ES2557157T3 - Marcador de célula precursora de neurona que produce la dopamina Lrp4/Corina - Google Patents

Marcador de célula precursora de neurona que produce la dopamina Lrp4/Corina Download PDF

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Abstract

Un método para seleccionar y/o detectar células progenitoras proliferativas dopaminérgicas en una muestra celular aislada, comprendiendo el método poner en contacto dicha muestra celular con una sonda polinucleotídica que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de (1) una secuencia nucleotídica complementaria a o que se hibrida en condiciones restrictivas a la secuencia nucleotídica de SEC ID NO:1 o SEC ID NO:2; (2) una secuencia nucleotídica complementaria a o que se hibrida en condiciones restrictivas a una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3 o SEC ID NO:4; (3) una secuencia nucleotídica complementaria a o que se hibrida en condiciones restrictivas a una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3 o SEC ID NO:4 que carece del dominio transmembránico; o (4) una primera secuencia nucleotídica que se hibrida en condiciones restrictivas a una segunda secuencia nucleotídica, segunda secuencia nucleotídica la cual se hibrida en condiciones restrictivas a la secuencia nucleotídica de SEC ID NO:1 o SEC ID NO:2.

Description

DESCRIPCIÓN
Marcador de célula precursora de neurona que produce la dopamina Lrp4/Corina.
Campo técnico
La presente invención se refiere a sondas polinucleotídicas y anticuerpos para detectar y seleccionar células progenitoras de neuronas dopaminérgicas, y a métodos para detectar y seleccionar células progenitoras de 5 neuronas dopaminérgicas mediante su uso, y a kits y métodos terapéuticos para tratar enfermedades neurodegenerativas, tales como enfermedad de Parkinson, usando células progenitoras de neuronas dopaminérgicas.
Técnica antecedente
El sistema de dopamina es un sistema extremadamente importante para la regulación motora esencial, regulación 10 de la secreción hormonal, regulación de la emoción, etc., en el cerebro de mamíferos. De este modo, las anormalidades en la transmisión neuronal dopaminérgica provocan diversos trastornos neuronales. Por ejemplo, la enfermedad de Parkinson es una enfermedad neurodegenerativa del sistema extrapiramidal que se produce debido a degeneración específica de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra del mesencéfalo (Harrison’s Principles of Internal Medicine, Vol. 2, 23ª edición, Isselbacher et al., ed., McGraw-Hill Inc., NY (1994), p. 2275-7). Como un 15 método terapéutico primario para la enfermedad de Parkinson, se lleva a cabo la administración oral de L-DOPA (3,4-dihidroxifenilalanina) para compensar la disminución en la cantidad de dopamina producida; sin embargo, se sabe que la duración del efecto es insatisfactoria.
Más recientemente, se intentó un método terapéutico para la enfermedad de Parkinson en el que las regiones ventrales del mesencéfalo de fetos abortados de 6 a 9 semanas de edad que contienen células progenitoras de 20 neuronas dopaminérgicas se transplantan para compensar la pérdida de neuronas dopaminérgicas (documento 1 de patente; y documentos 1 a 6 no de patente). Sin embargo, además del suministro celular y aspectos éticos (Rosenstain (1995) Exp. Neurol. 33: 106; Turner et al. (1993) Neurosurg. 33: 1031-7), este método está actualmente bajo crítica por otros diversos problemas, incluyendo el riesgo de infección y contaminación, rechazo inmunológico de transplantes (Lopez-Lozano et al. (1997) Transp. Proc. 29: 977-980; Widner y Brudin (1988) Brain Res. Rev. 13: 25 287-324), y tasas bajas de supervivencia debido a la dependencia primaria de tejidos fetales del metabolismo de lípidos en lugar de la glicolisis (Rosenstein (1995) Exp. Neurol. 33: 106).
A fin de resolver los aspectos éticos y la escasez de suministro, se han propuesto métodos que usan, por ejemplo, células porcinas de la corteza, de la estría, y del mesencéfalo (por ejemplo, véanse los documentos 2 a 4 de patente). En estos métodos, se requiere un procedimiento complejo que implica alterar los antígenos de la superficie 30 celular (antígenos del MHC clase I) a fin de suprimir el rechazo. Como método para eliminar el rechazo de transplante, se ha propuesto un método que implica la inmunosupresión local transplantando simultáneamente células de Sertoli (documentos 5 y 6 de patente; y documento 7 no de patente). Es posible obtener células de transplante procedentes de familiares que tienen MHCs coincidentes, médula ósea de otros individuos, bancos de médula ósea, o bancos de sangre de cordón umbilical. Sin embargo, si fuese posible usar las células del propio 35 paciente, el problema de las reacciones de rechazo se podría superar sin procedimientos laboriosos o sin ninguna dificultad.
Por lo tanto, como materiales de transplante, se considera que es prometedor el uso de neuronas dopaminérgicas diferenciadas in vitro de células no neuronales tales como células madre embrionarias (ES) y células intersticiales de la médula ósea, en lugar de células procedentes de fetos abortados. De hecho, se ha dado a conocer que se han 40 formado neuronas dopaminérgicas funcionales transplantando células ES a estría lesionada de un modelo de enfermedad de Parkinson de rata (documento 8 no de patente). Se cree que la importancia de la terapia regenerativa a partir de células ES o de células madre nerviosas del propio paciente aumentará en el futuro.
En el tratamiento de tejido nervioso dañado, es necesario reconstruir la función cerebral, y, a fin de formar una conexión adecuada con las células circundantes (formación de una red), es necesario transplantar células 45 inmaduras, células capaces de diferenciarse en neuronas in vivo. En el transplante de células progenitoras neuronales, además del problema mencionado anteriormente con respecto al suministro, también existe la posibilidad de que las células progenitoras se diferenciarán en grupos de células heterogéneas. Por ejemplo, en el tratamiento de una enfermedad de Parkinson, es necesario transplantar selectivamente las neuronas que contienen catecolamina productoras de dopamina. Los ejemplos de células de transplante que se han propuesto previamente 50 para uso en el tratamiento de enfermedad de Parkinson incluyen el estriado (documentos 3 y 9 no de patente), estirpes celulares inmortalizadas derivadas de neuronas fetales humanas (documentos 7 a 9 de patente), neuronas postmitóticas humanas derivadas de células NT2Z (documento 10 de patente), células neuronales primordiales (documento 11 de patente), células y células estrómicas de la médula ósea transfectadas con genes exógenos para producir catecolaminas tales como dopaminas (documentos 12 y 13 de patente), y células ES manipuladas mediante 55 ingeniería genética (documento 8 no de patente). Adicionalmente, se ha propuesto el uso de neuronas dopaminérgicas formadas poniendo en contacto células progenitoras nerviosas derivadas de tejido mesencefálico fetal con FGF-8 y Shh (documento 14 de patente), y de células que expresan tirosina hidroxilasa obtenidas tratando
células nerviosas NT2 con ácido retinoico (documento 15 de patente). Sin embargo, ninguna de estas contiene solamente neuronas dopaminérgicas o células que se diferencian en células dopaminérgicas.
Se ha propuesto un método para concentrar selectivamente y aislar neuronas dopaminérgicas a partir de poblaciones de células no diferenciadas. En este método, se introduce un gen informador que expresa una proteína fluorescente en cada célula de una población celular, bajo el control de un promotor/potenciador génico tal como la 5 tirosina hidroxilasa expresada en neuronas dopaminérgicas (aquí más abajo, también denominada “TH”), y entonces se aíslan las células que emiten fluorescencia. Las neuronas dopaminérgicas se visualizan en su estado viable, después se concentran, se aíslan, y se identifican (documento 16 de patente). Este método requiere la etapa complicada de introducir un gen exógeno, y además, la presencia de un gen informador plantea problemas de toxicidad e inmunogenicidad cuando se usa conjuntamente con terapia génica. 10
[Documento 1 de patente] Patente US nº 5690927
[Documento 2 de patente] Publicación de patente japonesa Kohyo nº (JP-A) H10-508487 (publicación japonesa en fase nacional sin examinar, correspondiente a una publicación internacional no japonesa)
[Documento 3 de patente] JP-A H10-508488
[Documento 4 de patente] JP-A H10-509034 15
[Documento 5 de patente] JP-AH11-509170
[Documento 6 de patente] JP-AH11-501818
[Documento 7 de patente] JP-A H8-509215
[Documento 8 de patente] JP-A H11-506930
[Documento 9 de patente] JP-A 2002-522070 20
[Documento 10 de patente] JP-A H9-5050554
[Documento 11 de patente] JP-A H 11-509729
[Documento 12 de patente] JP-A 2002-504503
[Documento 13 de patente] JP-A 2002-513545
[Documento 14 de patente] Patente US nº 6277820 25
[Documento de patente 15] Publicación internacional WO 00/06700
[Documento 16 de patente] Publicación de solicitud de patente japonesa Kokai nº (JP-A) 2002-51775 (solicitud de patente japonesa publicada, sin examinar)
[Documento 1 no de patente] Spencer et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327: 1541-8
[Documento 2 no de patente] Freed et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327: 1549-55 30
[Documento 3 no de patente] Widner et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327: 1556-63
[Documento 4 no de patente] Kordower et al. (1995) N. Engl. J. Med. 332: 1118-24
[Documento 5 no de patente] Defer et al. (1996) Brain 119: 41-50
[Documento 6 no de patente] Lopez-Lozano et al. (1997) Transp. Proc. 29: 977-80
[Documento 7 no de patente] Selawry y Cameron (1993) Cell Transplant 2: 123-9 35
[Documento 8 no de patente] Kim et al. (2002) Nature 418: 50-56
[Documento 9 no de patente] Lindvall et al. (1989) Arch. Neurol. 46: 615-31
Descripción de la invención
Problemas a resolver por la invención
Uno de los problemas importantes en la terapia de transplante de la enfermedad de Parkinson actualmente es que 40 tanto las células precursoras de neuronas dopaminérgicas diferenciadas in vitro como la región ventral del mesencéfalo de fetos abortados son mezclas de una miríada de tipos celulares. Cuando se considera la seguridad
en la formación del circuito neuronal, es preferible usar células aisladas que comprendan solamente el tipo celular de interés. Además, cuando se considera el riesgo de tumorigénesis, se cree que es mejor usar células postmitóticas aisladas. Además, cuando se considera la supervivencia de células en su sitio de transplante en el cerebro, y su capacidad para formar apropiadamente una red, se espera que los efectos terapéuticos se puedan mejorar adicionalmente aislando células progenitoras de neuronas dopaminérgicas en una etapa tan temprana como sea 5 posible.
Medio para resolver los problemas
A fin de aislar genes específicos para las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas, se identificó un gen expresado específicamente en la región más ventral del mesencéfalo murino E12.5 que contiene neuronas dopaminérgicas, usando una modificación (“Method for Homogenizing the Amounts of DNA Fragments and 10 Subtraction Method”, documento WO 2002/103007 (Panfleto de Publicación Internacional)) del método de sustracción (N-RDA: Representational Difference Analysis; RDA (Listsyn N.A. (1995) Trends Genet. 11: 303-7) dividiendo adicionalmente la región ventral en dos regiones en la dirección dorsoventral. Como resultado, los presentes inventores aislaron con éxito Lrp4/Corina. Lrp4 codificó una proteína transmembránica de tipo II (Fig. 1).
El ARNm de Lrp4 se expresa específicamente en una región de la línea media ventral en el mesencéfalo. Las áreas 15 en las que ARNm de Lrp4 se expresa coinciden con las áreas en las que están presentes células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas. Además, cuando la expresión de Lrp4 se compara con la de TH, que es un marcador para neuronas dopaminérgicas, sus señales están en posiciones dorsoventrales idénticas, pero no se solapan (Figs. 4 y 5). Esto indicó que ARNm de Lrp4 no es expresado en estas células progenitoras, que tienen detenida la división celular y han migrado a la capa exterior del tubo neural. Por lo tanto, usando ARNm de Lrp4 20 como índice, es posible detectar específicamente y seleccionar células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas.
