WO2011145622A1

WO2011145622A1 - 胃癌の検出方法

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Publication number: WO2011145622A1
Application number: PCT/JP2011/061330
Authority: WO
Inventors: 克子山下; 慶子福島; 昌彦渡邊; 継史山下
Original assignee: 国立大学法人東京工業大学; 学校法人北里研究所
Priority date: 2010-05-17
Filing date: 2011-05-17
Publication date: 2011-11-24
Also published as: JPWO2011145622A1; US20130130276A1; EP2573567A4; EP2573567A1

Abstract

　本発明の課題は、胃癌の検出方法及び検出用キットを提供することにある。　本発明の課題は、β１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素１を分析することを特徴とする胃癌の検出方法によって解決できる。本発明の検出方法により、自覚症状の見られない、胃癌の早期癌において、高率に胃癌患者を検出することが可能である。

Description

胃癌の検出方法

　本発明は、生体由来の液体試料中のβ１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素１を分析することを特徴とする胃癌の検出方法に関する。なお、本明細書における前記「分析」には、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。

　胃癌は、日本、韓国、及び中国などのアジア、並びに南米における患者数の多い癌であり、日本においては、長い間、部位別の癌による死亡率では、第一位であった。胃癌の罹患率と死亡率は、女性より男性の方が高く、その死亡率は年々減少してきている。しかしながら、２００６年における死亡数は約５万人であり、部位別の死亡率としても、男性では肺癌に次いで多く１７％、女性では胃癌が最も多く１３％を占めており、依然として癌全体の死亡率に占める割合は高い。

　胃癌は、胃壁の最も内側にある粘膜内の細胞が癌化するものであり、進行すると癌細胞は胃壁や外側の漿膜に浸潤し、更にはリンパ節や他の臓器への転移も見られる。胃癌の進行度は、癌が胃壁にどの程度浸潤しているかを示す深達度、リンパ節への転移、及び他の臓器への転移などによって決定され、Ｉ期（ＩＡ、ＩＢ）、ＩＩ期、ＩＩＩ期（ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ）、及びＩＶ期の４つの臨床病期（ステージ）に分類される。また、癌の深さが粘膜下層までのものを「早期胃癌」、深さが粘膜下層を超えて固有筋層より深くに及ぶものを「進行胃癌」と呼ぶことがある。

　胃癌の主な治療方法には、手術療法、内視鏡的治療、化学療法、及び放射線療法があり、前記の臨床病期（ステージ）によって、これらの治療方法を単独又は組み合わせて行われる。これらの治療方法のうち、手術療法が最も有効で標準的な治療法であり、胃の切除、及び決まった範囲の周囲のリンパ節の切除（リンパ節郭清）を行う。胃癌は、早期に発見され手術療法が行われれば予後の良い癌であり、例えば、「全国がん（成人病）センター協議会加盟施設における５年生存率（１９９７～２０００年診断例）」によれば、臨床病期Ｉ期の５年生存率は９５％を超えている。また、臨床病期ＩＶでも、手術療法によりすべての癌巣を切除することができれば、治癒させることが可能である。

　胃癌は、早期胃癌の段階では無症状のことが多く、自覚症状による早期発見は困難である。また、胃癌で最初に出現する症状は、上腹部の不快感、膨満感などであることが多く、これらの症状は慢性胃炎、胃潰瘍、又は十二指腸潰瘍でも認められるため、発見が遅れることが多い。従って、胃癌を早期に発見するためには、定期的な胃癌検診により発見することが重要である。

　胃癌の検査方法としては、胃Ｘ線検査、胃内視鏡検査、ペプシノーゲン検査、及びヘリコバクターピロリ抗体検査があるが、胃癌検診の方法として胃癌の発見に効果があると考えられているものは、胃Ｘ線検査である。しかしながら、硫酸バリウムの飲用、及びＸ線の照射を行う必要があり、検診者の負担となっている。また、胃Ｘ線検査による胃癌の発見時には、比較的進行していることも多い。

　以上のような状況から、患者の負担が少なく、胃癌検診等で行うことが可能で、早期胃癌を発見することのできる胃癌の検査方法の開発が望まれており、特に、血液を用いて胃癌を診断することのできる胃癌マーカーの開発が期待されていた。しかしながら、現在、胃癌において血液を用いて胃癌患者を検出することのできる腫瘍マーカーとしては、ＣＥＡ及びＣＡ１９－９などがあるが、いずれも胃癌患者に特異的なものではなく、ＩＩＩ期以降の臨床病期で検出率が上昇するものであり、早期癌においては検出率は１０％以下であり、胃癌の発見においては満足できるものではなく、胃癌検診での有用性は認められていない。

土肥多恵子他「蛋白質・核酸・酵素」１９９２年（日本）第３７巻、ｐ．１８６８～１８７２「バイオケミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ）」２００２年、（オランダ）第１５７３巻、ｐ．３５６－３６２

　本発明者らは、胃癌患者を早期に発見することのできる検出マーカーを探索するため様々な細胞内のタンパク質について胃癌マーカーとしての可能性を鋭意研究した。その結果、驚くべきことに、β１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素１（以下、β４ＧＡＬＮＴ１と称することがある）が、胃癌患者の血液中のほぼ全例において、検出されることを見出した。
　本発明はこのような知見に基づくものである。従って、本発明の課題は、胃癌患者の検出方法及び検出用キットを提供することにある。

