混合物を氷中に３０分置いた。遠心後、上清にＮｉ−ＮＴＡアガロース０．３ｍＬを加え、混合物を時々混合しながら、３０分おいた。樹脂をプラスチックのカラムに詰め、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５ｍＬのＢｕｆｆｅｒＢ（２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．３Ｍ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で洗浄し、更に５ｍＬのｂｕｆｆｅｒ Ｂで洗浄した。組換えタンパク質は、０．２５Ｍのイミダゾールを含むｂｕｆｆｅｒＢで溶出した。溶出物は、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１０（ミリポア社）を用いて、ＰＢＳで洗浄し、濃縮した。０．３６ｍｇの得られたタンパク質の内、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定によると、組換えβ３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質はおよそ１０％の收率であった。この分画は、十分なβ３Ｇａｌ−Ｔ５活性を含んでいた。得られたタンパク質を非変性大腸菌β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質と称する。
実施例１で作製した形質転換大腸菌Ｍ１５を用いて、非変性β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質を調製した。大腸菌の培養３００ｍＬを、０．１ｍＭＩＰＴＧにより発現誘導した後に、菌体を集菌し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）（０．３Ｍ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含む）２５ｍＬ中で超音波破砕した。得られたホモジネートに、５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を２．５ｍＬ添加し、混合物を氷中に３０分置いた。遠心後、上清にＮｉ−ＮＴＡアガロース０．３ｍＬを加え、混合物を時々混合しながら、３０分おいた。樹脂をプラスチックのカラムに詰め、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５ｍＬのＢｕｆｆｅｒＢ（２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．３Ｍ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で洗浄し、更に５ｍＬのｂｕｆｆｅｒ Ｂで洗浄した。組換えタンパク質は、０．２５Ｍのイミダゾールを含むｂｕｆｆｅｒＢで溶出した。溶出物は、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ−１０（ミリポア社）を用いて、ＰＢＳで洗浄し、濃縮した。０．３６ｍｇの得られたタンパク質の内、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる推定によると、組換えβ３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質はおよそ１０％の收率であった。この分画は、十分なβ３Ｇａｌ−Ｔ５活性を含んでいた。得られたタンパク質を非変性大腸菌β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質と称する。
（Ｃ）モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の作製
β３Ｇａｌ−Ｔ５に対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は、株式会社医学生物学研究所において調製された。モノクローナル抗体は、以下のように調製した。４匹のマウスの足蹠に、前記変性大腸菌β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質を、３日間おきに３回免疫した。定法に従い、マウス脾臓細胞をマウスミエローマと融合し、前記非変性β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質を抗原として用いて、抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行った。非変性大腸菌β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質に反応するモノクローナル抗体を産生する１株のハイブリドーマをクローニングした。定法に従い、５匹のマウスの腹腔内に、ハイブリドーマを接種し、２５ｍＬの腹水を得た。腹水は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（１．４×６８ｃｍ；ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅｄ ａｎｄ ｅｌｕｔｅｄ ｗｉｔｈ ＴＢＳ：ＧＥヘルスケア社）を用いて精製し、２１ｍｇのβ３Ｇａｌ−Ｔ５モノクローナル抗体を得た。
ポリクローナル抗体は、前記変性大腸菌β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質を、ウサギに１週間毎に、６回免疫し、β３Ｇａｌ−Ｔ５ポリクローナル抗血清として取得した。
β３Ｇａｌ−Ｔ５に対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は、株式会社医学生物学研究所において調製された。モノクローナル抗体は、以下のように調製した。４匹のマウスの足蹠に、前記変性大腸菌β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質を、３日間おきに３回免疫した。定法に従い、マウス脾臓細胞をマウスミエローマと融合し、前記非変性β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質を抗原として用いて、抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行った。非変性大腸菌β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質に反応するモノクローナル抗体を産生する１株のハイブリドーマをクローニングした。定法に従い、５匹のマウスの腹腔内に、ハイブリドーマを接種し、２５ｍＬの腹水を得た。腹水は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（１．４×６８ｃｍ；ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅｄ ａｎｄ ｅｌｕｔｅｄ ｗｉｔｈ ＴＢＳ：ＧＥヘルスケア社）を用いて精製し、２１ｍｇのβ３Ｇａｌ−Ｔ５モノクローナル抗体を得た。
ポリクローナル抗体は、前記変性大腸菌β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質を、ウサギに１週間毎に、６回免疫し、β３Ｇａｌ−Ｔ５ポリクローナル抗血清として取得した。
（Ｄ）モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の特異性の確認
得られたモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のβ３Ｇａｌ−Ｔ５に対する特異性を確認するため、β３ＧａｌＴ−１、β３ＧａｌＴ−２、β３Ｇａｌ−Ｔ４、β３ＧａｌＴ−６、及びβ３ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１との反応性を検討した。まず、それぞれの組換えタンパク質を作製した。β３ＧａｌＴ−１については、プライマーとして下記のプライマーを使用したことを除いては、前記（Ａ−１）の工程を繰り返し、発現ベクターを構築した。β３ＧａｌＴ−２、β３Ｇａｌ−Ｔ４、β３ＧａｌＴ−６、及びβ３ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１については、ｃＤＮＡライブラリーとして、ヒト大腸ｃＤＮＡライブラーの代わりに、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔヒト脳ｃＤＮＡライブラリーを用い、プライマーとして下記のプライマーを用いたことを除いては、前記（Ａ−１）の工程を繰り返し、発現ベクターを構築した。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３Ｇａｌ−Ｔ１：5’-tttggatccAGTATAACTCGCCCTACTT-3’（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３Ｇａｌ−Ｔ１：5’-tttaagcttCCTAACATCTGAGATG-3’（配列番号４）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３Ｇａｌ−Ｔ２：5’-tttggatccCTGCCAGGCAGAGCTGGA-3’（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３Ｇａｌ−Ｔ２：5’-tttaagcttAATGTAGTTTACGGTGG-3’（配列番号６）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１：5’-tttggatccAGCCTTCCCCACTACAATG-3’（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１：5’-tttaagcttAATAATGGCATGTGGTGT-3’（配列番号８）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３Ｇａｌ−Ｔ４：5’-tttggatccTTGGGGGAGGAGCTGCTG-3’（配列番号９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３Ｇａｌ−Ｔ４：5’-tttgtcgacTCAGCTCTGAAGCCAGGC-3’（配列番号１０）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３Ｇａｌ−Ｔ６：5’-tttggatccGACCCCAGGGCGATGTCG-3’（配列番号１１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３Ｇａｌ−Ｔ６：5’-tttaagcttGGCTCAGGGGATGCCCT-3’（配列番号１２）
得られたモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のβ３Ｇａｌ−Ｔ５に対する特異性を確認するため、β３ＧａｌＴ−１、β３ＧａｌＴ−２、β３Ｇａｌ−Ｔ４、β３ＧａｌＴ−６、及びβ３ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１との反応性を検討した。まず、それぞれの組換えタンパク質を作製した。β３ＧａｌＴ−１については、プライマーとして下記のプライマーを使用したことを除いては、前記（Ａ−１）の工程を繰り返し、発現ベクターを構築した。β３ＧａｌＴ−２、β３Ｇａｌ−Ｔ４、β３ＧａｌＴ−６、及びβ３ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１については、ｃＤＮＡライブラリーとして、ヒト大腸ｃＤＮＡライブラーの代わりに、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔヒト脳ｃＤＮＡライブラリーを用い、プライマーとして下記のプライマーを用いたことを除いては、前記（Ａ−１）の工程を繰り返し、発現ベクターを構築した。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３Ｇａｌ−Ｔ１：5’-tttggatccAGTATAACTCGCCCTACTT-3’（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３Ｇａｌ−Ｔ１：5’-tttaagcttCCTAACATCTGAGATG-3’（配列番号４）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３Ｇａｌ−Ｔ２：5’-tttggatccCTGCCAGGCAGAGCTGGA-3’（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３Ｇａｌ−Ｔ２：5’-tttaagcttAATGTAGTTTACGGTGG-3’（配列番号６）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１：5’-tttggatccAGCCTTCCCCACTACAATG-3’（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１：5’-tttaagcttAATAATGGCATGTGGTGT-3’（配列番号８）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３Ｇａｌ−Ｔ４：5’-tttggatccTTGGGGGAGGAGCTGCTG-3’（配列番号９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３Ｇａｌ−Ｔ４：5’-tttgtcgacTCAGCTCTGAAGCCAGGC-3’（配列番号１０）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３Ｇａｌ−Ｔ６：5’-tttggatccGACCCCAGGGCGATGTCG-3’（配列番号１１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ β３Ｇａｌ−Ｔ６：5’-tttaagcttGGCTCAGGGGATGCCCT-3’（配列番号１２）
それぞれの組換えタンパク質は、前記（Ａ−２）の工程を若干変更し、調製した。具体的には、一晩培養したそれぞれの形質転換Ｍ１５を、１／１００の濃度で１５ｍＬの抗生物質を含んだＬＢ培地に加え、３０℃で３時間培養した。最終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧを培養に添加し、１８℃で１６時間の間、発現誘導を行った。大腸菌を集菌し、１０ｍＬのｂｕｆｆｅｒＡ中で超音波破砕した。ホモジネートは、２５℃１６時間静置した。遠心後、上清に０．５ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロース（キアゲン社）を加え、３０分置いた。樹脂を１０ｍＬのｂｕｆｆｅｒＡで洗浄し、組換えタンパク質を０．２５Ｍのイミダゾールを含むｂｕｆｆｅｒＡで溶出した。その結果、β３ＧａｌＴ−１、β３ＧａｌＴ−２、β３Ｇａｌ−Ｔ４、β３ＧａｌＴ−６、及びβ３ＧａｌＮａｃ−Ｔ１の収量は、それぞれ、０．０３ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．０６ｍｇ、０．７０ｍｇ及び１．８ｍｇであった。
次に、ウエスタンブロッティングにより、反応性を確認した。得られた、それぞれのタンパク質３００ｎｇを、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。ブロッキング後、抗β３Ｇａｌ−Ｔ５モノクローナル抗体（１μｇ／ｍＬ）と反応させた。洗浄後、メンブレンをＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭウサギ抗体（０．３μｇ／ｍＬ：Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ）と反応させた。ＥＣＬウエスタンブロット検出試薬（ＧＥヘルスケア社）を用いて、化学発光により検出した。
ポリクローナル抗血清の反応特性は、それぞれのタンパク質を５０ｎｇ電気泳動し、ポリクローナル抗血清を１，０００倍に希釈し反応させ、更に、洗浄後ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇ抗体（０．３μｇ／ｍＬ）と反応させ、モノクローナル抗体と同様に化学発光で検出した。
図１に示すように、モノクローナル抗体は、β３Ｇａｌ−Ｔ５に強く反応した。また、それ以外にβ３ＧａｌＴ−１、及びβ３Ｇａｌ−Ｔ４にも反応した。一方、ポリクローナル抗体は、β３Ｇａｌ−Ｔ５に強く反応し、β３Ｇａｌ−Ｔ４にも反応した。
ポリクローナル抗血清の反応特性は、それぞれのタンパク質を５０ｎｇ電気泳動し、ポリクローナル抗血清を１，０００倍に希釈し反応させ、更に、洗浄後ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇ抗体（０．３μｇ／ｍＬ）と反応させ、モノクローナル抗体と同様に化学発光で検出した。
図１に示すように、モノクローナル抗体は、β３Ｇａｌ−Ｔ５に強く反応した。また、それ以外にβ３ＧａｌＴ−１、及びβ３Ｇａｌ−Ｔ４にも反応した。一方、ポリクローナル抗体は、β３Ｇａｌ−Ｔ５に強く反応し、β３Ｇａｌ−Ｔ４にも反応した。
《実施例２：卵巣癌細胞におけるβ３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５のｍＲＮＡの発現》
卵巣癌細胞でのβ３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５のｍＲＮＡの発現を、５種の卵巣癌細胞株を用い、ＲＴ−ＰＣＲにより検討した。ＥＳ−２細胞（卵巣明細胞癌）は、ＡＴＣＣより購入し、ＭＣＡＳ細胞（卵巣粘液性嚢胞腺癌）、ＲＭＧ−Ｉ細胞（卵巣中腎腺癌）、ＲＭＧ−ＩＩ細胞（卵巣中腎腺癌）、及びＲＭＵＧ−Ｌ（卵巣粘液性嚢胞腺癌）は、ヒューマンサイエンス研究資源バンクから購入した。
回収した細胞を、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて溶解し、総ＲＮＡを分離した。得られたＲＮＡから、オリゴｄＴプライマー及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（インビトロジェン社）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ量は、βアクチンのｃＤＮＡ量によって補正した。
β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５の発現は、それぞれ下記のプライマーを添加し、９５℃で２分、インキュベーション後にＰＣＲによって確認した。ＰＣＲは、GoTaq DNA polymerase（プロメガ社）を用いて、２０μＬの容量で、９５℃３０秒、６２℃１分、７２℃２分を２９サイクル繰り返すことにより、行った。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ｏｆ β３Ｇａｌ−Ｔ４：5’-ATTCTTGCTGGGAGAGCCGAAC-3’（配列番号１３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ｏｆ β３Ｇａｌ−Ｔ４：5’-AAGTACAGAAGAGGCACTTCCTC-3’（配列番号１４）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ｏｆ β３Ｇａｌ−Ｔ５：5’-GGAAACGAAAGAGGTGGACCAG-3’（配列番号１５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ｏｆ β３Ｇａｌ−Ｔ５：5’-GAGCTCCTCCAATCTGATGTTCA-3’（配列番号１６）