La presente invención se refiere a las realizaciones como se definen en las reivindicaciones. De este modo, se refiere a los siguientes apartados:
1. Un método para seleccionar y/o detectar células progenitoras proliferativas dopaminérgicas en una 25 muestra celular aislada, comprendiendo el método poner en contacto dicha muestra celular con una sonda polinucleotídica que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de
(1) una secuencia nucleotídica complementaria a o que se hibrida en condiciones restrictivas a la secuencia nucleotídica de SEC ID NO:1 o SEC ID NO:2;
(2) una secuencia nucleotídica complementaria a o que se hibrida en condiciones restrictivas a una 30 secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3 o SEC ID NO:4;
(3) una secuencia nucleotídica complementaria a o que se hibrida en condiciones restrictivas a una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3 o SEC ID NO:4 que carece del dominio transmembránico; o
(4) una primera secuencia nucleotídica que se hibrida en condiciones restrictivas a una segunda 35 secuencia nucleotídica, segunda secuencia nucleotídica la cual se hibrida en condiciones restrictivas a la secuencia nucleotídica de SEC ID NO:1 o SEC ID NO:2.
2. Un método para seleccionar y/o detectar células progenitoras de neuronas dopaminérgicas en una muestra celular aislada, comprendiendo el método poner en contacto dicha muestra celular con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a una secuencia de aminoácidos seleccionada de 40
(1) la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3 o SEC ID NO:4;
(2) una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3 o SEC ID NO:4 que carece del dominio transmembránico;
(3) la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3 o SEC ID NO:4 mutada mediante una o más supresiones, sustituciones o adiciones de aminoácidos, o combinaciones de las mismas, secuencia de 45 aminoácidos la cual está unida específicamente mediante el anticuerpo producido por el hibridoma FERM BP-10315 o FERM BP-10316; o
(4) una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones restrictivas a una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO:2. 50
3. El método del apartado 2, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es el anticuerpo producido por el hibridoma FERM BP-10315 o FERM BP-10316, o un fragmento del mismo.
4. Un método para producir u obtener una célula de la estirpe de neurona dopaminérgica, comprendiendo
dicho método
(1) cultivar las células progenitoras proliferativas dopaminérgicas seleccionadas según el apartado 1 o las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas seleccionadas del apartado 2 o 3; y
(2) identificar las células cultivadas usando un marcador para células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas o neuronas dopaminérgicas. 5
5. El método del apartado 4, en el que dicha célula de la estirpe de neurona dopaminérgica es una célula progenitora proliferativa dopaminérgica, y en el que dicho método comprende además eliminar las células identificadas en la etapa (2) como positivas para un marcador de células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas o neuronas dopaminérgicas.
6. El método del apartado 4, en el que dicha célula de la estirpe de neurona dopaminérgica es una célula 10 precursora de neurona dopaminérgica postmitótica, y en el que dicho método comprende además seleccionar las células identificadas en la etapa (2) como positivas para un marcador de células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas.
7. El método del apartado 4, en el que dicha célula de la estirpe de neurona dopaminérgica es una neurona dopaminérgica, y en el que dicho método comprende además seleccionar las células identificadas en la etapa 15 (2) como positivas para un marcador de neuronas dopaminérgicas.
8. Un método para producir una célula progenitora proliferativa dopaminérgica seleccionando dicha célula según el método del apartado 1.
9. Un anticuerpo anti-Lpr4 producido mediante el hibridoma FERM BP-10315 o FERM BP-10316.
10. El anticuerpo del apartado 9, para uso como una sonda para un marcador de célula progenitora 20 dopaminérgica.
11. Un método in vitro para aislar un gen específico de una célula progenitora de neurona dopaminérgica, o un gen expresado específicamente en una célula que se ha diferenciado, inducido o proliferado a partir de una célula progenitora de neurona dopaminérgica, comprendiendo dicho método detectar y aislar un gen expresado específicamente en un nivel diferente en una célula progenitora de neurona dopaminérgica 25 seleccionada según el método del apartado 1, con respecto a aquél en una célula que se ha diferenciado, inducido o proliferado a partir de aquél.
12. Un método in vitro para identificar un compuesto que regula la proliferación y/o diferenciación de una célula de la estirpe de neurona dopaminérgica, comprendiendo dicho método poner en contacto dicho compuesto con una célula progenitora de neurona dopaminérgica seleccionada según el método del apartado 30 1, y detectar un cambio en la proliferación o diferenciación de dicha célula que resulta de dicho contacto.
13. El método del apartado 1 o 5, en el que la célula progenitora proliferativa dopaminérgica se usa para producir un kit o medicamento para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa.
14. El método del apartado 13, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es enfermedad de Parkinson.
15. Uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a una secuencia de aminoácidos 35 seleccionada del grupo que consiste en (1) a (5) para discriminar una célula progenitora de neurona dopaminérgica:
(1) la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3 o SEC ID NO:4;
(2) una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3 o SEC ID NO:4 que carece del dominio transmembránico; 40
(3) la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3 o SEC ID NO:4 mutada mediante una o más supresiones, sustituciones o adiciones de aminoácidos, o combinaciones de las mismas, secuencia de aminoácidos la cual está unida específicamente mediante el anticuerpo producido por el hibridoma FERM BP-10315 o FERM BP-10316;
(4) una secuencia de aminoácidos codificada por un polipéptido que se hibrida en condiciones 45 restrictivas a una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO:2; o
(5) una secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos (1) a (4) específica de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 4.
16. El uso del apartado 15, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es el anticuerpo producido 50
por el hibridoma FERM BP-10315 o FERM BP-10316, o un fragmento del mismo.
17. El método de uno cualquiera de los apartados 1-7, en el que dicha muestra celular se obtiene diferenciando células ES no humanas en células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas o en células progenitoras de neuronas dopaminérgicas.
18. El método del apartado 17, en el que el tratamiento de diferenciación se lleva a cabo mediante el método 5 SDIA.
19. El método de uno cualquiera de los apartados 1-7, que comprende además la etapa de diferenciar células ES no humanas en células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas o en células progenitoras de neuronas dopaminérgicas para obtener una muestra celular que comprende las células progenitoras proliferativas dopaminérgicas o las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas. 10
20. El método del apartado 19, en el que el tratamiento de diferenciación se lleva a cabo mediante el método SDIA.
21. El método de uno cualquiera de los apartados 17-20, en el que al menos una célula progenitora proliferativa dopaminérgica seleccionada o producida según el método de uno cualquiera de los apartados 17-20 se usa para producir un kit o medicamento para tratar una enfermedad neurodegenerativa. 15
22. El método del apartado 21, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es enfermedad de Parkinson.
De este modo, la presente descripción proporciona sondas polinucleotídicas marcadoras de células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas capaces de detectar específicamente ARNm de Lrp4, y la invención proporciona métodos para seleccionar células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas utilizando estas sondas. 20
Además, la presente invención se refiere a células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas antes de la salida del ciclo celular, seleccionadas usando tales sondas nucleotídicas (aquí en lo sucesivo, algunas veces denominadas simplemente como “células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas”); así como a métodos para aislar genes específicos de células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas y genes específicos para cada etapa de maduración de célula progenitora para neurona dopaminérgica, utilizando las células 25 progenitoras proliferativas; y métodos de identificación de compuestos que inducen diferenciación o proliferación de las células progenitoras, usando como índice la maduración. También es posible cultivar las células progenitoras proliferativas seleccionadas usando las sondas nucleotídicas de la presente invención, y obtener células de estirpes de neuronas dopaminérgicas que comprenden las células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas. La expresión “células de la estirpe de neuronas dopaminérgicas”, usada aquí, se refiere a células progenitoras 30 proliferativas de neuronas dopaminérgicas, células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas, y/o neuronas dopaminérgicas. Las células de la estirpe de neuronas dopaminérgicas también se pueden utilizar para los métodos para aislar genes específicos de cada etapa de maduración de neurona dopaminérgica, y para los métodos de identificación de compuestos que inducen la diferenciación o proliferación de células progenitoras, usando como índice la maduración. Por lo tanto, la presente invención se refiere a métodos para obtener las células de la estirpe 35 de neuronas dopaminérgicas cultivando las células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas seleccionadas usando las sondas nucleotídicas de la presente invención; a células obtenidas de esta manera; a métodos para aislar genes específicos de cada etapa de maduración de neuronas dopaminérgicas que usan las células; y a métodos de identificación de compuestos que inducen la diferenciación o proliferación de las células usando como índice la maduración. 40
Además, los presentes inventores produjeron un anticuerpo anti-Lrp4, y examinaron la expresión de la proteína Lrp4. En primer lugar, mediante el análisis de su expresión en tejidos (Fig. 8), se confirmó que la proteína Lrp4 se expresaba de la misma manera que ARNm de Lrp4. En este experimento, las señales de la proteína Lrp4 también se detectaron en áreas que expresan TH. Sin embargo, puesto que las células progenitoras proliferativas extienden procesos hacia la capa exterior del tubo neural, no se pudo determinar que esta señal estuviese causada por la 45 detección de proteínas en los procesos o por las células que expresan TH, que también expresan la proteína Lrp4. A continuación, usando el anticuerpo anti-Lrp4, se analizó mediante citometría de flujo si la proteína Lrp4 se expresó sobre la superficie celular. Las células en las que se confirmó la expresión de ARNm de Lrp4 se obtuvieron induciendo la diferenciación de células ES en células progenitoras de neuronas dopaminérgicas in vitro (método de actividad inductora derivada de células estrómicas (SDIA)), y usándolas como muestras. Como resultado, se 50 confirmó que la proteína Lrp4 se expresó ciertamente en la superficie de las células (Fig. 9). Tales proteínas expresadas sobre la superficie celular son particularmente preferibles para uso como marcadores de separación, debido a que las células vivas se pueden seleccionar (véase la Fig. 15). Además, se indujo a las células ES a diferenciarse in vitro en las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas mediante el método de 5 etapas, y la expresión de Lrp4 se confirmó mediante RT-PCR y citometría de flujo usando el anticuerpo monoclonal anti-Lrp4. 55 Como resultado, se reveló que Lrp4 también está expresada en células progenitoras de neuronas dopaminérgicas diferenciadas mediante el método de 5 etapas (Figs. 17A y 17B).
A continuación, las células positivas para Lrp4 se separaron de células que se indujeron para que se diferenciaran
(método SDIA) y de células de mesencéfalo ventral fetal de ratón mediante un clasificador de células usando el anticuerpo anti-Lrp4. La expresión génica en las células separadas se analizó mediante el método de RT-PCR. Como resultado, se observó la expresión del marcador de células progenitoras proliferativas de neuronas Nestina. Además, también se reveló que estaban incluidas células que expresan MAP2, que es un marcador para neuronas postmitóticas (Fig. 10). TH y Nurr1, que es un marcador para células precursoras de neuronas dopaminérgicas 5 postmitóticas, se expresaron en mayores niveles en una población de células positivas para Lrp4 que en una población de células negativas para Lrp4. Por lo tanto, a diferencia del caso en el que se usa como índice ARNm de Lrp4, cuando las células se seleccionan usando anticuerpos usando la proteína Lrp4 como índice, es posible aislar las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas, incluyendo células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas. Aquí en lo sucesivo, la expresión “células progenitoras de neuronas dopaminérgicas” se refiere a 10 células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas y células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas. Para células separadas usando el anticuerpo anti-Lrp4 de aquellas células inducidas para que se diferencien de las células ES in vitro mediante el método SDIA, se realizó la expresión de ERas y Nanog expresadas específicamente en las células ES. Como resultado, no se observó expresión en células positivas para Lrp4, mientras que se observó expresión de ambos genes en células negativas para Lrp4 (Fig. 18). Por lo tanto, 15 seleccionando células usando el anticuerpo anti-Lrp4, es posible seleccionar y eliminar células ES no diferenciadas tras inducir la diferenciación. Además, las células positivas para Lrp4 se separaron de poblaciones celulares que incluyen células progenitoras de neuronas dopaminérgicas que son inducidas para que se diferencien in vitro de células ES mediante el método de 5 etapas. A continuación, las células separadas positivas para Lrp4 se cultivaron in vitro para inducir neuronas dopaminérgicas positivas para la proteína TH (Fig. 17C). Esto reveló que células 20 positivas para Lrp4 inducidas mediante el método de 5 etapas son células progenitoras de neuronas dopaminérgicas, y pueden madurar in vitro.
