JP2002530067A - 細胞の低酸素培養 - Google Patents

細胞の低酸素培養

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞の生存、増殖、及び/又は細胞の分化を促進させる条件下での培養内細胞の育成に関する。本発明者らは、細胞培養法に従来用いられている環境酸素条件に比べて細胞を低酸素中で増殖した場合に増殖を促進させアポトーシスを減少させることを見出した。更に、本発明者らは、特定の運命への前駆細胞の分化が低酸素中で促進され、中脳前駆体を低酸素条件でエクスパンジョン及び分化させたときに非常に多くの数と割合のドーパミン作動性ニューロンが得られることを見出した。即ち、より生理的な酸素レベルでCNS前駆体の増殖及び分化が促進され、低酸素は特定のニューロンタイプのex vivo 生成を有効に補助する。これらの知見を利用する方法及び組成物が記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 アメリカ合衆国政府は、本発明／アメリカ予防衛生研究所提供グラントＮｏ．
AR40780-8およびAR42671-05並びにDARPA/AFOSRグラントNo.F49620-98-10487の条
項に従う発明において権利を有するであろう。
【０００２】 （発明の分野） 本発明は培養における細胞の育成に関する。より具体的には、本発明は、低酸
素環境条件で細胞を育成させることによって、細胞の生存、細胞の増殖および／
または固有の経路による細胞の分化を高める方法および組成物に関する。
【０００３】 （発明の背景） ドナー器官が決定的に不足する時代に、細胞移植を臨床領域に適用しようとす
る試みは差し迫った要請である（Neelakanta & Csete, 1996）。実際、細胞移植
および組織移植は、嚢胞性線維症（肺）、腎不全、退行性心疾患および神経変性
疾患を含む多様な疾患の治療的措置のための望ましい技術として今や充分に認知
されている。しかしながら、この技術は、好ましくかつ非常に要請の高い措置で
はあるが、この種の治療措置の主要な障害は、生命活性を有する分化した細胞の
利用可能な供給源の不足である。一般に分化した細胞は容易に培養でエクスパン
ジョン(expand)させることができない。したがって、生命活性を有する分化細胞
の数および／または入手可能性を高める方法が要求される。
【０００４】 中枢神経系（CNS）（脳および脊髄）は極めて再生能力が低く、このことは多
数の神経変性疾患（例えばパーキンソン病）で実証されている。そのような疾患
は薬理学的措置（パーキンソン病の場合はＬ−ドーパ）を用いてある程度制御で
きるが、神経病理学的損傷および消耗性進行を元に戻すことはできない。細胞移
植は、そのような損傷の結果を単に治療するものとは反対に、神経病理学的損傷
を回復させるための有望な選択肢を提供する。
【０００５】 培養CNS幹細胞は自己再生が可能で、マイトジェンを除いた後、稀突起神経膠
細胞、星状神経膠細胞およびニューロンを予測可能な割合で再生させる固有の能
力を有する（Johe et al.,1996)。この固有の分化能の培養時操作は、特定の分
化現象を維持したり、増幅させたりまたは減少させたりする複雑な因子群を特定
するために用いられた。そのような実験のほとんどは、局所的および遠隔的に作
用する成長因子および栄養性因子だけでなくCNS系列を規定する転写因子の主要
な役割を力説している（Johe et al.,1996, Panchinsion et al., 1998)。ドー
パミン作動性ニューロンおよびこれらの培養に由来する前駆細胞は、パーキンソ
ン病患者の細胞置換治療の有望な供給源として特に興味深い（概説：Olanow et
al., 1996)。
【０００６】 神経冠の交感神経副腎（SA）系列は、末梢神経系（ＰＮＳ）のカテコールアミ
ン作動性派生細胞の全てを形成する。これらには交感神経ニューロン、副腎のク
ロム親和性細胞、頸動脈毬細胞および小型の強度に蛍光性の（Small Intensely
Fluorescent(ＳＩＦ)）細胞が含まれる（Doupe et al., 1985, p.2119およびp.2
143）。SA由来細胞の最終分化および形成性はここ１０年以上にわたって重点的
に研究されてきた（概説：Anderson et al., 1993）。多能神経冠前駆細胞はin
vivoでSA由来細胞を生じることが観察されたが（Fraser, 1991）、どのようにし
て神経冠幹細胞（NCSC）がこの亜系列に委ねられるのかはほとんど分かっていな
い。骨形態形成タンパク質(BMP)-2、-4および-7は、ニワトリおよび哺乳類の神経
冠細胞の集団培養でSAマーカー発現の誘発物質として特定された（Varley et al
., 1995; Varley et al., 1996; Reissman et al., 1996; Lo et al., 1999）。
そのようなＢＭＰはまた、哺乳類のNCSCのクローン培養で自律神経系ニューロン
の分化を誘発できるが（Stemple, 1992)、SA系列マーカーは誘発できない（Shah
et al., 1996)。NCSCのクローン培養でSA系列の分化を達成できないということ
によって、この重要な系列の制限過程の調節メカニズムの更なる研究は大いに妨
げられた。
【０００７】 NCSCの交感神経系としての潜在能力は基礎的な興味だけでなく臨床的にも重要
である。なぜならば交感神経系列細胞はドーパミンを合成し、ドーパミン作動性
細胞はパーキンソン病を軽減するために用いられるからである（概説：Gage et
al., 1989）。パーキンソン病は黒質のドーパミン作動性ニューロンの減少によ
って引き起こされる比較的一般的な神経変性疾患である。胎児中脳（Freed et a
l., 1992）および神経冠由来副腎クロム親和性細胞（Date, 1996）または頸動脈
毬細胞（Luquin, 1999）を含む極めて多様なタイプのドーパミン作動性細胞の黒
質への移植によってパーキンソン病の症状が軽減できるが、胎児組織の供給は極
めて制限され、ドーパミン作動性細胞の自家移植さえもときには適切ではない（
Date, 1996; Stoddard et al., 1989）。このような束縛は、ドーパミン作動性
ニューロンの代替供給源を明らかにし（Zawada, 1989）、さらにドーパミン作動
性細胞を培養で増殖させる試み（Studer, 1998）を広範囲に促進させた。
【０００８】 理想的には、ex vivo培養条件は完全に忠実にin vivoの細胞環境を再現すべき
である。この考えは外移植片を用いて発生を研究する場合に特に妥当である。な
ぜならば、細胞の発育の選択および分化のための条件を特定できるからである。
CNS幹細胞の場合、特に生存、増殖およびドーパミン作動性ニューロンに至る細
胞を最大にすることがその後の細胞移植治療に必須である。したがって、そのよ
うな細胞の分化を理解し制御することは、移植または多様な条件に対するin viv
oでのCNS細胞の反応の研究で用いることができる、生命活性を有する有用な生成
物を提供するために重要である。
【０００９】 胚の発生の場合、各組織および器官は巧みに組織化された発生によって成長す
る。その場合、比較的特殊化されていないまたは”未分化”の前駆細胞または幹
細胞が、最終的に特殊な分化した特性および機能をもつ子孫を生じる。成熟組織
および器官は多くのタイプの分化細胞を含み、各細胞タイプは特定の遺伝子サブ
セットを発現させる。この遺伝子サブセットは、細胞の固有の構造、特異的機能
並びに、環境シグナルおよび栄養素と相互反応し応答する能力を順次特定してい
く。これらの分子的、構造的および機能的能力および特性が細胞の表現型を構成
する。同様に、損傷または変性成人組織が修復および再生を受ける場合、局所の
O2供給に変化が存在するとき、連携された細胞増殖および／または分化が惹起さ
れる。酸素レベルは、正常な血液供給が外傷または塞栓症的事例（心筋梗塞、卒
中など）によって減少または一過性に停止するような多くの再生例で特にいえる
ことである。
【００１０】 したがって、臨床時条件設定では、ガスは器官の生存で主要な変数として十分
に認識され、酸素はもっとも重要なガスパラメーターである。実質的に全ての近
代的細胞培養は、５％CO2および９５％空気を含むガス雰囲気中で３７℃で実施
される。このような条件は人体中心部の温度および生理的CO2濃度にほぼ完全に
適合する。例えば、脳組織の平均CO2は8kPa（60mmHg）または７％である（Hoffm
an et al., 1998）。しかしながら、注目すべきことには、標準的組織培養の酸
素は生理的組織レベルを反映せず、実際のところ明らかに酸素過剰である。
【００１１】 平均海面では、（湿り気を付与されていない）部屋の空気は２１％のO2を含み
、これは21.3kPa（160mmHg）の酸素分圧〔0.21(101.3kPa(760mmHg))〕に換算さ
れる。しかしながら、身体の平均酸素レベルはこのレベルよりはるかに低い。肺
胞空気は１４％の酸素を含み、動脈の酸素濃度は１２％で、静脈の酸素レベルは
5.3％で、組織細胞内の平均酸素濃度はわずかに３％である（Guyton, and Hall,
1996）。さらにまた、微小電極による組織酸素の直接測定によって、脳の部分
は全身の平均組織レベルよりも顕著に低い酸素レベルに通常曝されており、脳の
高い酸素利用を反映していることが明らかにされた。これらの研究は、毛細管密
度の局所的相違に起因する脳の平均酸素レベルにおける顕著な局部的変動（表１
）を明らかにした。成人における脳の平均組織酸素濃度は1.5％で（Silver & Er
ecinska, 1988）、ヒツジ胎児の平均酸素張度もまた1.6％と見積もられた（Koos
& Power, 1987）。
【００１２】
【表１】 表１：微小電極で測定したラット脳組織の局部酸素分圧 （以下の文献から引用：L. Silver, M. Erecinska, "Oxygen and ion concentra
tions in normoxic and hypoxic brain cells.", In Oxygen Transport to Tiss
ue XX, 7-15, edited by Hudetz & Bruley, Plenum Press, New York(1988)）
【００１３】 したがって上記の考察から、標準的培養条件下では周囲酸素レベルは明らかに
酸素過剰で、完全に生理的範囲内ではない。このような細胞育成条件は、脳また
は他の身体領域に移植する細胞および組織を生成するため、またはin vivoで発
生している事象の正確なin vitroモデルを提供するためには不適切である。した
がって、治療目的および研究目的で使用できる分化細胞を製造する方法がなお必
要である。本発明は、そのような方法を提供することを目的とする。
【００１４】 本発明は、より忠実に生理的酸素状態を模倣するために低酸素環境条件で細胞
を育成することを目的とする。そのような状態で細胞を育成することによってあ
る驚くべきかつ予期せぬ結果が得られた。これらの結果を利用し、本明細書でさ
らに詳細に開示する。より具体的には、本発明は、細胞の生存度、細胞の増殖お
よび／または固有の経路による細胞の分化を高めるためにそれぞれ別個に有用な
方法を開示する。
【００１５】 ある実施態様では、本発明は、未分化の中枢神経系（CNS）細胞を低酸素環境
条件で培養することを含む細胞分化を高める方法を開示する。この場合、低酸素
環境条件は神経細胞の細胞分化を促進する。低酸素環境条件の定義は本明細書の
他の場所で極めて詳しく説明する。しかしながら、ある実施態様では、低酸素環
境条件は約0.25％から約18％酸素の周囲酸素条件を含む。他の実施態様では、周
囲酸素条件は、約0.5％から約15％酸素の周囲酸素条件を含む。さらに他の実施
態様では、低酸素環境条件は、約１％から約10％酸素の周囲酸素条件を含む。さ
らに他の実施態様では、低酸素環境条件は、約1.5％から約６％酸素の周囲酸素
条件を含む。もちろんのこと、これらは培養で使用可能な周囲酸素条件の代表的
範囲であって、一般にこのような範囲のいずれかに含まれるか、またはCNS細胞
の生理的酸素状態に類似するこれらの範囲のいずれの酸素状態も当業者は利用す
ることができることは理解されるところである。したがって当業者は、酸素培養
条件を0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、
7％、7.5％、8％、8.5％、9％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、
14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％に設定するか
、またはこれらのいずれかの数字の間の任意の他の酸素条件に設定することがで
きるであろう。
【００１６】 開示される方法で用いられる細胞はCNS研究のために日常的に用いられるいず
れの細胞でもよい。したがって、細胞は初代組織培養細胞でも細胞株に由来する
ものでもよい。細胞は胎児細胞でも成人の細胞でもよい。個々の実施態様では、
細胞は、中枢神経系幹細胞、脊髄由来前駆細胞、神経膠細胞、星状神経膠細胞、
ニューロン幹細胞、中枢神経系神経冠由来細胞、ニューロン前駆細胞、ニューロ
ン細胞、肝細胞、および骨髄由来細胞から成る群から選択できるであろう。好ま
しい実施態様では、外側神経節前駆細胞、皮質前駆細胞、星状神経膠細胞または
神経芽細胞であろう。 本方法は、分化の量、レベルまたは程度を決定することを含むであろう。当業
者は、細胞の分化を測定するために用いられる技術に精通しているであろう。分
化は、分化に固有の表現型を細胞でモニターすることによって測定できる。例え
ば、分化固有表現型は、メッセージレベル、タンパク質レベル、細胞内分布、機
能アッセイ、または形態変化をモニターすることによって測定できる。
【００１７】 メッセージレベルの測定に用いることができる技術には種々の技術があり、PC
R（登録商標）、in situハイブリダイゼーション、ＲＮＡ分解酵素保護アッセイ
、または単一細胞PCR（登録商標）が含まれるが、ただしこれらに限定されない
。個々の実施態様では、本発明は、ネスチン、チロシンヒドロキシラーゼ、GAPD
H;BDNF;GDNF;FGFR3;En1;FGF8;SHH;Ptx3;NuRR1;VEGF;EPO;HIFLαまたはVHLのメッ
セージレベルをモニターできる。もちろんのこと、これらはCNS細胞のための代
表的分化マーカーまたは酸素に対する細胞反応マーカーであり、当業者は、煩雑
な実験を実施することなく本明細書に特に記載したマーカーに代わって別の同様
なマーカーを代用することができる。他の実施態様では、タンパク質レベルが、
例えば抗体染色、ＨＰＬＣ、ウェスタンブロッティングまたは免疫沈澱を用いて
モニターされる。より具体的な実施態様では、モニターされるタンパク質レベル
は、ネスチン、チロシンヒドロキシラーゼ、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼま
たはドーパミントランスポーターのレベルである。機能アッセイは、典型的には
選択したCNS細胞の特定の機能をモニターするアッセイであろう。特に有用な機
能アッセイは、ドーパミン産生速度をモニターするものであろう。
【００１８】 本発明の好ましい特徴は、２０％酸素インキュベーターの条件で育成した同様
な細胞集団と比較したとき、低酸素条件ではドーパミン作動性ニューロンが豊富
な細胞集団が産生されるということである。別の好ましい実施態様では、２０％
酸素インキュベーターの条件で育成した同様な細胞集団と比較したとき、低酸素
条件はセロトニン作動性ニューロンが豊富な細胞集団を産生する。さらに別の実
施態様では、２０％酸素インキュベーターの条件で育成した同様な細胞集団と比
較したとき、低酸素条件はGABA作動性ニューロンが極めて少ない細胞集団を産生
する。さらにまた、本発明のある方法では、低酸素条件は、２０％酸素インキュ
ベーターの条件で育成した同様な細胞集団と比較したとき、グルタミン酸作動性
ニューロンが極めて少ない細胞集団を産生する。
【００１９】 好ましい実施態様では、本方法は、ニューロン増殖刺激物質、マイトジェン、
サイトカイン、神経保護因子または抗アポトーシス剤の存在下で細胞を育成する
ことを含む。本発明者らは、２０％O2に対し低酸素での培養の結果、EPO発現が
顕著に増加することを見出した。ある実施態様では、分化表現型は、低酸素環境
条件から２０％酸素培養状態へ細胞を移した後も維持される。ある実施態様では
、細胞は、２０％酸素培養状態に移す前に数世代低酸素環境条件で育成すること
ができる。他の実施態様では、細胞は低酸素環境条件で連続して維持することが
できる。 本発明の別の特徴では、低酸素環境条件で細胞を育成することを含む、培養CN
S細胞のアポトーシスを抑制する方法が提供される。
【００２０】 さらに別の実施態様では、細胞を低酸素環境条件で育成することを含む培養CN
S細胞のエクスパンジョン(expansion)を増強する方法が提供される。この場合、
２０％酸素インキュベーターの条件で細胞を育成した場合と比較して細胞は低酸
素環境条件でエクスパンジョンの強化を示す。 さらに別の実施態様では、本発明はさらに、低酸素環境中でCNS細胞を育成す
ることを含む、培養細胞の増殖を高める方法を提供する。この場合、２０％酸素
インキュベーターの条件で細胞を育成させた場合と比較して低酸素環境条件での
育成は細胞分裂を高める。 さらにまた、CNS細胞集団を得て、それら細胞を低酸素環境条件で育成するこ
とを含む、神経変性疾患に対抗して使用される細胞を調製する方法が提供される
。この場合、低酸素環境条件は神経変性疾患で重要な遺伝子の発現を高める。あ
る実施態様では、前記神経変性疾患はパーキンソン病で、前記遺伝子はチロシン
ヒドロキシラーゼ（TH）である。
【００２１】 本方法はさらに、ドーパミン生合成タンパク質をコードする第一のポリヌクレ
オチドと、前記タンパク質の発現に適した条件下で細胞と接触させることを含み
、この場合、前記ポリヌクレオチドは前記細胞で活性を有するプロモーターの転
写制御下にある。さらに、本方法は、ドーパミン放出タンパク質をコードする第
一のポリヌクレオチドと、前記タンパク質の発現に適した条件下で細胞を接触さ
せることを含み、この場合、前記ポリヌクレオチドは前記細胞で活性を有するプ
ロモーターの転写制御下にある。さらにまた、ドーパミン放出タンパク質をコー
ドする第二のポリヌクレオチドと、前記タンパク質の発現に適した条件下で細胞
と接触させることを含む方法もまた提供され、この場合、前記ポリヌクレオチド
は前記細胞で活性を有するプロモーターの転写制御下にある。他の実施態様では
、ドーパミン生合成タンパク質をコードする第二のポリヌクレオチドと、前記タ
ンパク質の発現に適した条件下で細胞と接触させることが含まれ、この場合、前
記ポリヌクレオチドは前記細胞で活性を有するプロモーターの転写制御下にある
。
【００２２】 より具体的な実施態様では、ドーパミン生合成タンパク質は、TH；Ｌ−アミノ
酸デカルボキシラーゼ（AADC）、エリスロポイエチン、またはドーパミン生合成
に直接または間接的に関与する任意の他のタンパク質であろう。ドーパミン放出
タンパク質は濾胞性モノアミントランスポーター（VMAT）で、これはＶＭＡＴ１
またはＶＭＡＴ２であろう。ある実施態様では、第一および第二のポリヌクレオ
チドは異なるプロモーターの制御下にある。前記プロモーターは、使用される細
胞で機能を有する、当業者に既知の任意のプロモーターである。例えば、プロモ
ーターは、CMVIE、SV40IE、β−アクチン、THプロモーター、AADCプロモーターお
よびネスチンプロモーターであろう。第一およに第二のポリヌクレオチドは各々
ポリアデニル化シグナルに共有結合によって連結されているであろう。
【００２３】 さらにまた本方法にしたがって製造される細胞も本発明に包含される。本方法
は、出発CNS細胞を得て、前記細胞を分化ニューロン細胞を産生する低酸素環境
条件で細胞を育成することを含む。ある実施態様では、前記出発細胞はネスチン
陽性細胞である。より具体的には、低酸素環境条件は、従来の培養条件よりもよ
り迅速により大量にネスチン陰性分化細胞を産生する。ある実施態様では、低酸
素環境条件はTH陽性細胞を産生する。他の実施態様では、細胞はさらに外因性遺
伝子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含み、この場合前記ポ
リヌクレオチドはプロモーターに機能的に連結されている。
【００２４】 本発明の別の特徴では患者のパーキンソン病を治療する方法が提供される。本
方法は、前記患者に移植するために適した細胞を入手し、前記細胞を低酸素環境
条件で育成し、さらに低酸素環境条件で育成した細胞を前記患者に移植すること