図４に示すように、β３Ｇａｌ−Ｔ４のｍＲＮＡは、ＥＳ−２細胞、ＭＣＡＳ細胞、ＲＭＧ−Ｉ細胞、及びＲＭＵＧ−Ｌ細胞で発現していた。一方、β３Ｇａｌ−Ｔ５のｍＲＮＡは、ＥＳ−２細胞、ＲＭＧ−Ｉ細胞、ＲＭＧ−ＩＩ細胞、及びＲＭＵＧ−Ｌ細胞で発現していた。
卵巣癌細胞でのβ３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５のｍＲＮＡの発現を、５種の卵巣癌細胞株を用い、ＲＴ−ＰＣＲにより検討した。ＥＳ−２細胞（卵巣明細胞癌）は、ＡＴＣＣより購入し、ＭＣＡＳ細胞（卵巣粘液性嚢胞腺癌）、ＲＭＧ−Ｉ細胞（卵巣中腎腺癌）、ＲＭＧ−ＩＩ細胞（卵巣中腎腺癌）、及びＲＭＵＧ−Ｌ（卵巣粘液性嚢胞腺癌）は、ヒューマンサイエンス研究資源バンクから購入した。
回収した細胞を、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて溶解し、総ＲＮＡを分離した。得られたＲＮＡから、オリゴｄＴプライマー及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ（インビトロジェン社）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ量は、βアクチンのｃＤＮＡ量によって補正した。
β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５の発現は、それぞれ下記のプライマーを添加し、９５℃で２分、インキュベーション後にＰＣＲによって確認した。ＰＣＲは、GoTaq DNA polymerase（プロメガ社）を用いて、２０μＬの容量で、９５℃３０秒、６２℃１分、７２℃２分を２９サイクル繰り返すことにより、行った。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ｏｆ β３Ｇａｌ−Ｔ４：5’-ATTCTTGCTGGGAGAGCCGAAC-3’（配列番号１３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ｏｆ β３Ｇａｌ−Ｔ４：5’-AAGTACAGAAGAGGCACTTCCTC-3’（配列番号１４）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ｏｆ β３Ｇａｌ−Ｔ５：5’-GGAAACGAAAGAGGTGGACCAG-3’（配列番号１５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ ｏｆ β３Ｇａｌ−Ｔ５：5’-GAGCTCCTCCAATCTGATGTTCA-3’（配列番号１６）
図４に示すように、β３Ｇａｌ−Ｔ４のｍＲＮＡは、ＥＳ−２細胞、ＭＣＡＳ細胞、ＲＭＧ−Ｉ細胞、及びＲＭＵＧ−Ｌ細胞で発現していた。一方、β３Ｇａｌ−Ｔ５のｍＲＮＡは、ＥＳ−２細胞、ＲＭＧ−Ｉ細胞、ＲＭＧ−ＩＩ細胞、及びＲＭＵＧ−Ｌ細胞で発現していた。
β３Ｇａｌ−Ｔ４のｍＲＮＡ及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５のｍＲＮＡは、それぞれ５株の卵巣癌細胞株のうち、４株の卵巣癌細胞株で発現していた。また、５株の卵巣癌細胞株において、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５のいずれかのｍＲＮＡが発現していた。
《実施例３：ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２抗体の作製》
（Ａ）可溶性ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質の調製（免疫用抗原の調製）
（Ａ−１）ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２発現ベクターの構築
ＰＣＲにより、以前取得した全長のｃＤＮＡ（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００２、１２、ｐ．３７９−３８８）より、下記のForward primer for GlcNAc6ST2及びReverse
primer for GlcNAc6ST2を用いて、細胞質及び膜貫通領域を欠如したペプチドをコードしたｃＤＮＡフラグメントを増幅した。得られたｃＤＮＡフラグメントは、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の２８番〜３８６番のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするｃＤＮＡである。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ２：5’-tttgtcgacAGCCACAACATCAGCT-3’（配列番号１７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ２：5’-tttaagcttAGTGGATTTGCTCAG-3’（配列番号１８）
配列中において、小文字で記載されている配列は、発現ベクターへ連結するための制限酵素サイトを含む配列である。得られたｃＤＮＡを、ｐＱＥ９ベクター（キアゲン社）のクローニングサイトにクローニングし、クローニングされたベクターにより大腸菌Ｍ１５を形質転換した。得られたプラスミドのヌクレオチド配列を、Prism 310Genetic Analyzer（アプライド・バイオシステムズ社）で決定した。
（Ａ）可溶性ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質の調製（免疫用抗原の調製）
（Ａ−１）ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２発現ベクターの構築
ＰＣＲにより、以前取得した全長のｃＤＮＡ（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００２、１２、ｐ．３７９−３８８）より、下記のForward primer for GlcNAc6ST2及びReverse
primer for GlcNAc6ST2を用いて、細胞質及び膜貫通領域を欠如したペプチドをコードしたｃＤＮＡフラグメントを増幅した。得られたｃＤＮＡフラグメントは、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の２８番〜３８６番のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするｃＤＮＡである。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ２：5’-tttgtcgacAGCCACAACATCAGCT-3’（配列番号１７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ２：5’-tttaagcttAGTGGATTTGCTCAG-3’（配列番号１８）
配列中において、小文字で記載されている配列は、発現ベクターへ連結するための制限酵素サイトを含む配列である。得られたｃＤＮＡを、ｐＱＥ９ベクター（キアゲン社）のクローニングサイトにクローニングし、クローニングされたベクターにより大腸菌Ｍ１５を形質転換した。得られたプラスミドのヌクレオチド配列を、Prism 310Genetic Analyzer（アプライド・バイオシステムズ社）で決定した。
（Ａ−２）ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質の発現及び精製
β３Ｇａｌ−Ｔ５の発現ベクターの代わりに、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２発現ベクターを用い、ＩＰＴＧ発現誘導のための培養を１．２５Ｌで行ったことを除いては、前記実施例１の（Ａ−２）の工程を繰り返し、最終的に３．５ｍｇのＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質を得た。得られたタンパク質を大腸菌ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質と称した。
β３Ｇａｌ−Ｔ５の発現ベクターの代わりに、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２発現ベクターを用い、ＩＰＴＧ発現誘導のための培養を１．２５Ｌで行ったことを除いては、前記実施例１の（Ａ−２）の工程を繰り返し、最終的に３．５ｍｇのＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質を得た。得られたタンパク質を大腸菌ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質と称した。
（Ｂ）ピキア・パストリスによる、可溶性ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質の調製（スクリーニング用抗原の調製）