En consecuencia, la presente invención proporciona anticuerpos que detectan específicamente la proteína Lrp4, y métodos que utilizan los anticuerpos para seleccionar células progenitoras de neuronas dopaminérgicas. Además, la presente invención se refiere a células progenitoras de neuronas dopaminérgicas seleccionadas usando tales 25 anticuerpos; así como a métodos que usan las células progenitoras para aislar genes específicos de células progenitoras de neuronas dopaminérgicas y genes específicos para cada etapa de maduración de célula progenitora para neurona dopaminérgica; y a métodos de identificación de compuestos que inducen la diferenciación o proliferación de las células progenitoras usando como índice la maduración. También es posible obtener células de la estirpe de neuronas dopaminérgicas en otras etapas de diferenciación cultivando las células progenitoras 30 seleccionadas usando los anticuerpos de la presente invención. Tales células también se pueden utilizar en los métodos para aislar genes específicos de cada etapa de maduración de neurona dopaminérgica, y los métodos de identificación de compuestos que inducen la diferenciación o proliferación de la célula progenitora usando como índice la maduración. En consecuencia, la presente invención también se refiere a métodos para obtener células de la estirpe de neuronas dopaminérgicas cultivando células progenitoras de neuronas dopaminérgicas seleccionadas 35 usando los anticuerpos de la presente invención; a células obtenidas usando los métodos; a métodos que usan las células para aislar genes específicos de cada etapa de maduración de neuronas dopaminérgicas; y a métodos de identificación de compuestos que inducen la diferenciación o proliferación de las células usando como índice la maduración.
Además, los presentes inventores transplantaron células que expresan Lrp4, separadas usando el anticuerpo 40 monoclonal anti-Lrp4, en el estriado de ratones del modelo de la enfermedad de Parkinson. Como resultado, se observaron células positivas para EGFP en el estriado de ratones transplantados (Tabla 1). De este modo, parece que las células transplantadas positivas para la proteína Lrp4 se injertaron con éxito en el estriado de los ratones del modelo de enfermedad de Parkinson. La mayoría de las células injertadas con éxito fueron positivas para el marcador de neurona madura MAP2, y se observó que los axones positivos para EGFP se extienden en el estriado 45 (Tabla 1 y Fig. 16). La mayoría de las células injertadas con éxito se diferenciaron en células nerviosas y después maduraron, mientras que las células transplantadas positivas para la proteína Lrp4 fueron células progenitoras neuronales, y alrededor del 20% de las células injertadas con éxito fueron positivas para TH. Estos hallazgos sugieren fuertemente que al menos algunas de las células transplantadas positivas para la proteína Lrp4 se diferenciaron en neuronas dopaminérgicas. Por lo tanto, las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas, 50 separadas según la presente invención, se pueden diferenciar en neuronas dopaminérgicas al ser transplantadas en el cerebro, y pueden ser eficaces para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Esto es, la presente invención también se refiere a kits para tratar enfermedades neurodegenerativas, preferiblemente enfermedad de Parkinson, que comprenden las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas, separadas según la presente invención; y a métodos para tratar enfermedades neurodegenerativas, preferiblemente enfermedad de Parkinson, que comprenden 55 la etapa de transplantar células progenitoras de neuronas dopaminérgicas en los cerebros de pacientes.
Efectos de la invención
No ha habido informes previos de genes que codifican proteínas de membrana expresados específicamente en células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas. Se cree que los anticuerpos frente a la proteína Lrp4 expresada sobre la superficie de la membrana celular son extremadamente eficaces en el aislamiento de 60 células progenitoras de neuronas dopaminérgicas. Por ejemplo, las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas puras se pueden obtener aislando células que expresan Lrp4 de la región del mesencéfalo ventral o células cultivadas que contienen células progenitoras de neuronas dopaminérgicas diferenciadas in vitro, usando
anticuerpos anti-Lrp4 (Fig. 15). La expresión del Lrp4 se confirmó en ambas células progenitoras de neuronas dopaminérgicas inducidas mediante dos métodos de diferenciación diferentes (método SDIA y método de 5 etapas). En consecuencia, Lrp4 es útil como un marcador de células progenitoras de neuronas dopaminérgicas, independientemente de la fuente celular. Además, puesto que ERas y Nanog, que son expresadas específicamente en células ES, no se expresan en células positivas para Lrp4, es posible seleccionar células ES no diferenciadas 5 usando como índice la expresión de Lrp4.
Además, en la presente invención, las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas aisladas también se pueden transplantar directamente, o después de haberlas hecho crecer in vitro. Las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas de la presente invención también tienen el potencial de diferenciarse y madurar en la región óptima en el cerebro, así como el potencial de crecer adicionalmente in vivo, y se puede esperar que 10 demuestren efectos terapéuticos a largo plazo. Además, si las células que expresan Lrp4 son transplantadas después de haber sido diferenciadas y de haber madurado in vitro, se puede esperar que demuestren efectos terapéuticos, incluso si por alguna razón no se diferencian en neuronas dopaminérgicas in vivo. En consideración de los riesgos de tumorigénesis y etc., se puede esperar un grado incluso mayor de seguridad si se transplantan células que se han aislado usando un marcador de células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas tal como 15 65B13 (panfleto WO 2004/038018) después de diferenciar células que expresan Lrp4 que se hicieron crecer in vitro. El uso de células que expresan Lrp4 para terapia de transplante después de ser aisladas, independientemente del método, permite un grado elevado de seguridad, puesto que solamente se aísla el tipo celular de interés. Además, puesto que se pueden usar las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas más prematuras, se puede esperar una elevada eficacia terapéutica en términos de tasa de supervivencia, capacidad de formación de redes, etc. 20 Además, incluso si los mejores efectos terapéuticos no se pueden lograr mediante estas células progenitoras tempranas inmediatamente después del aislamiento, puesto que las células progenitoras aisladas usando marcadores de la presente invención pueden madurar in vitro mediante cultivo o similar, se pueden preparar materiales en la etapa óptima de diferenciación (Fig. 6).
Por otro lado, las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas puras también son útiles en la investigación de 25 dianas terapéuticas para la enfermedad de Parkinson, tal como para uso en el aislamiento de genes específicos para neuronas dopaminérgicas. En particular, las células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas son útiles para la investigación sobre el proceso de maduración de neuronas dopaminérgicas, sistemas de identificación usando como índice la maduración, la identificación de fármacos en la que las células progenitoras se hacen crecer in vitro o in vivo, la identificación de fármacos que inducen la diferenciación de células progenitoras in 30 vivo (fármacos de terapia regenerativa in vivo), y similares.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra esquemáticamente la estructura de Lrp4. TM: dominio transmembránico, FRI: dominio Frizzled, LDLa: dominio del receptor de LDL, SR: dominio del receptor de depurador, Proteasa: dominio de serina proteasa. 35
La Fig. 2 es un conjunto de fotografías que muestran los resultados del análisis de expresión de ARNm de Lrp4 y Shh en la región del mesencéfalo ventral de ratón E12.5 y la médula espinal mediante hibridación in situ.
La Fig. 3 es un conjunto de fotografías que muestran los resultados del análisis de expresión de ARNm de Lrp4, Shh, tirosina hidroxilasa (TH), y NCAM en la región del mesencéfalo ventral de ratón E12.5 mediante 40 hibridación in situ.
La Fig. 4 es un diagrama esquemático del patrón de expresión de Lrp4 en el mesencéfalo, y fotografías que indican la expresión de los ARNm de Lrp4, Shh, tirosina hidroxilasa (TH), Sim-1, y NCAM en el mesencéfalo ventral de ratones E12.5 analizada mediante hibridación in situ. VZ: zona ventricular; y ML: capa del manto.
La Fig. 5 es un conjunto de fotografías que muestra los resultados del análisis de expresión de ARNm de 45 Lrp4 en el sistema nervioso central de ratón E12.5 mediante hibridación in situ. A: sección transversal sagital, B: fotografía agrandada del área dentro de la caja en A, C: sección transversal en la localización de la línea roja en A, D: expresión de ARNm de Lrp4, Shh, y tirosina hidroxilasa (TH), en la región ventral del mesencéfalo de ratón E12.5.
La Fig. 6 muestra esquemáticamente el ritmo de expresión de los ARNm de Lrp4, NCAM, TH, y DAT desde la 50 generación hasta la maduración de neuronas dopaminérgicas.
La Fig. 7 (panel superior que consiste en un dibujo y una fotografía) muestra esquemáticamente la inducción de diferenciación de células ES en neuronas dopaminérgicas mediante el método SDIA. La fotografía inferior muestra los resultados de la investigación de la expresión de ARNm de Lrp4 en neuronas dopaminérgicas diferenciadas a partir de células ES a lo largo del tiempo, usando el método SDIA mediante RT-PCR. 55
La Fig. 8 es una fotografía que muestra la expresión de la proteína Lrp4 en el mesencéfalo de ratón E12.5.
La Fig. 9 muestra la expresión de la proteína Lrp4 en la superficie de células diferenciadas mediante SDIA, analizada mediante citometría de flujo usando el anticuerpo anti-Lrp4.
La Fig. 10 es un conjunto de fotografías que muestra la expresión de diversos marcadores de neuronas dopaminérgicas en células positivas para Lrp4 analizada mediante RT-PCR.
La Fig. 11 muestra esquemáticamente los períodos de expresión de ARNm de Lrp4 y de proteína, y ARNm 5 de TH desde el desarrollo hasta la maduración de neuronas dopaminérgicas. Esto muestra que tanto las células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas como las células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas están presentes en células que expresan Lrp4.
La Fig. 12 es un conjunto de fotografías que muestra los resultados de examinar las etapas de diferenciación de células positivas para Lrp4. 10
La Fig. 13 es un conjunto de fotografías que muestra la proliferación in vitro de células positivas para Lrp4.
La Fig. 14 es un conjunto de fotografías que muestra que las células positivas para Lrp4 se diferencian en neuronas dopaminérgicas.
La Fig. 15 muestra esquemáticamente la separación y aplicación de células progenitoras de neuronas dopaminérgicas usando anticuerpo anti-Lrp4. 15
La Fig. 16 es un conjunto de fotografías que muestra la diferenciación in vivo de células transplantadas positivas para Lrp4.
La Fig. 17 muestra un diagrama y fotografías que indican la expresión de Lrp4 en células diferenciadas mediante el método de 5 etapas, y la diferenciación de células positivas para Lrp4 en neuronas dopaminérgicas. Las flechas en el panel C indican neuronas dopaminérgicas positivas para la proteína TH. 20
La Fig. 18 es un conjunto de fotografías que muestra los resultados de usar RT-PCR para analizar la expresión de genes (ERas y Nanog) específicos de células ES en células positivas para Lrp4 y en células negativas para Lrp4.
Mejor modo para llevar a cabo la invención
Aquí más abajo se describirán las realizaciones de la presente invención, pero se ejemplifican para ilustrar la 25 presente invención y no limitar la presente invención a estas realizaciones. La presente invención se puede llevar a cabo en diversas formas sin separarse de su alcance.