　なお、非特許文献１には、酸性糖脂質であるＧＭ２、及びＧＭ２を合成するＧＭ２合成酵素活性が、正常な胃底腺粘膜の組織と比較すると、胃癌の組織において上昇していることが開示されている。前記ＧＭ２合成活性酵素は、β１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素ファミリーのうちのβ４ＧＡＬＮＴ１であることが明らかにされている（非特許文献２）。しかしながら、非特許文献１によると、ＧＭ２は、胃を含む多くの正常な組織、例えば食道、胃（胃底腺領域、及び幽門腺領域）、十二指腸、空腸、回腸、横行結腸、肝臓、肺、副腎、膀胱、前立腺、睾丸、心臓、脳、筋肉、皮膚にも発現していることが開示されており、特に、副腎、脳、及び筋肉では、胃癌の組織と同等、又はそれ以上の量のＧＭ２が発現している。すなわち、ＧＭ２を合成するＧＭ２合成活性は、胃癌の組織に特異的に発現するものではなく、正常な組織にも発現しているβ４ＧＡＬＮＴ１による糖転移酵素活性であると考えられる。
　非特許文献１の開示は、β４ＧＡＬＮＴ１が、胃癌組織において、発現していることを示しているのみである。ここで、β４ＧＡＬＮＴ１（ＧＭ２合成活性）などの糖転移酵素は、細胞内において翻訳されるタンパク質に糖鎖を付加する酵素であり、通常、細胞外に分泌されるものではない。従って、この技術常識を考慮すると、引用文献１の開示から、β４ＧＡＬＮＴ１が血液中に分泌されていることは予想することはできない。加えて、β４ＧＡＬＮＴ１が、仮に血液に分泌されると仮定すると、正常人における多くの正常な組織、特に、副腎、脳、及び筋肉においても大量のβ４ＧＡＬＮＴ１が発現しており、これらの組織から血液中にβ４ＧＡＬＮＴ１が分泌される。この場合、正常人の血液中のβ４ＧＡＬＮＴ１と胃癌患者の血液のβ４ＧＡＬＮＴ１とを鑑別することができない。
　従って、後述の実施例において示すように、血液中のβ４ＧＡＬＮＴ１を測定することによって、胃癌患者と正常人をほとんど完全に鑑別できることは、当業者にとって驚くべきことである。

　本発明は、生体由来の液体試料中のβ１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素１を分析することを特徴とする胃癌の検出方法に関する。
　本発明の検出方法の好ましい態様においては、前記分析が、β１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合部位を含む抗体フラグメントと、被検試料とを接触させる工程；及び
β１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素１と前記抗体又はその抗原結合部位を含む抗体フラグメントとの結合体を検出する工程；
を含む免疫学的分析方法である。
　また、本発明の検出方法の好ましい態様においては、前記液体試料が、血液、血漿、血清、尿、唾液、汗、及び髄液からなる群から選択される少なくとも１つの液体試料であるも関する。
　本発明は、β１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素１に結合する抗体又はその抗原結合部位を含む抗体フラグメントを含むことを特徴とする、胃癌の検出用キットに関する。
　更に、本発明は、β１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素１の基質として、ＧＭ３を含むことを特徴とする、胃癌の検出用キットに関する。
　なお、本明細書は、前記β４ＧＡＬＮＴ１に特異的に結合する抗体、その抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はその組み合わせの胃癌の検出用キットへの使用に関する発明を開示する。また、本明細書は、前記β４ＧＡＬＮＴ１に特異的に結合する抗体、その抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はその組み合わせの胃癌の検出用キットの製造への使用に関する発明を開示する。更に、ＧＭ３の胃癌の検出用キットへの使用に関する発明、及びＧＭ３の胃癌の検出用キットの製造への使用に関する発明を開示する。

　現在、胃癌検診においては、胃Ｘ線検査が広く行われているが、硫酸バリウムの飲用、及びＸ線の照射を行う必要があり、検診者の負担となっている。また、胃癌の発見時には、比較的進行していることも多い。本発明の検出方法によれば、血液検査により、胃癌を検出することが可能であり、患者に過度の負担を与えることなく、胃癌患者を高率に発見することができる。
　また、本発明の検出方法によれば、従来血液を用いて胃癌患者を検出することのできる腫瘍マーカーとして用いられていたＣＥＡ及びＣＡ１９－９と比較して、高率に胃癌患者を検出することが可能である。具体的には、ＣＥＡ及びＣＡ１９－９の胃癌患者の検出率は、１０％以下であるが、本発明の検出方法によれば、ほぼ１００％検出することが可能である。
　また、本発明の検出方法は、手術後の再発のモニタリング、放射線療法及び化学療法の治療効果のモニタリングに用いることも可能である。

