JP2002510291A - ガングリオシドｇｍ３によって誘導される神経細胞のアポトーシス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、ガングリオシドＧＭ３が増殖しているＣＮＳ細胞の増殖を阻害し、アポトーシスを誘導する能力に関する。さらにこの発明では、迅速に増殖するヒト神経グリア細胞の初代培養および９Ｌラットグリオザルコーマ培養細胞株の細胞数をＧＭ３が減少させる能力について示す。加えて、ＧＭ３が正常ヒトＣＮＳ細胞の静止状態培養細胞に影響を与えないことを示す。マウスの異種移植片モデル系において、腫瘍細胞を移植して３日後にＧＭ３を単回投与した結果、宿主動物の無症状の生存期間が有意に延びた。したがって、ＧＭ３はヒトの高度なグリオーマの化学療法剤として有効である。

Description

【発明の詳細な説明】 ガングリオシドＧＭ３によって誘導される神経細胞のアポトーシス 本出願は、米国仮出願番号６０／０４７，４３０号（１９９７年５月２２日出 願）の出願日の優先権を有する。 発明の分野 単純なガングリオシドＧＭ３（天然に存在するリガンド）は、細胞増殖を選択 的に調節すること、および星状膠細胞のアポトーシスを誘導することが知られて いる。さらに、ＧＭ３は、選択的な化学療法剤として、ヒト患者における高い悪 性度のグリオームを処置するために有用であることが明らかにされている。 発明の背景 脊髄動物の正常な発達時において、約２倍もの細胞が産生し、それらは、最終 的には、成熟した神経系に取り込まれる。このような大過剰の細胞には、過剰な 細胞を排除し、それによって動物にとって不必要な栄養負荷を防止する機構が存 在しなければならない。過剰な細胞を選択的に取り除くための１つの機構は、プ ログラム化された細胞死、すなわち、アポトーシスの誘導である。 アポトーシスは、中枢神経系（ＣＮＳ）の発達において重要な役割を果たして いる。しかし、正常なＣＮＳ発達時にアポトーシスを誘導する因予は、明確に同 定されていない。 ガングリオシド（すべての哺乳動物細胞の表面成分）は、多くの他の組織と比 較して、ＣＮＳで非常に発現している（Ｆｉｓｈｍａｎ、Ｐ．Ｈ．およびＲ．Ｏ ．Ｂｒａｄｙ、ガングリオシドの生合成および機能、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７６ 、１９４：９０６〜９１５頁；Ｌｅｄｅｅｎ，Ｒ．Ｗ．およびＲ．Ｋ．Ｙｕ、ガ ングリオシド：構造、単離および分析、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９ ８２、８３：１３０９〜１９１頁）。特定のガングリオシドの発現は、発達によ って調節されている（Ｉｒｗｉｎ，Ｌ．Ｎ．およびＣ．Ｃ．Ｉｒｗｉｎ、海馬、 網膜および眼蓋のガングリオシド組成の発達時の変化、Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃ ｉ．、１９７９、２：１２９〜１３８頁；Ｉｒｗｉｎ，Ｌ．Ｎ．、Ｄ．Ｂ．Ｍｉ ｃｈａｅｌおよびＣ．Ｃ．Ｉｒｗｉｎ、胎児ラット脳および胎児マウス脳のガン グリオシドパターン、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、１９８０、３４：１５２７〜 １５３０頁；Ｈｉｌｂｉｇ．Ｒ．他、マウスおよびラットの脊髄におけるガング リオシドの発達パターン、Ｒｏｕｘ’ｓ Ａｒｃｈ．、１９８２、１９１：２８ １〜２８４頁；Ｒｏｓｎｅｒ，Ｈ．、ニワトリの眼葉における脳の発達および成 熟化の生化学的指標としてのガングリオシド変化、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１９８ ２、２３６：４９〜６１頁）。初期の発達時において、ＧＤ３（Ｉｒｗｉｎ，Ｌ ．Ｎ．Ｄ．Ｂ．ＭｉｃｈａｅｌおよびＣ．Ｃ．Ｉｒｗｉｎ、胎児ラット脳および 胎児マウス脳のガングリオシドパターン、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、１９８０ 、３４：１５２７〜１５３０頁；Ｈｉｌｂｉｇ．Ｒ．他、マウスおよびラットの 脊髄におけるガングリオシドの発達パターン、Ｒｏｕｘ’ｓ Ａｒｃｈ．、１９ ８２、１９１：２８１〜２８４頁）、およびＧＭ３（Ｈｅｆｆｅｒ−Ｌａｕｃ， Ｍ．他、抗ＧＭ３（１１３Ｎｅｕ５ＡＣ−ラクトシルセラミド）ガングリオシド 抗体は小脳発達の重要な段階時におけるヒト胎児プルキンエニューロンを標識す る、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．、１９９６、２１３：９１〜９４頁）が、Ｃ ＮＳで高いレベルで発現している。これらは、その後、減少する（Ｇｏｌｄｍａ ｎ，Ｊ．Ｅ．他、ＧＤ３ガングリオシドは未成熟な神経外胚葉細胞の糖脂質特徴 を有する、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８４、７：１７９〜１９２頁 ）。最も高いレベルのＧＤ３およびＧＭ３の発現は、局所的な細胞増殖の期間と 相関する。これは、ガングリオシドが、ＣＮＳ神経細胞の増殖および分化を調節 し得ることを示唆する（Ｂｒｅｍｅｒ，Ｅ．Ｇ．他、ガングリオシドによって媒 介される細胞増殖の調節、増殖因子の結合およびレセプターのリン酸化、Ｊ.Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８４、２５８：６８１８〜６８２５頁；Ｂｒｅｍｅｒ． Ｅ．Ｇ．、Ｊ．ＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒおよびＳ．Ｈａｋｏｍｏｒｉ、ガング リオシドによって媒介される細胞増殖、上皮増殖因子レセプターのチロシンリン 酸化に対するＧＭ３の特異的作用、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８６、２６１ ：２４３４〜２４４０頁；Ｃａｎｎｅｌｌａ，Ｍ．Ｓ．他、軸索外方成長（ｏ ｕｔｇｒｏｗｔｈ）の刺激因子としてのｅｐｉ−ＧＭ３とＧＭ３およびＧＭ１と の比較、Ｄｅｖｅｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、１９８８、３９：１３７〜１４３ 頁；Ｄｕｒａｎｄ，Ｍ．