を含み、この場合、２０％酸素インキュベーターの状態で育成させた同様な細胞
と比較したとき、移植細胞は患者でのドーパミン産生能力が増強されている。あ
る実施態様では、細胞は、前記患者から得られ、ドーパミン産生を増加させるタ
ンパク質を発現するポリヌクレオチドで形質導入され、低酸素環境条件で処理ま
たはエクスパンジョンされる。他の好ましい実施態様では、細胞は患者以外の供
給源に由来するCNS細胞である。好ましい実施態様では、細胞は、ドーパミン産
生を増加させるタンパク質を発現するポリヌクレオチドで形質転換され、低酸素
条件で処理またはエクスパンジョンされる。
【００２５】 ある実施態様では、神経冠幹細胞（NCSC）の生存、増殖または分化を強化する
ために、少なくとも１つのNCSCを培養する方法が提供される。本方法は低酸素環
境条件でNCSCを培養することを含み、この場合、環境酸素状態で培養されたコン
トロールNCSCと比較して生存、増殖または分化が強化されている。 ある特徴では、NCSCの分化を強化する方法が提供される。この場合、分化はニ
ューロンへの分化である。好ましい実施態様では、分化は交感神経副腎系列また
はコリン作動性系列の細胞への分化である。別の実施態様では、分化は感覚ニュ
ーロンへの分化である。別の特徴では、分化はドーパミンおよびノルエピネフリ
ンを産生する表現型への分化である。また別の特徴では、分化は副腎クロム親和
性細胞、小型の強度に蛍光性の細胞、または交感神経ニューロンへの分化である
。 神経冠幹細胞は単一の単離した細胞であってよい。さらにまた、神経冠細胞は
初代培養源または培養から得ることができる。本方法は、患者に移植するために
用いることができる細胞の貯蔵および形成を含む多数の方法に適用できる。患者
は、神経変性疾患をもつ個体または前記疾患の動物モデルであろう。
【００２６】 さらに別の特徴では、少なくとも１つの未分化細胞を培養してドーパミンおよ
びノルエピネフリンを産生する細胞を形成する方法が提供される。ある実施態様
では、本方法は、前記細胞を低酸素環境条件で培養しドーパミンおよびノルエピ
ネフリンを産生する細胞を形成することを含む。 他の好ましい実施態様では、本発明は、前駆細胞または幹細胞を単離し、維持
し、増殖もしくは濃縮する方法、および／またはそのような細胞の特定組織タイ
プへの分化開始もしくは分化の動的態様に影響を与える方法を提供する。本方法
は、１つまたは２つ以上の分化表現型を有するかまたはそのような表現型をもつ
細胞を産生できる子孫細胞を産生する能力を有する少なくとも１つの前駆細胞ま
たは幹細胞を含む哺乳類組織に由来する細胞を入手し、さらにそのような哺乳類
組織（種々の器官および組織タイプ）に由来する細胞を、経験的に決定される大
気より低い酸素状態で十分な時間適切な培養液中で培養して、幹細胞もしくは前
駆細胞集団の生存、増殖または濃縮を促進させるか、または１つまたは２つ以上
の分化経路を開始させるかまたは影響を与えることを含む。
【００２７】 本発明のある特徴では前駆細胞／幹細胞の収量を操作する方法が提供される。
本方法は以下を含むいくつかの実施態様を有する：大気より低い酸素状態／生理
的酸素状態を用いて幹細胞および／または前駆細胞を培養するかまたは濃縮する
；大気より低い酸素状態を用いて、未特定の幹細胞または前駆細胞を単離／特定
する；大気より低い酸素状態／生理的酸素状態を用いて、幹細胞および／または
前駆細胞集団からの発生の動的態様を変化させるかまたは前記集団の分化を促進
する；大気より低い酸素状態／生理的酸素状態を用いて再生を強化し、大気より
低い酸素状態／生理的酸素状態を用いて、特定細胞の発育を選択、促進またはま
たは強制する。
【００２８】 本発明は、前駆細胞もしくは幹細胞、それらの子孫細胞および他の”夾雑”細
胞を含む細胞集団中の前駆細胞もしくは幹細胞を濃縮する方法を含む。本方法は
、分化子孫を産生する能力を有する少なくとも１つの幹細胞または前駆細胞を含
む哺乳類細胞集団（成人または胚性；１つまたは２つ以上の固形組織タイプに由
来）を入手し、哺乳類組織に由来する細胞を適切な培養液中で、それら細胞が得
られた組織の生理的酸素供給を反映させる酸素レベル下または低酸素条件で十分
な時間培養し、前記培養中の前駆細胞／幹細胞集団を集団中の１つまたは２つ以
上の他の細胞タイプと比較して濃縮させる。
【００２９】 さらに本発明に含まれるものは、大気より低い酸素状態／生理的酸素状態を使
用して、未特定の幹細胞／前駆細胞を単離／特定することである。本実施態様で
は、幹細胞および／または前駆細胞および分化細胞の多様な細胞から成る、器官
または組織系に由来する培養が樹立される。酸素の用量反応実験が実施される。
この場合、並行培養を１２％（ほぼ成人の動脈レベル）から徐々にレベルを下げ
た酸素に暴露する。この目的は、幹細胞および／または前駆細胞の絶対数を増加
させるか、培養で他の細胞に優先してそれらを生存させるか、または選択的に増
殖させるか、またはそれら効果の組み合わせが得られる酸素レベルを特定するこ
とである。これらの事例の何れにおいても、通常は稀少な幹細胞および／または
前駆細胞集団の特定および性状決定を容易にするために、大気より低い酸素が用
いられる。
【００３０】 本発明の別の実施態様は、前駆細胞および／または幹細胞を生理的酸素レベル
／大気より低い酸素レベルに暴露することによって、それら細胞から多様な細胞
タイプへの分化の動的態様および分化収量を変化させることを含む。本実施態様
では、未分化幹細胞および／または前駆細胞状態から分化表現型をもつ細胞への
進行の動的態様を変化させるために、大気より低い酸素が用いられる。この動的
態様における変化は、細胞タイプおよび培養条件にしたがって促進または減速さ
れるであろう。さらにまた、大気より低い酸素の使用によって、分化する幹細胞
または前駆細胞の割合を増加または減少させることができるであろう。どのよう
に適用するかによって、そのような減少または増加が所望できるであろう。 別の実施態様では、大気より低い酸素を用いて、先ず幹細胞および／または前
駆細胞プールをエクスパンジョンし、そのプールから続いて再生を進行させるこ
とができる。組織／器官を再生させることができる最初のプールでは数を増加さ
せるので、分化細胞に再生する最終的な量もまた増加する。
【００３１】 本発明の他の目的、特色および利点は以下の詳細な説明によって明らかとなろ
う。しかしながら、詳細な説明および個々の実施例は本発明の好ましい実施態様
を示すが、当業者には本発明の範囲内で多様な変更および改変が本詳細な説明に
基づいて可能であるのでそれらは単に説明として提示される。
【００３２】 細胞移植療法が広くかつ一般的に用いられるようになるためには、適切に分化
した生命活性を有する細胞が入手できることが必要である。好ましくは、これら
の細胞は、凍結保存しても表現型の完全性が低下しない十分な復元力を有する必
要がある。細胞を周囲大気O2レベル（以下では従来のO2状態または２０％O2培養
状態と呼ぶ）で成育させる高インキュベーター酸素レベルはそのような細胞の産
生を促進しない。これらの細胞はしばしば、役に立つほど十分な数では生存せず
増殖せずまたは分化しない。従来の培養でこれらの細胞を増殖させた場合、移植
での使用はいうまでもなく、最良の場合でもin vitroのモデルアッセイ実験にも
不適切な細胞しか得られない。
【００３３】 本発明は、分化し生命活性を有し凍結保存に耐える細胞を製造するための方法
および組成物を提供することを目的とし、さらに、in vivoでの条件設定でその
ような細胞がどのような生化学的動態を有するかについての正確な指標を提供す
る。したがって、本方法は、性状決定実験を実施するためにin vitroで用いるか
、または疾患、外傷による損傷、虚血または薬剤誘発損傷によって障害された細
胞のための置換治療としてin vivoで用いることができる細胞を提供するであろ
う。さらに、本方法は、移植にも用いることができる未分化の前駆細胞の生存の
強化をもたらすことは特記されるべきである（これら未分化の細胞は適切な環境
状態に置かれたとき適切な分化経路をたどるであろう）。
【００３４】 本発明は特に、大気より低い／生理的酸素レベルの培養条件を用いてニューロ
ン細胞集団を培養しこれを濃縮することを含む。この細胞集団は、特定のニュー
ロン表現型を発現させるためにエクスパンジョンおよび／または分化させた細胞
を含む。細胞分化の増加とは、原始的な未分化状態から特定の細胞表現型（ドー
パミン作動性表現型；GABA作動性表現型；セロトニン作動性表現型など）が発現
されている細胞へと細胞プロセスが変換されるようなものである。特に、低O2状
態での成育はドーパミン作動性およびセロチン作動性ニューロン集団の濃縮をも
たらし、一方、GABA作動性およびグルタミン酸作動性ニューロンは比較的減少す
るようである。これらの濃縮された集団を、例えばセルソーティングのような方
法によってさらに濃縮することができる。
【００３５】 あるいは、本方法によって生じる分化の増加は、(未分化状態にとどまるもの
と対照的に)分化に向かう細胞の相対百分率が低酸素では増加するものであろう
。しかしながら、多能細胞系統を低酸素保温状態下でin vitroでインキュベーシ
ョンすることによって、細胞集団の分化の方向を操作または曲げることができる
であろう。したがって、分化経路はガスの影響下で変化するので、集団内の１つ
のタイプの細胞の数および百分率が増加または減少するように制御するために酸
素が用いられる。生理的または低酸素レベルによるCNS細胞の濃縮は、したがっ
て以下を含む１つまたは２つ以上のメカニズムの結果であろう：（１）CNS細胞
の絶対数の増加、（２）CNS細胞の選択的生存による濃縮、（３）それらの選択
的増殖によるCNSの濃縮、（４）特定の分化経路の増加。同様に、これらの方法
は幹細胞／前駆細胞の濃縮のために用いられる。低酸素または生理的酸素状態は
、濃縮される固有の細胞タイプに応じて、または個々の出発細胞集団およびその
生理的状態に応じて、単離時からまたはしばらく後（例えば細胞が組織培養プレ
ートに付着してから）または分離プロセスの間中ずっと濃縮プロセスの不可欠要
素である。
【００３６】 CNS、幹細胞または前駆細胞数の増加はいずれも、より多くの細胞をより大き
な新しい組織の再生に利用できるということで重要である。たとえ数の増加がな
くとも、総細胞数の制限が妥当である場合、または混入する非CNS前駆細胞の影
響が所望の出現に対して若しくは物質を充分に特定することに関して陰性である
とき、濃縮は重要である。CNS、幹細胞または前駆細胞の生存の強化はいずれも
（細胞数の増加がなくとも）、または細胞タイプの濃縮はいずれも、培養が必要
とされる設定では有用である（すなわち、細胞療法の施術前に組織を取り扱うた
めに、または細胞をその間生存させておかねばならない他の一切の操作（例えば
遺伝子トランスフェクション、薬剤処置、または細胞タイプ分けもしくは他の付
加的操作による濃縮）を可能にするために）。
【００３７】 本発明のある実施態様は、大気より低い培養状態でCNS細胞（または実際のと
ころ任意の多能幹細胞）を成育させることによってアポトーシス性および非アポ
トーシス性細胞死レベルが減少することを示す。細胞の生存増加は、おそらくア
ポトーシスの抑制および非アポトーシス細胞死の抑制の両方によるものであろう
。アポトーシスまたはプログラムされた細胞死は周知の現象で、当業者によく知
られた技術によって測定できる。 本発明のある特徴では、少なくとも１つの神経冠幹細胞（NCSC）を培養しNCSC
の生存、増殖または分化を強化する方法が提供される。好ましい実施態様では、
本方法は、少なくとも１つのNCSCを低酸素環境条件で培養することを含み、この
場合、周囲酸素条件で培養されたコントロールのNCSCと比較して、生存、増殖ま
たは分化が強化される。 したがって低酸素環境条件は、CNS細胞の分化を促進し、培養細胞のアポトー
シスを抑制し、細胞のエクスパンジョンを増強し、あるいはそのような細胞を移
植で使用しやすくするために用いられるであろう。そのような方法および組成物
は以下でさらに詳細に説明する。
【００３８】 定義 この章では、本発明のいっそうの理解を進めるために本発明で使用される用語
の定義を示す。 ”幹細胞”は、比較的未分化の細胞であって、誘導して増殖させすることがで
き、その後１つまたは２つ以上の成熟細胞タイプに分化するが、一方、親の発生
潜在能力もまた保持する子孫を産生することができる。多くの生物学的事例では
、幹細胞はまた、２つ以上の別の細胞タイプの子孫を産生できるので”多能”で
あるが、しかしながらこのことは”幹細胞”の要件ではない。自己再生は幹細胞
定義におけるまた別の古典的不可欠要素で、本明細書で用いられるとおり本質的
要件である。理論的には自己再生は２つの主要なメカニズムのどちらかによって
生じるであろう。幹細胞は非対称的に分裂し、１つの娘細胞は幹細胞状態を保持
し、他方の娘細胞は異なる他の固有の機能および表現型を発現することがある。
あるいは、集団中の幹細胞のいくつかは対称的に２つの幹細胞に分裂することが
でき、したがって集団内で全体としていくつかの幹細胞を維持することができる
が、一方、集団内の他の細胞は分化子孫のみを産生する。形式的には、幹細胞と
して開始する細胞は分化表現型に向かって進化していくが、その後”復帰”して
幹細胞表現型を再度発現することが可能である。個々の表現型が形成されるある
特徴では、種々の細胞が使用されるであろう。好ましい実施態様では、分化細胞
はドーパミンおよびノルエピネフリンの両方を産生する。ある実施態様では前駆
細胞または幹細胞が利用される。
【００３９】 本明細書で用いられるように、”神経冠幹細胞”という用語は、神経冠から派
生する細胞を意味し、（１）自己再生および（２）非対称性分裂という特性を有
することを特徴とする。すなわち、１つの細胞が分裂して２つの異なる娘細胞を
産生し、これら娘細胞の１つはそのもの自身（再生）で、他方は、親の神経冠幹
細胞と比較してより限定的な発生潜在能をもつ。しかしながら、前述の説明は、
神経冠幹細胞の毎回の分裂が非対称性分裂を生じるという意味に解してはならな
い。神経冠幹細胞の分裂は、自己再生のみ、発性的により限定された子孫のみ、
または自己再生幹細胞と限定的発生能をもつ細胞を生じることができるであろう
。神経冠は末梢神経系（ＰＮＳ）を生じる。
【００４０】 ”前駆細胞”は、より原始的な細胞表現型を有する（すなわち発生経路または
進化において完全に分化した細胞よりもより初期の段階にある）。しばしば、前
駆細胞は顕著なまたは極めて高い増殖能を有する。前駆細胞はまた、細胞が発生
し分化する環境および発生経路に応じて複数の別個の分化細胞タイプまたはただ
１つの分化細胞タイプを生じる。幹細胞と同様に、前駆細胞として始まる細胞は
分化表現型に向かって変化をとげるが、”復帰”して前駆細胞表現型を再発現す
ることがある。
【００４１】 ”分化”は発生過程を指し、その過程によって細胞は固有の表現型を身につけ
る（すなわち、他の細胞タイプから区別される１つまたは２つ以上の特性または
機能を獲得する）。ほとんどの場合、分化表現型は、ある発生経路の成熟終末点
にある細胞表現型を指す。多くの組織（ただし全てではない）では、分化の過程
は細胞サイクルから退出することと連携しており、このような事例では、細胞は
、それらが分化したとき増殖能を失うかまたは増殖能は極めて制限される。した
がって、ある実施態様では、低酸素条件は、環境酸素条件と比較して高い割合の
ニューロン単独コロニーおよび低い割合のニューロン非含有コロニーをもたらす
。好ましい実施態様では、環境酸素条件で１／３のコロニーが全てニューロンで
ある場合は、低酸素環境条件では２／３のコロニーが全てニューロンである。他
の実施態様では、全てがニューロンであるコロニーの割合は２５％から５０％、
より好ましくは５０％から１００％、より好ましくは１５０％から２００％、さ
らに好ましくは３００％または４００％増加する。
【００４２】 本発明のある特徴では分化は特定の表現型に向かう。好ましい表現型は、以下
の１つまたは２つ以上を発現する細胞を含む：チロシンヒドロキシラーゼ、ドー
パミンβ−ヒドロキシラーゼおよび交感神経副腎系列固有抗原SA−１。別の実施
態様では、細胞は分化してＰＮＳ感覚細胞、交感神経副腎細胞またはコリン作動
性細胞に成る。好ましい実施態様では、本方法はドーパミン作動性またはノルア
ドレナリン作動性細胞を産生するために用いられる。
【００４３】 ある特徴では生存が強化される。本明細書で用いられるように、”生存”はア
ポトーシス性および非アポトーシス性細胞死のどちらかの遅延または速度低下を
含む。細胞の生存強化はいずれも多くの有用性を提供する。例えば、生存は、細
胞療法を施す前の組織の取り扱い、またはその間に細胞が生存していなければな
らない任意の他の方法（例えば遺伝子のトランスフェクション、薬剤処置、また
は細胞のタイプ分けもしくは他の付加的な操作による濃縮）を容易にする。好ま
しい実施態様では、生存は、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０
％、もっとも好ましくは少なくとも３０％増加する。例えば好ましい実施態様で
は、環境酸素中で培養から添加される細胞の約３５％がコロニーを形成する場合
、低酸素環境条件では約４８％の細胞がコロニーを形成する。他の好ましい実施
態様は、少なくとも５０％、または７５％から１００％、または２倍または３倍
の生存率の強化を含む。
【００４４】 本発明の別の実施態様では、神経冠幹細胞は低酸素中でよりいっそう多系列コ
ロニーを形成しやすい。好ましくは、低酸素条件は、すくなくとも１０％または
２０％増加、より好ましくは３０％から４０％増加、さらに好ましくは少なくと
も５０％から６０％増加をもたらす。例えば、周囲酸素中では、コロニーの４８
％のみが多系列（ニューロン、シュワン細胞および筋線維芽細胞を含む）（残り
がシュワン細胞）である場合、低酸素条件は少なくとも８０％が多能であるコロ
ニーを生じる。
【００４５】 本発明のさらに別の特徴では増殖が強化される。”増殖”は、細胞の分裂によ
る集団内の細胞の数の増加（成育）を指す。細胞増殖は、一般に環境（成長因子
および他のマイトジェンを含む）に対する反応における多数のシグナルトランス
ダクション経路の協調的活性化から生じると理解されている。細胞増殖はまた、
細胞増殖を阻止するかまたは負の影響を与える細胞内もしくは細胞外シグナルの
作用から開放されることによって促進される。好ましい実施態様では、増殖は少
なくとも１０％から５０％、より好ましくは少なくとも５０％から１００％増加
し、さらに好ましくは、増殖は２倍から３倍または４倍から５倍になる。もっと
も好ましくは、低（または減少ともいう）酸素中の細胞は、環境条件で増殖させ
た場合の約２倍の細胞を含むコロニーを形成する。
【００４６】 本明細書で用いられる”低酸素環境条件”という語句は、大気酸素より少ない
任意の培養条件を指す。さらにまた、本明細書では前記語句は、時には”大気よ
り低い”状態または”低酸素”状態と互換的に用いられる。低酸素環境条件は、
一般に、平均海面で約２０％未満、好ましくは約１５％未満、より好ましくは約
１０％未満の任意の酸素濃度を指す。本発明では、”低酸素環境条件”という語
句によって、本発明は、大気より低い酸素での任意の培養条件を意味する。した
がって個々の実施態様では、低酸素環境条件は、約0.5％から約１８％の間とし
て定義される。理想的には、培養酸素条件は、細胞が正常な生理的酸素条件に可
能な限り近く保たれる。この条件は、in vivoにおいて特定の細胞がよりよい状
態で見出されるものである。これは明らかに、細胞について用いられる状態は個
々の細胞の発生局所にしたがって左右されることを意味している。例えば、肺胞
に由来する細胞は約１４％酸素での成育を好み、動脈に由来する細胞は約１２％
の酸素濃度を好むであろう。一方、脳のある局所に由来する細胞は約1.5％の低
い酸素状態を好むであろう。好ましくは、培養酸素条件は、可能なかぎり個々の
細胞がin vivoで見出される正常な生理的酸素状態近くに保たれる。したがって
、いくつかの実施態様では、細胞について用いられる状態は、個々の細胞の由来
局所によって左右されるであろう（そのような状態は当業者には知られている）
。”生理的”酸素レベルは、健康な組織および器官で通常見出される範囲の酸素
レベルである。
【００４７】 ”大気より低い”状態とは、海面において約２０％未満、好ましくは約１５％
未満、より好ましくは約１０％未満の任意の酸素濃度を指す。本明細書では大気
より低いという用語は、上記で定義した”低酸素環境条件”と互換的に用いるこ
とができる。 ”大気O2条件”とは、大気で見出される酸素条件、すなわち２０−２１％O2で
ある。本明細書で用いられるように、この用語は、従来の組織培養インキュベー
ターが大気酸素条件で保持されるとき、”従来の”O2条件という用語と互換的に