β４ＧＡＬＮＴ１に対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清の特異性を、β４ＧＡＬＮＴ１（レーン１）、β４ＧＡＬＮＴ２（レーン２）、β４ＧＡＬＮＴ３（レーン３）、β４ＧＡＬＮＴ４（レーン４）に対する免疫沈降により確認した写真である。Ａ：β４ＧＡＬＮＴ１に対するモノクローナル抗体を用いた、それぞれのタンパク質に対する免疫沈降を示す。Ｂ：β４ＧＡＬＮＴ１に対するポリクローナル抗血清を用いた、それぞれのタンパク質に対する免疫沈降を示す。 β４ＧＡＬＮＴ１に対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗血清を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるβ４ＧＡＬＮＴ１の検量線を示す。胃癌患者、正常人、及びその他の癌患者（前立腺癌患者、卵巣癌患者、膵臓癌患者、十二指腸癌患者、食道癌患者）におけるβ４ＧＡＬＮＴ１の検出を示した図である。ＲＵ値は変性β４ＧＡＬＮＴ１の１ｎｇ／ｍＬに相当するシグナルを１ＲＵとした。

［１］胃癌の検出方法
　胃癌は、胃壁の粘膜内の細胞にできる癌であり、その進行度によって、Ｉ期（ＩＡ、ＩＢ）、ＩＩ期、ＩＩＩ期（ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ）、及びＩＶ期の臨床病期（ステージ）に分類することができる。日本胃癌学会の胃癌治療ガイドラインでは、前記の臨床病期によって、内視鏡的粘膜切除（ＥＭＲ）、縮小手術（Ａ，Ｂ）、定型切除、又は拡大手術などの外科的療法の一般的な適用を定めている。

　胃癌は、胃癌検診等で早期に発見し、手術による外科療法を行えば、早期であるほど治療効果が高くなり、例えば、ＩＡ期では８７％、ＩＢ期では９３．４％、ＩＩ期では６８．３％、ＩＩＩＡ期では５０．１％、ＩＩＩＢ期では３０．８％、ＩＶ期でも１６．６％の５年生存率が得られる。

［１－１］β４ＧＡＬＮＴ１の分析
　本発明の検出方法では、β４ＧＡＬＮＴ１を分析することにより、胃癌を検出する。β４ＧＡＬＮＴ１は、β１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素ファミリーに属し、ＧＭ_３を基質とし、Ｎ－アセチルガラクトサミンをシアル酸が付加されているガラクトースにβ１→４結合で転移させる酵素である。健常者では、食道、胃（胃底腺領域、及び幽門腺領域）、十二指腸、空腸、回腸、横行結腸、肝臓、肺、副腎、膀胱、前立腺、睾丸、心臓、脳、筋肉、及び皮膚に発現しており、特に、副腎、脳、及び筋肉に高発現している。

　本発明の検出方法において、β４ＧＡＬＮＴ１を分析する方法としては、β４ＧＡＬＮＴ１を定量的又は半定量的に決定することができるか、あるいは、β４ＧＡＬＮＴ１の存在の有無を判定することができる限り、特に限定されるものではなく、例えば、抗β４ＧＡＬＮＴ１抗体又はその断片を用いる免疫学的手法（例えば、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロット等）、生化学的手法（例えば、酵素学的測定法）、又はｍＲＮＡ量を測定する分子生物学的手法などを挙げることができる。また、本発明の検出方法は、生体由来の被検試料をインビトロにおいて、β４ＧＡＬＮＴ１を分析する方法であり、β４ＧＡＬＮＴ１の全長のタンパク質を測定してもよく、又はβ４ＧＡＬＮＴ１のペプチド断片を測定してもよい。

　β４ＧＡＬＮＴ１の分析方法として、免疫学的分析方法を用いる場合には、β４ＧＡＬＮＴ１に対するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体を用いることができる。モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体は、免疫抗原としてβ４ＧＡＬＮＴ１を用いること以外は、公知の方法によって作製することが可能であり、例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５－４９７，１９７５）に従って、作成することができる。また、ポリクローナル抗体は、例えば、ウサギの皮内に、β４ＧＡＬＮＴ１のタンパク質を単独もしくはＢＳＡ、ＫＬＨなどと結合させた抗原として、フロイント完全アジュバント等のアジュバントと混合して定期的に免疫する。血中の抗体価が上昇した時点で採血し、そのまま抗血清として、又は抗体を公知の方法で精製して使用することができる。
　β４ＧＡＬＮＴ１の分析方法として、酵素学的測定法を用いる場合は、例えば、Ｙａｍａｓｈｉｒｏら〔Yamashiro et al., J. Biol. Chem., 270, 6149-6155（1995）〕の方法に従って、β４ＧＡＬＮＴ１活性を測定することにより、β４ＧＡＬＮＴ１の量又は存在の有無を分析することが可能である。

　モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を取得するために用いることのできる免疫抗原は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の全部又は一部のペプチドを免疫抗原として用いることができる。具体的には、生体試料から精製した抗原、遺伝子工学的に作成した組換え抗原、又は化学的に合成した部分ペプチドなどを用いることが可能である。大腸菌や酵母などで発現させる組換え抗原を用いる場合は、発現を容易にするため、他のタンパク質、例えば、ＳＯＤやＴｒｐＥとの融合抗原とすることも可能である。また、精製を容易にするため、Ｈｉｓ－Ｔａｇなどを結合させて発現させることもできる。また、β４ＧＡＬＮＴ１の細胞質内領域及び膜貫通領域を除いて、発現させることが好ましく、例えば、前記配列番号１１で表されるアミノ酸配列の６５番から５３３番のアミノ酸からなるペプチドを組換え抗原として発現させることが好ましい。