他編、初代培養におけるニューロンの発達に対するガン グリオシドの作用に関する証拠、Ｇａｎｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｅｕ ｒｏｎａｌ Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ、Ｒ．Ｔｅｔｔａｍａｎｔｉ他編、１９８６ 、Ｌｉｖｉａｎａ：Ｐａｄｏｖａ、イタリア、２９５〜３０７；Ｙｉｍ，Ｓ．Ｈ ．他、発達中のラット脳から培養される希突起神経膠細胞の分化は外因性のＧＭ ３ガングリオシドによって増強される、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．１９９ ４、３８：２６８〜２８１頁）。 ガングリオシドは、大部分の哺乳動物細胞の形質膜に存在し、中枢神経系（Ｃ ＮＳ）に多く存在する（Ｐ．Ｈ．Ｆｉｓｈｍａｎ、Ｒ．Ｏ．Ｂｒａｄｙ、Ｓｃｉ ｅｎｃｅ １９４：９０６〜１５頁（１９７６）；Ｒ．Ｗ．Ｌｅｄｅｅｎ、Ｒ． Ｋ．Ｙｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８３：１３９〜９１頁（１９８２ ））。ガングリオシドの発現は、脳の発達により調節されており、最も単純なガ ングリオシドのＧＭ３は、胚発生の１６日目（Ｅ１６）までは主としてラットの 脳で発現し、その後の発達期間中はより低いレベルであり（Ｒ．Ｋ．Ｙｕ．Ｌ． Ｊ．Ｍａｃａｌａ、Ｔ．Ｔａｋｉ、Ｈ．Ｍ．Ｗｅｉｎｆｉｅｌｄ、Ｆ．Ｓ．Ｙｕ 、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５０：１８２５〜９頁（１９８８））、低レベルの 発現が成体期間中を通じて持続されている。ＧＭ３は、ヒト脳の初期発達の脳室 帯で発現している（Ｍ．Ｓｔｏｊｉｊｉｋｏｖｉｃ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｎ ｅｕｒｏｓｃｉ．１４：３５〜４４頁（１９９６））。成体ラットの脳において は、ＧＭ３は白質および小脳の第ＶＩ層で強く発現している（Ｍ．Ｋｏｔａｎｉ 他、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、４：８５５〜６５頁（１９９４））。インビト ロにおいて、外部から添加されたガングリオシドは細胞の形質膜に迅速に取り込 まれ（Ｔ．Ｗ．Ｋｅｅｎａｎ、Ｅ．Ｓｃｈｍｉｄ、Ｗ．Ｗ．Ｆｒａｎｋｅ、Ｈ． Ｗｉｅｇａｎｄｔ、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．９２：２５９〜７０頁（１９７ ５）；Ｒ．Ａ．Ｌａｉｎｅ、Ｓ．Ｈａｋｏｍｏｒｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、５４：１０３９〜4５頁（１９７３））、そ して数多くの生物学的作用を引き起こす。１つの共通した作用は、細胞増殖の 調節である。ＥＧＦ誘導の３Ｔ３繊維芽細胞細胞株およびＡ４３１（ＫＢ類表皮 ガン）細胞株の増殖（Ｅ．Ｇ．Ｂｒｅｍｅｒ、Ｓ．Ｈａｋｏｍｏｒｉ、Ｐ．Ｄ． Ｂｏｗｅｎ、Ｅ．Ｒａｉｎｅｓ、Ｒ．Ｒｏｓｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５ ９：６８１８〜２５頁（１９８４）：Ｅ．Ｇ．Ｂｒｅｍｅｒ、Ｊ．Ｓｃｈｌｅｓ ｓｉｎｇｅｒ、Ｓ．Ｈａｋｏｍｏｒｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：２３ ３４〜４０頁（１９８６））、ＰＤＧＦ誘導の３Ｔ３繊維芽細胞株およびＳＨ− ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞株の増殖（Ｅ．Ｇ．Ｂｒｅｍｅｒ、Ｓ．Ｈａｋｏｍｏｒｉ 、Ｐ．Ｄ．Ｂｏｗｅｎ、Ｅ．Ｒａｉｎｅｓ、Ｒ．Ｒｏｓｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ ｅｍ．２５９：６８１８〜２５頁（１９８４）；Ｅ．Ｇ．Ｂｒｅｍｅｒ、Ｊ．Ｓ ｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｓ．Ｈａｋｏｍｏｒｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２ ６１：２３３４〜４０頁（１９８６）；Ｄ．Ｌ．Ｈｙｎｄｅ．Ｍ．Ｓｕｍｍｅｒ ｓ．Ｂ．Ｊ．Ｖａｎ、Ｍ．Ｓ．Ｏ’Ｄｏｒｉｓｉｏ、Ａ．Ｊ．Ｙａｔｅｓ、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．６５：２２５１〜８頁（１９９５））、ＦＧＦ誘導のＢＨ Ｋ繊維芽細胞株の増殖（Ｅ．Ｇ．Ｂｒｅｍｅｒ、Ｓ．Ｈａｋｏｍｏｒｉ、Ｂｉｏ ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１０６：７１１〜８頁（ １９８２））、ならびにインスリン誘導のＨＬ−６０白血病細胞株の増殖（Ｎ． Ｎｏｊｉｒｉ、Ｍ．Ｓｔｒｏｕｄ、Ｓ．Ｈａｋｏｍｏｒｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ ｅｍ．、２６６：４５３１〜７頁（１９９１））は、外部から添加されたＧＭ３ によって阻害される。適切なレセプター（ＥＧＦレセプター（Ｒ）、ＰＤＧＦ− Ｒ、およびインスリン−Ｒ）のリン酸化は、ＧＭ３によって阻害される（Ｅ．Ｇ ．Ｂｒｅｍｅｒ、Ｓ．Ｈａｋｏｍｏｒｉ、Ｐ．Ｄ．Ｂｏｗｅｎ、Ｅ．Ｒａｉｎｅ ｓ、Ｒ．Ｒｏｓｓ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６８１８〜２５頁（１９ ８４）；Ｅ．Ｇ．Ｂｒｅｍｅｒ、Ｊ．Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｓ．Ｈａｋｏ ｍｏｒｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：２３３４〜４０頁（１９８６）； Ｎ．Ｎｏｊｉｒｉ、Ｍ．Ｓｔｒｏｕｄ、Ｓ．Ｈａｋｏｍｏｒｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６６：４５３１〜７頁（１９９１）；Ｑ．