モノクローナル抗体のスクリーニングに用いる酵母によるＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質の調製を行った。ＰＣＲにより、以前取得した全長のｃＤＮＡ（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１２、ｐ．３７９−３８８、２００２）より、下記のForward primer for GlcNAc6ST2-pichia及びReverse
primer for GlcNAc6ST2-pichiaを用いて、細胞質及び膜貫通領域を欠如したペプチドをコードしたｃＤＮＡフラグメントを増幅した。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ２−ｐｉｃｈｉａ：5’-tttcctaggTACAGCCACAACATCAG-3’（配列番号１９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ２−ｐｉｃｈｉａ：5’-tttgcggccgcTTAGTGGATTTGCTCAGG-3’（配
列番号２０）
得られたｃＤＮＡを、ｐＰＩＣ９−Ｈｉｓベクターの最適なクローニングサイトに挿入し、ヌクレオチド配列を、Prism 310Genetic Analyzerで決定した。組換えＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質の産生及び精製は、既報の方法（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５、ｐ．９４３−９５１、２００５）に従い、行った。５００ｍＬの緩衝メタノール複合培地中の培養から、３００μｇの組換えタンパク質が得られた。この分画は、十分なＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２活性を含んでいた。得られたタンパク質を酵母ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質と称する。
モノクローナル抗体のスクリーニングに用いる酵母によるＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質の調製を行った。ＰＣＲにより、以前取得した全長のｃＤＮＡ（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１２、ｐ．３７９−３８８、２００２）より、下記のForward primer for GlcNAc6ST2-pichia及びReverse
primer for GlcNAc6ST2-pichiaを用いて、細胞質及び膜貫通領域を欠如したペプチドをコードしたｃＤＮＡフラグメントを増幅した。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ２−ｐｉｃｈｉａ：5’-tttcctaggTACAGCCACAACATCAG-3’（配列番号１９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ２−ｐｉｃｈｉａ：5’-tttgcggccgcTTAGTGGATTTGCTCAGG-3’（配
列番号２０）
得られたｃＤＮＡを、ｐＰＩＣ９−Ｈｉｓベクターの最適なクローニングサイトに挿入し、ヌクレオチド配列を、Prism 310Genetic Analyzerで決定した。組換えＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質の産生及び精製は、既報の方法（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５、ｐ．９４３−９５１、２００５）に従い、行った。５００ｍＬの緩衝メタノール複合培地中の培養から、３００μｇの組換えタンパク質が得られた。この分画は、十分なＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２活性を含んでいた。得られたタンパク質を酵母ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質と称する。
（Ｃ）モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の作製
免疫原として、大腸菌ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質を用いること、及びモノクローナル抗体のスクリーニング抗原として、酵母ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質を用いることを除いては、前記実施例１の（Ｃ）の工程を繰り返し、モノクローナル抗体を産生する１株のハイブリドーマ及びポリクローナル抗血清を取得した。５匹のマウスの腹腔内に、ハイブリドーマを接種し、１３ｍＬの腹水を得た。腹水は、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ （０．９×７．９ｃｍ；ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＰＢＳ：ＧＥヘルスケア社）を用いて精製し、１２．６ｍｇの抗体を得た。
免疫原として、大腸菌ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質を用いること、及びモノクローナル抗体のスクリーニング抗原として、酵母ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質を用いることを除いては、前記実施例１の（Ｃ）の工程を繰り返し、モノクローナル抗体を産生する１株のハイブリドーマ及びポリクローナル抗血清を取得した。５匹のマウスの腹腔内に、ハイブリドーマを接種し、１３ｍＬの腹水を得た。腹水は、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ （０．９×７．９ｃｍ；ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＰＢＳ：ＧＥヘルスケア社）を用いて精製し、１２．６ｍｇの抗体を得た。
（Ｄ）モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の特異性の確認
得られたモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２に対する特異性を確認するため、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ１、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ３、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ４、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ５、Ｇａｌ６ＳＴ、及びＣｈ６ＳＴ１との反応性を検討した。まずそれぞれの組換えタンパク質を作製した。プライマーとして下記のプライマーを使用したことを除いては、本実施例の（Ａ−１）の工程を繰り返し、発現ベクターを構築した。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ１：5’-tttgtcgacTACAAGTGGCACAAG-3’（配列番号２１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ１：5’-tttgtcgacCCCTTTTAGAGACGG-3’（配列番号２２）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ３：5’-tttgtcgacTCCCGGCCAGGGCCCTC-3’（配列番号２３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ３：5’-tttaagcttCAGTCAGGCGATGCCCA-3’（配列番号２４）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ４：5’-tttgtcgacGGCGGCCGCGACGG-3’（配列番号２５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ４：5’-tttaagcttGGGAGGCTACGTGGCGC-3’（配列番号２６）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ５：5’-tttgtcgacTCCCGGCCAGGGCCCTC-3’（配列番号２７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ５：5’-tttaagcttGCTACAACTGTGGCCTC-3’（配列番号２８）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ Ｇａｌ６ＳＴ：5’-tttgtcgacACCTTCACCGCCAAGTC-3’（配列番号２９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ Ｇａｌ６ＳＴ：5’-tttaagcttCACGAGAAGGGGCGGAA-3’（配列番号３０）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ Ｃｈ６ＳＴ１：5’-tttgtcgacATATCAAGGGTCTCAGA-3’（配列番号３１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ Ｃｈ６ＳＴ１：5’-tttaagcttCTACGTGACCCAGAAGGT-3’（配列番号３２）
得られたモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２に対する特異性を確認するため、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ１、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ３、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ４、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ５、Ｇａｌ６ＳＴ、及びＣｈ６ＳＴ１との反応性を検討した。まずそれぞれの組換えタンパク質を作製した。プライマーとして下記のプライマーを使用したことを除いては、本実施例の（Ａ−１）の工程を繰り返し、発現ベクターを構築した。
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ１：5’-tttgtcgacTACAAGTGGCACAAG-3’（配列番号２１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ１：5’-tttgtcgacCCCTTTTAGAGACGG-3’（配列番号２２）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ３：5’-tttgtcgacTCCCGGCCAGGGCCCTC-3’（配列番号２３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ３：5’-tttaagcttCAGTCAGGCGATGCCCA-3’（配列番号２４）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ４：5’-tttgtcgacGGCGGCCGCGACGG-3’（配列番号２５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ４：5’-tttaagcttGGGAGGCTACGTGGCGC-3’（配列番号２６）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ５：5’-tttgtcgacTCCCGGCCAGGGCCCTC-3’（配列番号２７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ５：5’-tttaagcttGCTACAACTGTGGCCTC-3’（配列番号２８）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ Ｇａｌ６ＳＴ：5’-tttgtcgacACCTTCACCGCCAAGTC-3’（配列番号２９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ Ｇａｌ６ＳＴ：5’-tttaagcttCACGAGAAGGGGCGGAA-3’（配列番号３０）
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ Ｃｈ６ＳＴ１：5’-tttgtcgacATATCAAGGGTCTCAGA-3’（配列番号３１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ Ｃｈ６ＳＴ１：5’-tttaagcttCTACGTGACCCAGAAGGT-3’（配列番号３２）
ＩＰＴＧの発現誘導に１５ｍＬの培養を用いたことを除いては、前記実施例１の（Ｄ）のβ３ＧａｌＴ−１等の発現及び精製の工程を繰り返し、それぞれの組換えタンパク質を得た。ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ１、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ３、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ４、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ５、Ｇａｌ６ＳＴ、及びＣｈ６ＳＴ１の収量は、それぞれ、０．２０ｍｇ、１．２ｍｇ、０．２６ｍｇ、０．８３ｍｇ、０．２６ｍｇ及び０．１３ｍｇであった。
次に、ウエスタンブロットを行った。電気泳動の抗原量として２００ｎｇを用いたことを除いては、前記実施例１の（Ｄ）のウエスタンブロッティングの工程を繰り返した。
図２に示すように、モノクローナル抗体は、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２のみに強く反応した。一方、ポリクローナル抗血清は、全ての抗原に反応した。
図２に示すように、モノクローナル抗体は、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２のみに強く反応した。一方、ポリクローナル抗血清は、全ての抗原に反応した。
《実施例４：β３Ｇａｌ−Ｔ５及びＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２のサンドイッチＥＬＩＳＡの構築》
前記β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質を免疫して得られたモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清、並びにＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質を免疫して得られたモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法による、β３Ｇａｌ−Ｔ５及びＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の免疫学的分析方法の構築を行った。
前記β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質を免疫して得られたモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清、並びにＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質を免疫して得られたモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法による、β３Ｇａｌ−Ｔ５及びＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の免疫学的分析方法の構築を行った。
（Ａ）β３Ｇａｌ−Ｔ５検出系
ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したβ３Ｇａｌ−Ｔ５モノクローナル抗体５０μＬを、９６ｗｅｌｌ ｂｌａｃｋ、ｈｉｇｈ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｌａｔｅｓ（コーニング社）に加え、４℃、１６時間で、固相化した。表面を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで、２５℃１時間、ブロッキングした。ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）に１％ＢＳＡを添加した希釈液で、標準物質として非変性大腸菌β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質を２５０ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、６２．５ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、４．０ｎｇ／ｍＬに希釈し、５０μＬ加え、２５℃、２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、１０００倍希釈したβ３Ｇａｌ−Ｔ５ポリクローナル抗血清５０μＬを加え、２５℃、１．５時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ＰＢＳ−Ｔで希釈したロバのＨＲＰ標識抗ウサギＩｇ抗体（０．３μｇ／ｍＬ：ＧＥヘルスケア社）を加え、２５℃、１時間インキュベートした。ウエルをＰＢＳ−Ｔで、４回洗浄し、１００μＬのSuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate（ピアス社）を加え、Ｐｌａｔｅ ＣＨＡＭＥＬＥＯＮ Ｖ（ハイデックス社）で、化学発光をカウントした。
ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したβ３Ｇａｌ−Ｔ５モノクローナル抗体５０μＬを、９６ｗｅｌｌ ｂｌａｃｋ、ｈｉｇｈ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｌａｔｅｓ（コーニング社）に加え、４℃、１６時間で、固相化した。表面を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで、２５℃１時間、ブロッキングした。ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）に１％ＢＳＡを添加した希釈液で、標準物質として非変性大腸菌β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質を２５０ｎｇ／ｍＬ、１２５ｎｇ／ｍＬ、６２．５ｎｇ／ｍＬ、１６ｎｇ／ｍＬ、４．０ｎｇ／ｍＬに希釈し、５０μＬ加え、２５℃、２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、１０００倍希釈したβ３Ｇａｌ−Ｔ５ポリクローナル抗血清５０μＬを加え、２５℃、１．５時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、ＰＢＳ−Ｔで希釈したロバのＨＲＰ標識抗ウサギＩｇ抗体（０．３μｇ／ｍＬ：ＧＥヘルスケア社）を加え、２５℃、１時間インキュベートした。ウエルをＰＢＳ−Ｔで、４回洗浄し、１００μＬのSuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate（ピアス社）を加え、Ｐｌａｔｅ ＣＨＡＭＥＬＥＯＮ Ｖ（ハイデックス社）で、化学発光をカウントした。