<Sondas polinucleotídicas marcadoras>
Las sondas polinucleotídicas marcadoras de células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas de la presente invención se usan como marcadores y/o reactivos para seleccionar y/o detectar células progenitoras 30 proliferativas de neuronas dopaminérgicas. Los polinucleótidos usados para esta sonda comprenden una secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 1 o 2 detectada en células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas. SEC ID NO: 1 es la secuencia nucleotídica de ADNc de Lrp4 murina. SEC ID NO: 2 es la secuencia nucleotídica de ADNc de Lrp4 humana. Ambas secuencias están registradas en GenBank (murina: nº de acceso NM. 016869; humana: nº de acceso XM_035037). 35
Aquí, una “sonda polinucleotídica marcadora” se refiere a un polímero compuesto de un número de nucleótidos, tal como ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o ácidos ribonucleicos (ARN), o pares nucleotídicos, en los que el polímero debería de ser capaz de detectar la expresión de Lrp4, particularmente ARNm transcrito. También se sabe que los ADNc bicatenarios se pueden usar como sondas en la hibridación in situ de tejidos, y tales ADNc bicatenarios están incluidos en los marcadores de la presente invención. Las sondas de ARN (ribosondas) son particularmente 40 preferibles como sondas polinucleotídicas marcadoras para detectar los ARN en tejido. Si es necesario, las sondas polinucleotídicas marcadoras de la presente invención también pueden contener nucleótidos de origen no natural tales como 4-acetilcitidina, 5-(carboxihidroximetil)uridina, 2’-O-metilcitidina, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluridina, dihidrouridina, 2’-O-metilpseudouridina, β-D-galactosilqueuosina, 2’-O-metilguanosina, inosina, N6-isopenteniladenosina, 1-metiladenosina, 1-metilpseudouridina, 1-metilguanosina, 1-45 metilinosina, 2,2-dimetilguanosina, 2-metiladenosina, 2-metilguanosina, 3-metilcitidina, 5-metilcitidina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 5-metilaminometiluridina, 5-metoxiaminometil-2-tiouridina, -D-mannosilqueuosina, 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina, 5-metoxicarbonilmetiluridina, 5-metoxiuridina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, N-((9--D-ribofuranosil-2-metiltiopurin-6-il)carbamoil)treonina, N-((9--D-ribofuranosilpurin-6-il)N-metilcarbamoil)treonina, éster metílico del ácido uridin-5-oxiacético, ácido uridin-5-oxiacético, wibutoxosina, 50 pseudouridina, queuosina, 2-tiocitidina, 5-metil-2-tiouridina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, 5-metiluridina, N-((9--D-ribofuranosilpurin-6-il)carbamoil)treonina, 2’-O-metil-5-metiluridina, 2’-O-metiluridina, wibutosina, y 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina.
Además, las sondas polinucleotídicas marcadoras de la presente invención comprenden secuencias nucleotídicas complementarias a las secuencias nucleotídicas que codifican la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 o 4. La secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 o 4 incluye no solamente las secuencias nucleotídicas de SEC ID NO: 1 o 2, sino también secuencias nucleotídicas que difieren de las secuencias de SEC ID NO: 1 o 2 debido a la degeneración del código genético. Las sondas polinucleotídicas 5 marcadoras de la presente invención también incluyen aquellas que comprenden secuencias complementarias a secuencias nucleotídicas que codifican una secuencia que carece del dominio transmembránico en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 o 4. No hay ninguna secuencia señal en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 o 4. En Lrp4 murina (SEC ID NO: 3), los restos de aminoácidos 113-135 forman un dominio transmembránico, mientras que en Lrp4 humana (SEC ID NO: 4), los restos de aminoácidos 46-68 forman un dominio 10 transmembránico. Las secuencias descritas en SEC ID NOs: 3 y 4 están registradas respectivamente en GenBank (Lrp4 humana, XP_035037; Lrp4 murina, NP_058565).
Aquí, la frase “complementaria a una secuencia nucleotídica” engloba no solamente los casos en los que una secuencia nucleotídica se empareja completamente con el molde, sino también incluye aquellos que tienen al menos 70%, preferiblemente 80%, más preferiblemente 90%, e incluso más preferiblemente 95% o más (por ejemplo, 97% 15 o 99%) de los nucleótidos emparejados con el molde. El emparejamiento se refiere a la formación de una cadena en la que T (U en el caso de los ARN) corresponde a A, A corresponde a T o U, G corresponde a C, y C corresponde a G en la secuencia nucleotídica del polinucleótido molde. Las homologías al nivel de la secuencia nucleotídica entre ciertos polinucleótidos se pueden determinar mediante el algoritmo BLAST (Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7). El programa BLASTN para 20 secuencias nucleotídicas (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410) se ha desarrollado basado en este algoritmo, y se puede usar para determinar la homología de secuencias de sondas polinucleotídicas marcadoras (véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov para un ejemplo específico de métodos de análisis).
Además, las secuencias polinucleotídicas marcadoras de la presente invención incluyen polinucleótidos que contienen secuencias nucleotídicas que se hibridan en condiciones restrictivas con polinucleótidos comprendidos en 25 la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 1 o 2. Aunque los polinucleótidos con una secuencia nucleotídica indicada en SEC ID NO: 1 o 2 son conocidos con respecto a Lrp4, también pueden existir isoformas y variantes alélicas alternativas. Los polinucleótidos con una secuencia complementaria a tales isoformas y variantes alélicas también se pueden usar como polinucleótidos marcadores de la presente invención. Tales isoformas y variantes alélicas se pueden obtener a partir de genotecas de ADNc o genotecas genómicas derivadas de animales tales como seres 30 humanos, ratones, ratas, conejos, hámsters, pollos, cerdos, vacas, cabras, y ovejas, usando una secuencia polinucleotídica que comprende una secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2, en métodos de hibridación conocidos tales como hibridación en colonia, hibridación en placa, o transferencia Southern. Véase “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2ª ed.” (Cold Spring Harbor Press (1989)) para métodos de construcción de genotecas de ADNc. Además, también se pueden usar genotecas de ADNc o genotecas genómicas comercialmente 35 disponibles.
Más específicamente, al construir una genoteca de ADNc, primero se prepara ARN total procedente de células, órganos, tejidos, o similares, que expresan Lrp4, mediante técnicas conocidas tales como ultracentrifugación con guanina (Chirwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) o AGPC (Chomczynski y Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162: 156-159), seguido de la purificación del ARNm usando el kit de purificación de ARNm (Pharmacia), o similar. 40 También se puede usar un kit para la preparación directa de ARNm, tal como el kit de purificación de ARNm QuickPrep (Pharmacia). A continuación, los ADNc se sintetizan a partir de los ARNm resultantes usando transcriptasa inversa. También están comercialmente disponibles los kits de síntesis del ADNc, tales como el kit de síntesis de ADNc de primera hebra mediante transcriptasa inversa de AMV (Seikagaku Corporation). También se pueden usar otros métodos que usan el método 5’-RACE para sintetizar y amplificar ADNc mediante PCR (Frohman 45 et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002; Belyavsky et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 2919-32). Además, a fin de construir genotecas de ADNc que contienen un porcentaje elevado de clones de longitud completa, también se pueden emplear técnicas conocidas tales como el método de oligoencaperuzamiento (Maruyama y Sugano (1994) Gene 138: 171-4; Suzuki (1997) Gene 200: 149-56). El ADNc obtenido de esta manera se puede incorporar entonces en un vector adecuado. 50
Los ejemplos de condiciones de hibridación restrictivas adecuadas para uso en la presente invención incluyen “2x SSC, 0,1% de SDS, 50ºC”, “2x SSC, 0,1% de SDS, 42ºC” y “1x SSC, 0,1% de SDS, 37ºC”. Los ejemplos de condiciones de mayor restricción incluyen “2x SSC, 0,1% de SDS, 65ºC”, “0,5x SSC, 0,1% de SDS, 42ºC” y “0,2x SSC, 0,1% de SDS, 65ºC”. Más específicamente, se puede llevar a cabo un método que usa el tampón Rapid-hyb (Amersham Life Science) realizando la prehibridación a 68ºC durante 30 minutos o más, añadiendo una sonda para 55 permitir la formación del híbrido a 68ºC durante una hora o más, lavando tres veces en 2x SSC/0,1% de SDS a temperatura ambiente durante 20 minutos cada vez, lavando tres veces en 1x SSC/0,1% de SDS a 37ºC durante 20 minutos cada vez, y finalmente lavando dos veces en 1x SSC/0,1% de SDS a 50ºC durante 20 minutos cada vez. Esto también se puede llevar a cabo usando, por ejemplo, la disolución de hibridación Expresshyb (CLONTECH), realizando la prehibridación a 55ºC durante 30 minutos o más, añadiendo una sonda marcada e incubando a 37ºC 60 hasta 55ºC durante una hora o más, lavando tres veces en 2x SSC/0,1% de SDS a temperatura ambiente durante 20 minutos cada vez, y lavando una vez a 37ºC durante 20 minutos con 1x SSC/0,1% de SDS. Aquí, las condiciones de mayor restricción se pueden lograr incrementando la temperatura para la prehibridación, para la hibridación, o
para el segundo lavado. Por ejemplo, las temperaturas de la prehibridación y de la hibridación de 60ºC se pueden elevar hasta 68ºC para una mayor restricción. Además de los factores tales como la concentración de sal del tampón y la temperatura, los expertos normales en la técnica también pueden integrar otros factores, tales como la concentración de la sonda, la longitud de la sonda, y el tiempo de reacción, para obtener isoformas y variantes alélicas de Lrp4, y genes correspondientes derivados de otros organismos. 5
Se puede hacer referencia a referencias tales como Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2ª ed. (Cold Spring Harbor Press (1989); Sección 9.47-9.58), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons (1987-1997); Sección 6.3-6.4), DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2ª ed. (Oxford University (1995); Sección 2.10 para condiciones, en particular) para una información detallada sobre procedimientos de hibridación. Los ejemplos de polinucleótidos que se hibridan incluyen polinucleótidos que incluyen una secuencia nucleotídica que 10 tiene al menos 50% o más, preferiblemente 70%, más preferiblemente 80%, e incluso más preferiblemente 90% (por ejemplo, 95% o más, o 99%) de identidad con una secuencia nucleotídica que comprende los nucleótidos de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2. Tales identidades se pueden determinar mediante el algoritmo BLAST (Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7) como se describe en la determinación de la homología anteriormente. Además del programa BLASTN descrito anteriormente para 15 secuencias nucleotídicas, en base a este algoritmo se ha desarrollado y se puede usar el programa BLASTX para determinar la identidad de secuencias de aminoácidos (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10), y similar (como se describe anteriormente, véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. para un ejemplo específico de métodos de análisis).
Las isoformas o variantes alélicas de Lrp4, y otros genes con una estructura o función similar a Lrp4, se pueden 20 obtener a partir de genotecas de ADNc y genotecas genómicas de animales tales como seres humanos, ratones, ratas, conejos, hámsters, pollos, cerdos, vacas, cabras, y ovejas, diseñando cebadores basados en las secuencias nucleotídicas de SEC ID NOs: 1 y 2, usando tecnología de amplificación de genes (PCR) (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Secciones 6.1-6.4).
Las secuencias polinucleotídicas se pueden confirmar usando métodos de determinación de secuencia 25 convencionales. Por ejemplo, se puede usar el método de terminación de cadena de didesoxinucleótido (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463). Además, las secuencias también se pueden analizar usando un secuenciador de ADN adecuado.
Además, las sondas polinucleotídicas marcadoras de la presente invención incluyen las ya mencionadas (1) secuencias complementarias a la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 1 o 2, (2) secuencias complementarias a 30 secuencias nucleotídicas que codifican la secuencia de aminoácidos descrita en SEC ID NO: 3 o 4, (3) secuencias complementarias a secuencias nucleotídicas que codifican una secuencia que carece de la porción del dominio transmembránico de la secuencia de aminoácidos descrita en SEC ID NO: 3 o 4, y (4) polinucleótidos que comprenden secuencias nucleotídicas que contienen al menos 15 nucleótidos consecutivos en cada una de las secuencias nucleotídicas que se hibridan en condiciones restrictivas con un polinucleótido comprendido por la 35 secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 1 o 2. Tales polinucleótidos que comprenden una secuencia nucleotídica que contiene al menos 15 nucleótidos consecutivos se pueden usar como una sonda para detectar, o como un cebador para amplificar, la expresión de ARNm de Lrp4. La cadena nucleotídica consiste normalmente en 15 a 100, y tiene preferiblemente 15 a 35 nucleótidos cuando se usa como una sonda, o al menos 15 y preferiblemente 30 nucleótidos cuando se usa como un cebador. Un cebador se puede diseñar para que tenga una secuencia de reconocimiento de 40 enzima de restricción, una etiqueta o similar, añadida al lado del extremo 5’ del mismo, y en el extremo 3’, una secuencia complementaria a una secuencia diana. Tales polinucleótidos, que comprenden una secuencia nucleotídica que contiene al menos 15 nucleótidos consecutivos, se pueden hibridar con un polinucleótido de Lrp4.
Además, las sondas polinucleotídicas marcadoras de la presente invención comprenden un segundo polinucleótido que se hibrida en condiciones restrictivas con un primer polinucleótido que comprende una cualquiera de: (1) la 45 secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 1 o 2; (2) secuencias nucleotídicas que comprenden polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 o 4; (3) secuencias nucleotídicas que comprenden polinucleótidos que codifican polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que carece de la región transmembránica en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 o 4; y (4) secuencias nucleotídicas que comprenden polinucleótidos que se hibridan en condiciones restrictivas con un 50 polinucleótido que comprende la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 1 o 2. Como segundo polinucleótido, se prefieren polinucleótidos que consisten en una secuencia nucleotídica que comprende al menos 15 nucleótidos consecutivos.