Ｚｈｏｕ、Ｓ．Ｈａｋ ｏｍｏｒｉ、Ｋ．Ｋｉｔａｍｕｒａ、Ｙ．Ｉｇａｒａｓｈｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ ｈｅｍ．、２６９：１９５９〜６５頁（１９９４））。 いくつかの研究により、別のガングリオシドのＧＭ１が、ＣＮＳニューロンに 対して支持作用を有することが示唆されている（Ｃ．Ｌ．Ｓｃｈｅｎｇｒｕｎｄ 、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．２４：１３１〜４１頁（１９９０））。ＧＭ ３の支持作用についてはあまり知られていない。ＧＭ３はまた、ヒト白血病細胞 株のＨＬ−６０およびＵ９３７の細胞増殖を阻害し、その細胞分化を調節し、そ して単核細胞的な分化を誘導する（Ｎ．Ｎｏｊｉｒｉ、Ｆ．Ｔａｋａｋｕ、Ｙ． Ｔｅｒｕｉ、Ｙ．Ｍｉｕｒａ、Ｍ．Ｓａｉｔｏ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：７８２〜６頁（１９８６））。一方、抗ＧＭ３抗体は 、ニューロ−２ａ神経芽腫細胞の分化を媒介する（Ｄ．Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ、 Ｍ．Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ、Ｇ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ．、５８３：３１〜４４頁（１９９２）；Ｍ．Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ、Ｇ．Ｍ ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａ．Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ、Ｄ．Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ 、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、６２５：１９７〜２０２頁（１９９３））。ニューロ −２ａ細胞およびＰＣ−１２細胞の軸索生成は、ＧＭ３によって増大する（Ｍ． Ｓ．Ｃａｎｎｅｌｌａ、Ｆ．Ｊ．Ｒｏｉｓｅｎ、Ｔ．Ｏｇａｗａ．Ｍ．Ｓｕｇｉ ｍｏｔｏ、Ｒ．Ｗ．Ｌｅｄｅｅｎ、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、４６７：１３７〜４ ３頁、１９８８）。さらに、培養された希突起膠細胞の濃化（ｔｈｉｃｋｎｅｓ ｓ）プロセスの回数もまた増大する（Ｓ．Ｈ．Ｙｉｍ、Ｅ．Ｙａｖｉｎ、Ｊ．Ａ ．Ｈａｍｍｅｒ、Ｒ．Ｈ．Ｑｕａｒｌｅｓ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、５７： ２１４４〜７頁（１９９１）；Ｓ．Ｈ．Ｙｉｍ、Ｒ．Ｇ．Ｆａｒｒｅｒ、Ｊ．Ａ ．Ｈａｍｍｅｒ、Ｅ．Ｙａｖｉｎ、Ｒ．Ｈ．Ｑｕａｒｌｅｓ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓ ｃｉ．Ｒｅｓ．、３８：２６８〜８１頁（１９９４））。 ガングリオシドは脳に多量に存在しているが、特に発達時におけるＣＮＳ細胞 に対するその機能についてはほとんど知られていない。 ガングリオシドは、ニューロン細胞の分化を調節すると考えられている（Ｃａ ｎｎｅｌｌａ，Ｍ．Ｓ．他、軸索外方成長の刺激因子としてのｅｐｉ−ＧＭ３と ＧＭ３およびＧＭ１との比較、Ｄｅｖｅｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、１９８８、 ３９：１３７〜１４３頁；Ｄｉｍｐｆｅｌ，Ｗ．、Ｗ．ＭｏｌｌｅｒおよびＵ． Ｍｅｎｇｓ編、培養神経芽腫細胞のガングリオシド誘導の軸索形成、Ｇａｎｇｌ ｉｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｍ．Ｍ ．ＲａｐｐｏｒｔおよびＡ．Ｇｏｒｉｏ編、１９８１、Ｒａｖｅｎ：Ｎｅｗ Ｙ ｏｒｋ、１１９〜１２４；Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｇ．、Ｍ．ＦａｂｒｉｓおよびＡ． Ｇｏｒｉｏ、ガングリオシドはＰＣ１２細胞の軸索外方成長を増強する、Ｄｅｖ ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、１９８３、８：２１５〜２２１頁；Ｋａｔｏｈ−ｓｅ ｍｂａ，Ｒ．、Ｓ．Ｄ．ＳｋａｐｅｒおよびＳ．Ｖａｒｏｎ、ＧＭ１ガングリオ シドとＰＣ１２フェノクロモサイトーマ（ｐｈｅｎｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ ）細胞との相互作用：軸索外方成長および増殖に対する血清（ｓｅｒｕｍａｎｄ ）ＮＧＦ依存的な作用、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、１９８４、１２：２ ９９〜３１０頁；Ｌｅｓｋａｗａ，Ｋ．Ｃ．およびＥ．Ｌ．Ｈｏｇａｎ、外因的 な精製ガングリオシドに対するインビトロでの神経芽腫の応答の定量、Ｊ．Ｎｅ ｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、１９８５、１３：５３９〜５５０頁；Ｍａｔｔａ，Ｓ ．Ｃ．、Ｇ．ＹｏｒｋｅおよびＦ．Ｊ．Ｒｏｉｓｅｎ、神経芽腫およびフェノク ロモサイトーマの培養における個々のガングリオシドの軸索および代謝の影響な らびに神経増殖因子とのその相互作用、Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１９８６ 、２７：２４３〜２５２頁）。その一方で、様々なガングリオシドが、正常なグ リアおよび形質転換グリアで発現している（Ｉｒｗｉｎ，Ｌ．Ｎ．、Ｄ．Ｂ．Ｍ ｉｃｈａｅｌおよびＣ．Ｃ．Ｉｒｗｉｎ、胎児ラット脳および胎児マウス脳のガ ングリオシドパターン、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、１９８０、３４：１５２７ 〜１５３０；Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｊ．Ｅ．、Ｓ．Ｓ．ＧｅｉｅｒおよびＭ．Ｈｉｒ ａｎｏ、初代培養における胚マトリックスからの星状膠細胞および希突起膠細胞 の分化、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９８６、６（１）：５２〜６０頁；Ｓｕｎ ｇ，Ｃ．Ｃ．他、ヒト希突起膠腫における糖脂質およびミエリンタンパク質、Ｇ ｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．、１９９６、１３：４３３〜４４３；Ｋｉｍ ，Ｓ．Ｕ．、Ｇ．ＭｏｒｅｔｔｏおよびＲ．Ｋ．Ｙｕ、培養されているヒトのニ ューロン細胞およびグリア細胞のガングリオシドの神経免疫学、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ ｃｈｅｍ．、１９８６、１５：３０３〜３２１頁；Ｓｈｉｎｏｕｒａ，Ｎ．他、 脳腫瘍におけるガングリオシド組成および臨床データに対するその関係、Ｎｅｕ ｒｏｓｕｒｇ．、１９９２、３１：５４１〜５４９頁；Ｓｔｏｊｉｌｊｋｏｖｉ ｃ，Ｍ．他、ヒトの初期脳発達におけるガングリオシドＧＭ１およびＧＭ３： 免疫組織化学的研究、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖｅｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９９６ 、１４：３５〜４４頁）。ヒトの脳腫瘍の大部分はグリアに由来する。小児にお いては、グリオームは、６７％のＣＮＳ腫瘍を含み、第２番目に最も頻繁に診断 される小児悪性疾患である（Ｐａｒｋｉｎ，Ｄ．Ｍ．他、小児ガンの国際的な発 生率、１９８８、ＩＡＲＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｉ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ）。成人においては、脳腫瘍は原発性ＣＮＳ腫瘍の４０％〜６７％ の間である（Ｂｏｈｎｅｎ，Ｎ．Ｊ．他、脳腫瘍の識別的および分析的な疫学、 Ｃａｎｃｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐ．Ｍ．Ｂｌａ ｃｋおよびＪ．Ｓ．Ｌｏｅｆｆｅｒ編、１９９７、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉ ｅｎｃｅ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｍａｓｓ、３〜２４）。ＣＮＳ腫瘍は、すべて の成人悪性疾患の約２％（Ｇｉｌｅｓ，Ｇ．Ｇ．、Ｂ．Ｋ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ およびＬ．Ｎ．Ｓｍｉｔｈ、Ｃａｎｃｅｒ ｉｎ Ａｕｓｔｒａｌｉａ、１９８ ７）を占めているが、異常に多い年間死亡数の原因となっている（Ｈｏｆｆｍａ ｎ，Ｒ．Ｍ．編、Ｆｅｒｔｉｌｅ ｓｅｅｄ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｓｏｉｌ；Ｔ ｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎ ｔ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｔ ｉｓｓｕｅ、抗ガン薬剤開発指針：前臨床スクリーニング、臨床試験および承認 、Ｂ．Ａ．Ｔｅｉｃｈｅｒ編、１９９７、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ：Ｔｏｔｏ ｗａ、Ｎ．Ｊ．１２７〜１４４）。原発性ＣＮＳ悪性疾患の中で、多形グリア芽 細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ、ＧＢＭ）は最も悪 い予後を有し、平均余命は２９週〜３６週の間である（Ａｍｍｉｒａｔｉ，Ｍ． 他、グリア芽細胞腫（ｓｕｐｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍ ａｓ）および再生星状膠細胞腫の患者の生存および生活の質に関する手術切除の 程度の影響、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ、１９８７、２１：２０１〜２０６頁； Ｈａｒｓｃｈ、Ｇ．Ｒ．他、再発グリア芽腫細胞腫および再生星状膠細胞腫の再 手術、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ、１９８７、２１：６１５〜６２１頁）。積極 的な手術切除、その後の補助的な治療（放射線療法、免疫療法、化学療法）を用 いた場合でも、大多数のＧＢＭ患者は、その疾患で死亡する（Ｗｅｎ，Ｐ．Ｙ． およびＤ．Ｓｃｈｉｆｆ編、星状膠細胞腫患者の臨床的評価、神経学的手術の最 近の問題−星状膠細胞腫：診断、処置および生物学、Ｐ．Ｍ．Ｂｌａｃｋ、Ｗ． Ｃ．ＳｃｈｏｅｎｅおよびＬ．Ａ．Ｌａｍｐｓｏｎ編、１９９３、Ｂｌａｃｋｗ ｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ、２６〜３６）。ＣＮ Ｓ悪性疾患の処置は、側副脳組織の感受性、および腫瘍に隣接する細胞に対する 損傷の著しい結果のために複雑である。 発明の要旨 本発明は、増殖性ＣＮＳ細胞の増殖を阻害し、そのアポトーシスを有するガン グリオシドＧＭ３の能力に関する。本発明はさらに、ＧＭ３が、ヒトのグリア腫 瘍および９Ｌラット神経膠肉腫細胞株を迅速に増殖させる初代培養における細胞 数を減少させ得ることを明らかにする。さらに、ＧＭ３は、正常なヒトＣＮＳ細 胞の静止培養物に対しては作用を有しないことが明らかにされている。ネズミの 外植片モデル系において腫瘍細胞を頭蓋内に移植した３日後にＧＭ３を１回注射 することによって、症状を伴わない宿主動物の生存期間の著しい増大が生じる。 従って、ＧＭ３は、ヒトの高い悪性度のグリオームの化学療法薬剤として有用で ある。 