（Ｂ）ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系
ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２に対するモノクローナル抗体の濃度を３μＬ／ｍＬで固相化したこと、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２に対するポリクローナル抗血清を３０００倍に希釈したこと、及び標準物質として大腸菌ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質使用したことを除いては、前記（Ａ）の工程を繰り返し、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２のサンドイッチＥＬＩＳＡを構築した。
図３に示すように、β３Ｇａｌ−Ｔ５検出系及びＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系共に、直線性のよい検量線を得ることができた。
ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２に対するモノクローナル抗体の濃度を３μＬ／ｍＬで固相化したこと、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２に対するポリクローナル抗血清を３０００倍に希釈したこと、及び標準物質として大腸菌ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質使用したことを除いては、前記（Ａ）の工程を繰り返し、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２のサンドイッチＥＬＩＳＡを構築した。
図３に示すように、β３Ｇａｌ−Ｔ５検出系及びＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系共に、直線性のよい検量線を得ることができた。
（Ｃ）β３Ｇａｌ−Ｔ５検出系の検量線の改善
標準物質である非変性大腸菌β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質の希釈液を、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）の希釈液から、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）に正常人ヒト血清１０％を添加した希釈液に変更したことを除いては、前記（Ａ）の工程を繰り返し、β３Ｇａｌ−Ｔ５の検量線を得た。図５Ａに結果を示す。β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質の低濃度の領域において、直線性が改善された。添加する血清は正常人ヒト血清以外に、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の血清を用いても同じような効果があった。
標準物質である非変性大腸菌β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質の希釈液を、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）の希釈液から、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）に正常人ヒト血清１０％を添加した希釈液に変更したことを除いては、前記（Ａ）の工程を繰り返し、β３Ｇａｌ−Ｔ５の検量線を得た。図５Ａに結果を示す。β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質の低濃度の領域において、直線性が改善された。添加する血清は正常人ヒト血清以外に、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の血清を用いても同じような効果があった。
（Ｄ）ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系の検量線の改善
標準物質である大腸菌ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質の希釈液を、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）の希釈液から、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）に正常人ヒト血清１０％を添加した希釈液に変更したことを除いては、前記（Ｂ）の工程を繰り返し、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の検量線を得た。図５Ａに結果を示す。ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質の低濃度の領域において、直線性が改善された。
標準物質である大腸菌ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質の希釈液を、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）の希釈液から、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）に正常人ヒト血清１０％を添加した希釈液に変更したことを除いては、前記（Ｂ）の工程を繰り返し、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の検量線を得た。図５Ａに結果を示す。ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質の低濃度の領域において、直線性が改善された。
《実施例５：卵巣癌患者の血清中のβ３Ｇａｌ−Ｔ５検出系による測定》
卵巣癌患者６０症例及び健常成人女性８検体の血清中のβ３Ｇａｌ−Ｔ５検出系による測定を行った。卵巣癌患者の血清は、開腹手術によりＩ期〜IV期の病期診断を受けた患者の血清を用い、５７症例については、組織学的検査により卵巣癌の組織型を判定することができた。これらの卵巣癌患者は、卵巣癌以外の癌の発生は確認されなかった。
標準物質の変性大腸菌β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質の代わりに、患者及び健常人の血清をＰＢＳ−Ｔで１０倍希釈して加えたことを除いては、実施例４の（Ａ）の工程を繰り返した。図３（Ａ）の検量線から血清中のβ３Ｇａｌ−Ｔ５の値を決定した。陽性の判定は、健常成人女性の平均＋２ＳＤの値を、カットオフ値として判定した。
なお、実施例１の（Ｄ）におけるβ３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質を免疫して得られたモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清の、他のβ１−３ガラクトース転移酵素との反応性の検討により、このモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清によるＥＬＩＳＡは、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５の両方の酵素を検出することができる。
卵巣癌患者６０症例及び健常成人女性８検体の血清中のβ３Ｇａｌ−Ｔ５検出系による測定を行った。卵巣癌患者の血清は、開腹手術によりＩ期〜IV期の病期診断を受けた患者の血清を用い、５７症例については、組織学的検査により卵巣癌の組織型を判定することができた。これらの卵巣癌患者は、卵巣癌以外の癌の発生は確認されなかった。
標準物質の変性大腸菌β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質の代わりに、患者及び健常人の血清をＰＢＳ−Ｔで１０倍希釈して加えたことを除いては、実施例４の（Ａ）の工程を繰り返した。図３（Ａ）の検量線から血清中のβ３Ｇａｌ−Ｔ５の値を決定した。陽性の判定は、健常成人女性の平均＋２ＳＤの値を、カットオフ値として判定した。
なお、実施例１の（Ｄ）におけるβ３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質を免疫して得られたモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清の、他のβ１−３ガラクトース転移酵素との反応性の検討により、このモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清によるＥＬＩＳＡは、β３Ｇａｌ−Ｔ４及びβ３Ｇａｌ−Ｔ５の両方の酵素を検出することができる。
《実施例６：卵巣癌患者の血清中のＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系による測定》
実施例５において測定した卵巣癌患者６０症例及び健常成人女性８検体の血清についてＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系による測定を行った。