　本発明の胃癌の検出方法に用いることのできるβ４ＧＡＬＮＴ１に結合する抗体は、少なくともβ４ＧＡＬＮＴ１に結合する抗体であれば、限定されず、その他のβ１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素、例えばβ４ＧＡＬＮＴ２、β４ＧＡＬＮＴ３、又はβ４ＧＡＬＮＴ４に結合する抗体でもよいが、好ましくは、β４ＧＡＬＮＴ１に特異的に結合する抗体である。

　本発明の胃癌の検出方法において、前記分析は、好ましくはβ１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合部位を含む抗体フラグメントと、被検試料とを接触させる工程；及びβ１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素１と前記抗体又はその抗原結合部位を含む抗体フラグメントとの結合体を検出する工程；を含む免疫学的分析方法である。この免疫学的分析法は、酵素免疫測定法、ラテックス凝集免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、放射免疫測定法、免疫沈降法、免疫組織染色法、又はウエスタンブロット等を含む。以下に、免疫学的分析方法の例として、サンドイッチ法を説明する。

［１－２］サンドイッチ法
　免疫学的分析方法として、酵素免疫測定方法、化学発光免疫測定法、又は放射免疫測定法を用いる場合には、以下のサンドイッチ法により行うことが可能である。
（ｉ）一次反応工程
　マイクロプレート又はビーズなどの不溶性担体に、β４ＧＡＬＮＴ１に結合する抗体（捕捉抗体、一次抗体）を固相化する。次に、捕捉抗体や不溶性担体への非特異的な吸着を防ぐために、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）で不溶性担体のブロッキングを行う。捕捉抗体（一次抗体）が固相化された不溶性担体（プレート又はビーズ）に、β４ＧＡＬＮＴ１が含まれる可能性のある被検試料を一次反応液と一緒に加え、捕捉抗体（一次抗体）とβ４ＧＡＬＮＴ１を接触させ、そして結合させる。この後、捕捉抗体（一次抗体）に結合しなかった抗原や夾雑物を適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含むリン酸緩衝液）で洗浄する。
（ii）二次反応工程
　β４ＧＡＬＮＴ１と結合する抗体に西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素を標識した標識抗体（二次抗体）を添加し、捕捉されたβ４ＧＡＬＮＴ１に標識抗体を結合させる（二次反応工程）。この反応により、捕捉抗体－β４ＧＡＬＮＴ１－標識抗体の免疫複合体が不溶性担体（マイクロプレート又はビーズ）上に形成される。
（iii）検出工程
　不溶性担体（マイクロプレート又はビーズ等）を洗浄液で洗浄し、標識抗体の酵素に対する発色基質や発光基質を添加し、酵素と基質を反応させることによりシグナルを検出する。また、二次抗体を直接標識せずに、二次抗体に結合する抗体を標識しシグナルを検出することも可能である。

　抗体を標識する酵素としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼなどを挙げることができる。また酵素以外にも、標識物質として、アクリジニウム誘導体などの発光物質、ユーロピウムなどの蛍光物質、Ｉ^１２５などの放射性物質などを使用することができる。また、標識物質に合わせて基質や発光誘導物質を適宜選択することができる。更に、本発明における標識抗体は、検出マーカーとしてハプテンや低分子量のペプチド、レクチンなどの抗原抗体反応のシグナルの検出に利用できる物質を結合させた抗体も含むことができる。

　サンドイッチ法に用いる抗体は、一次抗体又は二次抗体のいずれか一方が、分析するタンパク質に特異的に結合する抗体であれば、もう一方の抗体は、分析するタンパク質以外のタンパク質と結合する（交差反応を有する）ことのできる抗体でもよい。すなわち、β４ＧＡＬＮＴ１を分析する場合、一次抗体又は二次抗体のいずれか一方が、β４ＧＡＬＮＴ１特異的に結合する抗体であれば、もう一方の抗体はβ４ＧＡＬＮＴ２、３、又は４を認識する抗体（β４ＧＡＬＮＴ２、３、又は４と交差反応を有する抗体）であってもよい。

　前記のサンドイッチ法に用いる一次抗体又は二次抗体は、特に限定されないが、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、又はそれらの抗体の抗原結合部位を有する抗体フラグメントなどを挙げることができる。抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、又はＦｖ等を挙げることができる。これらの抗体フラグメントは、例えば、抗体を常法によりタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化し、続いて、常法のタンパク質の分離精製の方法により精製することにより、得ることができる。

［１－３］被検試料
　本発明の胃癌の検出方法において、β４ＧＡＬＮＴ１の分析に用いる被検試料としては、胃癌の疑いのある患者の被検試料であり、胃癌検診を受けた正常者の被検試料も含まれる。より具体的には、β４ＧＡＬＮＴ１を含有する可能性のある生体由来の液体試料であり、例えば、尿、血液、血清、血漿、リンパ液、組織液、髄液、唾液、尿、汗等を挙げることができ、血液、血清、又は血漿（以下、血液等と称することがある）が好ましい。後述の実施例で示したように、健常者の血液、血清、又は血漿中には、β４ＧＡＬＮＴ１は、ほとんど存在しない。一方、胃癌患者においては、病期の初期から血液中に放出されるために、胃癌を検出するための被検試料として適当であるからである。これらの被検試料は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、本発明の胃癌の検出方法に用いられる。