用いられる。 ”生理的”酸素レベルは、健康な組織および器官で通常見出される範囲の酸素
レベルである。このようなレベルは組織タイプにしたがって変動する（表１）。
しかしながら、この割合は全ての組織で１５％より低く、ほとんどの組織で８％
より低い。したがって、生理的酸素レベルは、測定される身体局所にしたがって
約15％から約1.5％の範囲であろう。
【００４８】 ”低酸素症”は、通常の生理的レベルの酸素が細胞または組織に供給されない
ときに生じる。”低酸素環境条件”は”低酸素症的”条件と同じものであると解
するべきではない。低酸素環境条件は生理的条件を模倣しようとするものである
。本明細書で定義されるように、”低酸素症的条件”は、酸素レベルが0.1％O2
未満のものである（Gross et al., 1999）。 ”酸素正常条件”は、問題の個々の細胞タイプ、細胞状態または組織について
通常の生理的レベルの酸素を指す。 ”無酸素症”は酸素がない状態である。”低酸素症的状態”は細胞の低酸素症
をたらすものである。これらの状態は、細胞タイプおよび個々の構造または組織
もしくは器官内の細胞の存在場所並びに細胞の代謝状態に左右される。重要な点
は、過去２５年間の細胞生物学研究のほとんどで、２０−２１％の環境大気酸素
レベルが日常的に用いられ、実験的に”正常酸素条件”であるとされたが、この
仮定は生理学的には誤りである。このような経緯で、多くの細胞培養に関する文
献は、環境大気より低い酸素を含む一切の状条件を”低酸素症的”と呼んだが、
この用い方もまた生理学的に正確ではない。
【００４９】 ”アシドーシス”はｐＨが正常な生理的レベルより低いことを意味する。 細胞の”濃縮”は、１つのタイプの細胞の収率（割合）が出発培養または調製
物における割合より増加することを意味する。 ”増殖”は、細胞の分裂による集団内の細胞の数の増加（成育）を指す。細胞
増殖は、一般に環境（成長因子および他のマイトジェンを含む）に対する反応に
おける多数のシグナルトランスダクション経路の協調的活性化から生じると理解
されている。細胞増殖はまた、細胞増殖を阻止するかまたは負の影響を与える細
胞内もしくは細胞外シグナルの作用から開放されることによって促進される。 ”再生”は、疾患または外傷後の細胞集団、器官または組織の再増殖を意味す
る。 本明細書で用いられる他の用語は、別に記載がなければ当業者によって一般的
に割り当てられた意味を有する。
【００５０】 中枢神経系細胞 前述のように、本発明の特定の利点は、神経変性障害を軽減するために使用す
ることができるような生存可能な細胞又は組織を生じるためにこれを使用するこ
とができることである。このような細胞又は組織は移植時に、移植片と称される
。移植用細胞は、卒中、脳及び脊髄の損傷、アルツハイマー病、ハンチントン病
及びその他の神経変性障害のためのヒト又は動物の神経；てんかんのための中隔
及びGABA作動性細胞；パーキンソン病の治療のための腹側(ventral)中脳又は他
のCNSドーパミン作動性細胞；並びに、神経系疾患のため、又は特定の精神障害
までもの栄養因子分泌細胞を含むが、これらに限定されるものではない。移植片
として使用される細胞は、初代組織から又は特定の細胞株さえからも由来するこ
とができる。更に、本願明細書を通じて言及されたあらゆる細胞型は、成熟細胞
であるか又は胎児起源のものであることは理解されなければならない。
【００５１】 本発明は、神経疾患の治療のために、増殖及び分化する分化した神経幹細胞を
生じるであろう。未分化の神経前駆細胞は、ニューロン及びグリア細胞を生じる
神経芽細胞及びグリア芽細胞に分化する。発生時に、神経管に由来する細胞は、
CNSのニューロン及びグリア細胞を生じる。発生時に存在する特定の因子、例え
ば神経成長因子(NGF)は、神経細胞の増殖を促進する。神経幹細胞及び前駆細胞
を単離及び培養する方法は、当業者には周知である(Hazel及びMuller、1997年；
米国特許第5,750,376号)。
【００５２】 本願明細書に示されたいずれかの方法に関して、1又はクローン密度の複数個
の細胞が好ましい。本願明細書において使用される用語「クローン密度」とは、
培養皿に播種した場合に、衝突しない単一細胞の単離を生じるのに十分な程低い
密度であり、概して約225個細胞／100mm培養皿を意味する。更にこれらの細胞は
、成人又は胎児を起源とする初代又は培養物であることができる。更に、ヒト細
胞が好ましいが、哺乳類細胞のいずれかを本発明において使用することができ、
これはマウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ラット、ウサギ及び霊長類由
来の細胞を含む。適当な固形組織の具体的な例は、脳組織に由来したニューロン
又は中枢神経の支持細胞、生殖細胞又は胚性幹細胞を含む。いずれか他の固形臓
器(肝、膵、脾、腎、甲状腺など)又は髄、脾もしくは血液から単離された幹細胞
及び前駆細胞も、生理的又は低酸素状態下で培養し易い候補である。これまでに
文献において同定されていない固形組織(固形組織から外れるのは、血液、血漿
及び骨髄を含む全血である)から単離された幹細胞及び前駆細胞も、本発明の範
囲内である。
【００５３】 ある実施態様において、環境酸素条件中でコロニーのおよそ1/6がニューロン
を有さないならば、低い環境酸素条件中ではコロニーのおよそ1/20がニューロン
を有さない。別の実施態様において、ニューロンを有さないコロニーの割合は、
少なくとも25％〜50％、より好ましくは50％〜100％、より好ましくは150％〜20
0％、並びにより好ましくは200％〜300％、又は400％増大する。
【００５４】 Hazel及びMullerは、胎仔及び成体の両ラット脳に由来するラット脳神経上皮
幹細胞の単離、培養、及び分化の方法を説明している。簡単に述べると、神経前
駆細胞を胎仔ラットの中枢神経系の望ましい領域から切り出し、単細胞浮遊液へ
と分離し、かつ組織培養皿上のマイトジェン塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)を
含有する培地中に播種した。最初に、分化したニューロンの多くが死滅する。そ
の後増殖中の細胞が緩衝溶液中に収集される。継代された細胞は、多能性前駆細
胞について比較的均質である。ニューロン及びグリア細胞への分化を誘導するた
めに、bFGF含有培地を取り除き、bFGF非含有培地と交換する。
【００５５】 このような幹細胞単離から出発するプロトコールにおいては、幹細胞プールを
濃縮しかつより多数の細胞への分化を増強するために、大気中よりも低い培養条
件を用いることができる。細胞の「濃縮(enriching)」とは、ある種の細胞の収
量(画分)が、出発培養物又は調製物の細胞画分よりも増大することを意味する。
より分化した脳細胞において特定の遺伝子産物をアップレギュレートするために
は、最初に播種しかつ分裂した後には、大気中よりも低い／生理的培養条件も使
用することができる。大気中よりも低い／生理的培養条件は、移植のための全集
団の機能を増強するために、プロセスを通じて使用することもできる。
【００５６】 神経幹細胞由来物の検出は、抗体染色により決定することができる。例えば、
中枢神経系多能性幹細胞は、中間径フィラメントであるネスチンの高レベル発現
により印がつけられる(Hazel及びMuller、1997)。分化したニューロンは抗体TUJ
1により(O’Rourkeら、1997)、オリゴデンドロサイトはGalCにより(Bosioら、19
96)、及びアストロサイトはGFAP抗体により(Rutkaら、1997)印をつけられる。
【００５７】 本発明の方法は、異種遺伝子を含む神経細胞を作出するために使用することが
できる。異種遺伝子を含む神経起源の細胞を作出しかつこのような細胞を使用す
る方法は、米国特許第5,750,376号に開示されている(これは本明細書に引用によ
り組入れられるものとする)。
【００５８】 培養条件 初代培養物を作出するための適当な培地及び条件は、当該技術分野において周
知であり、かつ細胞型に応じて決まる。例えば骨格筋、骨、ニューロン、皮膚、
肝及び胚性幹細胞は全て、それらの具体的内容物が異なる培地において増殖され
る。更にひとつの細胞型のための培地は、実験室毎及び施設毎に著しく異なるこ
とができる。一般的原則として、培養の目標が細胞分裂を維持することである場
合は、培地に血清が比較的多量に(10〜20容量％)添加される。特異的精製された
成長因子又は複数の成長因子のカクテルも添加されるか、もしくは時には血清の
代わりに使用される。一般的原則として、培養の目標が分化を補強するためであ
る場合は、一般にマイトジェンを伴う血清に限定される(血清約1〜2容量％)。分
化を促進する及び／又は細胞周期の停止を促進する特異的因子又はホルモンも使
用することができる。
【００５９】 特異的細胞表現型の選択、特異的細胞型の生育及び増殖、又は特異的細胞型の
分化への重大な付随物として、培養時の細胞の増殖及び分化のいずれかの時点で
、生理的酸素及び大気より低い酸素の条件を用いることができる。一般に、生理
的又は低酸素レベルの培養は、強力な緩衝剤の培地(Hepesなど)への添加、頻繁
な培地の交換及びCO2濃度の変化のような、培養物のアシドーシスを制限する方
法により達成される。
【００６０】 細胞は、様々な手段を用い低酸素条件に晒すことができる。特化された実験施
設は、酸素レベルが指定された隔離室全体で制御される完全に封じ込められた環
境を有することができる。このような特定の領域においては、低酸素レベルが間
断なく、細胞の単離、増殖及び分化を通じて維持され得る。このような特殊な領
域を有する実験室は非常に少ない。更に生理的又は低酸素培養条件は、予め定め
られた混合ガスでフラシュされた市販のチャンバー(例えば、Billups-Rothenber
g、サンディエゴ、CAから入手できる)を用いて維持することもできる。補助的に
、細胞を供給する前に、同じ混合ガスで培地をフラッシュすることができる。一
般に、これらの比較的小さい封じ込めユニットを用いる細胞供給及び継代の間に
生理的又は低酸素条件を維持することは可能ではなく、かつそのため、これらの
操作の時間は、できる限り短縮されなければならない。適当な湿度、温度、及び
二酸化炭素が提供されるならば、あらゆる密閉されたユニットを、生理的酸素又
は低い酸素レベルでの培養に用いることができる。
【００６１】 酸素に加えて、培養のためのその他の気体は、典型的には約5％二酸化炭素で
あり、かつ残余は窒素であるが、任意に変動量の酸化窒素(3ppm程度の低濃度か
ら開始)、一酸化炭素並びに不活性及び生体活性の両方のその他の気体を含有す
ることができる。二酸化炭素濃度は、典型的には前述のように約5％の範囲であ
るが、これは2〜10％を変動することができる。酸化窒素及び一酸化炭素の両方
が典型的には非常に少量(すなわちppmの範囲)で投与され、これは経験又は文献
から決定される。
【００６２】 いずれか所定の細胞型又はいずれか特定の望ましい結果にとって最適な生理的
又は低酸素レベル条件は、変動するであろう。当業者は、二酸化炭素が一定に維
持され、かつ酸素レベル(残余ガスとしての窒素と共に) が変動するような酸素
用量反応曲線を作成することにより、適当な大気より低い条件を決定することが
できる。例えば、CNS細胞のエクスパンジョンに関する最適酸素環境培養条件を
決定するためには、ある酸素システムから培養を確立するであろう。いくつかの
分化した細胞、その他の発生系統又は経路の細胞、更にはCNS細胞からなる最初
の培養物が、混合される。様々な酸素レベル(例えば、1％、2％、5％、10％及び
15％)に曝露された後のCNS細胞の数及び機能は、そのシステムに適した方法によ
り評価される。一部では、分子マーカーの一群を、細胞集団を迅速に同定するた
めに利用できる。別の場合は増殖アッセイと組合せた単独のマーカーが適してお
り、その他の場合は増殖アッセイ単独が適している。一部の場合、前述のアッセ
イの全て又は一部は、推定された幹細胞の分化能を辿るバイオアッセイと組合せ
られる。全般的に、幹細胞及び／又は前駆細胞の酸素レベルに対する反応を決定
するために使用される正確なアッセイは、試験されたシステムの性質、更にはそ
のシステムに特異的な利用できるマーカー及び技術に応じて決まる。
【００６３】 生理的又は低酸素条件のタイミングも、酸素用量反応曲線の一部である。一部
の細胞は、単離の間又は単離直後に酸素に多かれ少なかれ感受性であることがで
きる一方で、一部の細胞は培養物中のいずれかの時点以降のみ反応することがで
きる。生理的又は低酸素条件のタイミングは、絶対的及び培養物の他の操作との
関係において、最適酸素培養条件を評価する一部である。更に、その他の気体の
有糸分裂促進作用は、生理的又は低酸素条件により相乗され得る。様々な遺伝子
調節ネットワークは、培養の様々な相の間に低／生理的酸素培養により誘導され
得る。細胞のエクスパンジョン時の低酸素は、分化時の低酸素により誘導される
ものとは異なる遺伝子発現を誘導することができる。
【００６４】 これらの細胞は、典型的には低酸素レベル条件に、その他の細胞型と比較して
前駆細胞／幹細胞の集団を豊富にするのに十分な時間晒される。典型的には、こ
れは1時間以上、好ましくは3時間以上、より好ましくは6時間以上、及び最も好
ましくは12時間以上であり、かつ継続することができる。培養時の温度は、典型
的には体芯温度(core body temperature)を反映しているか又は約37℃であるが
、約32℃及び約40℃の間を変動することができる。別の重要な実施態様は、単純
に細胞絶対数の増大を達成するか又は細胞の生存を促進することができる。 低又は生理的酸素培養条件への最初の曝露後に、望ましい結果に応じて、細胞
を、これらの条件において維持するか、又は正常な実験室酸素条件に戻すことが
できる。
【００６５】 CNS細胞の単離のための初期培地、これらの細胞の増殖培地、及びこれらの細
胞の分化培地は、同じ又は異なって良いことは理解される。全ては、低又は生理
的酸素レベル培養と組合せて使用することができる。この培地は、様々な成長因
子、サイトカイン、血清などを補充することができる。適当な成長因子の例は、
塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)、血管内皮成長因子(VEGF)、上皮成長因子(EGF
)、トランスフォーミング成長因子(TGFα及びTGFβ)、血小板由来成長因子(PDGF
s)、肝細胞成長因子(HGF)、インスリン様成長因子(IGF)、インスリン、エリスロ
ポイエチン(EPO)、及びコロニー刺激因子(CSF)がある。適当なホルモン培地添加
物の例は、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、又はデキサメタゾ
ンのようなグルココルチコイドである。サイトカイン培地添加物の例は、インタ
ーフェロン、インターロイキン、又は腫瘍壊死因子α(TNFα)である。酸素レベ
ルは添加物に対する細胞応答、添加物の有効期間又はそれらの生体活性に影響を
及ぼすその他の性質を変更し得るので、当業者は、添加物及び培地成分を様々な
酸素レベルで試験するであろう。加えて、細胞が生育している表面には、細胞の
生存、生育及び／又は分化に寄与する様々な基質を置くことができる。これらの
基質は、ラミニン、ポリ-L-リシン、ポリ-D-リシン、ポリオルニチン及びフィブ
ロネクチンを含むが、これらに限定されるものではない。
【００６６】 生理的又は低酸素条件で培養した後、細胞が増殖しているかどうかを、放射性
ヌクレオチド(例えば3H-チミジン)の組込み、又はBrdU(チミジンアナログ)の取
り込みを含む様々な手段により決定することができる(Assy及びMinuk、1997)。
一部のCNS、前駆細胞又は幹細胞は、特定の細胞型に分化するそれらの能力によ
り同定され、かつこのアッセイは、適当なマーカーの利用可能性に応じて、単独
で又は前述の他のアッセイと組合せて使用されるであろう。
【００６７】 生育及び分化の促進のための更なる因子 本願明細書に記したように、本発明はCNS細胞の生存、分化及び表現型の完全
性を増大する方法を提供する。この方法は一般に、in vitroにおけるこれらの細
胞の生理的酸素パラメータ内での生育に関する。現時点で、このような細胞の生
存を増加することがあるその他の因子を指摘している文献は豊富である。これら
の因子のいくつかを本発明の育成条件と組合せて使用することが有用であろうと
考えられている。
【００６８】 この関心の多くは、栄養因子の発見に焦点が当てられている。これらの因子は
、移植により調製されたドーパミン作動性細胞の生存を増大し；線条へ移植され
た胚性ニューロンの移植後のin situ生存を維持し；移植片の容積を増すことに
加え、これにより、in vitro及びin vivoの両方において作用することが示され
ているような尾状核及び被殻のより大きい部分を再−神経支配することができる
。
【００６９】 NGF、bFGF、EGF、IGF I及びII、TGFβ1-3、PDGF、脳由来の成長因子(BDNF)、
神経節由来の成長因子(GDNF)、ニューロトロフィン(NT)-3、NT-4、及び毛様体神
経栄養因子(CNTF)のような栄養因子(Engele及びBohn、1996；Mayerら、1993a及
び1993b；Knuselら、1990、1991；Poulsenら、1994；Nikkhahら、1993；Othberg
ら、1995；Hymanら、1991)が研究され、かつin vitroにおいて顕著な作用を有す
ることが示されている。
【００７０】 霊長類におけるMPTP及び6-OHDA病巣は、神経変性障害のあるモデルである。こ
のような病巣の作用は、移植術前の細胞浮遊液へのNGF又はbFGFの添加により、
霊長類及びラットにおいて逆行することができることが示されている(Gashら199
6)。更にこれらの因子は、細胞浮遊液に移植術前に添加した場合に、移植片の生
存を増大することも示されている(Chenら、1996；Dunnett及びBjorkland、1994)
。追加の試験は、NGFによりレトロウイルスを使って誘導された神経前駆細胞(CI
NP)細胞株(Martinez-Serranoら、1995)、及びBDNFにより誘導されたアストロサ
イト(Yoshimotoら、1995)に由来した移植されたニューロンにおいて移植片生存
率の上昇を示した。GDNFは、移植片生存を増大し、繊維の伸長を増大させかつラ
ット線条における6-ヒドロキシドーパミン病巣の後の行動作用を緩和することが
示されている(Sauerら、1994；Bowenkampら、1995；Rosenbladら、1996；Olson
、1996)。 従ってin vitro又はin vivoのいずれかにおいてCNS細胞の生存を延長するよう
なこれら及び他の因子は、本発明において説明された増殖及び維持の条件下で使
用することが考察されている。
【００７１】 EPO による大気O2での分化の誘導 別の実施態様において、ドーパミン作動性分化に対する低酸素の作用を模倣す
るためにEPOを使用することができる。すなわち、大気酸素レベルでのEPOは、幹
細胞、CNS前駆細胞、又はそれらの子孫の分化を促進し、ドーパミン作動性細胞
を作出するために使用される。中脳前駆細胞は、特に好ましい。この実施態様に
おいて使用されるEFOの量は、ドーパミン作動性細胞を少なくとも約10％以上、
好ましくは20％、より好ましくは50％作出するのに十分な量である。好ましくは
、飽和濃度のEPOが増殖相、分化相又は両相の間に培養物に添加される。この培
養物はEPOと、少なくとも約1日以上、好ましくは2日、より好ましくは5日間接触
される。例えばCNS前駆細胞の培養物は、増殖相の間は5％CO2、20％O2 (平衡N2)
を含有する大気内で5日間、飽和濃度のEPOで培養され、かつ引き続き分化相の間
は3日間10％EPOで培養することができる。この大気は、20％O2を含有することが
好ましいが、より低いO2濃度も使用することができる。
【００７２】 移植法 前述の細胞を、様々な用途で使用することができる。本願明細書に記した生理
的／大気より低い培養条件を用いて、移植に有用な特異的細胞集団を分化し、か
つ様々な培養システムに由来する利用できる細胞数をエクスパンジョンすること
ができる。
【００７３】 実験室及び臨床での研究は、CNSへの細胞移植が、パーキンソン病のような神
経変性障害の重要な別の治療モダリティとなり得る可能性があることを示してい
る(Wictorinら、1990；Lindvallら、1990；Sanbergら、1994；Bjorklund及びSte
nevi、1985；Freemanら、1994)。一部の症例において、移植された神経組織は生
存し、かつレシピエントすなわち宿主のCNSとの結合を形成する(Wictorinら、19