そのようなものとして、本発明の第１の局面は、増殖性神経細胞のアポトーシ スを誘導するための新規な化学療法薬剤であって、ＧＭ３を含む化学療法薬剤を 包含する。 本発明の第２の局面は、ＧＭ３化学療法薬剤を使用して、増殖性神経細胞のア ポトーシスを選択的に誘導することに関する。 本発明のさらなる局面は、脳腫瘍を有する患者における増殖性神経細胞の増殖 を阻害し、そのアポトーシスを誘導するために、該患者を処置することに関する 。 本発明のさらなる局面は、化学療法計画を必要とする患者を処置するための化 学療法計画に関する。 従って、本発明は、患者において、高い悪性度のグリオームを含む脳腫瘍を選 択的に処置することができ、それによって、そのような患者の平均生存期間を増 大させることによって患者の予後を高めることができるという利点を有する。 別の利点は、身体内で通常的に産生される化学薬剤の化学療法的に有効な組成 物での使用、それによってそのような処置に典型的に関連する有害な副作用の危 険性を減少させる使用に関する。 本発明のさらに別の利点および利益は、好ましい実施形態の下記の詳細な説明 を読み、理解することによって当業者には明らかである。 図面の簡単な説明 図１は、５０μＭのＧＭ３で処理した星状膠細胞が増殖するためのＤＮＡフラ グメント化を表すＴＵＮＥＬラベリングを示している。 図２Ａおよび２Ｂは、ＧＭ３処理時およびＧＭ３非処理時における、増殖中の 星状膠細胞の形態学的特徴を示している。 図３Ａおよび３Ｂは、非増殖中の星状膠細胞に及ぼすＧＭ３の効果を示してい る。 図４は、ＧＭ３で処理したニューロンおよびグリア前駆細胞が増殖するための ＤＮＡフラグメント化を表すＴＵＮＥＬラベリングを示している。 図５は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒトグリア細胞腫瘍の成長およびラット９ Ｌ細胞系列に対するＧＭＢ処理の効果を示している。 図６Ａ〜６Ｅは、対照細胞培養（６Ａ、６Ｃ）、およびＧＭＢ処理した細胞培 養（６Ｂ、６Ｄ、６Ｅ）における形態学的変化を示している。 図７は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒトグリア芽細胞の多形（ＧＢＭ’ｓ）に 対する、ＧＭ３濃度増加の影響を示している。 図８は、正常なヒト中枢神経系（ＣＮＳ）の組織培養に対する、ＧＭ３の効果 を示している。 図９は、９Ｌラット腫瘍細胞を移植した動物の生存時間に対する、ＧＭ３処理 の効果を示している。 好ましい実施形態の詳細な説明 増殖中のラットＣＮＳ（中枢神経系）神経細胞をガングリオシドＧＭ３に暴露 すると、細胞の増殖が阻害され、アポトーシスが誘起された。本発明は、ヒトＣ ＮＳ腫瘍細胞をＧＭ３処理すると、そのｉｎ ｖｉｔｒｏにおける増殖が阻害さ れ、結果として異種移植脳腫瘍モデルにおいて、移植後の症状の現れない期間（ ｓｙｍｐｔｏｍ−ｆｒｅｅ ｐｏｓｔ−ｉｍｐｌｅｍｅｎｔ ｉｎｔｅｒｖａｌ ｓ）が延長されることになることが実証された。 ＧＭ３がｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてヒトＧＢＭの成長を阻害する機構は明らか である。特別な理論と結びつけなくとも、ＧＭ３が腫瘍細胞の増殖を阻害すると 同時に、活発に増殖している細胞のアポトーシスを誘起するであろうことが考え られる。この仮説に矛盾することなく、ＧＭ３処理により、ラット神経細胞前駆 体の増殖が著しく阻害されると同時に、アポトーシスが迅速に誘起された。この アポトーシスの誘起は、ｐ２７^kip1発現の増加制御およびｐＲｂ（高リン酸化網 膜芽腫タンパク質）発現の低下に関連する。２つの方向からの実証は、ヒト腫瘍 細胞もまた、ＧＭ３暴露に応答してアポトーシスを受けることを示唆するもので ある。第１に、ＧＭ３で処理された培養中の細胞数は、初発集団および対照培養 のいずれと比較しても減少しており、これは細胞死を示唆するものである。第２ に、ＧＭ３暴露後に見られた円形形態および核のフラグメント化は、アポトーシ スの特徴である。 ＧＭ３暴露に対する培養の応答の程度は、細胞特異的または腫瘍特異的である と思われる。本発明で調べたすべての腫瘍は、グリア芽細胞の多形（ＧＢＭ）で あるとキャラクタライズされており、同一の条件下において同様の密度で培養し たにも拘わらず、それらのＧＭ３に対する応答は異なっていた。いくつかの培養 では、細胞数の減少が８０％を超える一方で、別の腫瘍の培養を用いた並行実験 においては、細胞数の減少はわずか３５％であった。このＧＭ３処理に対する応 答性の違いは、培養継代数の違いによるものではないと思われる。というのも、 最初の７つの培養はオリジナルの平板培養から、あるいは切除された腫瘍の初期 継代からとったものであるためである。 異なる腫瘍からの細胞のＧＭ３に対する応答性を調節する１つの因子は、増殖 速度である。非増殖中の齧歯類動物のＣＮＳ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける ＧＭ３処理に応答したアポトーシスを受けないが、さらに活発に分化するように なる。同様に、ＧＭ３を発育中のラットに脳室内注射すると、脳室および副脳室 の増殖中の細胞手段においてのみ細胞死が起こった。本発明に示されるように、 ＧＭ３は、正常なヒト神経細胞の静止培養における細胞数を減少させることはな く、ラットへにおけるＧＭ３注射に付随する神経学的挙動の変化は見られなかっ た。したがって、異なる腫瘍の培養内の細胞は、異なる細胞周期時間を有し、Ｇ Ｍ３への応答はこの細胞周期時間と直接に関係しているのかもしれない（すなわ ち周期時間が短いと細胞死も増加する）。 本発明では、ＧＭ３処理が、正常なヒト脳細胞の静止培養における細胞数を有 意に変化させることなく、ヒトおよび齧歯類動物の腫瘍細胞の初代培養の増殖を 有意に低下させることを実証した。さらに、ＧＭ３による単一処理は、ラット９ Ｌ脳腫瘍細胞が頭蓋内移植されたヌードマウスにおける、移植後の症状の現れな い期間を引き延ばした。これらのデータをすべて考え合わせると、ＧＭ３はヒト の良性神経膠腫の効果的な治療方法を与える。 以下に、ＧＭ３を腫瘍細胞列および正常細胞列に適用した場合の、ｉｎ ｖｉ ｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方における結果を示す実施例である。