　本発明の検出方法では、β４ＧＡＬＮＴ１の存在の有無、あるいはβ４ＧＡＬＮＴ１の量を測定することにより、胃癌を検出することが可能である。例えば、被検試料として血液等を用いる場合、胃癌の疑いのある患者から血液を採取し、全血のままか、あるいは血清又は血漿とし、その中のβ４ＧＡＬＮＴ１の量を測定し、健常者から採取した血液等中のβ４ＧＡＬＮＴ１の量と比較することにより、前記患者が胃癌であるか否かを判定することができる。より具体的には、健常者のβ４ＧＡＬＮＴ１の量と比べて、前記患者のβ４ＧＡＬＮＴ１の量が有意に多い場合に前記患者は胃癌であると判定することができる。
　例えば、後述のサンドイッチ法によるＥＬＩＳＡの場合、β４ＧＡＬＮＴ１が検出されない健常者の平均値を求め、標準偏差（ＳＤ）を求める。胃癌患者の検出のためのカットオフ値は、それぞれの癌を検出することのできる値であれば、限定されない。例えば、健常者の平均値を超える被検試料を陽性と判定することも可能であるし、平均値±ＳＤ、平均値±２ＳＤ、又は平均値±３ＳＤをカットオフ値とすることもできる。また、カットオフ値は、制御された臨床試験により決定されることが好ましい。

　本発明の検出方法により、胃癌患者を検出する場合、胃癌を特異的に検出することが最も望ましい。しかしながら、例えば、胃癌検診において、血液検査により胃癌の早期診断を行う場合、胃癌患者を一次スクリーニングすることのできるマーカーであることが好ましく、すなわち、胃癌患者のうちのできるだけ多くの患者を検出することのできるマーカーであることが好ましい。本発明の検出方法は、後述の実施例で示すように、手術によって胃癌であることが確認された胃癌患者（他の癌を併発しているものは含まれていない）を全例検出することが可能であり、癌マーカーとしての有用性を備えている。

　本発明の胃癌の検出方法は、胃癌の診断方法として、用いることができ、健康診断などにおいて、胃癌の早期発見に有効である。

［２］胃癌の検出用キット
　本発明の胃癌の検出用キットは、β４ＧＡＬＮＴ１に特異的に結合する抗体、その抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はその組み合わせを含む。前記抗体としては、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれを用いることもできる。前記抗体フラグメントとしては、β４ＧＡＬＮＴ１への特異的結合能を有する限り、特に限定されるものではなく、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、又はＦｖを用いることができる。
　なお、本明細書において、「β４ＧＡＬＮＴ１に特異的に結合する抗体」は、β４ＧＡＬＮＴ１に特異的に結合する抗体の抗原結合部位を有する抗体フラグメントを意味することがある。

　本発明の検出用キットは、用いる免疫学的手法に応じて、所望の形態でβ４ＧＡＬＮＴ１に特異的に結合する抗体、又はその抗原結合部位を有する抗体フラグメントを含むことができる。
　例えば、標識化抗体を用いる免疫学的手法、例えば、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光抗体法、又は放射免疫測定法などの場合には、標識物質で標識した標識化抗体又は標識化抗体断片の形態で含むことができる。標識物質の具体例としては、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼ等を、蛍光物質としてフルオレセインイソチアネート又は希土類金属キレート等を、放射性同位体として^３Ｈ、^１４Ｃ、又は^１２５Ｉ等を、その他、ビオチン、アビジン、又は化学発光物質等を挙げることができる。酵素又は化学発光物質等の場合には、それ自体単独では測定可能なシグナルをもたらすことはできないことから、それぞれ対応する適当な基質等を選択して含むことが好ましい。
　また、サンドイッチ法の検出用キットの場合、β４ＧＡＬＮＴ１に特異的に結合する抗体は、不溶性担体（マイクロプレート又はビーズ等）に固相化された状態で含むことができる。更に、本発明の胃癌の検出用キットは、β１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素１を標準物質として含むことができる。具体的には、生体試料から精製したβ４ＧＡＬＮＴ１、遺伝子工学的に作成した組換えβ４ＧＡＬＮＴ１、又は化学的に合成したβ４ＧＡＬＮＴ１の部分ペプチドを挙げることができる。

　本発明の検出用キットは、本発明のβ１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素１を分析することを特徴とする胃癌の検出方法に用いることができる。従って、キットには胃癌の検出用であることを明記した取り扱い説明書を含むことができる。包装容器に胃癌の検出用であることを明記することもできる。また、本発明の胃癌の検出用キットは、胃癌の診断に用いることができる。

　前記β４ＧＡＬＮＴ１に特異的に結合する抗体、その抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はその組み合わせは、胃癌の検出用キットに使用することができる。また、β４ＧＡＬＮＴ１に特異的に結合する抗体、その抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はその組み合わせは、胃癌の検出用キットの製造に使用することができる。更に、β４ＧＡＬＮＴ１に特異的に結合する抗体、その抗原結合部位を有する抗体フラグメント、又はその組み合わせは、胃癌の検出用試薬に含まれることもできる。

　本発明の胃癌の検出用キットが、酵素学的測定法を用いるキットの場合は、β４ＧＡＬＮＴ１の基質として、ＧＭ３を含む。すなわち、前記ＧＭ３は胃癌の検出用キットに使用することができ、また、ＧＭ３は胃癌の検出用キットの製造に使用することができる。