90)。宿主にうまく受け入れられた場合は、移植された細胞及び／又は組織は、
前記障害に関連した行動上の欠陥を改善することが示されている(Sanbergら、19
94)。この種の治療が成功するための必須の工程は、移植のために利用できる十
分生存可能な細胞を獲得することである。
【００７４】 前述の細胞培養に加えて、胎児神経組織が、神経移植の別の重要な給源である
(Lindvallら、1990；Bjorklund、1992；Isacsonら、1986；Sanbergら、1994)。
別の生存可能な移植片の給源は、副腎細胞並びに神経成長因子及び栄養因子を分
泌する様々な細胞型を含む。神経変性障害に関する再生治療プロトコールのよう
な神経組織移植の分野が、多くの注目を浴びており、その結果臨床試験が進行し
ている。今日までこの分野の主要な問題点は、十分に生存可能な細胞を得る能力
が欠けていることであった。本発明は、それらの神経変性疾患のための適当な移
植片としての利用能を失うことを防ぐような状態で、このような組織を維持する
方法を提供する。
【００７５】 現在は、細胞移植術の方法は、当業者には周知である(米国特許第5,762,926号
；米国特許第5,650,148号；米国特許第5,082,670号)。神経移植又は移植術は、
中枢神経系又は脳室腔又は宿主脳表面の硬膜下への細胞の移植に関っている。移
植が成功する条件は以下を含む：1)インプラントの生存率；2)移植部位への移植
片の維持；及び、3)移植部位での最低量の病理学的反応。
【００７６】 例えば胚性脳組織のような様々な神経組織の宿主脳への移植法は、Neural Gra
fting in the Mammalian CNS、Bjorklund及びStenevi編集(1985年)、Das, 第3章
、23〜30頁；Freed、第4章、31〜40頁；Steneviら、第5章、41〜50頁；Brundin
ら、第6章、51〜60頁；Davidら、第7章、61〜70頁；Seiger、第8章、71〜77頁(1
985年)に記されており、これは本願明細書引用により組入れられている。これら
の手法は、移植時に脳実質(brain parenchyma)へ対置するために、実質内移植(i
ntraparenchymal transplantation)、すなわち宿主脳内の組織の注射又は沈着に
より達成される(脳外側又は実質外への移植と比較して)宿主内への移植を含む(D
as、前掲)。
【００７７】 実質内移植のふたつの主な手法は以下のものである：1)ドナー細胞の宿主脳実
質内への注入、又は2)宿主脳実質を露出するための手術手技による腔の形成、そ
の後の腔への移植片の沈着(Das、前掲)。両方法共、移植時に移植片と宿主脳組
織の間に実質の付着を提供し、かつ両方法共移植片と宿主脳組織の間の解剖学的
一体化を促進する。これは、移植片が宿主脳の一体化された部分でありかつ宿主
生命を生存させることが必要であるならば重要である。
【００７８】 あるいは、この移植片は、脳室内、例えば大脳室内、又は硬膜下、すなわち介
在軟膜(intervening pia mater)又はクモ膜及び軟膜により宿主脳実質から隔て
られた宿主脳の表面に配置することができる。脳室への移植術は、ドナー細胞の
注入によるか、又はその後移植片の転置を防ぐために脳室内に移植される固形組
織の栓(plug)を形成するための3％コラーゲンのような基質内で細胞を増殖する
ことにより達成することができる。硬膜下移植術のためには、硬膜にスリットを
形成した後、脳表面の周りに細胞が注入される。宿主脳の選択された領域への注
入は、ドリルで穴あけしかつ微量注入器の針を挿入することができるように硬膜
を穿刺することにより行うことができる。微量注入器は、脳定位固定装置に装着
されることが好ましく、かつ針を脳又は脊髄の所望の位置に配置するために3次
元定位固定性座標が選択される。 ドナー細胞は、被殻、基底核、海馬皮質、脳の線条又は尾状領域、更には脊髄
に導入することもできる。
【００７９】 移植のためには、細胞浮遊液を、注射器で吸引し、かつ麻酔をかけた移植レシ
ピエントへ投与する。この手法を用いて、複数回の注入を行うことができる。ド
ナー組織の年齢、すなわち発達段階は、移植術後の細胞生存の成功に影響を及ぼ
すことがある。 従って細胞浮遊液の手法は、ドナー細胞の脳又は脊髄のいずれかの予め定めら
れた部位への移植術を可能にし、これは比較的非外傷性であり、同じ細胞浮遊液
を用いるいくつかの異なる部位又は同一部位への同時に多回移植術を可能にし、
かつ異なる解剖学的領域由来の細胞の混合物を可能にする。多回移植術は、細胞
型の混合物、及び／又は細胞に挿入される導入遺伝子の混合物からなる。好まし
くは、1回の移植術当たり約104〜約108個の細胞が導入される。
【００８０】 脊髄への移植術について好ましい腔への移植に関しては、例えば脳を覆う骨の
除去及びゲルフォームのような材料による出血の停止により、組織がCNSの外面
に密接した領域から除去され、移植腔を形成する(Steneviら、Brain Res.、114:
1-20(1976))。吸引を用いて腔を形成することができる。その後移植片が、腔内
に配置される。細胞の注入又は固形組織インプラントを用いて、1回より多い移
植を、同じ腔に行うことができる。
【００８１】 外傷を受けた脳へのドナー細胞の移植は、例えば移植術を試みる前に、損傷部
位を浄化しかつ出血を停止しなければならないといった、様々な手技が必要であ
ろう。加えて、ドナー細胞は、外傷を受けた脳の病理学的環境内で移植片の単離
を防ぐために宿主脳のあらゆる病巣又は腔を満たすのに十分な増殖能を有さなけ
ればならない。
【００８２】 細胞表現型の測定 特定の実施態様において、細胞の分化又は他の修飾が生じているかどうかを決
定するために、大気より低い酸素条件において生育している細胞の表現型を追跡
することが必要なことがある。これを行うために、メッセージレベル、タンパク
質レベル、細胞下局在、機能アッセイ又は形態学的変化の追跡を含む、様々な方
法が使用される。メッセージレベルを追跡する方法は、PCR（登録商標）(米国特
許第5,364,790号；米国特許第4,800,159号；米国特許第4,683,195号)、In Situ
ハイブリダイゼーション(米国特許第4,888,278号；米国特許第4,886,741号；米
国特許第5,506,098号；米国特許第5,225,326号；米国特許第5,521,061号；米国
特許第5,538,869号；米国特許第5,665,540号)、RNAseプロテクションアッセイ、
及び単細胞PCR（登録商標）がある。タンパク質レベルを追跡する方法は、抗体
染色、HPLC、ウェスタンブロット又は免疫沈降法を使用することができる。これ
らの技術は、全て当業者には周知である。
【００８３】 迅速な遺伝子検出及び配列決定技術の利点と組合せた2種の細胞型又は集団に
おいて示差的に発現された遺伝子を検出できるということを、酸素濃度の変動下
で培養された細胞における遺伝子発現を比較するために使用することができる。 ディファレンシャルディスプレイ法を用いて、2種の比較的類似した細胞型間
で、又はある状態から別の状態への細胞の逐次的な変化時に、表現型の差異に寄
与する遺伝子を解明する。例えば、ディファレンシャルディスプレイ技法を用い
、Kocherら(1995)は、正常な腎実質と比較して腎細胞癌腫においてアップレギュ
レーションされた遺伝子を選択した。この方法により、Kocherら(1995)は、正常
上皮細胞集団において発現されることは稀な、癌腫の大半の悪性上皮細胞におい
て発現され、かつ結腸、乳及び肺起源の癌腫において著しく過剰発現される遺伝
子(DD96)を単離することができた。同様の技法を用いて、通常条件、対、低酸素
レベル条件でインキュベーションした細胞における遺伝子発現を比較することが
できる。次にある集団においてその他よりもアップレギュレーションされた遺伝
子をプローブとして用い、他の細胞集団又は異なる培養条件下(すなわち、該遺
伝子発現に影響を及ぼし得る化合物又は環境刺激が存在する)での同じ細胞集団
における遺伝子の発現をスクリーニングする。
【００８４】 Kangら(1998)は、豊富又は稀有に示差的に発現された遺伝子の両方の迅速かつ
効率的な同定及びクローニングを可能にする、相互引き算式(reciprocal subtra
ction)ディファレンシャルRNAディスプレイ(RSDD)法を開発した。この技術は、
アデノウイルスで形質転換されたげっ歯類細胞が激しい形質転換状態を展開する
際のような、癌の進行時に生じた遺伝子発現の変動を分析するために使用された
(Kangら、1998)。この方法は、進行の関数としての発現及び進行の関数としての
抑制された発現を示した既知及び未知の配列の同定及びクローニングをもたらし
た(Kangら、1998)。このRSDD技術を使用して、室内大気条件、対、大気より低い
条件において、細胞の維持、増殖および／または前駆細胞又は幹細胞からの完全
に分化した細胞へ分化時の際の、細胞間の遺伝子発現を比較することができる。
【００８５】 ディファレンシャルディスプレイ法を、迅速なDNA配列決定及び検出法と組合
せて用いることができ、これにより比較的短時間に非常に多くの遺伝子をスクリ
ーニングまたは配列決定する能力を可能にする。米国特許第5,800,992号は、ア
レイ内の相補的ポリヌクレオチドを用いて、2種の細胞型の間で複数の遺伝子の
示差的発現を検出する方法を提供している。このような技術は、ポリヌクレオチ
ドが基板上に付着されているのが、コンピュータのマイクロプロセッサーチップ
に似ているので、通常「DNAチップ」技術と称されている。更に、DNAチップを用
いて遺伝子を配列決定する方法も記されている。
【００８６】 加えて同様の技術が米国特許第5,834,181号にも開示されており、これは1個の
ヌクレオチド置換のような遺伝子の小さい変化を検出するために同様の技術を使
用し、そのため細胞表現型の変化に繋がる遺伝子における突然変異の検出が可能
である。 単一細胞逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)法も、通常本発明において育
成された細胞表現型の追跡に有用であろう。このような技術は、例えばCornelis
on及びWold(1997)に説明されている。
【００８７】 Comelison及びWoldの単細胞RT-PCR技術は、一度に多数の遺伝子の発現を決定
することを可能にし、並びに骨格筋衛星細胞を同定しかつ本発明の低／生理的酸
素条件下でインキュベーションした場合のそれらの活性化状態を決定するために
使用することができる。
【００８８】 通常使用される別の検出法は、RNAse保護アッセイであり、ここでは放射標識
されたRNAプローブが、個体から得た総細胞RNAのような、被験RNA集団とRNAプロ
ーブの相補的セグメントと被験RNAがハイブリダイズするような条件下で混合さ
れる。その後、この混合物にRNAseが添加され、未保護(ハイブリダイズしていな
い)、1本鎖プローブ及び被験RNAを破壊する。全ての1本鎖RNAが破壊された場合
、保護されたRNAの短い断片のみが残留し、これは被験RNAの特定のRNA組成物を
診断するために電気泳動により分析することができる。保護された2本鎖RNA断片
は、分析の前に変性され、検出可能な、標識された1本鎖RNAプローブ断片として
利用することができる。
【００８９】 疾患モデル 一旦特定の細胞セットが作成されたならば、当然、これらの細胞が疾患モデル
に適用できるかどうかテストすることが必要であろう。パーキンソン病及び他の
神経変性疾患の動物モデルが現在当業者に周知である。
【００９０】 例えばパーキンソン病ラットモデルは、生理食塩水-アスコルビン酸6-ヒドロ
キシ-ドーパミン(6-OHDA)を内側前脳束に一側性注入を行うことにより作出する
ことができる。これは、最終的にパーキンソン挙動を模倣する病巣を形成する。
形成された病巣の完全性は、アポモルヒネ又はアンフェタミンのいずれかにより
誘導される回旋行動を監視することにより可能である(Ungerstedt及びArbuthnot
t、1970)。1分間に7回転より多い率で回転する動物は(Schmidtら、1982)、適当
な病巣を有すると推定することができる(アポモルヒネ投与後の少なくとも7回の
反対側性回転／分、及びアンフェタミン投与後の病巣側に向かう少なくとも7回
の同側性回転／分)。
【００９１】 このようなモデルを用いて、ベースライン時の回旋行動を確立することができ
る。その後、本発明で増殖した細胞を、前述のラットモデルに移植することがで
きる。何らかの回旋行動の減少は、適当な治療的価値のある細胞移植の指標とな
るであろう。
【００９２】 遺伝子の置換／増強の用途 場合により、本発明の方法を用いて得られたCNS細胞を操作し、所望の遺伝子
産物を発現することができる。遺伝子治療を使用するため、遺伝子産物を置換す
るため、組織の再生を促進するため、疾患を治療するため、もしくは患者への移
植後の細胞の生存を改善する(すなわち拒絶反応の防止)ために、細胞を修飾する
ことができる。 この実施態様において、CNS細胞は、エクスパンジョン及び分化の前に、トラ
ンスフェクションされる。細胞のトランスフェクション技法は当該技術分野にお
いて公知である。
【００９３】 当業者は、トランスフェクションされた細胞に、又はより間接的にはレシピエ
ント患者／動物に、有益な特性を運ぶであろう多数の遺伝子を構想することがで
きるであろう。加えられた遺伝子は、実施態様に応じて、最終的にレシピエント
細胞及びその子孫全てにおいて維持されてもよく、又は単に一過性に維持される
のみでもよい。例えば、チロシンヒドロキシラーゼ、又はVMAT1もしくはVMAT2の
ようなモノアミン輸送体をコードしている遺伝子を、特定のCNS細胞にトランス
フェクションし、パーキンソン病対象への移植術に適した適当な治療的細胞を提
供することができる。使用することができるその他の遺伝子には、GABA-デカル
ボキシラーゼ、エンケファリン、ドーパデカルボキシラーゼ(AADC)、毛様体神経
栄養因子(CNTF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロピン(NT)-3、NT-4、
及び塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)が含まれる。
【００９４】 添加された遺伝子は、実施態様に応じて、最終的にはレシピエント細胞及びそ
の全ての子孫に残留するか、又は一過性に残留するのみであろう。例えば、脈管
形成性因子をコードしている遺伝子は、平滑筋から単離された前駆細胞にトラン
スフェクションされる。このような遺伝子は、平滑筋組織が再生されときに、側
副血管形成の誘導に有用であろう。一部の状況において、細胞を1種よりも多い
遺伝子でトランスフェクションすることが望ましいことがある。一部の状況にお
いて、細胞を1種よりも多い遺伝子でトランスフェクションすることが望ましい
ことがある。勿論、前述の治療的遺伝子はひとつの例であり、かつ当業者は、遺
伝子の発現及び／又は機能の異常に起因したいずれかの神経変性障害は、遺伝子
の置換及び／又は増大により治療することができることを理解するであろう。こ
のような障害及びそれに関連した遺伝子は、当業者には周知である。 一部の状況においては、遺伝子産物を分泌させることが望ましい。このような
場合、遺伝子産物は、該タンパク質の分泌を促進する分泌シグナル配列を含むこ
とが好ましい。
【００９５】 本願明細書において使用されたウイルスベクターは、アデノウイルス(米国特
許第5,824,544号；米国特許第5,707,618号；米国特許第5,693,509号；米国特許
第5,670,488号；米国特許第5,585,362号；これらは各々本願明細書に参照として
組入れられている)、レトロウイルス(米国特許第5,888,502号；米国特許第5,830
,725号；米国特許第5,770,414号；米国特許第5,686,278号；米国特許第4,861,71
9号、これらは各々本願明細書に参照として組入れられている)、アデノ随伴ウイ
ルス(米国特許第5,474,935号；米国特許第5,139,941号；米国特許第5,622,856号
；米国特許第5,658,776号；米国特許第5,773,289号；米国特許第5,789,390号；
米国特許第5,834,441号；米国特許第5,863,541号；米国特許第5,252,521号；米
国特許第5,252,479号；これらは各々本願明細書に参照として組入れられている)
、アデノウイルス−アデノ随伴ウイルスハイブリッド(米国特許第5,856,152号、
これは本願明細書に参照として組入れられている)、レンチウイルスベクター、
ワクシニアウイルス又はヘルペスウイルス(米国特許第5,879,934号；米国特許第
5,849,571号；米国特許第5,830,727号；米国特許第5,661,033号；米国特許第5,3
28,688号；これらは各々本願明細書に引用により組入れられている)ベクターで
あることができる。
【００９６】 非ウイルスベクターによる発現構築物の送達も考察されている。このような送
達は、微量注入法(米国特許第5,612,205号)、電気穿孔法(米国特許第5,507,724
号；米国特許第5,869,326号；米国特許第5,824,547号；米国特許第5,789,213号
；米国特許第5,749,847号；米国特許第5,019,034号；Tur-Kaspaら、1986；Potte
rら、1984)、リン酸カルシウム共沈降法(Graham及びVan Der Eb、1973；Chen及
びOkayama、1987；Rippeら、1990)、DEAEデキストラン誘導法(Gopal、1985)、受
容体が媒介した導入法(Wu及びWu、1987；Wu及びWu、1988)、リポソーム媒介した
導入法(米国特許第5,631,018号；米国特許第5,620,689号；米国特許第5,861,314
号；米国特許第5,855,910号；米国特許第5,851,818号；米国特許第5,827,703号
、米国特許第5,785:987号；Nicolau及びSene、1982；Fraleyら、1979)、デンド
リマー法(米国特許第5,795,581号；米国特許第5,714,166号；米国特許第5,661,0
25号)、剥き出しのDNA注入法(Harland及びWeintraub、1985)、及びパーティクル
ボンバードメント法(米国特許第5,836,905号；米国特許第5,120,657号；Yangら
、1990)がある。
【００９７】 所望の遺伝子は、通常それ自身のプロモーター又は外来プロモーターに機能的
に連結され、これらはいずれの場合も遺伝子産物の転写を媒介する。プロモータ
ーは、制限された又は全般的な組織型の発現を起動するそれらの能力を基に、又
はそれらが促進する発現レベルか、もしくはこれらが添加された化学物質、薬物
又はホルモンといかに反応するかを基に選択される。特に考察されたプロモータ
ーは、CMV IE、SV40 IE、β-アクチン、コラーゲンプロモーター、THプロモータ
ー、AADCプロモーター及びネスチンプロモーターを含むが、これらに限定される
ものではない。
【００９８】 遺伝子の発現を変更するその他の遺伝子調節配列は、同時トランスフェクショ
ンすることができる。いくつかの実施態様において、宿主細胞DNAは、プロモー
ター及び／又は追加の調節配列を提供することができる。 エンハンサー又は高レベルの発現を生じるシステムのような発現を増強する他の
エレメントも、同じく含むことができる。
【００９９】 哺乳類細胞における遺伝子ターゲティング法は、当業者に周知である(米国特
許第5,830,698号；第5,789,215号；第5,721,367号及び第5,612,205号)。「遺伝
子ターゲティング」は、細胞の染色体に位置する遺伝子の全体又は一部が、異種
ヌクレオチド断片により置換されることを意味する。この断片は、主に該遺伝子
に対する特異的突然変異を伴う標的化された遺伝子配列を含むことができるか、
又は第二の遺伝子を含むことができる。第二の遺伝子は、プロモーターに機能的
に連結されるか、又は転写に関して該細胞のゲノム内に含まれたプロモーターに
依存的である。好ましい実施態様において、第二の遺伝子は、該遺伝子を欠いて
いる細胞に対して毒性のある化合物に対する耐性を細胞に付与する。このような
遺伝子は、典型的には抗生物質耐性遺伝子と称される。その後この遺伝子を含む
細胞は、毒性化合物の存在する中での該細胞の培養により選択される。
【０１００】 その他の細胞型の用途 前述の考察の大半はCNS細胞の育成及び培養に焦点を合わせているが、本発明
の技術は、その他の種類の細胞の増殖にとっても有用であることは理解されなけ
ればならない。このように、本願明細書において提供された技術は、移植治療に
おいて常用されるあらゆる細胞の増殖に有用であることが意図されている。例え