Las sondas polinucleotídicas marcadoras de la presente invención se pueden preparar a partir de células que expresan Lrp4 mediante la ya mencionada hibridación o PCR o similar. Además, las sondas polinucleotídicas 55 marcadoras de la presente invención también se pueden producir mediante síntesis química en base a datos de secuencias de Lrp4 conocidos. Las ribosondas, que se considera que son particularmente preferibles para detectar ARN en tejidos, se pueden obtener, por ejemplo, insertando un gen clonado de Lrp4, o porción del mismo, en un vector plasmídico pSP64 en la dirección inversa, seguido de la transcripción run-off de la porción de secuencia insertada. Aunque pSP64 contiene un promotor SP6, también se conocen métodos para producir ribosondas 60 combinando el fago T3, el promotor T7 y la ARN polimerasa. Las sondas polinucleotídicas marcadoras de la
presente invención también se pueden usar como reactivos para discriminar las células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas. En los reactivos descritos anteriormente, los polinucleótidos como ingredientes activos se pueden mezclar según sea necesario con, por ejemplo, agua estéril, disolución salina, aceites vegetales, tensioactivos, lípidos, solubilizantes, tampones, estabilizantes, y conservantes.
<Anticuerpos> 5
La presente invención proporciona anticuerpos marcadores de células progenitoras de neuronas dopaminérgicas (aquí en lo sucesivo, algunas veces denominados como “anticuerpos de la presente invención”) que se pueden usar para seleccionar células progenitoras de neuronas dopaminérgicas a partir de tejido cerebral o células cultivadas. A diferencia de ARNm de Lrp4, el polipéptido de Lrp4 se expresa no solamente en las células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas antes de la salida del ciclo celular, sino también en células precursoras 10 de neuronas dopaminérgicas postmitóticas. Por lo tanto, usando los anticuerpos de la presente invención frente al polipéptido, es posible seleccionar y/u obtener células progenitoras de neuronas dopaminérgicas antes y después de la salida del ciclo celular. Los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos monocatenarios (scFV) (Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83; The Pharmacology of Monoclonal Antibody, vol. 113, Rosenburg and Moore ed., Springer 15 Verlag (1994) p. 269-315), anticuerpos humanizados, anticuerpos multiespecíficos (LeDoussal et al. (1992) Int. J. Cancer Supl. 7: 58-62; Paulus (1985) Behring Inst. Mitt. 78: 118-32; Millstein y Cuello (1983) Nature 305: 537-9; Zimmermann (1986) Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 105: 176-260; Van Dijk et al. (1989) Int. J. Cancer 43: 944-9), y fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab’, F(ab’)2, y Fv. Además, los anticuerpos de la presente invención también se pueden modificar mediante PEG y similar, según sea necesario. Los anticuerpos de la 20 presente invención también se pueden producir en forma de una proteína de fusión con -galactosidasa, proteína de unión a maltosa, GST, proteína fluorescente verde (GFP), y similar, para permitir la detección sin el uso de un anticuerpo secundario. Además, los anticuerpos de la presente invención se pueden modificar marcando con biotina o similar, para permitir la recuperación usando avidina, estreptoavidina, o similar.
Los anticuerpos de la presente invención son específicos para cualquiera de (1) polipéptidos codificados por la 25 secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 1 o 2, (2) polipéptidos comprendidos en la secuencia de aminoácidos descrita en SEC ID NO: 3 o 4, (3) polipéptidos comprendidos en una secuencia de aminoácidos que carece del dominio transmembránico en la secuencia de aminoácidos descrita en SEC ID NO: 3 o 4, (4) polipéptidos comprendidos en una secuencia de aminoácidos en la que uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 o 4, están suprimidos, insertados, sustituidos, o añadidos, (5) polipéptidos codificados por una secuencia 30 nucleotídica que se hibrida en condiciones restrictivas con una secuencia complementaria a la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 1 o 2, y (6) polipéptidos que son fragmentos de los polipéptidos de (1) a (5) anteriores, con al menos ocho restos de aminoácidos.
También, los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos que se unen a polipéptidos que comprenden una cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos (1) a (4) o partes de las mismas: (1) la 35 secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 o 4, (2) secuencias de aminoácidos que carecen de la región transmembránica en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 o 4, (3) secuencias de aminoácidos mutadas mediante una o más supresiones, sustituciones, o adiciones de aminoácidos, o combinaciones de las mismas, en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 o 4; y (4) secuencias de aminoácidos que comprenden polipéptidos codificados por polinucleótidos que se hibridan en condiciones restrictivas con polinucleótidos que comprenden una 40 secuencia nucleotídica complementaria a la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 1 o 2. Los polipéptidos descritos anteriormente que consisten en secuencias parciales incluyen polipéptidos que comprenden preferiblemente al menos seis restos de aminoácidos consecutivos (por ejemplo, 8, 10, 12, o 15 restos de aminoácidos o más).
Las secuencias de aminoácidos mutadas mediante una o más supresiones, sustituciones, o adiciones de aminoácidos, o combinaciones de las mismas, en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 incluyen, por 45 ejemplo: (i) secuencias de aminoácidos con 1 a 9 (por ejemplo, 1 a 5, preferiblemente 1 a 3, más preferiblemente 1 a 2, y todavía más preferiblemente 1) supresiones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3; (ii) secuencias de aminoácidos con 1 a 9 (por ejemplo, 1 a 5, preferiblemente 1 a 3, más preferiblemente 1 a 2, y todavía más preferiblemente 1) adiciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3; (iii) secuencias de aminoácidos con 1 a 9 (por ejemplo, 1 a 5, preferiblemente 1 a 3, más preferiblemente 1 a 2, y 50 todavía más preferiblemente 1) aminoácidos sustituidos por otros aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3; y (iv) una secuencia de aminoácidos mutada mediante una combinación de las (i) a (iii) anteriores.
Las secuencias de aminoácidos mutadas mediante una o más supresiones, sustituciones, o adiciones de aminoácidos, o combinaciones de las mismas, en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4 incluyen, por ejemplo: (i) secuencias de aminoácidos con 1 a 9 (por ejemplo, 1 a 5, preferiblemente 1 a 3, más preferiblemente 1 a 55 2, y todavía más preferiblemente 1) supresiones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4; (ii) secuencias de aminoácidos con 1 a 9 (por ejemplo, 1 a 5, preferiblemente 1 a 3, más preferiblemente 1 a 2, y todavía más preferiblemente 1) adiciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4; (iii) secuencias de aminoácidos con 1 a 9 (por ejemplo, 1 a 5, preferiblemente 1 a 3, más preferiblemente 1 a 2, y todavía más preferiblemente 1) aminoácidos sustituidos por otros aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de 60 SEC ID NO: 4; y (iv) secuencias de aminoácidos mutadas por cualquier combinación de las (i) a (iii) anteriores.
La expresión “supresiones de aminoácidos” significa aquí variantes en las que uno o más restos de aminoácidos en la secuencia están suprimidos. La expresión “supresión” incluye la supresión de un aminoácido en cualquier extremo de una secuencia de aminoácidos, y la supresión de un aminoácido en una secuencia de aminoácidos.
La expresión “adiciones de aminoácidos” significa aquí variantes en las que uno o más restos de aminoácidos se han añadido a la secuencia. El término “adición” incluye la adición de un aminoácido en cualquier extremo de una 5 secuencia de aminoácidos, y la adición de un aminoácido en una secuencia de aminoácidos.
La expresión “sustituciones de aminoácidos” significa aquí variantes en las que uno o más restos de aminoácidos en la secuencia están sustituidos por restos de aminoácidos diferentes. Cuando las secuencias de aminoácidos se modifican mediante tal sustitución, preferiblemente se lleva a cabo la sustitución conservativa. La expresión “sustitución conservativa” significa cambiar la secuencia para que codifique un aminoácido con propiedades 10 similares al aminoácido antes de la sustitución. Los aminoácidos se pueden clasificar según sus propiedades en, por ejemplo: aminoácidos no polares (Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, y Val); aminoácidos no cargados (Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, y Tyr); aminoácidos ácidos (Asp y Glu); aminoácidos básicos (Arg, His, y Lys); aminoácidos neutros (Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, y Val); aminoácidos alifáticos (Ala y Gly); aminoácidos ramificados (Ile, Leu, y Val), hidroxiaminoácidos (Ser y Thr); aminoácidos de tipo amida (Gln y Asn); 15 aminoácidos que contienen azufre (Cys y Met); aminoácidos aromáticos (His, Phe, Trp, y Tyr); aminoácidos heterocíclicos (His y Trp); y iminoácidos (Pro y 4Hyp).
Por lo tanto, es preferible que los aminoácidos no polares se sustituyan entre sí, o que los aminoácidos no cargados se sustituyan entre sí. De éstas, son preferibles las sustituciones entre Ala, Val, Leu, y Ile, entre Ser y Thr, entre Asp y Glu, entre Asn y Gln, entre Lys y Arg, y entre Phe y Tyr, para retener propiedades de las proteínas. El número y 20 sitios de aminoácidos mutados no está particularmente limitado.
Como los anticuerpos de la presente invención, son particularmente preferibles los dos anticuerpos anti-Lrp4 usados en el Ejemplo 4, y modificaciones que comprenden fragmentos de los mismos. Los dos anticuerpos se han depositado de forma internacional con los siguientes números de acceso:
(1) Nombre y dirección de la institución depositaria 25
Nombre: International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
Dirección: Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki Prefecture, Japón 305-8566
(2) Fecha de depósito: 14 de julio de 2004
(3) Números de acceso: FERM BP-10315 y FERM BP-10316 30
(transferidos de FERM P-20120 y FERM P-20121 depositados de forma nacional en Japón)
Los anticuerpos de la presente invención se pueden producir usando un agente sensibilizante tal como un polipéptido de Lrp4, o fragmentos del mismo, o células que expresan un polipéptido de Lrp4 o fragmentos de polipéptido de Lrp4. Además, también se pueden usar como inmunógenos fragmentos cortos del polipéptido de Lrp4 mediante acoplamiento con un vehículo tal como seroalbúmina bovina, hemocianina de lapa californiana, y 35 ovoalbúmina. Además, el polipéptido de Lrp4, o fragmentos del mismo, se puede usar en combinación con adyuvantes conocidos, tales como adyuvante de aluminio, adyuvante completo de Freund (o incompleto), adyuvante de pertussis, para potenciar la respuesta inmunitaria frente al antígeno.
El “polipéptido de Lrp4”, en la presente invención, es un polímero peptídico, del cual un ejemplo preferido es una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en SEC ID NO: 3 o 4. Los restos de aminoácidos que 40 componen un polipéptido de Lrp4 pueden ser de origen natural o pueden ser modificados. Además, los polipéptidos de Lrp4 incluyen proteínas que carecen de una porción de dominio transmembránico, o proteínas de fusión modificadas por otras secuencias peptídicas.