標準物質の大腸菌ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質の代わりに、患者血清をＰＢＳ−Ｔで１０倍希釈して加えたことを除いては、実施例４の（Ｂ）の工程を繰り返した。図３（Ｂ）の検量線から血清中のＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の値を決定した。陽性の判定は、健常成人女性の平均＋２ＳＤの値を、カットオフ値として判定した。
実施例５において測定した卵巣癌患者６０症例及び健常成人女性８検体の血清についてＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系による測定を行った。
標準物質の大腸菌ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質の代わりに、患者血清をＰＢＳ−Ｔで１０倍希釈して加えたことを除いては、実施例４の（Ｂ）の工程を繰り返した。図３（Ｂ）の検量線から血清中のＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の値を決定した。陽性の判定は、健常成人女性の平均＋２ＳＤの値を、カットオフ値として判定した。
《比較例１》
実施例５において測定した卵巣癌患者６０症例及び健常成人女性８検体の血清について、従来の卵巣癌のマーカーであるＣＡ１２５の測定を行った。
ＣＡ１２５の測定は、エクルーシス試薬ＣＡ１２５ＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）のキットを用い、添付のプロトコールに従い、測定した。
実施例５において測定した卵巣癌患者６０症例及び健常成人女性８検体の血清について、従来の卵巣癌のマーカーであるＣＡ１２５の測定を行った。
ＣＡ１２５の測定は、エクルーシス試薬ＣＡ１２５ＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）のキットを用い、添付のプロトコールに従い、測定した。
《比較例２》
実施例５において測定した卵巣癌患者６０症例及び健常成人女性８検体の血清について、従来の卵巣癌のマーカーであるＣＡ５４６の測定を行った。
ＣＡ５４６の測定は、プレートカイノスＣＡ５４６試薬（株式会社カイノス）のキットを用い、添付のプロトコールに従い、測定した。
実施例５において測定した卵巣癌患者６０症例及び健常成人女性８検体の血清について、従来の卵巣癌のマーカーであるＣＡ５４６の測定を行った。
ＣＡ５４６の測定は、プレートカイノスＣＡ５４６試薬（株式会社カイノス）のキットを用い、添付のプロトコールに従い、測定した。
《解析例１》
実施例４及び５、並びに比較例１及び２の陽性率を、卵巣癌の病期別、又は組織型により分類して解析した。結果を表１に示す。
病期Ｉ及びIIの初期の卵巣癌において、β３Ｇａｌ−Ｔ５検出系による陽性率は、８７．１％であり、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系による陽性率は、７４．２％であり、ＣＡ１２５又はＣＡ５４６の陽性率と比較して高率に卵巣癌を検出することが可能であった。更に、β３Ｇａｌ−Ｔ５検出系及び／又はＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系が陽性であった検体は、９６．８％であり、β３Ｇａｌ−Ｔ５検出系及びＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系の免疫学的分析方法を組み合わせることによって、初期の卵巣癌患者を、高率に検出することが可能であった。
更に、卵巣癌の組織型に分類した場合、β３Ｇａｌ−Ｔ５検出系の免疫学的分析方法によれば、粘液性卵巣癌で１００％、類内膜性卵巣癌で８４．６％、そして明細胞性卵巣癌で８７．５％の陽性率を示した。これらの陽性率は、ＣＡ１２５又はＣＡ５４６の陽性率より高く、特には、β３Ｇａｌ−Ｔ５検出系の免疫学的分析方法は、化学療法に対して難治性（抵抗性）である粘液性卵巣癌及び明細胞性卵巣癌を高率に検出することが可能であった。
また、類内膜性卵巣癌及び明細胞性卵巣癌においては、β３Ｇａｌ−Ｔ５検出系の免疫学的分析方法及びＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系の免疫学的分析方法を組み合わせることによって、陽性率は、それぞれ１００％及び９３．８％となり、高率にこれらの組織型の卵巣癌を検出することが可能であった。
実施例４及び５、並びに比較例１及び２の陽性率を、卵巣癌の病期別、又は組織型により分類して解析した。結果を表１に示す。
病期Ｉ及びIIの初期の卵巣癌において、β３Ｇａｌ−Ｔ５検出系による陽性率は、８７．１％であり、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系による陽性率は、７４．２％であり、ＣＡ１２５又はＣＡ５４６の陽性率と比較して高率に卵巣癌を検出することが可能であった。更に、β３Ｇａｌ−Ｔ５検出系及び／又はＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系が陽性であった検体は、９６．８％であり、β３Ｇａｌ−Ｔ５検出系及びＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系の免疫学的分析方法を組み合わせることによって、初期の卵巣癌患者を、高率に検出することが可能であった。
更に、卵巣癌の組織型に分類した場合、β３Ｇａｌ−Ｔ５検出系の免疫学的分析方法によれば、粘液性卵巣癌で１００％、類内膜性卵巣癌で８４．６％、そして明細胞性卵巣癌で８７．５％の陽性率を示した。これらの陽性率は、ＣＡ１２５又はＣＡ５４６の陽性率より高く、特には、β３Ｇａｌ−Ｔ５検出系の免疫学的分析方法は、化学療法に対して難治性（抵抗性）である粘液性卵巣癌及び明細胞性卵巣癌を高率に検出することが可能であった。
また、類内膜性卵巣癌及び明細胞性卵巣癌においては、β３Ｇａｌ−Ｔ５検出系の免疫学的分析方法及びＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系の免疫学的分析方法を組み合わせることによって、陽性率は、それぞれ１００％及び９３．８％となり、高率にこれらの組織型の卵巣癌を検出することが可能であった。
《実施例７：子宮体癌患者の血清中のβ３Ｇａｌ−Ｔ５検出系による測定》
子宮体癌患者３０症例及び健常成人女性４０検体の血清中のβ３Ｇａｌ−Ｔ５検出系による測定を行った。子宮体癌患者のうち、２６人は、手術によりＩ期〜III期の病期診断を受けた患者の血清を用いた。これらの子宮体癌患者は、１例については子宮頸癌を併発していたが、その他の２９症例は、子宮体癌以外の癌の発生は確認されなかった。
標準物質の変性大腸菌β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質の代わりに、子宮体癌患者及び健常人の血清をＰＢＳ−Ｔで１０倍希釈して加えたことを除いては、実施例４の（Ｃ）の工程を繰り返した。図５（Ａ）の検量線から血清中のβ３Ｇａｌ−Ｔ５の値を決定した。子宮体癌患者３０症例の結果を表２に示す。陽性の判定は、健常成人女性の平均＋ＳＤの値を、カットオフ値として判定した。なお、健常人女性の平均は２．１ｎｇ／ｍＬであり、カットオフ値は５．４ｎｇ／ｍＬである。３０例のうち、１８例（６０％）が陽性であった。
子宮体癌患者３０症例及び健常成人女性４０検体の血清中のβ３Ｇａｌ−Ｔ５検出系による測定を行った。子宮体癌患者のうち、２６人は、手術によりＩ期〜III期の病期診断を受けた患者の血清を用いた。これらの子宮体癌患者は、１例については子宮頸癌を併発していたが、その他の２９症例は、子宮体癌以外の癌の発生は確認されなかった。
標準物質の変性大腸菌β３Ｇａｌ−Ｔ５タンパク質の代わりに、子宮体癌患者及び健常人の血清をＰＢＳ−Ｔで１０倍希釈して加えたことを除いては、実施例４の（Ｃ）の工程を繰り返した。図５（Ａ）の検量線から血清中のβ３Ｇａｌ−Ｔ５の値を決定した。子宮体癌患者３０症例の結果を表２に示す。陽性の判定は、健常成人女性の平均＋ＳＤの値を、カットオフ値として判定した。なお、健常人女性の平均は２．１ｎｇ／ｍＬであり、カットオフ値は５．４ｎｇ／ｍＬである。３０例のうち、１８例（６０％）が陽性であった。
《実施例８：子宮体癌患者の血清中のＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系による測定》
実施例７において測定した子宮体癌患者３０症例及び健常成人女性４０検体の血清についてＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系による測定を行った。
標準物質の大腸菌ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質の代わりに、患者血清をＰＢＳ−Ｔで１０倍希釈して加えたことを除いては、実施例４の（Ｄ）の工程を繰り返した。図５（Ｂ）の検量線から血清中のＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の値を決定した。子宮体癌患者３０症例の結果を表２に示す。陽性の判定は、健常成人女性の平均＋２ＳＤの値を、カットオフ値として判定した。なお、健常人女性の平均は２．０ｎｇ／ｍＬであり、カットオフ値は７．８ｎｇ／ｍＬである。３０例のうち１０例（３３％）が陽性であった。
実施例７において測定した子宮体癌患者３０症例及び健常成人女性４０検体の血清についてＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系による測定を行った。