ば、このような細胞は、糖尿病のための島細胞；筋ジストロフィーのための筋原
細胞；肝疾患のための肝細胞；創傷治癒及び／又は火傷のための皮膚移植片、並
びに造血系及び遺伝子疾患のための骨髄又は幹細胞であることができる。加えて
、1998年11月18日に出願された米国特許出願第09/195,569号(これは本明細書に
参照として組入れられている)の開示は、本発明と組合せることが有用な別の例
を提供するであろう。
【０１０１】 実施例 下記実施例は、本発明の好ましい実施態様を明らかにするために含まれている
。当業者には、本発明者により発見された代表的技術を辿るこれらの実施例に記
された技術は、本発明の実践において良好に機能し、従ってその実践のための好
ましい態様を構成するために考察することができる。しかし当業者は、本発明の
開示に関して、明らかにされた具体的な実施態様において、多くの変更を行うこ
とができること、及び本発明の精神及び範囲を逸脱することなく同様又は類似の
結果を得ることを理解しなければならない。
【０１０２】 実施例１ 材料及び方法 CNS幹細胞の培養 動物を、NIHガイドラインに準じ、飼育及び処置した。ラット胚の外側神経節
隆起(E14)又は中脳(E12)から切除した細胞を機械的に分離し、予めポリオルニチ
ン／フィブロネクチンで被覆したプラスチック製24-ウェルプレート(Costar社)
又は12mmガラスカバースリップ(Carolina Biologicals社)上に播種し、かつbFGF
を伴う規定培地で増殖した(Studerら、1998；Joheら、1996)。概してbFGFは、培
養の4〜6日後に培地から取り除いた。プラスチック製48-ウェルプレート(Costar
社)において、クローンアッセイを行った。一部の試験において、組換えヒト(rh
)EPO、rhVEGF165又は組換えマウス(m)FGF8b、又はそれらの中和抗体(全てR&D Sy
stems社から入手)を、下記の濃度で培養物に添加した：EPO 0.5U/ml、EPO中和抗
体10μg/ml、FGF8 250ng/ml、FGF8b中和抗体5μg/ml、VEGF 50ng/ml、VEGF中和
抗体0.5μg/ml。EPOについての用量反応決定を、0.05U/ml、0.5U/ml、5U/ml及び
15U/mlで行い；抗-EPOについて、10μg/ml及び100μg/mlで行った。全ての実験
の結果は、少なくとも2つの独立した培養シリーズにより確認した。
【０１０３】 坐骨神経前駆細胞の培養 坐骨神経前駆細胞を、先に記された(Morrisonら、1999)ようなクローン密度で
培養した。簡単に述べると、プレートを、ポリ-d-リシン(Biomedical Technolog
ies社、ストートン、MA)及びヒトフィブロネクチン(Biomedical Technologies社
)で被覆した。この培養培地は、15％ニワトリ胚抽出物(Stempleら、1992)、20ng
/ml組換えヒトbFGF(R&D Systems社、ミネアポリス)、N2補充物(Gibco社)、B27補
充物(Gibco社)、50μM 2-メカプトエタノール、35mg/mlレチノイン酸(Sigma社)
、及びペニシリン／ストレプトマイシン(BioWhittaker社)を伴うDMEM-低グルコ
ース(Gibco社)を含有した。この組成物は、全体を通じて「標準培地」と記され
る。標準条件下で、細胞は、標準培地において6日間培養し、その後分化に好ま
しい類似の培地(1％CEE及び10ng/ml bFGF)に交換し更に8日間培養し、その後コ
ロニー性組成物の免疫組織化学分析を行った。交感神経分化を促進するために、
5μMフォルスコリン及び1ng/ml BMP2(Genetics Institute社)を、標準培地で最
初6日間の後時々添加し、かつ培養物を更に6日間発生させた。更に交感神経分化
を促進するために、最後の6日間は、培養物を50ng/ml NGF及び50ng/ml NT3を含
有する標準培地と交換した。
【０１０４】 20％酸素培養のためには、約6％CO2の常湿の組織培養インキュベーターを用い
た。低酸素培養物のためには、1％O2／6％CO2／平衡N2を含有するようあつらえ
た混合ガスをフラッシュした気密性のモジュラーインキュベーターチャンバー(B
illups-Rothenberg社、デルマール、CA)にプレートを挿入した。このインキュベ
ーターチャンバーを、毎日15L/分の速度で1.5〜2分間フラッシュし、その後通常
の組織培養インキュベーターに挿入した。これは、微小電極(Animus社、マルバ
ーン、PA)で直接測定した値を基に、約5％酸素のチャンバー内の実濃度を達成し
ていた。5％酸素は、通常大気酸素に比べて低いと説明されるが、これは実際に
は生理的レベルに近い組織培養環境を形成している(Guytonら、1996)。
【０１０５】 低酸素培養 培養物を加湿した携帯単離用チャンバー(Bi1lups-Rothenberg社、デルマール
、CA) に配置し、毎日ガス混合物(1％O2、5％CO2 + 94％N2)をフラッシュした。
周囲大気中の正確なO2レベルは、チャンバーフラッシュの長さによって決まり(1
5L/分での90秒のフラッシュは6％O2を達成し、6分間のフラッシュは1.5％O2を達
成した)、これはO2−感受性電極システム(OS2000、Animus社、フレーザー、PA)
が利用できるようになるまでは標準化されなかった。従って、「低いO2」条件は
、環境O2 3±2％の範囲を表しており、これはほぼ正常な脳組織レベルである(表
1)。温度37℃に維持するために、チャンバー全体を、インキュベーターの中に収
容した。
【０１０６】 BrdU取り込み及びTUNEL分析 ブロモデオキシウリジン(10μM)を、固定直前に、正確に60分間培養物に添加
した。抗-BrdU染色を、製造業者のプロトコールに従い行った(Amersham Life Sc
iences社)。製造業者のプロトコールに従いTUNEL反応(Boehringer-Mannheim社)
を行った。TUNEL＋細胞を、FITC標識物のペルオキシダーゼ転換後に、金属増強
したDAB反応(Pierce社)により可視化した。
【０１０７】 免疫組織化学 細胞は、4％パラホルムアルデヒド+0.15％ピクリン酸／PBSで固定した。標準
の免疫組織化学的プロトコールに従った。下記の抗体を用いた：幹細胞／前駆細
胞の特徴決定：ネスチンポリクローナル抗体#130 1:500 (Martha Marvin & Ron
McKay社)、PSA-NCAM、En1及びFP4(全てモノクローナル抗体1:2、Developmental
Studies Hybridoma Bank、Tom Jesselより提供)。幹細胞分化：β-チューブリン
タイプIII(Tuj1)モノクローナル抗体1:500及びポリクローナル抗体1:500(両方共
BabCO社)、O4モノクローナル抗体1:5 (Boehringer-Mannheim社)、ガラクトセレ
ブロシド(GalC)モノクローナル抗体1:50 (Boehringer-Mannheim社)、グリア繊維
酸性タンパク質(GFAP) 1:100 (ICN Biochemicals社)。ニューロンサブタイプの
分化：チロシンヒドロキシラーゼ(TH)ポリクローナル抗体1:200〜1:500 (PelFre
eze社、ロジャー、AK)又はモノクローナル抗体1:2000 (Sigma社)、GABAポリクロ
ーナル抗体1:500 (Sigma社)、グルタミン酸1:500 (Sigma社)、ドーパミンβ-ヒ
ドロキシラーゼ(DBH) 1:100 (Protos Biotech社)。適当な蛍光-標識した(Jackso
n Immunoresearch社)又はビオチン化した(Vector Laboratories社)二次抗体、そ
の後の金属-増強したDAB反応(Pierce社)を用いて可視化した。
【０１０８】 神経堤細胞培養組成物の日常の分析のために、培養物を、先に示されたように
、酸性エタノール中に固定し、かつペリフェリンに対する抗体(Chemicon AB 153
0、テメキュラ、CA)、平滑筋アクチン(Sigma A-2547)、及びGFAP(Sigma G-3893)
で染色した(Morrisonら、1999)。交感神経マーカーを染色するために、培養物を
、4％パラホルムアルデヒドで固定し、4％ヤギ血清＋0.2％ BSA＋0.1％ NP-40を
含有するPBSでブロックし、その後にチロシンヒドロキシラーゼ (Behringer Man
nheim社、インディアナポリス、IN)、及び／又はドーパミンβ-ヒドロキシダー
ゼ(Pharmingen社、サンディエゴ、CA)、又はSA-1(Paul Pattersonから寄贈)に対
する抗体で染色した。VAChT染色は、4％パラホルムアルデヒド固定した培養物で
行い、ウマ血清でブロックし、かつヤギポリクローナル抗体(Chemicon AB1578)
中室温で1時間染色し、その後イムノペルオキシダーゼ検出した(ニッケル／ジア
ミノベンジジン沈殿)。
【０１０９】 細胞計測及び統計学的手法 細胞計数及び定量化には、フラクショネーター技術を用いる均一なランダム試
料採取法を用いた(Gundersenら、1988)。統計学的比較は、2群より多くが関連し
た場合、事後Dunnett検定によるANOVAを用いて行った。データが正規分布してい
ない場合は、非-パラメトリック検定(Mann-Whitney U)を用い、低O2対20％O2の
結果を比較した。データは、平均±SEMで表した。
【０１１０】 ドーパミン含量の逆相-HPLC決定 培地、HBSS、及びHBSS＋56mM KClの培養上清を、オルトリン酸及びメタ重亜硫
酸塩で安定化し、かつ分析まで-80℃で保存した。安定化、アルミニウム吸着、
平衡化、及びドーパミン溶離は、これまでに説明されている(Studerら、1998；S
tuderら、1996)。結果は、変動する流量及び感度で、ドーパミン標準品に対して
標準化した。
【０１１１】 Shimadzu溶媒移動システムを、下記移動相と共に用いた：92％ 75mM NaH2PO4、1
.7mMオクタンスルホン酸、0.05mM EDTA、pH3.1；8％アセトニトリル、流量0.8ml
/分。Alltech Absorbosphere HS C18逆相カラム(10 x 4.6mm、3μm)を、検出装
置1の印加電圧+0.02Vと検出装置2の+0.40Vとに設定した電気化学検出装置(ESA：
Coulochem II)に接続した。検出装置反応は、0.05〜10ngについては直線であっ
た(分析した全ての化合物について直線回帰計算、r＝0.99；アッセイ内変動は5
％未満であった)。ピーク面積は、Rainin MACintegrator systemにより計算した
。溶媒から、又は20％酸素中の標準条件下で培養した対照コロニーから調製した
ブランク試料においては、DAもNEも検出されなかった。
【０１１２】 ウェスタンブロット 細胞ペレットを、-80℃で貯蔵した。ペレットは、プロテアーゼインンヒビタ
ー(Complete、Boehringer-Mannheim社)が入った、20mM Hepes、pH7.6、20％グリ
セロール、10mM NaCl、1.5mM MgCl2、0.2mM EDTA、0.1％トリトン-X-100中に溶
解し、ホモジナイズし、かつ氷上で1時間インキュベーションした。遠心後、上
清タンパク質濃度を、BCA (Pierce社)によりアッセイした。ウェスタン法のため
には、TBST中の5％ミルクでブロックし、一次TH抗体(Pel-Freeze社、ロジャース
、AK)を1:500で使用し、かつ二次抗体は、HRP-複合ヤギ抗-ウサギ抗体(Pierce社
)1:5000であった。シグナルは、SuperSignal (Pierce社)で検出した。
【０１１３】 RTPCR（登録商標） 培養物を、PBSで1回洗浄し、その後2ml(6cm皿1枚当たり) Trizol (Life Techn
ologies社)で可溶化し、その後-80℃で保存した。製造業者(Gibco Life Technol
ogies社)の推奨に従い、RNA抽出を行った。ひとつの条件につき10μgのRNA逆転
写に、Superscriptキット(Gibco Life Technologies社)を用いた。PCR条件は、
直線状の増幅範囲を決定するように、MgCl濃度及びサイクル数を変更し最適化し
た。増幅産物は、サイズ別に同定し、かつDNA配列決定により確定した。親切に
もTHは、Vera Vikodem、NIDDK、30サイクル、56℃、300bpにより提供された。他
の産物については、プライマー配列、サイクル数及びアニーリング温度を、表2
に示した。
【０１１４】
【表２】 表２．PCRのためのプライマー配列、サイクル数およびアニーリング温度
【０１１５】
【表３】 表２．つづき
【０１１６】
【表４】 表２．つづき
【０１１７】 坐骨神経p75+Po-の単離 妊娠したスプラーグ−ダルウェイ系ラットは、Simonsen社(ギルロイ、CA)から
入手した。時機を合わせた妊娠のために、動物は午後はつがいとし、交尾栓(plu
g)を観察した午前をE0.5と称した。神経堤幹細胞を、先に説明されたようにE14.
5坐骨神経から採取した(Morrisonら、1999)。簡単に述べると、神経を切り出し
、トリプシン＋コラゲナーゼ中で、4分間37℃でインキュベーションしかつその
後機械的に摩砕することにより分離した。これらの細胞を、p75 (192Ig)、低親
和性ニュートロフィン受容体、及びPo(P07)、PNSミエリン成分に対するモノクロ
ーナル抗体で染色した。全ての検索及び分析は、FAGS Vantage フローサイトメ
ーター(Becton-Dickinson社、サンノゼ)で行った。NCSCは生存p75+Po-細胞とし
て検索した。
【０１１８】 実施例２ 結果：低O2は線条及び中脳前駆細胞のエクスパンジョンを増大させる CNS前駆細胞由来物として広く使用されているE14ラットの線条を、低O2中で培
養し、bFGFの存在下で広範な播種密度にわたって、20％O2培養物よりも平均2〜3
倍多い細胞を得た。(塩基性FGFは、発生時の脳の多くの領域から得られる幹細胞
にマイトジェンとして作用する。bFGFの除去は、ニューロン、アストロサイト及
びオリゴデンドロサイトへの分化を開始する。)(図1)。同様の結果が、E12中脳
前駆細胞においても得られた。全ての結果について、データは、少なくとも2回
の個別の一連の培養により証明された。
【０１１９】 細胞増殖及び細胞死に対する作用 低O2中で得られた増大した細胞が、増大した増殖、低下した細胞死、又はこれ
ら両方に起因するものかどうかを検証するために、前駆細胞を、固定直前に複数
の時点でブロモデオキシウリジン(BrdU)で1時間パルスすると、前駆細胞は増殖
又は分化した。中脳及び線条の両前駆細胞は、低O2中で育成した場合に通常の培
養と比べて増大したBrdU標識指標を示した。低O2中は、bFGFの存在下及び細胞分
化、その後の中脳前駆細胞からマイトジェンが取り除かれた時には、BrdU標識指
標は増大した(図2)。線条前駆細胞へのBrdU取り込み率は同様のパターンを示し
た。｛エクスパンジョン2日目：低O2中で18±6％、対、20％O2中で11±6％(n=24
、p < 0.05)。エクスパンジョン6日目：低O2中で30±8％、対、20％O2中で22±5
％(n=24、p < 0.05)。分化4日目(in vitro 10日目)：低O2中で12±5％、対、20
％O2中で3±3％(n=24、p < 0.05)。｝。
【０１２０】 この明らかな低O2培養での細胞増殖の増加に加えて、前駆細胞は恐らく20％O2 中で増殖したCNS前駆細胞よりも少ないアポトーシスを受けたであろう。中脳及
び線条の両前駆細胞は、エクスパンジョン時及びbFGF除去後の両方で TUNEL-陽
性細胞の割合の顕著な低下を示した。中脳前駆細胞に関するTUNELデータを図3に
示した。従って、減少したアポトーシス及び増大した細胞増殖の両方が、エクス
パンジョン終了時の細胞収量の上昇に寄与する。細胞死は、O2レベルの低下によ
り分化相時に減少するが完全に排除されるわけではない。
【０１２１】 細胞系列及びクローン増殖 低O2中の培養がいかに分化経路の選択及び分化の速度論に影響を及ぼすかを特
徴付けるために、一連の分子マーカーを、形態学的評価と共に使用した。中間径
フィラメントネスチンの免疫反応性を用いて、CNS幹細胞及び前駆細胞をより分
化した子孫から区別した(Lendahlら、1990)。bFGF除去の6日後、エクスパンジョ
ンした前駆細胞に由来するネスチン-陽性細胞の割合は、低O2培養物で、20％O2
培養物と比べ著しく減少しており、このことは、分化が低O2中で加速されたこと
を示唆している(図4A及び図6)。提唱された明確なニューロン前駆細胞のマーカ
ーであるNCAMのシアル酸置換型(PSA-NCAM) (Mayerら、1997)は、逆に、低O2中培
養物の分化を低下した(図6)。より分化された表現型への進行が加速されるとい
う考えは、低O2中でのニューロン性及びグリア性のマーカーのより早期の出現に
より裏付けられた。ニューロンはβ-チューブリンIII(Tuj1)染色により評価し、
アストロサイトはグリア繊維酸性タンパク質(GFAP)で、オリゴデンドロサイト前
駆細胞はO4で、及びオリゴデンドロサイトはGalCガラクトセレブロシド染色によ
り評価した(図4)。bFGF除去の5日後、低O2中に維持された線条培養物は、46％の
Tuj1-陽性細胞を含んだのに対して、20％O2中では34％であり(n=12、p <0.05)；
GFAP+は6％であるのに対し、20％O2中では2％であり(n=12、p < 0.05)；かつ、G
al-C+は4％であるのに対し、20％O2中では5％であった(p=n.s.)。低酸素中に維
持された中脳培養物においては、Tuj1+は73％であるのに対し、20％O2中では63
％であり(n=l2、p< 0.06)；GFAP+細胞はいずれの酸素条件でも検出されず；O4+
は1％であるのに対し、20％O2中では0％であった(n=12、p <0.01) (図4B)。
【０１２２】 クローン密度に対するO2の作用を調べるために、中脳前駆細胞を最初にbFGF中20
％O2中で6日間エクスパンジョンし、密度が1〜5個細胞／ウェルになるよう再度
播種し、その後低又は20％O2中のいずれかで維持した。20日後、20ng/mL bFGFを
取り除いた。典型的な多系分化反応を伴うクローン性培養物が、低O2及び20％O2 条件の両方で観察された。図4Cは、典型的ネスチン+クローン(左パネル)及びマ
イトジェン除去後4日間ニューロン分化したクローン性に誘導された細胞(右パネ
ル)を示している。予想される幹細胞のように、3種全ての系列は、低酸素条件で
増殖したクローンで示された。しかし、クローン形成の効率は、低O2条件が3倍
高く、平均クローンサイズも、20％O2中の<50個細胞より、低O2中の50〜500個細
胞と増加した(図4D、図4E)。
【０１２３】 実施例３ 結果：ニューロンサブタイプの分化 先の結果は、低酸素条件が幹細胞の増殖及びニューロン及びグリア細胞への分
化を支持することを確立した。本発明者らの以前の研究は、ネスチン-陽性中脳
前駆細胞が機能的ドーパミン作動性ニューロンへ分化することを示した(Studer
ら、1998)。次に、この特異的ニューロンの運命が低O2により影響を受けるかど
うかを決定した。低酸素中での中脳前駆細胞は、THを発現しているニューロンの
絶対数及び画分の両方で際だった増加を示した(図5A、図5B)。低O2中において、
実質的には全てのニューロンがTH+であるような多くのニューロン細胞集塊が認
められた。平均で、低O2中で生成されたニューロン(Tuj1染色により印付け)の56
％が、TH+であるのに対し、従来の培養物中では18％であった(n=l2、p <0.001)
。低O2培養物中で増大したTH-免疫反応性は、ウェスタンブロットにおける増大
したTHタンパク質含量に相関していた(図5C)。更にTH-陽性ニューロンの機能的
ドーパミン作動性の能力を逆相HPLCにより評価したところ、これは、低O2、対、
20％O2培養物において顕著に増大したドーパミンレベルを示した(図5D)：馴化培
地(condition medium)(24時間)は、5倍のドーパミンの増加を示した(n=5、p<0.0
１)。HBSS中の基本的放出は、2〜3倍の増加を示し(n=5、p <0.05)、かつ放出の
惹起は3倍の増加をもたらした(n=5、p < 0.05)。これらの結果は、機能的ドーパ
ミン作動性ニューロンの分化には低酸素が好ましいことを確認している。
【０１２４】 中脳前駆細胞は、ドーパミン作動性の運命に加えて、いくつかの異なる神経伝
達物質表現型を伴うニューロンを生じる(Studerら、1998)。興味深いことに、セ
ロトニン作動性ニューロンの割合も、20％O2中の1.2±0.3％に対し、低O2中で3.