本実施例 で使用したＧＭ３は、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）より入手したものであり、ウシの 脳から純度９８％に精製されたものである。通常の生理食塩水（滅菌）を担体と して使用した。 実施例１ 本実施例においては、ＧＭ３が増殖中の星状膠細胞のアポトーシスを誘起する ことを証明する。星状膠細胞は、スミスら（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ ．Ｂｉｏｌ．１３８，３７７−３９０（１９９０））によって記載されるように 、生まれたばかりの（ＰＯ）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの大脳皮質よ り調製し、１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を添加したデルベッコ改変イーグル 培地（Ｄｅｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ ｍｅｄｉｕｍ ：ＤＭＥＭ）中に維持した。 ＧＭ３によって誘起される星状膠細胞の細胞死のメカニズムを調べるために、 細胞を抗ＧＦＡＰ抗体、および、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフ ェラーゼによって媒介されるｄＵＴＰ−ジゴキシニンニック末端標識（ｔｅｒｍ ｉｎａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅ ｄｉａｔｅｄ ｄＵＴＰ−ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ ｎｉｃｋ−ｅｎｄ ｌａｂ ｅｌｉｎｇ：ＴＵＮＥＬ）法によって２重標識した。星状膠細胞の形態学的変化 は、５０μＭのＧＭ３とともにインキュベートしてから１８時間後に明確に現れ た。７２時間までに、大部分の細胞が高度に収縮して核が縮小され、これはアポ トーシスが誘起されたことを示すものであった。これらの形態学的変化に矛盾す ることなく、ＴＵＮＥＬ陽性の細胞の個体数が実質的に増加した。インキュベー ション７２時間後までに、いくらかの死細胞がカバーグラスから脱離していたの で、これらの培養中のＴＵＮＥＬ陽性細胞の個体数は、細胞死の程度を少な目に 表していると思われる。すべての培養において、おそらくは髄膜細胞または内皮 細胞と思われる、少数のＧＦＡＰ陰性細胞は、ＧＭ３とともに７２時間インキュ ベートした後であっても正常であることが判った。 壊死に起因するあらゆるランダムなＤＮＡ開裂は、潜在的にＴＵＮＥＬによっ て標識されるため、アポトーシス性ヌクレオソーム内ＤＮＡフラグメント化を調 べた（図１）。特徴的なＤＮＡフラグメント化は、最初４８時間後に見られ、Ｇ Ｍ３とともにインキュベート後７２時間で明確になる。これはＴＵＮＥＬ染色デ ータに矛盾しない。超微細構造に関しては、アポトーシス性細胞死の特徴的性質 、たとえば細胞収縮、クロマチンの凝縮、核の統合性の損失、および原形質膜が 観察された（図２）。 実施例２ ＧＭ３に対する応答が星状膠細胞の増殖状態と関連するかどうかを確認するた めに、ＧＭ３を接触阻害された非増殖中の星状膠細胞に添加した。ＧＭ３は、こ れらの接触阻害された非増殖中の星状膠細胞において、細胞の形態学的特徴にお ける変化または細胞死を誘起することはなかった。 実施例１および２の結果の分析から、ＧＭ３は未成熟の増殖中の星状膠細胞に おけるアポトーシスを選択的に誘起することがわかる。さらにこれらの結果は、 神経細胞の活発な増殖が、これらの細胞のＧＭ３に対する感受性に貢献すること を実証するものである。 実施例３ 本実施例においては、ＧＭ３がニューロンおよびグリア前駆体のアポトーシス を誘起することを示す。混合細胞培養（有糸分裂後のニューロン、ニューロン前 駆体およびグリア前駆体）を、スミスら（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．１３８，３７７−３９０（１９９０））によって記載されるように、 Ｅ１５の脳から調製し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳまたはＦＢＳ＋１％Ｎ２内に維 持した。 ＧＭ３がニューロンおよびグリア前駆体に与える効果を調べるために、混合培 養をＧＭ３で処理し、細胞死を二重標識法により検定したところ、抗β−チュブ リン陽性細胞およびＡ２Ｂ５陽性細胞がＴＵＮＥＬ陽性となり、特徴的なＤＮＡ フラグメント化が見られた（図４）。インキュベーション７２時間後までに、約 ８０％の細胞が死んだ。残りの細胞は損傷を受けておらず、これらの細胞の大部 分はβ−チュブリン陽性ニューロンであった。この結果は、ＧＭ３が成熟ニュー ロンに与えるプロセス発芽後促進効果（ｐｒｏｃｅｓｓ−ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ）に矛盾しない。ＧＭ３処理の最後の２４時 間の間に、これらの残った細胞をＢｒｄＵとインキュベートし、抗β−チュブリ ン抗体および抗ＢｒｄＵ抗体によって二重標識すると、残った生存細胞の大部分 （＞９９％）がβチュブリン陽性／ＢｒｄＵ陰性を示し、有糸分裂後のニューロ ンは非増殖中の星状膠細胞と同様にＧＭ３処理に対する感受性が低いことが判っ た。また同時に、これらの観察から、ＧＭ３暴露によるアポトーシスは、すべて のクラスの神経細胞において、増殖中には誘起されるが、非増殖中には誘起され ないことが示された。 以下の実施例において、すべての腫瘍試験片は、ＷＨＯグレード１．１．３お よび／またはＳｔ．Ａｎｎｅ−ＭａｙｏグレードＩＶに従って、グリア芽細胞の 多形（ＧＢＭ）と診断されたものである。非腫瘍性細胞は、ラスミュッセン（Ｒ ａｓｍｕｓｓｅｎ）不全のために大脳半球切除を植えた３歳の男性から得たもの である。 培養は標準的な方法を用いて作製した。簡単に説明すると、腫瘍試料を酵素的 に解離し、１×１０^{5 〜6}の密度で１２ｍｍのポリ−Ｌ−リジンでコートしたカバ ーグラスに広げ、５％ＣＯ₂の共存下で３７℃に維持した。培養を少なくとも２ ４時間増殖させた後、媒質に懸濁させた１００μＭのＧＭ３を試験培養に添加し た。