標準物質の大腸菌ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２タンパク質の代わりに、患者血清をＰＢＳ−Ｔで１０倍希釈して加えたことを除いては、実施例４の（Ｄ）の工程を繰り返した。図５（Ｂ）の検量線から血清中のＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２の値を決定した。子宮体癌患者３０症例の結果を表２に示す。陽性の判定は、健常成人女性の平均＋２ＳＤの値を、カットオフ値として判定した。なお、健常人女性の平均は２．０ｎｇ／ｍＬであり、カットオフ値は７．８ｎｇ／ｍＬである。３０例のうち１０例（３３％）が陽性であった。
《比較例３》
実施例７において測定した子宮体癌患者３０症例のうちの９症例の血清について、従来の子宮体癌のマーカーであるＣＡ１２５の測定を行った。
ＣＡ１２５の測定は、エクルーシス試薬ＣＡ１２５ＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）のキットを用い、添付のプロトコールに従い、測定した。測定値３５Ｕ／ｍＬ以上が、陽性判定である。結果を表２に示す。１３例のうち５例（３８．５％）が陽性であった。
実施例７において測定した子宮体癌患者３０症例のうちの９症例の血清について、従来の子宮体癌のマーカーであるＣＡ１２５の測定を行った。
ＣＡ１２５の測定は、エクルーシス試薬ＣＡ１２５ＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）のキットを用い、添付のプロトコールに従い、測定した。測定値３５Ｕ／ｍＬ以上が、陽性判定である。結果を表２に示す。１３例のうち５例（３８．５％）が陽性であった。
《比較例４》
実施例７において測定した子宮体癌患者３０症例のうちの１９症例の血清について、従来の子宮体癌のマーカーであるＣＡ６０２の測定を行った。
ＣＡ６０２の測定は、プレートカイノスＣＡ６０２試薬（株式会社カイノス）のキットを用い、添付のプロトコールに従い、測定した。測定値６３Ｕ／ｍＬ以上の検体が、陽性判定である。結果を表２に示す。１９例のうち５例（２６．３％）が陽性であった。
実施例７において測定した子宮体癌患者３０症例のうちの１９症例の血清について、従来の子宮体癌のマーカーであるＣＡ６０２の測定を行った。
ＣＡ６０２の測定は、プレートカイノスＣＡ６０２試薬（株式会社カイノス）のキットを用い、添付のプロトコールに従い、測定した。測定値６３Ｕ／ｍＬ以上の検体が、陽性判定である。結果を表２に示す。１９例のうち５例（２６．３％）が陽性であった。
《比較例５》
実施例７において測定した子宮体癌患者３０症例のうちの２３症例の血清について、すい臓癌のマーカー及び子宮体癌のマーカーであるＣＡ１９−９の測定を行った
ＣＡ１９−９の測定は、エクルーシス試薬ＣＡ１９−９ ＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）のキットを用い、添付のプロトコールに従い、測定した。測定値３７Ｕ／ｍＬ以上の検体が、陽性判定である。結果を表２に示す。２４例のうち、４例（１６．７％）が陽性であった。
実施例７において測定した子宮体癌患者３０症例のうちの２３症例の血清について、すい臓癌のマーカー及び子宮体癌のマーカーであるＣＡ１９−９の測定を行った
ＣＡ１９−９の測定は、エクルーシス試薬ＣＡ１９−９ ＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）のキットを用い、添付のプロトコールに従い、測定した。測定値３７Ｕ／ｍＬ以上の検体が、陽性判定である。結果を表２に示す。２４例のうち、４例（１６．７％）が陽性であった。
２）：ＮＴ：not tested
３）：gradeは組織分化度を示し、具体的は子宮体癌の悪性度を表す。Ｇ１（grade 1）は高分化型を指し、組織学的に正常な腺構造に近い形態を示すタイプであり、一方、Ｇ３（grade 3）は低分化型を指し、無秩序な増殖をするタイプである。
《解析例２》
前記の表２の結果を、それぞれのマーカーごとの陽性率として表３に纏めた。
前記の表２の結果を、それぞれのマーカーごとの陽性率として表３に纏めた。
従来、子宮体癌の腫瘍マーカーとして用いられていた、ＣＡ６０２、ＣＡ１２５及びＣＡ１９−９の陽性率は、それぞれ２６．３％、３８．５％、及び１６．７％の陽性率であった。これに対し、β３Ｇａｌ−Ｔ５検出系による陽性率は、６０％であり高い陽性率を示した。また、ＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系による陽性率は、３３．３％であり、ＣＡ６０２及びＣＡ１９−９より高いが、ＣＡ１２５よりは低かった。しかしながら、表２の検体番号１、２、及び１２のように従来のマーカーでは、検出することのできない子宮体癌の患者を検出することのできるものであり、有用であることが示された。更に、β３Ｇａｌ−Ｔ５検出系及び／又はＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系が陽性であった検体は、７０％であり、β３Ｇａｌ−Ｔ５検出系及びＧｌｃＮＡｃ６ＳＴ−２検出系の免疫学的分析方法を組み合わせることによって、子宮体癌患者を、高率に検出することが可能であった。
《実施例９》
子宮体癌患者６症例の血清についてβ３Ｇａｌ−Ｔ５検出系による測定を行った。本実施例の６症例及び実施例７で測定を行った３０症例について、病期I期と病期II〜IV期とに分類し、陽性率を表４に纏めた。
子宮体癌患者６症例の血清についてβ３Ｇａｌ−Ｔ５検出系による測定を行った。本実施例の６症例及び実施例７で測定を行った３０症例について、病期I期と病期II〜IV期とに分類し、陽性率を表４に纏めた。
本発明の卵巣癌の検出方法及び卵巣癌の検出キットは、婦人科癌、特には卵巣癌患者又は子宮体癌を高率に検出することが可能である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (14)
- β１−３ガラクトース転移酵素−５及び／又はβ１−３ガラクトース転移酵素−４を分析することを特徴とする、卵巣癌の検出方法。
- 血液、血清、又は血漿中のβ１−３ガラクトース転移酵素−５及び／又はβ１−３ガラクトース転移酵素−４を分析することを特徴とする、子宮体癌の検出方法。
- 血液、血清、又は血漿中のＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２を分析することを特徴とする、卵巣癌の検出方法。
- Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２を分析することを特徴とする、子宮体癌の検出方法。
- β１−３ガラクトース転移酵素−５及び／又はβ１−３ガラクトース転移酵素−４、並びにＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２を分析することを特徴とする、卵巣癌の検出方法。
- β１−３ガラクトース転移酵素−５及び／又はβ１−３ガラクトース転移酵素−４、並びにＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２を分析することを特徴とする、子宮体癌の検出方法。
- β１−３ガラクトース転移酵素−５及びβ１−３ガラクトース転移酵素−４に特異的に結合する抗体を用いることを特徴とする、請求項１〜２及び５〜６のいずれか一項に記載の検出方法。
- Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２に特異的に結合する抗体を用いることを特徴とする、請求項３〜６のいずれか一項に記載の検出方法。
- β１−３ガラクトース転移酵素−５及びβ１−３ガラクトース転移酵素−４に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、卵巣癌の検出用キット。
- β１−３ガラクトース転移酵素−５及びβ１−３ガラクトース転移酵素−４に特異的に結合する抗体又はその断片を含み、血液、血清、又は血漿中のβ１−３ガラクトース転移酵素−５及び／又はβ１−３ガラクトース転移酵素−４を分析することを特徴とする、子宮体癌の検出用キット。
- Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２に特異的に結合する抗体又はその断片を含み、血液、血清、又は血漿中のＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２を分析することを特徴とする、卵巣癌の検出用キット。
- Ｎ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、子宮体癌の検出用キット。
- β１−３ガラクトース転移酵素−５及びβ１−３ガラクトース転移酵素−４に特異的に結合する抗体又はその断片、並びにＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、卵巣癌の検出用キット。
- β１−３ガラクトース転移酵素−５及びβ１−３ガラクトース転移酵素−４に特異的に結合する抗体又はその断片、並びにＮ−アセチルグルコサミン６−Ｏ−硫酸転移酵素−２に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことを特徴とする、子宮体癌の検出用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2009530083A JP5345059B2 (ja) | 2007-08-24 | 2008-08-22 | 婦人科癌の検出方法 |
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007219046 | 2007-08-24 | ||
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