En la presente invención, los polipéptidos de Lrp4 deberían de tener la antigenicidad del polipéptido de Lrp4, e incluyen polipéptidos con una secuencia de aminoácidos en la que uno o más aminoácidos en la secuencia de 45 aminoácidos de SEC ID NO: 3 o 4 están suprimidos, insertados, sustituidos, o añadidos. Es bien conocido que los polipéptidos mutantes, que comprenden una secuencia de aminoácidos en la que uno o más aminoácidos están suprimidos, insertados, sustituidos o añadidos, mantienen la misma actividad biológica que el polipéptido original (Mark et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5662-6; Zoller y Smith (1982) Nucleic Acids Res. 10: 6487-500; Wang et al. (1984) Science 224: 1431-3; Dalbadie-McFarland et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6409-13). 50 Tales polipéptidos que mantienen la antigenicidad de Lrp4 y tienen una secuencia de aminoácidos en la que uno o más aminoácidos están suprimidos, insertados, sustituidos, o añadidos a la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 o 4, se pueden obtener preparando polinucleótidos que codifican los polipéptidos usando métodos conocidos tales como mutagénesis dirigida al sitio descrita en “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2ª ed.” (Cold Spring Harbor Press (1989)), “Current Protocols in Molecular Biology” (John Wiley & Sons (1987-1997); especialmente en la 55
sección 8.1-8.5), Hashimoto-Goto et al. (1995) Gene 152: 271-5, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92, Kramer y Fritz (1987) Method. Enzymol. 154: 350-67, Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6), y otros, y después expresándolos adecuadamente. Además de la mutagénesis dirigida al sitio descrita anteriormente, se pueden usar métodos para someter genes a mutágenos. Como alternativa, también se pueden usar métodos para escindir selectivamente genes; eliminar, añadir o sustituir nucleótidos seleccionados; y después ligar los genes. 5
Los fragmentos del polipéptido de Lrp4 son idénticos a una porción del polipéptido de Lrp4 mencionado anteriormente, y consisten preferiblemente en al menos seis o más restos de aminoácidos continuos (por ejemplo, 8, 10, 12, o 15 restos de aminoácidos o más). Un fragmento particularmente preferido se puede ejemplificar mediante un fragmento polipeptídico que carece de un término amino, término carboxilo, y dominio transmembránico. Los fragmentos del polipéptido de Lrp4 incluyen fragmentos que contienen una hélice  y una región formadora de hélice 10 , región anfipática , lámina  y región formadora de lámina , región anfipática , región de unión a sustrato, región de índice elevado de antígeno, enrollamiento y región formadora de enrollamiento, región hidrófila, región hidrófoba, región formadora de vuelta y vuelta, y región formadora de superficie. En el contexto de la presente invención, un fragmento de polipéptido de Lrp4 puede ser cualquier fragmento, en tanto que tenga la antigenicidad de un polipéptido de Lrp4. El sitio determinante de un antígeno de un polipéptido se puede predecir usando métodos 15 para analizar la hidrofobia/hidrofilia de una secuencia de aminoácidos de una proteína (Kyte-Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-22), o métodos de análisis de estructura secundaria (Chou-Fasman (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 251-76), y se puede confirmar usando programas de ordenador (Anal. Biochem. 151: 540-6 (1985)), o el método PEPSCAN en el que se sintetiza un péptido corto seguido de la confirmación de su antigenicidad (traducción japonesa publicada de la solicitud internacional nº Sho 60-500684), o similar. 20
Los polipéptidos de Lrp4 y fragmentos de polipéptido Lrp4 se pueden aislar de células, tejidos, etc., que expresan Lrp4, basándose en sus propiedades físicas y similares. Además, estos polipéptidos y fragmentos polipeptídicos también se pueden producir usando técnicas de recombinación genética o métodos de síntesis química. Por ejemplo, para la producción de polipéptidos de Lrp4 in vitro, los polipéptidos de Lrp4 se pueden producir en un sistema libre de células in vitro usando métodos tales como la traducción in vitro (Dasso y Jackson (1989) Nucleic 25 Acids Res. 17: 3129-44). Por el contrario, cuando se producen polipéptidos usando células, primero se incorpora en un vector apropiado un polinucleótido que codifica un polipéptido de interés, se selecciona una célula hospedante adecuada, y entonces las células se transforman mediante el vector. Subsiguientemente, las células transformadas se pueden cultivar para obtener el polipéptido de interés.
Los vectores apropiados incluyen diversos vectores tales como plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos, vectores 30 de clonación, y vectores de expresión (Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2ª ed., Cold Spring Harbor Press (1989); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987)). Los vectores comprenden secuencias reguladoras para la expresión de un polinucleótido deseado en células hospedantes transfectadas, y el polinucleótido se incorpora en ellas de manera que estará bajo el control de las secuencias reguladoras. Aquí, la frase “secuencia reguladora” incluye promotores, sitios de unión al ribosoma, y terminadores, en el caso de una 35 célula hospedante procariota y promotores y terminadores en el caso de una célula hospedante procariota, y promotores y terminadores en el caso de una célula hospedante eucariota, y en algunos casos, también puede contener transactivadores, factores de transcripción, señales de poli A que estabilizan los productos de transcripción, señales de ayuste y de poliadenilación, y otros. Tales secuencias reguladoras comprenden todos los componentes requeridos para la expresión de un polinucleótido enlazado a ellas. Los vectores pueden comprender además un 40 marcador de selección. Además, también se puede incorporar en un vector de expresión, mediante enlazamiento a un polipéptido de interés, un péptido señal requerido para transferir un polipéptido expresado intracelularmente a la luz del retículo endoplásmico, o el periplasma o el espacio extracelular cuando la célula hospedante es un microbio gramnegativo. Tales péptidos señal pueden ser péptidos señal derivados de proteína heterogéneas. Además, se puede añadir un enlazador, y se puede insertar un codón de partida (ATG) o de parada (TAA, TAG, o TGA), según 45 sea necesario.
Los ejemplos de vectores capaces de expresar polipéptidos in vitro incluyen pBEST (Promega). Además, se sabe que diversos vectores son adecuados para la expresión en células procariotas (véase, por ejemplo, “Basic Microbiology Course 8 - Genetic Engineering” (Kyoritsu Publishing)). Cuando se seleccionan células procariotas como el hospedante, un experto de pericia normal en la técnica puede seleccionar adecuadamente un vector 50 adecuado para el hospedante y un método adecuado para introducir el vector en el hospedante. Otros ejemplos de hospedantes que se pueden usar para expresar polipéptidos de Lrp4 y sus fragmentos antigénicos incluyen células fúngicas tales como levaduras, plantas superiores, insectos, peces, anfibios, reptiles, pájaros, mamíferos, células cultivadas (COS, Hela, C127, 3T3, BHK, HEK293, células de melanoma de Bowes), mieloma, Vero, Namalwa, Namalwa KJM-1, y HBT5637 (solicitud de patente japonesa publicada sin examinar nº Sho 63-299). También se 55 conocen sistemas de vectores adecuados para cada célula, y métodos para introducir un vector en células hospedantes. Además, también se conocen métodos para expresar proteínas exógenas en animales in vivo (véanse, por ejemplo, Susumu (1985) Nature 315: 592-4; Lubon (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4: 1-54) y en cuerpos vegetales, y se pueden usar para expresar polinucleótidos de Lrp4.
Los ADN se pueden insertar en vectores en una reacción de ligasa usando sitios de enzimas de restricción (Current 60 Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Sección 11.4-11.11; Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2ª ed., Cold Spring Harbor Press (1989) Sección 5.61-5.63). Además, un vector de expresión que codifique
el polipéptido de Lrp4 se puede diseñar según sea necesario seleccionando una secuencia nucleotídica que tiene una eficiencia de expresión elevada a la vista de la frecuencia del uso de codones del hospedante (Grantham et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9: r43-74). Un hospedante que produce un polipéptido de Lrp4 comprende en sus células un polinucleótido que codifica un polipéptido de Lrp4. En tanto que el polinucleótido no exista en una posición de origen natural en el genoma de una célula hospedante, el propio polinucleótido se puede regular mediante su propio 5 promotor, incorporado en el genoma del hospedante, o se puede mantener como una estructura extracromosómica.
La transducción (transformación/transfección) de células hospedantes con vectores se puede realizar usando métodos bien conocidos.
La transformación se puede realizar, por ejemplo, mediante el método de Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 (1972)), métodos de protoplastos (Mol. Gen. Genet., 168, 111 (1979)), y el método competente (J. Mol. 10 Biol., 56, 209 (1971)) para bacterias (E. coli, Bacillus subtilis, etc.); mediante el método de Hinnen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1927 (1978)) y métodos de litio (J. Bacteriol., 153, 163 (1983)) para Saccharomyces cerevisiae; mediante métodos del disco de hoja (Science, 227, 129 (1985)), métodos de electroporación (Nature, 319, 791 (1986)), y métodos con Agrobacterium (Horsch et al., Science, 227, 129 (1985); y Hiei et al., Plant J., 6, 271-282 (1994)) para células vegetales; mediante el método de Graham (Virology, 52, 456 (1973)) para células de animales; 15 y mediante el método de Summers et al. (Mol. Cell Biol., 3, 2156-2165 (1983)) para células de insectos.
El cultivo de células hospedantes se lleva a cabo usando métodos conocidos que son apropiados para la célula hospedante seleccionada. Por ejemplo, cuando se seleccionan células de animales, el cultivo se puede llevar a cabo a un pH de alrededor de 6 a 8 y a una temperatura de 30ºC a 40ºC durante alrededor de 15 a 200 horas, usando un medio tal como DMEM (Virology 8: 396 (1959)), MEM (Science 122: 501 (1952)), RPMI1640 (J. Am. Med. Assoc. 20 199: 519 (1967)), 199 (Proc. Soc. Biol. Med. 73: 1 (1950)), o IMDM, y añadiendo suero, tal como suero fetal de ternera (FCS), según sea necesario. Además, el medio se puede sustituir, airear, o agitar durante el transcurso del cultivo, según sea necesario.
Normalmente, un polipéptido de Lrp4 producido mediante técnicas de recombinación génica se puede recuperar del medio si el polipéptido es segregado fuera de una célula, o del fluido corporal de un organismo transgénico. Cuando 25 un polipéptido es producido en el interior de la célula, las células se pueden disolver y el polipéptido se puede recuperar del producto disuelto. El polipéptido de interés se puede purificar entonces combinando adecuadamente métodos conocidos de purificación de proteínas, tales como precipitación salina, destilación, diversos tipos de cromatografía, electroforesis en gel, filtración en gel, ultrafiltración, recristalización, extracción ácida, diálisis, inmunoprecipitación, precipitación con disolventes, extracción con disolventes, y precipitación con sulfato de amonio 30 o etanol. Los ejemplos de cromatografías incluyen cromatografía de intercambio iónico, tal como cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de fase inversa, cromatografía de adsorción, cromatografía de filtración en gel, cromatografía hidrófoba, cromatografía con hidroxiapatita, cromatografía con fosfocelulosa, y cromatografía con lectina (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Marshak et al. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). La cromatografía se 35 puede llevar a cabo usando una cromatografía en fase líquida, tal como HPLC o FPLC. Además, por ejemplo, una proteína fusionada con GST se puede purificar usando una columna de glutationa, y una proteína con una etiqueta de histidina se puede purificar usando una columna de níquel. Cuando un polipéptido de Lrp4 se produce como una proteína de fusión, las porciones innecesarias se pueden eliminar usando trombina, factor Xa, o similar, seguido de la purificación según sea necesario. 40
Además, los polipéptidos de origen natural también se pueden purificar y obtener. Por ejemplo, los polipéptidos se pueden purificar mediante cromatografía de afinidad usando anticuerpos contra los polipéptidos de Lrp4 (Current Protocols in Molecular Biology, John. Wiley & Sons (1987). Sección 16.1-16.19). Además, los polipéptidos purificados también se pueden modificar usando enzimas, tales como quimiotripsina, glucosidasa, tripsina, proteína cinasa, y lisil endopeptidasa, según sea necesario. Además de las técnicas de síntesis y de ingeniería genética 45 mencionadas anteriormente según se usan para polipéptidos de Lrp4, los fragmentos de polipéptido de Lrp4 también se pueden producir escindiendo un polipéptido de Lrp4, usando enzimas adecuadas, tales como peptidasas.
Los anticuerpos policlonales para seleccionar células progenitoras de neuronas dopaminérgicas se pueden obtener, por ejemplo, a partir del suero de un animal inmunizado tras inmunizar un mamífero con un polipéptido de Lrp4 purificado como se describe anteriormente, o un fragmento del mismo, acoplado a un adyuvante deseado. Aunque 50 no hay limitaciones particulares con respecto a los mamíferos usados, los ejemplos típicos incluyen roedores, lagomorfos, y primates. Los ejemplos específicos incluyen roedores tales como ratones, ratas, y hámsters, lagomorfos tales como conejos, y primates tales como monos, incluyendo monos cinomolgos, monos rhesus, babuinos, y chimpancés. La inmunización del animal se lleva a cabo diluyendo adecuadamente y suspendiendo un antígeno sensibilizante en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) o disolución salina fisiológica, mezclando 55 con un adyuvante según sea necesario hasta que se emulsione, e inyectándolo intraperitoneal o subcutáneamente en un animal. El antígeno sensibilizante mezclado con adyuvante incompleto de Freund se administra preferiblemente varias veces, cada 4 a 21 días. La producción del anticuerpo se puede confirmar midiendo el nivel de un anticuerpo de interés en el suero usando métodos convencionales. Finalmente, el propio suero se puede usar como un anticuerpo policlonal, o se puede purificar posteriormente. Véase, por ejemplo, “Current Protocols in 60 Molecular Biology” (John Wiley & Sons (1987) Secciones 11.12-11.13), para métodos específicos.