［３］β４ＧＡＬＮＴ１に特異的に結合する抗体、又はＧＭ３の使用
　β４ＧＡＬＮＴ１に特異的に結合する抗体は、胃癌の検出キットに使用することができ、特には、胃癌の検出用キットの製造のために使用することができる。β４ＧＡＬＮＴ１に特異的に結合する抗体は、本発明の胃癌の検出用キットに含まれる抗体を用いることができる。また、前記抗体を使用して製造される胃癌の検出用キットは、前記項目［２］に記載の胃癌の検出用キットである。

　ＧＭ３は、胃癌の検出キットに使用することができ、特には、胃癌の検出用キットの製造のために使用することができる。ＧＭ３は、本発明の胃癌の検出用キットに含まれるＧＭ３を用いることができる。また、前記ＧＭ３を使用して製造される胃癌の検出用キットは、前記項目［２］に記載の胃癌の検出用キットである。

　以下に実施例及び比較例を示し本発明の具体的な説明を行うが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《抗体製造例：抗β４ＧＡＬＮＴ１抗体の作製》
（Ａ）可溶性β４ＧＡＬＮＴ１タンパク質の調製（免疫用抗原の調製）
（Ａ－１）β４ＧＡＬＮＴ１発現ベクターの構築
　ヒト胃癌由来細胞株ＮＵＧＣ－４からトータルＲＮＡを精製し、ランダムプライマーを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。ＰＣＲにより、ＮＵＧＣ－４細胞由来ｃＤＮＡより、下記のForward primer for β4GALNT1及びReverse primer for β4GALNT1を用いて、細胞質及び膜貫通領域を欠如したペプチドをコードしたｃＤＮＡフラグメントを増幅した。得られたｃＤＮＡフラグメントは、β４ＧＡＬＮＴ１の６５番から５３３番のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするｃＤＮＡである。
Forward primer for β4GALNT1：5’-atagtcgacGTCAGGATCAAGGAGCAAGTA-3’（配列番号１）
Reverse primer for β4GALNT1：5’-atgaagcttCATCACTGGGAGGTCATGC-3’（配列番号２）
　配列中において、小文字で記載されている配列は、発現ベクターへ連結するための制限酵素サイトを含む配列である。得られたｃＤＮＡを、ｐＱＥ９ベクター（キアゲン社）のクローニングサイトにクローニングし、クローニングされたベクターにより大腸菌Ｍ１５を形質転換した。得られたプラスミドのヌクレオチド配列を、Prism 310 Genetic Analyzer（アプライド・バイオシステムズ社）で決定した。

（Ａ－２）β４ＧＡＬＮＴ１タンパク質の発現及び精製
　組換えβ４ＧＡＬＮＴ１タンパク質は、以下のように調製した。５００ｍＬのＬＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍＬ及びカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む）に、一晩培養した形質転換大腸菌Ｍ１５を、１／１００に希釈して加え、激しく撹拌しながら、３７℃で２時間培養した。培養液にイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと称する）を最終濃度１ｍＭで添加し、３７℃で４時間の間、発現を誘導した。遠心により、大腸菌を集菌し、２０ｍＬのＢｕｆｆｅｒＡ〔６Ｍ　ｇｕａｎｉｄｉｎｅ－ＨＣｌ、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、及び２０ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ〕中で、超音波で破砕した。得られたホモジネートは、２５℃で１６時間静置した。５，０００ｇで２０分遠心後に、上清を１ｍＬのＮｉ－ＮＴＡアガロース（キアゲン社）にアプライし、時々混合しながら、３０分置いた。樹脂をプラスチックのカラムに詰め２０ｍＬのＢｕｆｆｅｒＡで洗浄した。その後、組換えタンパク質は、０．２５Ｍのイミダゾールを含むｂｕｆｆｅｒＡで溶出した。溶出物を８Ｍ尿素－ＰＢＳに透析し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ　ＹＭ－３０（ミリポア社）で濃縮した。最終的に３．８ｍｇの組換えタンパク質を得た。得られたタンパク質を変性大腸菌β４ＧＡＬＮＴ１タンパク質と称した。

（Ｂ）非変性可溶性β４ＧＡＬＮＴ１タンパク質の調製（スクリーニング用抗原の調製）
　前記（Ａ－１）において作製した形質転換大腸菌Ｍ１５を用いて、非変性β４ＧＡＬＮＴ１タンパク質を調製した。４ＬのＬＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍＬ及びカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む）に、一晩培養した形質転換大腸菌Ｍ１５を、１／１００に希釈して加え、激しく撹拌しながら、３７℃で２時間培養した。培養液に最終濃度１ｍＭ　ＩＰＴＧを添加し、１５℃で１８時間の間、発現を誘導した。菌体を集菌し、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）（０．３Ｍ　ＮａＣｌ及び１０ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含む）２０ｍＬ中で超音波破砕した。得られたホモジネートに、５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を２ｍＬ添加し、混合物を氷中に３０分置いた。遠心後、上清にＮｉ－ＮＴＡアガロース０．５ｍＬを加え、混合物を時々混合しながら、３０分おいた。樹脂をプラスチックのカラムに詰め、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む５ｍＬのＢｕｆｆｅｒＢ（２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、０．３Ｍ　ＮａＣｌ及び２０ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で洗浄し、更に５ｍＬのｂｕｆｆｅｒ　Ｂで洗浄した。組換えタンパク質は、０．２５Ｍのイミダゾールを含むｂｕｆｆｅｒＢで溶出した。溶出物は、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ　ＹＭ－３０（ミリポア社）を用いて、ＰＢＳで洗浄し、濃縮した。０．７６ｍｇの得られたタンパク質の内、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる推定によると、組換えβ４ＧＡＬＮＴ１タンパク質はおよそ１０％の收率であった。この分画は、十分なβ４ＧＡＬＮＴ１活性を含んでいた。得られたタンパク質を非変性大腸菌β４ＧＡＬＮＴ１タンパク質と称する。