平行対照培養物は、実験の開始時に単独で媒体を受け取った。アッセイのほ とんどは、オリジナルの平板培養または腫瘍試料の初代培養からとった細胞に対 して行った。培養は、１０％ＦＢＳおよびインシュリン、トランスフェリン、セ レン、プロゲステロン、プトレシン、３，３’，５トリヨード−Ｌ−サイロニン 、チロキシン、およびＢＳＡのＶ分画を含有するＮ２補充剤を添加したＤＭＥＭ 中で増殖させた。 ７日間にわたるＧＭ３の暴露に続き、培養を４％パラホルムアルデヒド中に固 定し、ＤＮＡ染色Ｄａｐｉ（１：１００００分子プローブ）で５分間染色し、Ｚ ｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ電子顕微鏡で観察した。残存した細胞を定量するた めに、１０の連続した４０Ｘのランダムに選択された領域内の細胞数を計数し、 平均をとった。各腫瘍に対して、少なくとも３つの別個の培養をアッセイし、デ ータを集めた。ＧＭ３濃度増加の影響を調べるために、濃度１００μＭおよび４ ００μＭにて、上記の並行実験を行った。 実施例４ 下記実施例において、ＧＭ３治療が一次ヒト腫瘍細胞の拡大を阻害したかどう かを決定するために、試験管内の進行したヒト神経膠腫にＧＭ３を使用する。こ の実施例において用いられた腫瘍サンプルは、多様な腫瘍部位からの進行した病 変であった。７つの独立した腫瘍サンプルをアッセイした。 各腫瘍サンプルにおいて、単回使用において１００μＭＧＭ３を用いた。この 結果、７日間にこれらの実験培養物において細胞数の有意な減少が生じた（図５ ）。 これと対応する未処理対照培養物に対して、腫瘍培養物における細胞数へのＧ Ｍ３処理の効果は、腫瘍特異性であった。例えば細胞数は、ＧＢＭ−１の培養物 において約５７％減少したが、ＧＢＭ−７の培養物において細胞数は８５％より も多く減少した。ＧＭ３の効果は、一次腫瘍培養に限定されなかった。ラット９ Ｌ細胞系の培養物、すなわち生体内研究に対して確立されている脳腫瘍モデルに おける細胞数は、約６５％減少した。これはヒトの一次培養物における平均的減 少に近い（図５）。 ＧＭ３処理培養物における細胞の形態学は、対照培養物とは異なっていた（図 ６Ａ〜６Ｅ）。対照培養物において、細胞密度は試験管内において７日間で増加 し、細胞の大部分は平らにされ、よく粘着した。これに対してＧＭ３処理培養物 において、細胞密度は同じ期間で減少し、残留細胞は丸くなり、高度に屈折しう るもの（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ）であった。ＧＭ３処理培養物中（対照培養物中 ではない）の多くの細胞は、染色体断片化を有しており、これはＤＮＡステイン Ｄａｐｉによって明らかにされ（図６Ａ〜６Ｅ）、ＧＭ３培養物は有意量の細胞 破片を含んでいた。細胞数に対するＧＭ３処理の効果は、より高い濃度において 増加した。１００μＭ又は４００μＭＧＭ３に暴露された腫瘍ＧＢＭ−５の平行 培養物において、１００μＭＧＭ３で処理されたものよりも、４００μＭＧＭ３ で処理された培養物においては細胞が有意に少なかった（図７）。 実施例５ 正常なヒトＣＮＳの静止培養物においてＧＭ３処理が細胞数を減少させたかど うか決定するために、外来性ＧＭ３（１００μＭ）を、非新生物ＣＮＳ組織に由 来する培養物に添加した。細胞の密度は、試験管内での７日間に有意には変わら なかった。さらには対照と比較して、ＧＭ３処理培養物における細胞数に有意差 はなかった（図８）。このことは、ＧＭ３が正常なヒトＣＮＳ細胞に対して毒性 がないことを示唆しており、これは以前のすべての研究と矛盾がない。 実施例６ 生体内における腫瘍成長に対するＧＭ３の効果を評価するために、９Ｌラット 神経膠肉腫細胞を、マウスの頭蓋内に移植した。１〜１．５×１０⁶細胞を、２ つの別々の実験において、１８匹のスイスヌードマウスの大脳実質内に立体空間 的 に注入した。各実験においてこれらの動物は、移植手順の直後に、対照グループ 又は実験グループのどちらかに無作為に割当てられた。細胞移植の７２時間後、 対照動物は、０．９％塩化ナトリウム５ｍｌの頭蓋内注入を受けたが、一方、実 験動物は０．９％塩化ナトリウム５モル中の０．３ｍｇのＧＭ３を受けた。すべ ての動物は、神経障害（発作、片側不全麻痺、運動失調、ジスキネジー、歩行困 難等）の徴候について毎日評価され、検出された場合、この動物は犠牲にされた 。両方の実験で生き残ったラットを共同計算し、平均＋／−Ｓ．Ｄ．［標準偏差 ］を決定し、統計学的有意性を２テールスチューデントテストによって評価した 。グループ１における動物のうち、これらの動物のうちの一匹は、急速に進行す る感染症状を示し、腫瘍成長の症状を示す前にこの動物は犠牲にしなければなら なかった。この動物はこのデータの組から除外した。 ＧＭ３の注入は、ホスト動物において無症状の期間を伸ばした（図９）。対照 動物（Ｎ＝９）のうち、平均移植後生存期間は１８日（＋／−３）であった。１ ３日目に、約２０％（２／９）の動物が神経障害を示し、移植後２３日以上では 、顕著な神経障害を伴なわない動物は生存しなかった。これに対して、ＧＭ３の 単回注入を受けた実験動物（Ｎ＝８）の場合、平均移植後生存期間は２３日（０ ．０３の対照に比べたＰ値）であった。１７日目に一匹の動物に神経障害が生じ たが、２匹の動物は、移植後３０日まで無症状であった。すなわち、すべての対 照動物が犠牲にされた７日後である。 前記実施例は、ＧＭ３の単回処理が、９Ｌ細胞の移植後にホスト動物の平均無 症状生存時間を増加させたことを証明している。試験管内アッセイをベースとし た場合、この増加した生存時間は、ＧＭ３処理後の移植腫瘍細胞の成長率におけ る低下を最も反映しているように見える。ＧＢＭと診断された患者についての平 均生存率は２９〜３６週間と予測されているので、固有の治療毒性がほとんどな いならば、平均生存率におけるあらゆる増加は有益であろう。ＧＭ３は、自然発 生分子であり、これは非増殖性神経細胞において細胞死を誘発するのではなく、 その成熟を強化する。従ってＧＭ３処理は、残存する生活の質との厳しい妥協が 必要なものではなさそうである。 その他のいくつかの方法は、ＧＭ３処理されたホスト動物の無症状生存期間を 向上させうる。第一に試験管内研究では、ＧＭ３誘発細胞死の効力が、より高い 濃度で高まったことが示唆されている。