2±1.2％と増大した(n=12、p <0.05、図6)。他方で、GABA+及びグルタミン酸+ニ
ューロンは、低O2中でより少ないように生じた(図6：GABA+細胞は、低O2中で6.6
±1.8％、対、20％O2中で10.4±1.5％、n=12、p < 0.05；グルタミン酸+細胞は
、低O2中で12.8％±3.8％、対、20％O2中で23.6±4.0％(n=12、p <0.01)。GABA
とTHの二重標識は検出されず、これはTHの免疫反応性が分化したドーパミン作動
性ニューロンに対応しており、かつGABA作動性ニューロンの発生時に認められる
一過性の発生的現象ではないことを示している(Maxら、1996)。更に、TH-陽性ニ
ューロンは、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼで染色されなかったので、ノルア
ドレナリン作動性の表現型は運命づけられていない。
【０１２５】 低O2は、腹側(ventral)ニューロン表現型であるドーパミン作動性及びセロト
ニン作動性ニューロンの両方の分化を促進したので(Yamadaら、1991；Hynesら、
1995；Yeら、1998)、これらの変化は、底板細胞の増加に関連していることが決
定された。免疫組織化学的に、低O2中でのFP4+細胞のエクスパンジョンされたゾ
ーンが明らかにされた(図6)。より際立った特徴は、低O2中で転写因子エングレ
イルド-1(En1)(engrailed-1)を発現しているニューロン出現の増大である(図6)
。エングレイルド-1は、通常の中脳発生に重要であり(Joyner、1996；Danelian
及びMcMabon、1996；Wurstら、1994)、かつドーパミン作動性ニューロンの運命
の制御に関連している(Simoneら、1998)。
【０１２６】 低酸素条件が、培養システムの増殖又は分化相の間に作用することにより、ド
ーパミン作動性の分化を増強するかどうかを確立することは重要である。中脳前
駆細胞を5日間、低又は20％O2中のいずれかでエクスパンジョンした。その後各
群を低又は20％O2のいずれかでの分化について再分した。低O2中でエクスパンジ
ョンされたが20％O2中で分化された前駆細胞は、38±6％のTH-ニューロンを生じ
、これは全て低O2中で維持されたもの(41±7％、n=12、p = n.s.)と類似してい
たが、全て20％O2中で維持されたもの(17±4％、n=12、p <0.01)よりも顕著に高
かった。分化相に制限された低O2への曝露は、全て20％O2中で維持された培養物
と比べて、ドーパミン作動性ニューロンの収量を顕著に増大することはなかった
(21±2％、n=12、p=n.s.)。これらのデータから、低O2の主な作用はエクスパン
ジョンフェーズにおけるものであることが示された。
【０１２７】 半−定量的RT-PCRを用いて、培養物のRNAを様々な時点で、ドーパミン作動性
ニューロン発生に関与する候補遺伝子の示差的発現についてアッセイした(図7)
。20％O2と比べて、THメッセージのわずかな増加が、分化後の低O2培養物から検
出された。Ptx3ホメオボックス遺伝子も、ドーパミン作動性ニューロンの発生に
関連していて(Smidtら、1997)、かつ低O2中での増大したレベルで発現し、この
ことはこれらの条件が、単純にTH遺伝子発現をアップレギュレーションしたので
はなく、ドーパミン作動性表現型を促進したことを示唆している。強力な証拠は
、ソニックヘッジホグ(socnic hedgehog)遺伝子(Echelardら、1993)；及び、Nur
r1 (Saucedo -Cardenasら、1998)遺伝子を、中脳ドーパミン作動性ニューロンの
分化に関連付けているが、発現のO2−依存性は検出されなかった。しかし、エン
グレイルド-1は、低O2中でアップレギュレーションされ、これは免疫組織化学的
結果と相似していた(図6)。繊維芽細胞成長因子8b(FGF8b)のメッセージは、エク
スパンジョンフェーズの終了時までに、低O2中で劇的にアップレギュレーション
される。ドーパミン作動性分化の他の調節因子に対するメッセージは、O2条件に
著しく左右されることはなかった。
【０１２８】 実施例4 考察: 低酸素培養はCNS幹細胞の増殖と生存に好都合である 哺乳動物細胞の培養の標準条件は、5％CO2と95％空気のガス雰囲気中で37℃で
ある。即ち、環境温度は、コア哺乳動物体内温度を反映するように調節され、CO 2 はほぼ静脈濃度を反映するように調節されるが、著しく対照的には、培養内O2
レベルは生理的レベルを反映するように調節されない。水面においては、加湿さ
れていない室内空気は、21％のO2を含有し、95％空気/5％CO2混合物は、20％O2
を含有する。肺胞気は14％のO2を含有し、動脈O2濃度は12％であり、静脈O2レベ
ルは5.3％であり、組織細胞内O2平均濃度は3％である(Guyton, & Hall, 1996)。
本研究に直接関係する成体ラット及びヒツジ胎児の脳平均O2は、共に1.6％であ
った(Silver & Erecinska, 1988; Koos & Power, 1987)。脳領域の生理的組織O2 レベルは低い(表1)。本実験においては、CNS幹細胞培養に関する、より生理的な
低酸素レベルの影響を分析し、4つの主な効果: 1)前駆細胞の増殖増加; 2)アポ
トーシスの減少; 3)分化した状態への進行加速; 4)TH+ ニューロンの絶対数と割
合の上昇がわかった。
【０１２９】 低O2培養は、一貫してCNS幹細胞の増殖を促進させた。ほとんどの細胞がネス
チン＋前駆体であるときの増殖フェーズ中に細胞数の2〜4倍の増加が観察された
。この細胞数の増加は、増殖がかなり減少し分化が行われたときのマイトジェン
の使用中止後にも維持された。低O2において分化した培養中に多くの細胞が存在
するが、ニューロンとグリアの割合は、2つの培養条件において同様であった。
神経組織においては、特殊化されているが、視神経冠由来頚動脈体クロム親和性
細胞において低O2のマイトジェン活性の支持している先例がある(Nurse & Vollm
er, 1997)。これらのドーパミン作動性糸球体細胞は、機能的に特殊化されたO2
感受性化学受容体であるので、動脈におけるO2レベルの変化に特異的に応答する
と考えられる。本結果から、低酸素がCNS幹細胞の増殖と生存を促進させること
がわかる。
【０１３０】 2つの特定のシグナリング経路、FGF8及びEPOは、低O2応答に重要な役割の候補
として同定され、各々が20％のO2において低O2表現型の一部を反復し得ることが
わかった。低O2培養によってエリスロポイエチンとFGF8をコードしているRNAの
相対増加がもたらされた。初期の中脳発達においては、FGF8はマイトジェンとし
て機能する(Dandlian & McMahon 1996)が、CNS幹細胞培養物に対するFGF8の顕著
なマイトジェン又は栄養効果は報告されていない。ここでは、20％O2中で維持さ
れかつ250 ng/mlのFGG8に曝露した中脳前駆体からの細胞収量の増加が、低O2の
増殖/栄養効果を部分的に再現し、低O2中の200〜400％増加と比べて総数が30％
増加した。増殖促進のほかに、低O2中で培養したCNS幹細胞においてアポトーシ
スが減少する。室内空気培養物中に生じた反応性酸素中間体(ROI)には毒性の潜
在的役割がある。しかしながら、20％O2培養が低O2培養より酸化的ストレスを生
じることは、フリーラジカルが虚血状態で生じるので単純に考えることができな
い(Perez Velazquczら, 1997)。 低O2に見られる細胞数の増加と対照的に、増殖した線条体前駆体又は中脳前駆
体に由来するニューロンとアストログリアとオリゴデンドログリアの最終比に影
響がわずかだけ検出された。クローナル分析と共にこの結果から、低酸素で増殖
したネスチン＋前駆体が幹細胞特性を有することが確認される。
【０１３１】 実施例5 考察: ドーパミン作動性コミットメント(commitment)と分化 CNS幹細胞が複数のニューロンタイプを生じ得る多くの証拠がある(Joheら, 19
96; Grittiら, 1996; Kalyaniら, 1998)。ニューロンサブタイプ特定化のモデル
として中脳が数年研究されてきた(Hynesら, 1995; Yeら, 1998; Wangら, 1995;
Ericsonら, 1995; Hynes & Rosenthalの総説, 1999)。最近、試験管内で中脳前
駆細胞を増殖し、ドーパミン作動性ニューロンに分化させる条件が確かめられた
(Studerら, 1998)。わずか5％のニューロンがTHに免疫反応であるラット胎児中
脳初代培養と対照的に、E12中脳から分離した前駆体培養においてはこの数字が2
4％のニューロンに上昇した。ここでは、中脳前駆体から生じた56％のニューロ
ンがTH+ であり、この知見はHPLCによりドーパミン生産増加と関連があることが
わかる。この脳領域に見られる他の腹側ニューロンタイプのセロトニンニューロ
ンも低O2で数の増加が生じた。対照的に、GABA作動性ニューロンとグルタミン酸
作動性ニューロンの数は減少した。低酸素条件は、前駆細胞エクスパンジョンフ
ェーズでドーパミン作動性ニューロンを生成するのにたいてい有効であった。こ
れらの結果は、低酸素条件が分化前に作用するメカニズムによって腹側動態の生
産を高めることを示している。
【０１３２】 中脳ドーパミン作動性ニューロン発生の媒介物質と考えられているFGF8及びEn
1の転写物レベル(Yeら, 1998; Simoneら, 1998; Shamimら, 1999)は、低O2培養
と20％O2培養においてアップレギュレートした。FGF8は、セロトニンニューロン
のコミットメントにも関与している(Yeら, 1998)。これらの知見は、低O2培養に
見られるドーパミン作動性ニューロンサブタイプ及びセロトニンニューロンサブ
タイプのエクスパンジョンにおけるFGF8の役割と一致している。しかしながら、
20％O2培養へのFGF8の添加又は低O2培養におけるFGF8の中和は、O2依存性ニュー
ロンサブタイプ分化パターンを再現しなかった。分泌したモルフォゲンソニック
ヘッジホッグ(sonic hedgehog)(SHH)は、初期神経プレートの体外移植組織にお
いてドーパミン作動性ニューロン分化を誘導することがわかっている(Hynesら,
1995; Yeら, 1998; Wangら, 1995)。精製したソニックヘッジホッグは、両酸素
条件下に増殖した中脳前駆体に対して効果がなかった。
【０１３３】 Engrailed-1 mRNAとタンパク質レベルは、低酸素で上昇した。Engrailed-1は
、pax2、wnt-1及びFGF8による経路に作用して中脳ニューロンの運命を調節する
と考えられている(Joyner, 1996; Danelian & McMahon, 1996; Wurstら, 1994;
Simoneら, 1998)。FGF8遺伝子は、Engrailedの結合部位を含んでいる(Gemelら,
1999)。更に、FGF8 5'-UTR配列(受託番号#AF065607)は、VEGF及びEPO調節要素に
おける酸素応答性を制御することが既知である9塩基配列(CCTCCCTCA)を含んでい
る(Scandurro, & Beckman, 1998)。本発明者らは、En1が低O2培養においてFGF8
の直接の上流調節遺伝子として作用するのか又はそれぞれが独立して作用するか
をまだ決定していない。しかし、若いニューロンにおけるEn1の目だった発現は
、ニューロンサブタイプ分化を調節する良好な候補であってもよいことを示して
いる。
【０１３４】 EPOレベルは、造血系において酸素によって調節されることが既知である。EPO
及びその受容体は、初期発生から成体期まで脳において発現する(Juulら, 1999)
が、CNS発達のEPOの特定の役割は記載されていない。しかしながら、成体CNSに
おいて、EPOは神経保護物質として注目され(Sakanakaら, 1998)、PC12細胞のEPO
処理は、細胞内モノアミンレベルを上昇させることが証明されている(Masudaら,
1993)。ここでの結果から、20％O2においてEPOが低O2効果の一部をミミックし
得ることがわかる。20％O2培養におけるドーパミン作動性ニューロンの収量の増
加は用量依存性であるが、収量の増加は低酸素におけるEPOによって仲介されず
、低O2におけるEPOレベルはこの応答の最大機能レベルにあったことを示してい
る。20％O2培養のEPO補足は、ドーパミン作動性収量を著しく向上させるが、低O 2 の十分な効果は再現されず、低O2においてドーパミン作動性分化を促進させる
のに追加の要因が関係していることを示している。しかし、EPOがエクスパンジ
ョンしたCNS前駆体の分化パターンに影響するという知見は新規であり、低酸素
条件におけるドーパミン作動性ニューロン収量増加の成分としてのEPOを明らか
にしたものである。
【０１３５】 分化したドーパミン作動性中脳ニューロンを低酸素条件(0％のO2ガス混合物)
に曝露するとドーパミン含量が増加することが最近の報告によって強調された(G
rossら, 1999)。他の研究によって、5％O2に曝露した後のE14ラットからのニュ
ーロン初代培養においてTH発現ニューロンの相対増加が記載されている(Colton
ら, 1995)。また、低酸素条件がTH遺伝子の発現を援助することも既知である(Cz
yzyk-Krzeskaら, 1994; Pauliding, & Czyzyk-Krzeska, 1999)。しかしながら、
これは、低酸素条件がエクスパンジョンフェーズでCNS幹細胞を支持しかつ腹側
ニューロンサブタイプの生産を高める最初の報告である。 20％O2と比べて低O2におけるドーパミン作動性ニューロンの正味増殖は、少な
くとも9倍促進した(全細胞数で3倍の増加、及びTH＋ニューロンのパーセンテー
ジで3倍の増加)。HPLCから、これらのニューロンがドーパミンを生産することが
わかる。本結果から、培養において従来用いられているものより非常に低い酸素
レベルがin vivoの現象を模倣するのに用いることができることがわかる。低O2
培養は、パーキンソン病の移植片治療のためのドーパミン作動性ニューロンの効
率のよい生産にあずかるという実用的意味を有する。最後に、細胞培養に対する
生理的低O2の効果は、CNSに限定されず、PNS及び他のニューロン組織に及ぶもの
である。
【０１３６】 ドーパミン作動性分化に対するEPOの影響が研究された。飽和濃度のEPO又はEP
O中和抗体を、実施例3に示された条件を用いて低O2又は20％O2で増殖フェーズと
分化フェーズの間(それぞれ5日間)にE12中脳前駆体培養に添加した。EPOを、播
種時またはbFGFを除いたときの開始時に5 U/mlの用量で5日間培養液に添加した
。総培養時間10日間の終わりに、細胞を固定し、THを染色してドーパミン作動性
ニューロンをマークした。ポジティブ染色細胞の数を計数した。EPO補足によっ
て、20％O2培養内のTH＋細胞数が著しく増加した(n＝6、p＜0.05)。 EPOの代わりに抗EPOで実験を繰り返した。抗EPO濃度は、飽和濃度にした。時
間は、EPO実験と同じにし、染色し、同じ10日の時点で計数した。EPO中和抗体に
よって、低酸素(n＝6、p＜0.05)培養と20％O2培養双方においてTH＋細胞数が減
少した。図8は、EPOが初期に添加された場合の結果を示す図である。EPOの後期
添加において同様の結果が得られた。
【０１３７】 実施例6 結果: 低酸素培養は、NCSCの生存、増殖、及びニューロン分化を促進させる E14.5ラットの坐骨神経からフローサイトメトリーによってNCSCを単離し、標
準条件下クローン密度の培養物へ選別した(Morrisonら, 1999)。一部の培養物を
6％CO2及び20％O2(空気から)を含有する標準インキュベータ内に保ち、一部の培
養物を5％の実際のO2レベルを生成する1％O2/6％CO2/残りの％N2を流した気密チ
ャンバ内に保持した。15日後、プレートをペリフェリン(ニューロンを検出する
ため)、グリア原線維酸性タンパク質(GFAP; グリアを検出するため)、及び平滑
筋アクチン(SMA、筋線維芽細胞を検出するため)に対する抗体で染色した。結果
を表3に示す。p75+P0細胞の生存能及びコロニー形成能は、低酸素で著しく高か
った。培養に添加した35％の細胞が20％酸素においてコロニーを形成し、48％の
細胞が5％酸素において形成した(p＜0.01)。
【０１３８】
【表５】 表3: 低酸素における坐骨神経p75+P0細胞の培養は視神経冠幹細胞の生存と多系
分化を促進させる
【０１３９】 p75+P0細胞をクローン密度で培養へ選別し、15日間培養し、続いて組織免疫化
学を行った。プレート効率は、培養へ選別され、コロニーを形成し続けて15日後
に検出される細胞の％を意味する。N、S、及びMは、ニューロン、シュワン細胞
、及び筋線維芽細胞がそれぞれコロニー内に見出されることを意味する。例えば
、N＋S＋Mコロニーは、ニューロン、シュワン細胞及び筋線維芽細胞を含んでい
る。データは、平均±標準偏差として示され、1回の実験1回の処理に対して70コ
ロニーを超える平均が計数される6回の独立した実験から得たものである。結果
をt検定で比較し、著しく異なる統計は* が付けられている(P<0.05)。
【０１４０】 生存の向上のほかに、p75+P0細胞は5％酸素で多系統コロニーを形成するよう
であった。20％酸素中では、48％のコロニーだけが多系統(ニューロン、シュワ
ン細胞、及び筋線維芽細胞を含む; 表3のN+S+M)であり、残りは主にシュワンの
みのコロニーであった(Sのみ、表3)。対照的に、5％酸素培養では、かなりのコ
ロニーが多分化能(82％)であり、わずかなコロニーがシュワンのみ(6％)であっ
た。この差は、80％を超えるp75+P0細胞が多分化能であるが、20％酸素で培養し
た場合はシュワン細胞にのみ多分化能性前駆細胞がしばしば生じると説明できる
。その他の可能性は、低酸素レベルがグリア前駆細胞に対して毒性があって、頻
度が過小評価されることである。低酸素において著しく高いプレート効率は、後
者の可能性の反証となる。しかし、標準培養液中のE18.5坐骨神経細胞を5％か又
は20％酸素において培養することによりこれを試験した。多分化能性前駆細胞は
、E17.5後の坐骨神経で検出されなかったので、E18.5神経のほとんど又は全部の
神経前駆細胞はグリアへ向けられたと思われる(Morrisonら, 1999; Jessenら, 1
999)。シュワンのみ又は筋線維芽細胞のみのコロニーの頻度は5％と20％の酸素
培養間で差がなかった。23％のE18.5坐骨神経細胞はシュワンのみのコロニーを
形成し、22％は酸素レベルに無関係に筋線維芽細胞のみのコロニーを形成した(
残りの55％の細胞はコロニーを形成せずに死滅した)。これと一致して、低酸素
は、構成NCSCが15〜20％のみであるE14.5坐骨神経細胞の大量培養で全体のプレ
ート効率に影響しなかった(データは示されていない)。これらのデータは、低酸
素培養がNCSCの生存と多系分化を限られた前駆細胞の生存に偏らずに促進させる
という概念を支持している。p75+P0集団は、80％を超えるNCSCを含むと思われる
。
【０１４１】 p75+P0細胞が低酸素培養で自己再生するかを試験するために、96ウェルプレー
トの1ウェル当たり1つの細胞を入れてから、7日後に7コロニーをサブクローン化
した。すべての創始クローンは、多分化能サブクローンを生じ、1創始クローン
当たり平均158±149個の多分化能サブクローンを生じさせ、20％酸素において以
前に証明されたように個々のp75+P0細胞が低酸素で自己再生することを示してい
る(Morrisonら, 1999)。 低酸素培養は、NCSCの増殖も促進させた。以前に記載されているように(Morri
sonら, 1999)、多分化能コロニーは、外観に基づいて他のコロニータイプと区別
し得る。培養6日後、多分化能であると予想されるコロニーは、20％酸素で289±
237細胞(n＝9)又は5％酸素で589±156(n＝6)を含有した。コロニーサイズのこの
差(p＝0.018)は、培養のわずか6日後に両酸素レベルでコロニーに死滅細胞が観
察されたので増殖の差によるものであったに違いない。20％酸素で1コロニー当
たり7.1±5.6細胞又は5％酸素で1コロニー当たり17.5±7.0が形態学による死滅
が見られた。即ち、低酸素においては、培養6日目までに多くの細胞として約2倍
を含むかなりの程度の形成コロニーに増殖した。 標準培養条件下、シュワン細胞と筋線維芽細胞を含まないコロニーにニューロ
ンがほとんど観察されていない(表3; Morrisonら, 1999)。即ち、ニューロンの
可能性は、NCSC活性と関連がある。BMP2は、NCSCを指示してニューロンへ分化さ
せる(Shahら, 1996; Morrisonら, 1999)。ニューロンの可能性の独立した試験と