（Ｃ）モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の作製
　β４ＧＡＬＮＴ１に対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体は、株式会社医学生物学研究所において調製された。モノクローナル抗体は、以下のように調製した。４匹のマウスの足蹠に、前記変性大腸菌β４ＧＡＬＮＴ１タンパク質を、３日間おきに３回免疫した。定法に従い、マウス脾臓細胞をマウスミエローマと融合し、前記非変性β４ＧＡＬＮＴ１タンパク質を抗原として用いて、抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行った。非変性大腸菌β４ＧＡＬＮＴ１タンパク質に反応するモノクローナル抗体を産生する１株のハイブリドーマをクローニングした。定法に従い、５匹のマウスの腹腔内に、ハイブリドーマを接種し、２５ｍＬの腹水を得た。腹水１ｍＬから、Ｍｅｌｏｎ　ｇｅｌ（ピアス社）を用いて精製し、３．４ｍｇのβ４ＧＡＬＮＴ１モノクローナル抗体を得た。
　ポリクローナル抗体は、前記変性大腸菌β４ＧＡＬＮＴ１タンパク質を、ウサギに１週間毎に、６回免疫し、抗血清を取得した。血清１ｍＬから、Ｍｅｌｏｎ　ｇｅｌ（ピアス社）を用いて精製し、８．８ｍｇのβ４ＧＡＬＮＴ１ポリクローナル抗体を得た。

（Ｄ）モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の特異性の確認
　得られたモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のβ４ＧＡＬＮＴ１に対する特異性を確認するため、β４ＧＡＬＮＴ２、β４ＧＡＬＮＴ３、β４ＧＡＬＮＴ４との反応性を検討した。まず、各転移酵素の発現細胞を得るために、発現ベクターを構築した。β４ＧＡＬＮＴ１は、ＰＣＲによりプライマーとして下記のプライマーを使用して、ＮＵＧＣ－４細胞由来ｃＤＮＡからＰＣＲ産物を得た。β４ＧＡＬＮＴ２、β４ＧＡＬＮＴ３、及びβ４ＧＡＬＮＴ４については、それぞれの全長ｃＤＮＡを含むプラスミド（産業技術総合研究所の成松博士より御供与）を用い、プライマーとして下記のプライマーを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を、ｐ３ｘＦＬＡＧ－ＣＭＶ－１４ベクター（インビトロジェン社）のクローニングサイトにクローニングし、発現ベクターを構築した。得られたプラスミドのヌクレオチド配列を、Prism 310Genetic Analyzer（アプライド・バイオシステムズ社）で決定した。
Forward primer for β4GALNT1：5’-gctaagcttATGTGGCTGGGCCGCCGG-3’（配列番号３）
Reverse primer for β4GALNT1：5’-gcgtctagaCTGGGAGGTCATGCACTGC-3’（配列番号４）
Forward primer for β4GALNT2：5’-atataaatgcggccgcATGGGGAGCGCTGGCTTTTCC-3’（配列番号５）
Reverse primer for β4GALNT2：5’-tttctagaTGCGGCACATTGGAGATGGTTC-3’（配列番号６）
Forward primer for β4GALNT3：5’-agaattcATGGGGAGCCCCCGGGCCGC-3’（配列番号７）
Reverse primer for β4GALNT3：5’-gcggatatcCAGCGTCTTCATCTGGCGACG-3’（配列番号８）
Forward primer for β4GALNT4：5’-tttaagcttATGCCGCGGCTCCCGGTGAA-3’（配列番号９）
Reverse primer for β4GALNT4：5’-attctagaAGACGCCCCCGTGCGAG-3’（配列番号１０）

　各発現ベクターにより、形質転換試薬リポフェクタミン（インビトロジェン社）を用いてＣＯＳ細胞を形質転換した。
　次に、免疫沈降により、反応性を確認した。得られた形質転換細胞から、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いて免疫沈降を行った後、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。ブロッキング後、抗ＦＬＡＧ抗体（１μｇ／ｍＬ：Ｓｉｇｍａ社）と反応させた。洗浄後、メンブレンをＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭウサギ抗体（０．３μｇ／ｍＬ：Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ）と反応させた。ＥＣＬウエスタンブロット検出試薬（ＧＥヘルスケア社）を用いて、化学発光により検出した。
　図１に示すように、モノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体共にβ４ＧＡＬＮＴ１に強く反応し、他の糖転移酵素に対しては反応しなかった。