Un anticuerpo monoclonal se puede producir retirando el bazo de un animal inmunizado de la manera descrita anteriormente, separando inmunocitos del bazo, y fusionándolos con una célula de mieloma adecuada usando polietilenglicol (PEG) o similar, para establecer hibridomas. La fusión celular se puede llevar a cabo según el método de Milstein (Galfre y Milstein (1981) Methods Enzymol. 73: 3-46). Aquí, las células de mieloma adecuadas se ejemplifican particularmente mediante células que permiten la selección química de células fusionadas. Cuando se 5 usan tales células de mieloma, los hibridomas fusionados se pueden seleccionar mediante cultivo en un medio de cultivo (medio de cultivo HAT) que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina, que destruye las células distintas de las células fusionadas. A continuación, los clones que producen anticuerpos contra polipéptidos de la presente invención, o un fragmento de los mismos, se pueden seleccionar a partir de los hibridomas obtenidos. Subsiguientemente, el clon seleccionado se introduce en la cavidad abdominal de un ratón o similar, y el líquido 10 ascítico se puede recoger para obtener un anticuerpo monoclonal. Véase también “Current Protocols in Molecular Biology” (John Wiley & Sons (1987) Sección 11.4-11.11) para información sobre métodos específicos. Los hibridomas preferibles de la presente invención pueden ser FERM BP-10315 y FERM BP-10316.
Los hibridomas también se pueden obtener sensibilizando en primer lugar linfocitos humanos que se han infectado mediante el virus de EB con un inmunógeno in vitro, y fusionando los linfocitos sensibilizados con células de 15 mieloma humano (tales como U266) para obtener hibridomas que producen anticuerpos humanos (solicitud de patente japonesa publicada sin examinar nº Sho 63-17688). Además, los anticuerpos humanos también se pueden obtener usando células productoras de anticuerpos generadas sensibilizando un animal transgénico con un repertorio de genes de anticuerpos humanos (documentos WO92/03918; WO93-02227; WO94/02602; WO94/25585; WO96/33735; WO96/34096; Mendez et al. (1997) Nat. Genet. 15: 146-156, etc.). Los métodos que no usan 20 hibridomas se pueden ejemplificar mediante un método en el que un gen de cáncer se introduce para inmortalizar inmunocitos tales como linfocitos productores de anticuerpos.
Además, los anticuerpos de la presente invención también se pueden producir mediante técnicas de recombinación genética (véase Borrebaeck y Larrick (1990) Therapeutic Monoclonal Antibodies, MacMillan Publishers Ltd., UK). En primer lugar, un gen que codifica un anticuerpo se clona a partir de hibridomas o células productoras de anticuerpos 25 (tales como linfocitos sensibilizados). El gen resultante se inserta entonces en un vector adecuado, el vector se introduce en un hospedante, y el hospedante se cultiva entonces para producir el anticuerpo. Este tipo de anticuerpo recombinante también está incluido en los anticuerpos de la presente invención. Los ejemplos típicos de anticuerpos recombinantes incluyen anticuerpos quiméricos, que comprenden una región variable derivada de anticuerpo no humano y una región constante derivada de anticuerpo humano, y anticuerpos humanizados, que comprenden una 30 región determinante de la complementariedad (CDR) derivada de anticuerpo no humano, una región de armazón (FR) derivada de anticuerpo humano, y una región constante de anticuerpo humano (Jones et al. (1986) Nature 321: 522-5; Reichmann et al. (1988) Nature 332: 323-9; Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-6; Methods Enzymol. 203: 99-121 (1991)).
Los fragmentos de anticuerpo se pueden producir tratando los anticuerpos policlonales o monoclonales 35 mencionados anteriormente con enzimas tales como papaína o pepsina. Como alternativa, los fragmentos de anticuerpo se pueden producir mediante técnicas de ingeniería genética usando genes que codifican fragmentos de anticuerpo (véanse Co et al., (1994) J. Immunol. 152: 2968-76; Better y Horwitz (1989) Methods Enzymol. 178: 476-96; Pluckthun y Skerra (1989) Methods Enzymol. 178: 497-515; Lamoyi (1986) Methods Enzymol. 121: 652-63; Rousseaux et al. (1986) 121: 663-9; Bird y Walker (1991) Trends Biotechnol. 9: 132-7). 40
Los anticuerpos multiespecíficos incluyen anticuerpos biespecíficos (BsAb), dianticuerpos (Db), y similares. Los anticuerpos multiespecíficos se pueden producir mediante métodos tales como (1) acoplando químicamente anticuerpos que tienen especificidades diferentes con tipos diferentes de enlazadores bifuncionales (Paulus (1985) Behring Inst. Mill. 78: 118-32), (2) fusionando hibridomas que segregan anticuerpos monoclonales diferentes (Millstein y Cuello (1983) Nature 305: 537-9), o (3) transfectando sistemas de expresión de células eucariotas, tales 45 como células de mieloma de ratón, con un gen de cadena ligera y un gen de cadena pesada de anticuerpos monoclonales diferentes (cuatro tipos de ADN), seguido del aislamiento de una porción monovalente biespecífica (Zimmermann (1986) Rev. Physio. Biochem. Pharmacol. 105: 176-260; Van Dijk et al. (1989) Int. J. Cancer 43: 944-9). Como alternativa, los dianticuerpos son fragmentos de anticuerpo diméricos que comprenden dos cadenas polipeptídicas bivalentes que se pueden construir mediante fusión génica. Éstos se pueden producir usando 50 métodos conocidos (véanse Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-8; documentos EP404097; WO93/11161).
La recuperación y purificación de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo se pueden llevar a cabo usando Proteína A y Proteína G, o según las técnicas de purificación de proteínas descritas anteriormente en la producción de polipéptidos que no son anticuerpos (Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor 55 Laboratory (1988)). Por ejemplo, cuando se usa la Proteína A para purificar anticuerpos de la presente invención, se pueden usar columnas de Proteína A tales como Hyper D, POROS, o Sepharose F.F. (Pharmacia). La concentración de los anticuerpos resultantes se puede determinar midiendo la absorbancia o mediante ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA).
La actividad de unión a antígeno de un anticuerpo se puede determinar usando medidas de absorbancia, o usando 60 métodos con anticuerpos fluorescentes, métodos de inmunoensayos enzimáticos (EIA), métodos de
radioinmunoensayo (RIA), o ELISA. Cuando se usa ELISA, por ejemplo, en primer lugar los anticuerpos de la presente invención se inmovilizan sobre un soporte, tal como una placa. Se añade un polipéptido de Lrp4, y después se añade una muestra que contiene el anticuerpo de interés. Aquí, las muestras que contienen un anticuerpo de interés incluyen, por ejemplo, sobrenadantes de cultivo de células productoras de anticuerpo, anticuerpos purificados, y similares. A continuación, se añaden anticuerpos secundarios que reconocen los anticuerpos de la 5 presente invención, y se incuba la placa. La placa se lava entonces y se detecta un marcador unido al anticuerpo secundario. Concretamente, si un anticuerpo secundario está marcado con fosfatasa alcalina, la actividad de unión al antígeno se puede determinar añadiendo un sustrato enzimático tal como fosfato de p-nitrofenilo, y midiendo la absorbancia. Además, para evaluar las actividades de los anticuerpos, también se puede usar un sistema comercialmente disponible tal como BIAcore (Pharmacia). 10
La presente invención se refiere a reactivos que comprenden el anticuerpo anti-Lrp4 como ingrediente activo para identificar células progenitoras de neuronas dopaminérgicas. En los reactivos descritos anteriormente, los anticuerpos de la presente invención como ingredientes activos se pueden mezclar según sea necesario con, por ejemplo, agua estéril, disolución salina, aceites vegetales, tensioactivos, lípidos, solubilizante, tampones, estabilizantes de proteínas (tales como BSA y gelatina), y conservantes. 15
<Métodos para seleccionar células progenitoras de neuronas dopaminérgicas y similares>
La presente invención proporciona métodos para seleccionar células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas como una población selectivamente uniforme. Las células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas se pueden seleccionar usando las sondas polinucleotídicas marcadoras de la presente invención. La presente invención también proporciona métodos para seleccionar las células progenitoras de neuronas 20 dopaminérgicas como una población selectivamente uniforme. Las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas se pueden seleccionar adecuadamente usando los anticuerpos de la presente invención. Como se describe anteriormente, usando las sondas polinucleotídicas o anticuerpos de la presente invención, se pueden seleccionar específicamente las células de la estirpe de neuronas dopaminérgicas que eventualmente se diferencian en neuronas dopaminérgicas. 25
Aquí, el término “seleccionado” incluye tanto detectar la presencia de células que expresan marcadores en una muestra, como separar o aislar subsiguiente esas células progenitoras tras detectar su presencia. La presente invención proporciona métodos para seleccionar células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas, que comprenden una etapa de poner en contacto sondas polinucleotídicas marcadoras de la presente invención con muestras de células que contienen células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas. En este método, 30 las sondas polinucleotídicas marcadoras se marcan preferiblemente con un isótopo radioactivo o un compuesto no radioactivo. Los ejemplos de los isótopos radioactivos usados para el marcaje incluyen 35S y 3H. Cuando se usa una sonda polinucleotídica marcadora radiomarcada, el ARN que se une con el marcador se puede detectar detectando partículas de plata usando autorradiografía de emulsión. Los ejemplos de isótopos no radioactivos para marcar una sonda polinucleotídica marcadora incluyen biotina y digoxigenina. Un marcador marcado con biotina se puede 35 detectar usando, por ejemplo, avidina marcada con fluorescencia, o una enzima tal como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante. Por otro lado, los anticuerpos anti-digoxigenina marcados con fluorescencia o una enzima, tal como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante, se pueden usar para detectar un marcador marcado con digoxigenina. Cuando se usa un marcaje enzimático, la detección se puede llevar a cabo incubando con el sustrato enzimático para formar un pigmento estable en la localización del marcador. La hibridación 40 fluorescente in situ (FISH) es conveniente y particularmente preferible.
Además, la presente invención proporciona métodos para seleccionar células progenitoras de neuronas dopaminérgicas, que comprenden la etapa de poner en contacto anticuerpos para seleccionar las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas de la presente invención con muestras celulares que contienen células progenitoras de neuronas dopaminérgicas. Concretamente, las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas se 45 pueden adquirir poniendo en contacto muestras celulares que contienen células progenitoras de neuronas dopaminérgicas potenciales con anticuerpos de la presente invención, y seleccionando aquellas células que se han unido al anticuerpo (véase la Fig. 13). Los anticuerpos de la presente invención también se pueden inmovilizar sobre un soporte adecuado, antes de la puesta en contacto con muestras celulares. Como alternativa, las células que se unen con los anticuerpos se pueden recuperar selectivamente poniendo en contacto muestras celulares con los 50 anticuerpos de la presente invención, permitiéndoles que se unan, y purificando entonces el anticuerpo mediante cromatografía de afinidad. Por ejemplo, si los anticuerpos de la presente invención se conjugan a biotina, se pueden purificar en una placa o columna unida con avidina o estreptoavidina. Además, las perlas magnéticas se pueden unir a un anticuerpo, por ejemplo, y el anticuerpo y las células que expresan Lrp4 sobre sus superficies, cuando la Lrp4 se une al anticuerpo, se pueden recuperar usando un imán. Las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas 55 que expresan Lrp4 se pueden seleccionar mediante citometría de flujo usando un clasificador de células y anticuerpos anti-Lrp4 marcados fluorescentemente, y similares.
Las poblaciones de células progenitoras de neuronas dopaminérgicas obtenidas como se describe anteriormente son poblaciones celulares que comprenden, por ejemplo, 40% o más, preferiblemente 50% o más, más preferiblemente 60% o más, y particularmente de forma preferible 70% o más células progenitoras de neuronas 60 dopaminérgicas.