して、BMP2を5％か20％酸素でp75+P0細胞の培養に添加した。4〜6日後、培養に
ついてペリフェリンを染色してニューロン分化の程度を分析した。結果を表4に
示す。
【０１４２】
【表６】 表4: BMP2によって指示される坐骨神経p75+P0細胞のニューロン分化は低酸素で
の培養によって促進される
【０１４３】 p75+P0細胞をクローン密度で培養へ選別し、5又は6日間培養し、続いてペリフ
ェリン、末梢ニューロンのマーカーを染色した。プレート効率は、培養物へ最初
に選別した細胞の、コロニー形成に至った細胞のパーセンテージを意味する。デ
ータを、5回の独立した実験の平均±標準偏差として示す。異なる酸素濃度(添加
せず又は+BMP2処理の中で)の結果をt検定で比較し、有意に異なる統計値は* が
付けられている。(P<0.05)。低酸素培養によって、いずれの処理によってもプレ
ート効率が有意に増加し、BMP2の存在下においてニューロン分化効率が著しく高
められた。 以前に見られたように、低酸素において、高割合のp75+P0細胞が生存し、BMP2
を添加したかに関係なくコロニーを形成した。BMP2を入れなかった培養物では、
ほとんどのコロニーにはペリフェリン+ 細胞が含まれなかった(通常、標準培養
条件下少なくとも12日間ペリフェリン発現は明らかでない)。しかしながら、BMP
2を添加した培養では、低酸素と、ニューロンのみを含むコロニーの著しく高い
割合とニューロンを含まないコロニーの著しく低い割合とが関連していた。低酸
素ではほぼ60％のコロニーがニューロンのみを含み、ほとんどの95％のコロニー
が少なくとも一部のニューロンを含んでいた。即ち、ニューロンの分化は、低酸
素培養で著しく促進され、95％までのp75+P0細胞がNCSCであることができる。
【０１４４】 実施例7 結果: 低酸素培養によって坐骨神経から単離したほとんど全部のNCSCがSA系列の
可能性をもつことがわかる p75+P0細胞を添加して5％か又は20％酸素において標準条件のクローン密度で
培養した。6日間培養した後、5μMフォルスコリンと1ng/ml BMP2を培養に添加し
た。全体で12日間培養後、コロニーについて交感神経系統分化の3種のマーカー:
TH、DBH、及びSA-1、クロム親和性細胞のマーカー及び交感神経副腎前駆細胞を
染色した(Carnahanら, 1991)。標準培養及びフォルスコリン及びBMP2で補足した
培養双方において、低酸素は、TH、DBH、又はSA-1を発現する細胞を含有するコ
ロニーの割合を著しく増加させた(図9)。フォルスコリン及びBMP2で補足した低
酸素培養においては、ほぼすべての幹細胞コロニーはTH+ 細胞、DBH+ 細胞及びS
A-1+ 細胞を含有した(図9)。交感神経マーカーを発現するコロニーの割合を高め
るほかに、低酸素及び/又はフォルスコリン及びBMP2の添加はマーカーを発現す
るコロニー内の細胞の割合及びマーカー発現の強さを高める傾向がある。抗TH抗
体染色の蛍光外照射によってモニターした場合、BMP2＋フォルスコリンの低酸素
培養によるTH発現の誘導があった。本実験においてBMP2又はフォルスコリンを含
まない20％酸素で育成した培養にTH発現は見られなかった。一般に、環境酸素培
養においてはTH+ 細胞はほとんど認められなかった。
【０１４５】 5％O2においてBMP2＋フォルスコリンで育成した培養物において、細胞はTH及
びDBH、又はTH及びSA-1をしばしば同時発現した。TH及びDBHを二重染色したコロ
ニーにおいては、多くのTH+ 細胞はDBH+ (及び逆もまた同じ)であるが、TH+DBH- とTH-DBH+ 細胞のサブセットもある。TH及びSA-1を二重標識したコロニーにおい
ては、全部又はほぼ全部のSA-1+細胞はTH+であり、多くのTH+細胞はSA-1+である
が、一部はSA-1-であった。培養物を低酸素＋1 ng/ml BMP2＋5μMフォルスコリ
ンで育成し、抗TH及び抗DBH又は抗SA1で二重標識した。SA-1及びDBHに対する抗
体が同じイソタイプを有することから、それらのマーカーを二重染色することは
不可能であった。これらのデータから、E14.5坐骨神経から単離しかつこれらの
条件下で培養したほとんどすべてのNCSCがSA系統の可能性をもつことが示される
。
【０１４６】 実施例8 結果: NCSC由来のTH+ 細胞はニューロンマーカーを同時発現し、 ドーパミンとノルエピネフィリンを放出する これらの細胞によって明白なニューロン分化を促進させるために、p75+P0細胞
を低酸素においてクローン密度で標準培養液中で6日間、続いてフォルスコリン
及び低BMP2で補足した培養液中で6日間、続いてそれぞれ50ng/mlのNGF及びNT-3(
試験管内で交感神経神経芽細胞の分化と生存を促進させることが示されている(B
irrenら, 1993; Verdiら, 1994)で補足した培養液中で最後の6日間培養した。こ
れらの条件下、各コロニー内の細胞の3.6±2.5％はTH+であった。これらの幹細
胞コロニーは、105を超える細胞を含むので(Morrisonら, 1999)、個々のp75+P0
細胞は数千のSA系細胞を生じた。 これらの条件下で増殖した培養物をTHに対する抗体と神経フィラメント中分子
量サブユニット(NFM)で二重標識することによって、形態学及びNFM染色に関して
異なる3種のTH+ 細胞タイプを含有することがわかった。1つのタイプは、SIF又
はクロム親和様細胞に似ている(Doupeら, 1985)及びその中の参考文献)、ニュー
ライトの小さい又は存在しない、TH染色の非常に強い、及びNFM染色の弱い多角
形形態を示した。また、TH染色の非常に強い中間レベルのNFM染色をもつ結節状
突起の長い多角形細胞があり、SIF細胞と交感神経ニューロン間の表現型の中間
体と思われる。最後に、未熟な交感神経ニューロンに似ている他の細胞は、細胞
体が丸く、ニューライトが長く、TH染色のレベルが低く、NFM染色が強い。ニュ
ーロン促進条件下で培養してからTH及びNFMを二重標識した29NCSCコロニーのす
べてがSIF細胞と交感神経ニューロンに似ている細胞を含有した。
【０１４７】 TH+及びDBH+細胞を含む個々のNCSCに由来するコロニーもDA及びNE双方を生産
するかを決定するためにHPLC分析を用いた。p75+P0単一細胞を96ウェルプレート
の個々のウェルへ選別してから、交感神経ニューロン促進条件下で培養した。コ
ロニーをトリプシン処理し、0.2M過塩素酸に再懸濁し、HPLCによりDA及びNE含量
を分析した。真正標準と同様の保持時間(＜0.1 min)でDA及びNEピークを同定し
た。3/3コロニーはDAを含有し、2/3コロニーはNEを含有した。共に含有するコロ
ニーのDA:NEモル比は、約1:1であった。他のコロニーをHBSS中の40 mM KCl中で5
分間インキュベートして脱分極して伝達物質の放出を誘導してから、上清と細胞
をHPLCで分析した。その8個の上清中5個がDAを含有し、8個中6個がNEを含有した
。双方の伝達物質を含有する5試料中3試料中の比は、1:3(DA:NE)に近かった。脱
分極後に抽出した細胞においては、4/4は残留DAを含有したが、検出可能なNEを
含有しなかった。これらのデータは、DAは小胞性でもあり細胞質性でもあるが、
NEはカテコールアミン作動性細胞中では小胞性のみであるという事実と一致する
。
【０１４８】 SAマーカーを発現しないNCSCによって生じたニューロンの神経伝達物質表現型
は、特に興味深いものであった。交感神経と副交感神経(コリン作動性)系統間の
密接な発生関係を考えると、これらの細胞がコリン作動性でありえる。標準条件
下で増殖したNCSCコロニー内で発育したほとんどのニューロンは、小胞アセチル
コリン輸送体(VAChT)に対する市販のポリクローナル抗体で染色した。染色が弱
く、免疫ペルオキシダーゼ法で検出され得るだけであったが、適切な点状小胞局
在化を有した。SA系細胞を含有する培養物をTH及びVAChTに対する抗体で二重標
識する試みは、後者抗原の発現が低レベルのために不成功であったが、その培養
物におけるVAChTの発現は免疫ペルオキシダーゼ単一標識で検出され得た(図示さ
れていない)。しかし、すべてのコロニーが標準条件下でVAChT+ニューロンを含
有し、標準条件からBMP2＋フィルスコリンにスイッチしたほとんどすべてのコロ
ニーがTH+ 細胞を含有したという事実は、単離したNCSCが副交感神経系統能及び
SA系統能の双方を有することを意味する。
【０１４９】 低酸素培養が個々の精製幹細胞から非常に多数のドーパミン作動性ニューロン
の生産を促進し得るという知見は、パーキンソン患者への移植を容易にする重要
な手段である。示された培養条件下、個々のNCSCは、1コロニー当たり平均3000
を超えるTH+ 細胞を生じた。これは、幹細胞増殖を促進させるため又は交感神経
分化を最適化するための特別の努力を含まなかった。即ち、当業者に既知とみな
されるものの適度な努力によって、更にドーパミン作動性細胞数のかなりの増加
が得られるであろう。単一幹細胞から数千又は数百万のドーパミン作動性細胞が
生成できることによって、治療上の移植に適した特定の前駆細胞及びドーパミン
作動性細胞が得られる。
【０１５０】 実施例9 骨格筋前駆細胞の低酸素培養 成体骨格筋細胞においては、前駆細胞はサテライト細胞と呼ばれている。通常
、サテライト細胞は、休止状態であるが、筋が外傷を負った場合にこれらの細胞
は分裂及び分化するので、再生骨格筋源である。本明細書に開示されたように、
大気より低い酸素培養条件(1％酸素)は、培養の最初の数日間筋線維に付随した
分裂するサテライト細胞数を有意に増加させる。 BrdU標識及び形態学的基準を用いて、筋の単位長当たりのサテライト数を12時
間おきに定量した。(線維の単位長は20×拡大能径顕微鏡視野とした。) 最初の
数日間の各間隔では、低酸素条件下で分裂するサテライト数は、従来の室内空気
培養下の約2倍であった。
【０１５１】
【表７】 表5. 12時間おきの筋単位長当たりのサテライト数の定量
【０１５２】 サテライト細胞を単離、同定、培養及び分化する方法は、当業者に周知である
。例えば、Lucasらの米国特許第5,328,695号には、骨格筋幹細胞の系統始動及び
分化を刺激する哺乳動物骨からの筋形成タンパク質単離物が記載されている。筋
前駆細胞の初代培養は、ニワトリ胚から得られ、培養し、試験管内で分化させた
。本発明者らは、米国特許第5,328,695号の方法と共に用いられた本明細書に記
載されている低酸素条件が哺乳動物系由来の幹細胞及びサテライトの単離、活性
化、及び分化を更に増強すると考える。 Cormelison & Wold(1997)は、成体マウス骨格筋からサテライト細胞を単離し
、静止状態及び活性化サテライト細胞においてある種の遺伝子の発現を確認した
。従来は、静止状態のサテライト細胞は、混入している線維芽細胞と区別するこ
とが難しかった。その2つを区別するために使用し得る既知の分子マーカーがな
かったからである。単細胞逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)法を用いて
、Cormelison & Wold(1997)は、c-metが静止状態のサテライト細胞で発現するが
筋由来線維芽細胞又は健康な筋外植片からの他の単核形成細胞では発現しないこ
とを証明した。更に、c-metは、サテライト細胞の活性化、増殖、及び分化全体
に発現した。従って、c-metは、サテライト細胞及びそれから分化した細胞を検
出するために分子マーカーとして使用することができる(Cormelison & Wold, 19
97)。
【０１５３】 単一細胞RT-PCR法を用いて、Cormelison & Wold(1997)は、活性化時にサテラ
イト細胞が筋決定及び分化のMyoDファミリー調節遺伝子(mrf)の遺伝子発現の異
なる進行を示したことを続いて証明した。活性化サテライト細胞は、mrf中最初
にc-metとMyoDか又はc-metとmyf5を発現し始めた(Cormelison & Wold, 1997)。
次に、ほとんどの細胞がc-met及びmyf5とMyoD双方を同時に発現した(Cormelison
& Wold, 1997)。この状態に続いて細胞は、c-met、myf5、MyoD、及びミオゲニ
ンを発現した(Cormelison & Wold, 1997)。少しの細胞が後にc-metとミオゲニン
を発現したが、ほかは前の状態のMRFのすべて＋MRF4を発現した(Cormelison & W
old, 1997)。次の状態では、myf5及びMyoD発現が止められ、c-met、ミオゲニン
及びMRF4が発現したままである(Cormelison & Wold, 1997)。即ち、静止状態の
サテライト細胞は、c-met発現で決定することできるが、サテライト細胞の活性
化及び分化は、c-met、myf5、MyoD、ミオゲニン、及びmrf4の発現で決定するこ
とができる。
【０１５４】 本発明者らは、特に、骨格筋線維が1％酸素レベルによって培養される場合にm
rfグループの筋転写因子の発現が促進されることを示した。例えば、ミオゲニン
及びmrf4は、通常の実験酸素(21％)条件下で24時間培養した場合にサテライト内
に検出されない。 しかしながら、1％酸素で培養したサテライトはmrf4を発現し、ちょうど培養2
4時間後にはミオゲニンを発現する。更に、1％酸素条件下で培養したサテライト
は、通常培養条件と比べたときにより多くの割合が24時間でMyoDを発現する。こ
れは、低酸素培養条件の結果として遺伝子経路の分化のタイミングの変化の一例
である。 分化した骨格筋は、特有の外観を有する。筋管は、協調して整列した多核と融
合した大きな細胞である。筋線維は、特有のパターン形成横紋を有する。これら
の特徴は、培養内サテライトから新たに再生した筋の外観を定義するために用い
られる。更に、ミオシン重鎖のような特定のタンパク質は、分化融合筋管によっ
て発現し、抗体染色を用いて検出される。
【０１５５】 本発明の方法は、遅い、および、速い収縮筋線維の双方をつくるために使用す
ることができる(Cornelison & Wold, 1997)。他の実施態様においては、筋線維
タイプに関係なく、本発明の方法によってつくられた筋が臨床移植のための筋サ
テライト及び/又は線維をつくるために用いられる。理論上、サテライト及び/又
はその子孫は、筋ジストロフィー、又は外傷、神経損傷、又は非活動による萎縮
のような筋疾患を治療するために移植され得る。筋ジストロフィーの場合、サテ
ライト及び子孫は、正常な筋の強度に必要な遺伝子産物(例えば、ジストロフィ
ン)を欠損している。他の場合は、欠損する正常な筋質量は移植したサテライト
又は子孫から再生される。低酸素下で活性化したサテライト細胞は、更に分化さ
せずに患者へ移植することができる。このプロトコールは、筋質量を欠いている
ために活性化する機能サテライトを欠く患者に特に使用することができる。この
プロトコールは、また、供与細胞が修正遺伝子産物を発現するならば、正常な筋
を再生しない(筋ジストロフィー)サテライトをもつ患者に使用することもできる
。
【０１５６】 哺乳動物筋細胞の集団を得る 単一筋線維培養物をつくるために、生後100〜200日の雌のB6D2F1マウスを安楽
死させる(CO2で)。後脚の皮をはぎ、ヒップで切断し、足を取り除く。脚を、室
温でフェノールレッド又はピルビン酸ナトリウムを含まない、高グルコース、L-
グルタミン、25mM Hepes緩衝液をピロドキシン塩酸塩と共に含むDMEM(これはギ
ブコBRL製の市販の標品である、カタログNo.21063-029)に入れる。脚の筋を解剖
用顕微鏡を用いて個々に解剖し、小片に裂いてから、上記DMEM製剤中の400 U/ml
コラゲナーゼI型(Worthington Biochemical)へ34℃で45分間入れる。消化後、筋
を10cmプラスチック皿に入れ、個々の生きた線維をタンパク質被覆パスツールピ
ペット(手磨きした先端をもつ)を用いて取り出し、予め5％CO2を含む15〜30分間
34℃インキュベータで加温しておいた培養液（フェノールレッド＋5％ニワトリ
胚エキス＋10％ウマ血清＋抗生物質/抗真菌剤＋L-グルタミン＋25mM Hepesを含
むDMEM）へ入れる。手順を微細な磨いた先端をもつパスツールピペットで繰り返
し、取り出した線維を同じHepes緩衝化DMEM培養液へ入れる。3回目に取り上げた
線維を、フェノールレッド＋5％ニワトリ胚エキス＋10％ウマ血清＋抗生物質/抗
真菌剤＋L-グルタミンを含むがHepesが添加されていないDMEM(増殖培地)へ入れ
る。次に、線維を上記の従来のインキュベータか又は適切なガス混合物を流した
低酸素チャンバ(Billups-Rothenberg、カリフォルニア州サンディエゴ)に入れ、
次にインキュベータに入れる、。供給中を除いて低酸素培養をチャンバ内で維持
し、供給時間はできるだけ短くする。チャンバに毎日流す。 上記プロトコールは、以前に記載されたものと異なっている(Cornelison & Wo
ld, 1997)。重要なことは、(1)線維はPBSではなく緩衝化培養液中で切開される
、(2)コラゲナーゼ消化が行われる温度が下げられている、(3)線維がインキュベ
ータの外にある間はHepes緩衝化培養液が用いられ、CO2で緩衝化され得ない、こ
とである。
【０１５７】 集団の筋前駆細胞を濃縮する 培養のために単一骨格筋線維を単離した後、1匹のマウスからの線維の半分を
線維増殖培地を含む10cmのプラスチック組織培養プレートに入れ、1％酸素、5％
二酸化炭素及び94％窒素を流した密閉チャンバへ入れる。滅菌水と共に開放ペト
リ皿を含むチャンバを37℃に維持したインキュベータへ入れる。線維の残りの半
分(比較のため)を、室内の空気中5％に維持した二酸化炭素を含む同じインキュ
ベータに入れる。12時間後、線維を解剖顕微鏡下に予め加温した新しい増殖培地
に入れてから、直ちに前の培養条件に戻す。線維のアリコートを分析のために周
期的に取出す。必要な細胞操作中を除いて1％酸素を低酸素培養内に常に維持す
る。
【０１５８】 筋前駆細胞を分化させる 上記の培養内で4〜7日後、線維をDMEM＋2％ウマ血清＋ペニシリン/ストレプト
マイシン/抗真菌剤＋L-グルタミンの予熱した培養液に入れてから、低酸素チャ
ンバに戻す(又は対照細胞は標準培養条件に)。培養液を1週間に一度取り替える
。7日後、筋管の分化が生きた又は死滅した遊走筋線維に共に生じ、組織培養プ
レートの底に付着する。両方の場所から、メッセジャーRNA発現パターンの分析
のためにパッチクランプ装置を用いて単独につまみ得るし、特定のタンパク質産
物も染色され得る。
【０１５９】 実施例10 皮膚細胞の低酸素培養 他の実施態様においては、本発明の低酸素培養法をケラチン細胞(皮膚の前駆
細胞)の培養に用いることができる。ケラチン細胞を単離、培養、及び分化する
方法は、当業者に周知である(Jonesら, 1995; Di Cuntoら, 1998)。ケラチン19
はケラチン細胞の最良に利用できる全体マーカーであると広く考えられており(M
ichelら, 1996)、好適実施態様においては、信頼できる抗体が利用できないため
に形態学的基準によって区別される。胎児及び出産後双方のケラチン細胞の単離
のときから、これらの細胞の単離、増殖、及び分化を促進させるために、低酸素
/生理的酸素条件を使用し得る。 本発明の方法によってつくられた皮膚細胞は、臨床移植のために皮膚前駆細胞
又は組織をつくるために用いられる。移植は、創傷治癒の遅れ、熱火傷又は化学
火傷、又は重いアレルギー反応、又は悪性皮膚の大量切除後のような皮膚損傷を
治療するために用いることができる。
【０１６０】 実施例11 胚幹細胞の低酸素培養 胚幹細胞は、実験用遺伝子ノックアウトマウスの作成に広く用いられている。
胚幹細胞のヒト組織からの単離も報告されている(Thomson, 1998)。しかしなが
ら、本明細書に開示されているように、酸素濃度は、発生の最初の細胞の増殖及
び分化に著しい影響がある。従って、胚幹細胞の培養条件における周囲酸素環境
の変動は、治療目的の系統から特定の組織への発生に重要なパラメーターであろ
う。酸素濃度を変化させるとともに生理的/大気圧未満の酸素培養条件の影響を
分析する方法が本明細書に開示されている。
【０１６１】 実施例12 多分化能性幹細胞の操作 特定の幹細胞又は前駆細胞が多くの発生的に異なる細胞、組織、又は器官タイ
プへ分化できる場合に、その細胞は多分化能性と言われる。試験管内低酸素条件
下で多分化能性細胞をインキュベートすることにより、本発明者らは、細胞集団
の分化の方向を操作又は曲げる(skew)ことができた。 本方法の結果は、本質的に1種以上の細胞タイプの濃縮であるが、他の細胞タ
イプに対する選択を考慮することもできる。本実施例においては、低酸素条件下
での細胞の増殖によって筋細胞が濃縮され、同時に、脂肪細胞が対抗的に選抜さ