《実施例１：β４ＧＡＬＮＴ１のサンドイッチＥＬＩＳＡの構築》
　前記β４ＧＡＬＮＴ１タンパク質を免疫して得られたモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法による、β４ＧＡＬＮＴ１の免疫学的分析方法の構築を行った。
　まず、β４ＧＡＬＮＴ１ポリクローナル抗体を、２５ｍＭ　ＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．０に１ｍｇ／ｍＬに希釈し、磁性ビーズＤｙｎａｂｅａｄｓ　ＭｙＯｎｅ　Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ　ａｃｉｄ（インビトロジェン社）に固定化した。得られた磁性ビーズを５ｍｇ／ｍＬＰＢＳ懸濁液に調製した。
　β４ＧＡＬＮＴ１モノクローナル抗体はＡｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｋｉｔ（コスモバイオ社）を用いて、アルカリホスファターゼ標識した。

　標準物質希釈液は、ＰＢＳで１０倍に希釈した正常人血清に前記抗体固定化ビーズ５０μｇを加えて１時間インキュベートした後、ビーズを除去して作成した。標準物質として、前記変性大腸菌β４ＧＡＬＮＴ１タンパク質を、標準物質希釈液で２００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１２．５ｎｇ／ｍＬに希釈して５０μＬとし、抗体固定化ビーズ５０μｇを加えて２５℃、２時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄後、１μｇ／ｍＬアルカリホスファターゼ標識β４ＧＡＬＮＴ１モノクローナル抗体５０μＬを加え、２５℃、１時間インキュベートした。各ウエルをＰＢＳ－Ｔで、４回洗浄し、１００μＬのBM Chemiluminescence ELISA Substrate（ロシュ社）を加え、Ｐｌａｔｅ　ＣＨＡＭＥＬＥＯＮ　Ｖ（ハイデックス社）で、化学発光をカウントした。
　図２に示すように、定量性のある検量線が得られた。

《実施例２：胃癌患者の血清中のβ４ＧＡＬＮＴ１検出系による測定》
　胃癌患者３５症例、健常成人１０検体、及び他の癌患者（前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、十二指腸癌、及び食道癌）５０症例の血清中のβ４ＧＡＬＮＴ１検出系による測定を行った。胃癌患者の血清は、開腹手術によりＩ期～IV期の病期診断を受けた患者の血清を用いた。これらの胃癌患者は、胃癌以外の癌の発生は確認されなかった。
　標準物質の変性大腸菌β４ＧＡＬＮＴ１タンパク質の代わりに、患者及び健常人の血清をＰＢＳ－Ｔで１０倍希釈して加えたことを除いては、実施例１のＥＬＩＳＡの工程を繰り返した。図２の検量線から血清中のβ４ＧＡＬＮＴ１の値を決定した。陽性の判定は、正常人の平均＋２ＳＤの値を、カットオフ値として判定した。
結果を図３に示す。

　胃癌患者は、正常人と比較すると血中のβ４ＧＡＬＮＴ１が高く、正常人と胃癌患者とは、ほぼ完全に鑑別することが可能であった。また、卵巣癌、膵臓癌、及び食道癌で、わずかにβ４ＧＡＬＮＴ１が高い症例が見られたが、血液中のβ４ＧＡＬＮＴ１は、胃癌患者において、非常に特異的に上昇することが確認された。

《比較例１：胃癌患者の血清中のＣＥＡの測定》
　実施例２において測定した胃癌患者のうち２５症例の血清について、従来の胃癌のマーカーであるＣＥＡの測定を行った。
　ＣＥＡの測定は、ルミパルスプレストＣＥＡ試薬（富士レビオ株式会社製）のキットを用い、添付のプロトコールに従い、測定した。表１に示すように、胃癌患者におけるＣＥＡの陽性率は２／２５（８％）であった。

《比較例２》
　実施例２において測定した胃癌患者のうち２５症例の血清について、従来の卵巣癌のマーカーであるＣＡ１９－９の測定を行った。
　ＣＡ１９－９の測定は、ルミパルスプレストＣＡ１９－９試薬（富士レビオ株式会社製）のキットを用い、添付のプロトコールに従い、測定した。表１に示すように、胃癌患者におけるＣＡ１９－９の陽性率は１／２５（４％）であった。

　本発明の胃癌の検出方法及び胃癌の検出キットは、胃癌検診等において、胃癌患者をほぼ１００％検出することが可能であり、健康診断に用いることが可能である。
　以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。

Claims

　生体由来の液体試料中のβ１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素１を分析することを特徴とする胃癌の検出方法。
　前記分析が、β１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合部位を含む抗体フラグメントと、被検試料とを接触させる工程；及び
β１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素１と前記抗体又はその抗原結合部位を含む抗体フラグメントとの結合体を検出する工程；
を含む免疫学的分析方法である、請求項１に記載の胃癌の検出方法。
　前記液体試料が、血液、血漿、血清、尿、唾液、汗、及び髄液からなる群から選択される少なくとも１つの液体試料である、請求項１又は２に記載の胃癌の検出方法。
　β１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素１に結合する抗体又はその抗原結合部位を含む抗体フラグメントを含むことを特徴とする、胃癌の検出用キット。
　β１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素１の基質として、ＧＭ３を含むことを特徴とする、胃癌の検出用キット。
　胃癌の検出用キットの製造のための、β１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素１に結合する抗体又はその抗原結合部位を含む抗体フラグメントの使用。
　胃癌の検出用キットの製造のための、β１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素１の基質としてのＧＭ３の使用。