非増殖性神経細胞に対する効果は、より 高い濃度でより顕著なものになりうるが、ＧＭ３濃度を増加させた結果、生存期 間が延長される結果になることがある。第二に、現在の研究は、腫瘍移植の３日 後のＧＭ３の単回注入を使用している。ＧＭ３の多数回注入は、結果として腫瘍 成長のより大きな制限を生じ、これに付随する無症状生存期間の延長が生じるで あろう。最近の試験管内研究は、１週間以上のＧＭ３の持続使用の結果、腫瘍細 胞の大部分においてより大きな細胞損失が生じることを示している。これは１０ ０％に近い。 これらの研究をまとめることにより、ＧＭ３はＧＢＭと診断された患者への治 療薬と見做される。ＧＭ３での増殖性ＣＮＳ細胞の処理によって、細胞増殖を阻 害し、アポトーシスを誘発する。同様に、ヒトの一次ＧＢＭ腫瘍細胞の成長は、 ＧＭ３処理によって阻害される。これに対して正常な非増殖的ＣＮＳ細胞は、Ｇ Ｍ３処理後のアポトーシスを受けるようには誘導されない。ＧＭ３応答性のこの 強力な増殖依存性は、例えばＧＢＭのように高度に増殖的なヒトのＣＮＳ悪性病 の治療における強力な薬剤であることを示している。 様々な種類の神経細胞のアポトーシスの誘発は、本発明を実施することにおい て達成することができる。多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）、星状細胞腫（星状神経 膠腫）、寡突起神経膠芽腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｏｍａｓ）、上衣腫 、神経膠腫瘍、及びその他の様々な混合神経膠腫は、本発明に従って治療される 細胞の範囲内にある。 本発明によれば様々な治療法を用いることができる。例えばＧＭ３の投与は、 単回使用、多数回使用においてでもよく、あるいは徐放性（ｓｌｏｗ ｒｅｌｅ ａｓｅ）懸濁液ポリマー配合物としてであってもよい。投与される量は、腫瘍の 成長を阻害するのに必要な量によって決定される。患者に投与されるＧＭ３の効 果的な量の一般的な範囲は、約５μＭ〜５０μＭ（あるいは約１ｍｇ〜１６ｇ） である。治療法は、少なくとも腫瘍成長が完全に阻害されるまで続けるべきであ ろう。一般的に、これは約１日から約６ヶ月（又は必要であればそれ以上）であ ってもよい。 本発明の実施によれば、化学療法薬を送り込むために様々な通常の手段を用い ることができる。このような手段には、ＧＭ３の腫瘍への直接使用（単独又は徐 放性ポリマーと組合わせたもの）、動脈内注入、及び腫瘍内への立体空間的注入 が含まれる。 さらにはその他の補助療法及び化学治療方法もＧＭ３治療と共に用いることが できる。例えば照射療法の前投与又は後投与は、ＧＭ３治療と共に用いることが できる効果的な補助療法である。 本発明は、好ましい実施態様を参照して記載された。上で詳細に記載された説 明を読んで理解すれば、他の人々が修正及び変更を思い付くことは明白であろう 。本発明は、添付請求項又はこれらと同等のものの範囲内にある限り、このよう な修正及び変更のすべてを含むものと考えられるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ノール，エリザベス アメリカ合衆国、02146 マサチューセッ ツ州、ブルックリン、ダブリュー―309、 サミット アベニュー 227 (72)発明者 中辻 裕司 アメリカ合衆国、44106 オハイオ州、ク リーブランド ハイツ、オーバールック ロード ＃716 2300 (72)発明者 ブラック，ピーター，マクラーレン アメリカ合衆国、02108 マサチューセッ ツ州、ボストン、ルイスバーグ スクエア 13

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アポトーシス誘導有効量のガングリオシドＧＭ３を含む、増殖神経細胞の アポトーシスを誘導する組成。 ２．アポトーシス誘導有効量が約５μＭから約５０μＭ ＧＭ３である請求項 １に記載の組成。 ３．従来の治療アジュバントをさらに含む請求項１に記載の組成。 ４．従来の治療アジュバントが通常の生理食塩水（無菌）を含む請求項３に記 載の組成。 ５．他の化学療法剤をさらに含む請求項１に記載の組成。 ６．アポトーシス誘導有効量のガングリオシドＧＭ３を該増殖神経細胞へ導入 することを含む、増殖神経細胞のアポトーシスを選択的に誘導する方法。 ７．アポトーシス誘導有効量が約５μＭから約５０μＭである請求項６に記載 の方法。 ８．神経細胞がグリア腫瘍、グリオブラストーマ多形（ＧＢＭｓ）、アストロ サイトーマ、オリゴデンドロサイトーマの一つあるいはそれ以上である請求項６ に記載の方法。 ９．ガングリオシドＧＭ３を含む治療的に有効量の化学療法剤を該患者に投与 することを含む、脳腫瘍を有する患者の治療法。 １０．該脳腫瘍が高度あるいは低度のグリオーマあるいはアストロサイトーマ である請求項９に記載の方法。 １１．腫瘍の増殖を阻害する必要性から、単回投与、複数回投与、高分子の遅 遊離性懸濁液投与としてＧＭ３を該患者に投与することを含む請求項９に記載の 方法。 １２．該投与がＧＭ３を介し、ＧＭ３の動脈内注射、ＧＭ３の腫瘍内注射でＧ Ｍ３を腫瘍に直接投与し腫瘍層に運ばれる遅遊離性生体高分子と併用する請求項 ９に記載の方法。 １３．約１日から約６ヶ月間該投与が続く請求項１１に記載の方法。 １４．該患者においてＧＭ３が増殖神経細胞に対して選択的である請求項９に 記載の方法。 １５．脳腫瘍のＧＭ３治療と組み合わせてその前あるいはその後にアジュバン ト治療を実施することをさらに含む請求項９に記載の方法。 １６．アジュバント療法が放射線療法である請求項１５に記載の方法。 １７．脳腫瘍がグリオブラストーマ多形（ＧＢＭｓ）、アストログリオーマ、 オリゴデンドロサイトーマ、脳室上衣腫、混合グリオーマの一つあるいはそれ以 上である請求項１５に記載の方法。 １８．治療的に有効量のＧＭ３をそれを必要とする患者に投与することを含む 化学療法的養生法。 １９．ＧＭ３のアストロサイトへの投与によりｐ２７^Kip1存在量を増加させＣ ｄＫ阻害を誘導する方法。 ２０．高リン酸化網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）を同時に減少させる請求 項１９に記載の方法。