れた。本発明者らは、酸素濃度を操作して、他の多分化能性幹細胞又は前駆細胞
の分化を指令することができると考える。 特に、マウス細胞株10T1/2細胞は、薬理的に(5-アザシチジン)誘導して、軟骨
、骨格筋及び脂肪(脂肪細胞)を発生させることができる(Taylor & Jones, 1979)
。これらの細胞を2％酸素に曝露するという以前の研究によって、発生する骨格
筋細胞の数が低酸素条件で増加することが示された(Storch TG, 1996)。本発明
者らは、10T1/2細胞を5-アザシチジン処理と共に21％酸素条件下で培養すると、
2週間以内に骨格筋及び脂肪細胞ヘの分化が生じることがわかった。特に、この
細胞株の脂肪細胞の分化は、アザシチジンの存在(又は不在)のときの1％酸素条
件下で阻止される。これは、多分化能性細胞によって取られた正確な分化的運命
における役割を演じる生理的/大気より低い酸素条件の一例である。酸素条件の
変化によってアップレギュレート又はダウンレギュレートされる遺伝子ネットワ
ークを同定すると、特定の分化経路、この場合は脂肪発生経路、を促進又は阻止
するための薬理的標的となる。
【０１６２】 本明細書に開示され特許を請求した組成物及び/又は方法のすべてが、本開示
によって過度の実験をすることなく実施し得る。本発明の組成物及び方法は好適
実施態様によって記載してきたが、本発明の概念、真意及び範囲から逸脱するこ
となく本明細書に記載された組成物及び/又は方法及び方法の工程又は工程の順
序に変更を加えることができることは当業者に明らかである。更に詳しくは、本
明細書に記載された薬剤を化学的及び生理的双方に関係するある種薬剤に置き換
えることができ、同じ又は似た結果が得られることは明らかである。当業者に明
らかな類似した代用及び変更はすべて、前述の特許請求の範囲によって定義され
た本明細書の真意、範囲及び概念の範囲内と考えられる。
【０１６３】 参考文献 以下の参考文献は本明細書に述べた方例示的または他の詳細な記載の補足的記
載を提供するものであり、引用により本明細書に取り込まれるものとする。 Anderson, Molecular control of cell fate in the neural crest: the sympa
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【配列表】
【図面の簡単な説明】
以下の図面は本明細書の部分を構成し、本発明の特徴をさらに明らかにするた
めに含まれる。本発明は、本明細書に提示された個々の実施態様の詳細な説明と
ともにこれら図面の１つまたは２つ以上を参照してよりいっそう理解されるであ
ろう。
【図１】 図１は、種々のプレート培養密度でのin vitro前駆細胞収量に対
する低酸素の効果を示す。線条体培養を低酸素および周囲酸素中でbFGFでエクス
パンジョンし、増殖５日後に９５％を越える細胞がネスチン＋前駆細胞であると
き総細胞数を判定した。周囲酸素と比較して、顕著な細胞数の増加が低酸素で全
ての密度で検出された。
【図２】 図２は、低酸素培養はCNS前駆細胞の増殖増加をもたらすことを
示す。図２Ａ：中脳前駆細胞を固定直前に60分間10μMのBrdUでパルス処理し、
続いてBrdU取り込みについて染色した。より多くのBrdU+細胞が増殖時および分
化時の両方で低酸素培養で観察された。縮尺棒＝２０μｍ。図２Ｂ：低酸素では
中脳前駆細胞は、２０％O2で維持した培養よりもBrdU+細胞の百分率の増加およ
びBrdU+細胞の絶対数の増加を生じる。データは平均値±ＳＥＭとして示され、
ｎ＝４０である。低酸素と２０％酸素との間の相違は全ての時点および全てのパ
ラメーター（エクスパンジョン４日目のBrdU+細胞の割合を除く；n=8、p=0.10)で
統計的に有意であった。
【図３】 図３は、低酸素で培養したCNS前駆細胞は（２０％酸素に対して
）アポトーシスの割合が減少することを示す。図３Ａ：低酸素または２０％酸素
で平行して培養した中脳前駆細胞をＴＵＮＥＬ標識してアポトーシスをアッセイ
した。エクスパンジョン相（培養２日および６日）および分化相（bFGF除去後４
日）の代表的な数値を示す。縮尺棒＝２０μｍ。３Ｂ：低酸素で成育させた前駆
細胞は、従来の培養と比較して顕著なアポトーシス細胞の百分率の低下を示した
(n=8、p<0.05)。
【図４】 低酸素および２０％酸素培養でのCNS幹細胞の基本的分化パター
ンを示す。図４Ａ：前駆細胞由来ニューロン（ＴＵＪ１染色による）、星状神経
膠細胞（ＧＦＡＰ）および稀突起神経膠細胞（Ｇａｌ−Ｃ）の相対百分率につい
て、低酸素または２０％酸素中での線条体培養を５日間のｂＦＧＦ増殖とそれに
続く４日間の細胞分化後に調べた（定量については本文を参照されたい）。図４
Ｂ：低酸素および２０％酸素培養でのCNS幹細胞の基本的分化パターンを示す。
低酸素または２０％酸素で継代中脳前駆細胞を６日間増殖させ、さらに５日間分
化させて、稀突起神経膠細胞の前駆細胞のマーカーであるＯ４について分析した
。Ｏ４＋細胞は低酸素培養でのみ検出できた。図４Ｃ： 低酸素および２０％酸
素培養でのCNS幹細胞の基本的分化パターンを示す。ネスチン＋クローンは、継
代中脳前駆細胞の単一細胞から２０日間のｂＦＧＦ増殖の後で得られた（左図）
。低酸素中のクローンは、ｂＦＧＦ除去に際してＴＵＪ１＋ニューロンに分化し
た（右図）。図４Ｄ： 低酸素および２０％酸素培養でのCNS幹細胞の基本的分
化パターンを示す。低酸素はクローン形成を効率的に促進する。単一前駆細胞に
由来するクローンの収量は、２０％酸素培養と比較して低酸素培養で３倍高かっ
た（左図）。低酸素培養の前駆細胞に由来するクローンの大半は５０−５００細
胞を含み、一方、２０％酸素培養のクローンサイズは一般に５−５０細胞であっ
た（右図）。縮尺棒＝２０μｍ（全図）。
【図５】 図５は低酸素培養は機能的前駆細胞由来ドーパミン作動性ニュー
ロンの収量を改善することを示す。図５Ａおよび図５Ｂ：Ｅ１２中脳からの前駆
細胞をｂＦＧＦで５日間増殖させ、続いて５日間分化させた。その後ニューロン
マーカーＴＵＪ１についてさらにTHについて染色した。TH＋ニューロン総数（お
よび％）の顕著な増加が、２０％酸素培養と比較して低酸素培養で認められた(p
<0.001)。縮尺棒＝２０μｍ。図５Ｃ：ウェスタンブロット分析によるTHタンパ
ク質レベルの定量で、低酸素培養から得たサンプルでは２０％酸素培養に比して
THが顕著に多いことが分かった。各レーンに総タンパク質2.5mμgをロードした
。図５Ｄ：電気化学的検出を装備したｒｐ−ＨＰＬＣを用いて、条件付け培養液
（２４時間）、１５分条件付け処理後ＨＢＳＳ（基準放出）、および１５分処理
後にHBSS+56mMKCl（誘起放出）でのドーパミンレベルを定量した。低酸素で維持
した培養では、これら全ての条件で２０％酸素で成育させた場合と比較して顕著
に多いドーパミンが検出された（条件付け培養液p<0.01;基準および喚起放出p<0
.05）。挿入図は、低酸素および２０％酸素培養でのドーパミン検出について典
型的なクロマトグラフィー図を示している。
【図６】 図６は、低酸素培養と２０％酸素培養における中脳前駆細胞から
のニューロンサブタイプ分化を示す。二重免疫細胞化学標識によって、低酸素培
養はドーパミン作動性およびセロトニン作動性ニューロン（Ｔｕｊ１＋）サブタ
イプの出現を顕著に増加させるが、GABA＋およびグルタミン酸＋ニューロンの出
現を減少させることが明らかにされた。２０％酸素培養でGABA染色で表示された
コロニーは、これらの状態での非常に高いGABA発現の通常でない例である。THお
よびGABAは、いくつかの発生中ニューロンでin vivoで認められるように同時に
発現されることはなかった。フロアプレート細胞（floor plate cell）（ＦＰ４
＋）は、中脳転写因子Ｅｎ１を発現しているニューロンの百分率と同様に低酸素
培養でより多かった。２０％酸素状態（下方右図）と比較して、前駆細胞マーカ
ーネスチンおよびPSA-NCAMは両方とも低酸素培養で分化後に減少した。縮尺棒＝
２０μｍ。
【図７】 図７は、低酸素および２０％酸素培養での中脳前駆細胞における
示差的遺伝子発現のRT-PCRによる評価を示す。図７Ａ：酸素レベル変化に対する
生理的反応に必要な遺伝子の発現を示す。ＨＩＦ１α、ＶＨＬ、EPOおよびＶＥ
ＧＦの発現を、低酸素および２０％酸素で２または６日間のエクスパンジョン後
および分化後（分化第４日＝培養第１０日）に判定した。データはＧＡＰＤＨ発
現に対して標準化した。２０％酸素に比して、顕著なEPO発現の増加がほとんど
の細胞分化時に低酸素培養で検出され、一方、ＶＥＧＦ発現はエクスパンジョン
および分化の両方でアップレギュレートされた。驚くべきことには、ＨＩＦ１α
またはＶＨＬの主要な酸素依存調節は認められなかった。図７Ｂ：中脳発生に必
要な候補遺伝子もまた酸素依存性分化発現について調べられた。細胞分化中のTH
およびPtx-3の発現増加によって、低酸素培養における多数の機能的ドーパミン
作動性ニューロンの存在が確認された（図５と比較されたい）。ＦＧＦ８および
Ｅｎ１の発現レベルにおける酸素仲介変化の顕著な低下もまた検出された。
【図８】 図８は、EPOはドーパミン作動性分化に対する低酸素の効果と類
似することを示す。飽和濃度のEPOまたはEPO中和抗体を、低酸素または２０％酸
素で増殖相および分化相の両方のＥ１２中脳前駆細胞培養に（それぞれ５日間）
加えた。EPOの補充は、２０％酸素培養でTH＋細胞の数を顕著に増加させた(n=6、
p<0.05)。EPO中和抗体は、低酸素(n=6、p<0.01)および20%酸素培養(n=6、p<0.05)の
両方でTH+細胞数を減少させた。縮尺棒=20μm。
【図９】 図９は、低酸素での細胞は交感神経副腎系列分化を促進すること
を示す。坐骨神経p75+P0 -細胞（Morrison et al., 1999）を低酸素または周囲酸
素で培養した。培養は、標準状態または５μMのフォルスコリンおよび1ng/mLのB
MP2（標準培養の６日後に添加）とともに総数１２日間成育させた。培養物を固
定し、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）（ドーパミン産生のための速度限定酵素
）、ドーパミンβヒドロキシラーゼ（ＤＢＨ）および交感神経副腎系列マーカー
SA−１に対する抗体で染色した。棒線は、表示したマーカーを発現している細胞
を含む幹細胞コロニーの百分率を示している。エラーバーは標準誤差を示す。交
感神経マーカーは、低酸素並びにフォルスコリンおよびＢＭＰ２の存在下で顕著
に高い頻度で発現した(p<0.05)。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ，ＵＳ (72)発明者 ドイル ジョン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 91030 サウス パサディナ マウンテン ヴュー アヴェニュー 1308 (72)発明者 ウォルド バーバラ ジェイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 91108 サン マリノ アードモア ロー ド 2780 (72)発明者 モリソン シーン ジェイ アメリカ合衆国 ミシガン州 48105 ア ン アーバー バートン ファーム ドラ イヴ 3513 (72)発明者 アンダーソン デイヴィッド アメリカ合衆国 カリフォルニア州 91001 オルタデナ グレンヴュー テラ ス 2108 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA01 CA01 DA02 EA04 GA11 HA12 HA17 4B063 QA01 QA18 QQ02 QQ20 QQ94 QR69 QR77 QR80 QS24 QS28 4B065 AA91X AB01 AC14 AC20 BA01 BC06 BC07 BC14 CA24 CA44 CA46

Claims (36)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少なくとも1種の神経冠幹細胞(NCSC)を培養して前記NCSCの
    生存、増殖又は分化を促進させる方法であって、前記NCSCを低酸素環境条件で培
    養する段階を含み、前記生存、増殖又は分化が環境酸素条件で培養した対照NCSC
    と比較して促進されている、前記方法。
  2. 【請求項２】 生存を促進させる、請求項1記載の方法。
  3. 【請求項３】 増殖を促進させる、請求項1記載の方法。
  4. 【請求項４】 分化を促進させる、請求項1記載の方法。
  5. 【請求項５】 生存、増殖及び分化を促進させる、請求項1記載の方法。
  6. 【請求項６】 分化がニューロンへの分化である、請求項1記載の方法。
  7. 【請求項７】 分化が交感神経副腎系細胞への分化である、請求項1記載の
    方法。
  8. 【請求項８】 コリン作動性系細胞への分化である、請求項1記載の方法。
  9. 【請求項９】 分化が感覚ニューロンへの分化である、請求項1記載の方法
    。
  10. 【請求項１０】 分化がドーパミンを生産する表現型への分化である、請求
    項1記載の方法。
  11. 【請求項１１】 分化がノルエピネフィリンを生産する表現型への分化であ
    る、請求項1記載の方法。
  12. 【請求項１２】 分化がドーパミンとノルエピネフィリンを生産する表現型
    への分化である、請求項1記載の方法。
  13. 【請求項１３】 分化が副腎クロム親和性細胞への分化である、請求項1記
    載の方法。
  14. 【請求項１４】 分化が強く蛍光を発する小細胞への分化である、請求項1
    記載の方法。
  15. 【請求項１５】 分化が交感神経ニューロンへの分化である、請求項1記載
    の方法。
  16. 【請求項１６】 神経冠細胞が分離した単細胞である、請求項1記載の方法
    。
  17. 【請求項１７】 前記分化が神経伝達物質を生産する表現型への分化であり
    、前記神経伝達物質の欠損が神経変性疾患と関連がある、請求項1記載の方法。
  18. 【請求項１８】 神経伝達物質の欠損と関連がある神経変性疾患に対して用
    いられる細胞の調製方法であって、少なくとも1つの神経冠細胞を低酸素環境条
    件で培養して前記神経堤細胞の分化を促進させ、神経変性疾患と関連がある神経
    伝達物質を生産する細胞を形成させる段階を含む、前記方法。
  19. 【請求項１９】 前記神経変性疾患がパーキンソン病である、請求項18記載
    の方法。
  20. 【請求項２０】 前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項19記
    載の方法。
  21. 【請求項２１】 少なくとも1種の未分化細胞を培養してドーパミンとノル
    エピネフィリンを生産する細胞を形成する方法であって、前記細胞を低酸素環境
    条件で培養してドーパミンとノルエピネフィリンを生産する細胞を形成する段階
    を含む、前記方法。
  22. 【請求項２２】 幹細胞又は前駆細胞を培養する方法であって、 a) 少なくとも1種の幹細胞又は前駆細胞を含む固体組織を形成できる哺乳動物細
    胞の集団を得る段階; b) 哺乳動物細胞の前記集団を適切な培養液中で、前記幹細胞又は前駆細胞又は
    細胞タイプの生存を維持又は増強するように選択した酸素レベルで培養する段階
    ; 及び c) 幹細胞又は前駆細胞の前記集団を、前記幹細胞又は前駆細胞の生存を維持又
    は促進させるのに充分な時間培養する段階 を含む、前記方法。
  23. 【請求項２３】 幹細胞又は前駆細胞を培養する方法であって、 a) 少なくとも1種の幹細胞又は前駆細胞を含む固体組織を形成できる哺乳動物細
    胞の集団を得る段階; b) 哺乳動物細胞の前記集団を適切な培養液中で、前記幹細胞又は前駆細胞の増
    殖を維持又は増強するように選択した酸素レベルで培養する段階; c) 幹細胞又は前駆細胞の前記集団を、前記幹細胞又は前駆細胞の増殖を維持又
    は促進させるのに充分な時間培養する段階 を含む、前記方法。
  24. 【請求項２４】 少なくとも1種の幹細胞又は前駆細胞及び1種以上の他の細
    胞タイプを含む固体細胞を形成できる哺乳動物細胞の集団において1種以上の他
    の細胞タイプに相対して幹細胞又は前駆細胞を濃縮する方法であって、 a) 少なくとも1種の幹細胞又は前駆細胞及び1種以上の他の細胞タイプを含む哺
    乳動物細胞の集団を得る段階; 及び b) 哺乳動物細胞の前記集団を適切な培養液中、大気より低い酸素条件下で、前
    記集団内の1種以上の他の細胞タイプに相対して前記集団内の幹細胞又は前駆細
    胞を濃縮するのに十分な時間培養する段階 を含む、前記方法。
  25. 【請求項２５】 細胞の集団において幹細胞又は前駆細胞を同定する方法で
    あって、 a) 少なくとも1種の幹細胞又は前駆細胞及び他の細胞タイプを含む固体組織を形
    成できる哺乳動物細胞の該団を得る段階; b) 適切な培養液中で哺乳動物細胞の前記集団を大気より低い条件下で培養する
    段階; 及び c) 前記集団において幹細胞又は前駆細胞を同定する段階 を含む、前記方法。
  26. 【請求項２６】 固体組織を形成できる幹細胞又は前駆細胞、及び/又は、
    幹細胞又は前駆細胞の子孫細胞の分化を促進させる方法であって、適切な培養液
    中で幹細胞又は前駆細胞を大気より低い酸素条件下で、該幹細胞又は前駆細胞又
    はその子孫細胞が、発生経路においてより進行した又は分化した1種以上の細胞
    タイプへ発生進行する及び/又は分化するのを促進するのに充分な時間培養する
    段階を含む、前記方法。
  27. 【請求項２７】 所望の分化細胞又は固体組織由来の出発幹細胞又は前駆細
    胞より発生の進行した段階の細胞の生産を促進させる方法であって、 a) まず大気より低い酸素条件で培養して該幹細胞又は前駆細胞集団をエクスパ
    ンジョンさせる段階; 及び b) 次にエクスパンジョンした前記集団を大気より低い酸素条件下で培養して分
    化を促進させる段階 を含む、前記方法。
  28. 【請求項２８】 幹細胞又は前駆細胞の分化経路を操作する方法であって、 a) 適切な培養液中で幹細胞又は前駆細胞を、分化した子孫細胞を得るように選
    択した大気より低い酸素条件下で培養し、生産された少なくとも1種の分化した
    細胞タイプのパーセンテージが最終的に生産され得る少なくとも1種の分化した
    他の細胞タイプのパーセンテージに対して増大する段階、及び b) 場合により、適切な培養液中で前記分化した子孫細胞を大気より低い酸素条
    件下で培養し、段階a)の分化した子孫細胞が更に分化する段階 を含む、前記方法。
  29. 【請求項２９】 幹細胞又は前駆細胞が骨格筋、神経組織、骨、皮膚、肝臓
    、骨髄、平滑筋、又は胚幹細胞に由来する、請求項21〜28のいずれか1項に記載
    の方法。
  30. 【請求項３０】 幹細胞又は前駆細胞が骨格筋、皮膚又は神経組織に由来す
    る、請求項29記載の方法。
  31. 【請求項３１】 幹細胞又は前駆細胞を、プロモーターに操作可能に結合し
    たDNAを含む発現ベクターでトランスフェクトする段階を更に含む、請求項21〜2
    8のいずれか1項に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 幹細胞又は前駆細胞を、DNA又は他の合成又は天然核酸を
    含む発現ベクターでトランスフェクトする段階を更に含んでいる、請求項21〜28
    のいずれか1項に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 幹細胞又は前駆細胞の生存、増殖又は分化及び/又は再生
    に影響する化合物をスクリーニングする方法であって、 a) 固体組織を形成できる幹細胞又は前駆細胞の集団と化合物とを大気より低い
    条件下で接触させる段階、及び b) 種々の細胞集団について生存、増殖及び/又は分化をモニターする段階 を含む、前記方法。
  34. 【請求項３４】 適切な培養液中で分化した子孫細胞を大気より低い酸素条
    件下で培養し、段階a)の分化した子孫細胞が更に分化する段階を更に含んでいる
    、請求項26記載の方法。
  35. 【請求項３５】 培養が少なくとも12時間行われる、請求項26記載の方法。
  36. 【請求項３６】 該培養が0〜12％の酸素を含む雰囲気中で行われる、請求
    項26記載の方法。
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