La presente invención proporciona métodos para seleccionar y/o producir células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas, que comprenden la etapa de cultivar las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas seleccionadas usando las sondas polinucleotídicas marcadoras o anticuerpos de la presente invención. La presente invención también proporciona métodos para seleccionar y/o producir células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas, que comprenden las etapas de poner en contacto muestras celulares que 5 comprenden las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas con las sondas polinucleotídicas marcadoras o anticuerpos de la presente invención; seleccionar las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas; y cultivar las células seleccionadas.
Además, según la presente invención, las células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas, que tienen un bajo riesgo de tumorigénesis y son adecuadas para terapia de transplante, se pueden obtener cultivando 10 las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas seleccionadas usando las sondas polinucleotídicas marcadoras o anticuerpos de la presente invención; y seleccionando y/o identificando usando los marcadores de células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas. Las células marcadoras precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas pueden incluir, por ejemplo, 65B13, Nurr1, y TH (documento WO 2004/038018; Kawasaki et al., Neuron 28:31-40 (2000); Wallen et al., Exp. Cell Res., 253:737-46 (1999)). Por ejemplo, las células 15 precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas se pueden seleccionar y/o producir poniendo en contacto muestras celulares que comprenden células progenitoras de neuronas dopaminérgicas con las sondas polinucleotídicas marcadoras o anticuerpos de la presente invención; seleccionando las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas; y poniendo en contacto el anticuerpo contra el polipéptido 65B13 con las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas cultivadas adicionalmente según sea necesario para seleccionar las 20 células que expresan el polipéptido 65B13.
La presente invención proporciona métodos para seleccionar y/o producir neuronas dopaminérgicas, en el que los métodos comprenden la etapa de cultivar las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas seleccionadas usando las sondas polinucleotídicas marcadoras o anticuerpos de la presente invención. La presente invención también proporciona métodos para seleccionar y/o producir neuronas dopaminérgicas, que comprenden las etapas 25 de poner en contacto muestras celulares que contienen las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas con las sondas polinucleotídicas marcadoras o anticuerpos de la presente invención; seleccionar las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas; y cultivar las células seleccionadas.
Según la presente invención, las neuronas dopaminérgicas, que tienen un riesgo bajo de tumorigénesis y son adecuadas para terapia de transplante, también se pueden obtener cultivando las células progenitoras de neuronas 30 dopaminérgicas seleccionadas usando las sondas polinucleotídicas marcadoras o anticuerpos de la presente invención; y seleccionando y/o identificando usando los marcadores de neuronas dopaminérgicas. Los marcadores de neuronas dopaminérgicas pueden incluir, por ejemplo, DAT (Development 131 (5): 1145-55 (2004)). Por ejemplo, las neuronas dopaminérgicas se pueden seleccionar y/o producir poniendo en contacto muestras celulares que contienen las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas con las sondas polinucleotídicas marcadoras o 35 anticuerpos de la presente invención; seleccionando las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas; y poniendo en contacto un anticuerpo contra DAT con las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas cultivadas adicionalmente para seleccionar células que expresan DAT.
La presente invención proporciona métodos para seleccionar y/o producir células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas capaces de proliferar cuando se cultivan, en el que los métodos comprenden las etapas 40 de cultivar o no las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas seleccionadas usando los anticuerpos de la presente invención; y retirar las células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas. La presente invención también proporciona métodos para seleccionar y/o producir las células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas capaces de proliferar cuando se cultivan, en el que los métodos comprenden las etapas de poner en contacto muestras celulares que contienen las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas con 45 los anticuerpos de la presente invención; seleccionar las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas; cultivar o no las células seleccionadas; y después retirar las células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas.
En la etapa de la retirada de las células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas, las células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas capaces de proliferar cuando se cultivan también se pueden obtener mediante selección y/o eliminación usando marcadores para células precursoras de neuronas 50 dopaminérgicas postmitóticas. Los marcadores para células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas pueden incluir, por ejemplo, 65B13, Nurr1, y TH (documento WO 2004/038018; Kawasaki et al., Neuron 28:31-40 (2000); Wallen et al., Exp. Cell Res., 253:737-46 (1999)). Las células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas se pueden seleccionar y/o producir, por ejemplo, poniendo en contacto los anticuerpos de la presente invención con muestras celulares que contienen células progenitoras de neuronas dopaminérgicas, 55 seleccionando las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas, y poniendo en contacto un anticuerpo contra el polipéptido 65B 13 con las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas cultivadas adicionalmente según sea necesario para seleccionar células que no expresan el polipéptido 65B 13.
Además, las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas que expresan Lrp4 también se pueden seleccionar y/o identificar usando promotores para Lrp4 (véase, por ejemplo, la solicitud de patente japonesa publicada sin 60 examinar nº 2002-51775). Por ejemplo, se puede transfectar en las células un vector que posee un constructo que
comprende un gen que codifica un marcador de detección, tal como GFP, enlazado a una región promotora obtenida a partir del análisis de las regiones reguladoras de la expresión de Lrp4 que se describirán más tarde. Además, un gen que codifica un marcador también se puede apagar en el locus del gen de Lrp4. En cualquier caso, las células específicas se pueden seleccionar detectando la expresión de un gen marcador específico para las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas. 5
Las muestras celulares usadas aquí comprenden preferiblemente células de la región del mesencéfalo ventral, o células cultivadas que contienen células progenitoras de neuronas dopaminérgicas diferenciadas in vitro. La diferenciación in vitro de neuronas dopaminérgicas se puede llevar a cabo mediante métodos conocidos usando un material de partida como células tales como células ES no humanas conocidas, células intersticiales de médula ósea, estirpes celulares derivadas de neuronas inmortalizadas (traducción japonesa publicada de la publicación 10 internacional nº Hei 8-509215; traducción japonesa publicada de la publicación internacional nº Hei 11-506930; traducción japonesa publicada de la publicación internacional nº 2002-522070), o células neuronales primordiales (traducción japonesa publicada de la publicación internacional nº Hei 11-509729). Normalmente, las neuronas dopaminérgicas se pueden diferenciar cocultivando un tejido obtenido de una región de neuronas dopaminérgicas del cerebro, con una capa de células sustentaculares derivada de tejidos neurales. Además, también se conocen 15 métodos para derivar neuronas dopaminérgicas a partir de tejidos neurales que no producen normalmente dopamina, tales como el estriado y la corteza (traducción japonesa publicada de la publicación internacional nº Hei 10-509319). Además, se ha dado a conocer que el cultivo en condiciones hipóxicas produce células que contienen un mayor número de neuronas dopaminérgicas (traducción japonesa publicada de la publicación internacional nº 2002-530068). Las células ES (CCE) también pueden ser inducidas para que se diferencien en neuronas 20 dopaminérgicas usando el método de 5 etapas (Lee et al. (2000) Nat. Biotech. 18: 675-679, kit de diferenciación de neuronas dopaminérgicas de ratón (R&D Systems)). Las muestras celulares usadas en la selección de células progenitoras de neuronas dopaminérgicas de la presente invención pueden ser poblaciones celulares aisladas o cultivadas mediante cualquier método, incluyendo los métodos descritos anteriormente.
Además, los soportes usados en la inmovilización de los anticuerpos de la presente invención son preferiblemente 25 seguros para las células. Los ejemplos de tales soportes incluyen compuestos de polímeros orgánicos sintéticos o de origen natural, materiales inorgánicos tales como perlas de vidrio, gel de sílice, alúmina, y carbón activado, y aquellos con superficies revestidas con un polisacárido o polímero sintético. No hay limitaciones particulares sobre la forma del soporte, cuyos ejemplos incluyen películas, fibras, gránulos, fibras huecas, tejidos no tejidos, soportes porosos, o soportes en forma de panal de abejas. El área superficial de contacto de los soportes se puede controlar 30 cambiando de diversas maneras su grosor, área superficial, anchura, longitud, forma y tamaño.
<Kits para tratar enfermedades neurodegenerativas que comprenden células progenitoras de neuronas dopaminérgicas, y métodos para tratar enfermedades neurodegenerativas usando células progenitoras de neuronas dopaminérgicas>
Las células adquiridas usando sondas polinucleotídicas y la expresión de ARNm de Lrp4 como índice son células 35 progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas. Las células adquiridas usando los anticuerpos y la expresión de polipéptidos de Lrp4 como índice son células progenitoras de neuronas dopaminérgicas. De este modo, usando los ARNm o los polipéptidos como índices, se pueden obtener poblaciones de células de la estirpe de neuronas dopaminérgicas. Las células progenitoras obtenidas mediante los métodos de la presente invención son más preferibles para terapia de transplante para enfermedades relacionadas con el reflejo postural, movimiento, y 40 comportamientos asociados con una recompensa, particularmente enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Parkinson, esquizofrenia, y drogadicciones (Hynes et al., Cell 80: 95-101 (1995)), en términos de seguridad, tasa de supervivencia, y capacidad de formación de redes, en comparación con poblaciones celulares no purificadas convencionales o neuronas dopaminérgicas en las que se introducen genes exógenos. Las células adquiridas usando como índice la expresión de Lrp4 se pueden usar para el transplante directamente o después de 45 la proliferación in vitro (Fig. 13). Se espera que tales células ejerzan efectos terapéuticos debido a que probablemente se diferenciarán y madurarán en un lugar óptimo en el cerebro. Por lo tanto, la presente invención también proporciona kits (en lo sucesivo aquí, algunas veces denominados como “kits de la presente invención”) para tratar enfermedades neurodegenerativas, en el que los kits comprenden células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas, células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas, y/o neuronas 50 dopaminérgicas seleccionadas y/o producidas usando las sondas polinucleotídicas marcadoras o anticuerpos de la presente invención, así como métodos para tratar enfermedades neurodegenerativas, que comprenden la etapa de transplantar las células en los cerebros de pacientes. Además, la presente invención también proporciona el uso de células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas, de células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas, y/o de neuronas dopaminérgicas seleccionadas y/o producidas usando las sondas polinucleotídicas 55 marcadoras o anticuerpos de la presente invención para producir los kits para tratar una enfermedad neurodegenerativa. En la presente invención, la expresión “enfermedades neurodegenerativas” incluye preferiblemente enfermedad de Parkinson. Los kits de la presente invención pueden comprender vehículos farmacéuticamente aceptables, además de las células. El término “vehículo” incluye, por ejemplo, disoluciones salinas, tampones de fosfato, medios, sueros, fluidos corporales, disoluciones de carboximetilcelulosa, sólidos de 60 armazón para soportar células (por ejemplo, cytodex3 (Amersham Bioscience, 17-0485-01)), componentes de la matriz extracelular (por ejemplo, colágeno, fibronectina, vitronectina, laminina, sulfato de heparano, proteoglicano, glucosaminoglicano, sulfato de condroitina, hialuronato, elastina, o combinación de dos o más de los mismos), o
soportes semejantes a gel. A los kits de la presente invención se pueden añadir un ajustador del pH, un tampón, un estabilizante, un conservante, y similar. Los kits de la presente invención pueden ser para una única inoculación o para múltiples inoculaciones. También es posible seleccionar apropiadamente la dosis dependiendo del peso corporal y de la edad de los seres humanos o animales a inocular, los métodos de administración, etc.
Puesto que las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas seleccionadas usando como índice la expresión de 5 Lrp4 probablemente proliferarán posteriormente in vitro, se espera que ejerzan efectos terapéuticos durante un período prolongado. Además, las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas seleccionadas usando como índice la expresión de Lrp4 se pueden diferenciar in vitro en una etapa apropiada seleccionando las condiciones tales como el medio, y son preferidas como los materiales para diversas terapias de transplante neural. Como se describe anteriormente, por ejemplo, las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas seleccionadas usando 10 como índice la expresión de Lrp4 se pueden someter a selección posterior usando marcadores (por ejemplo, 65B13, Nurr1, TH, etc.) para células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas, para obtener células incluso más seguras para uso en transplante. La presente invención se refiere a métodos para cultivar las células progenitoras descritas anteriormente in vitro para la diferenciación y proliferación. Las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas para el cultivo pueden ser células precursoras postmitóticas. 15
Por ejemplo, se pueden transplantar 1 x 102 a 1 x 108 células progenitoras de neuronas dopaminérgicas obtenidas usando los métodos de la presente invención, preferiblemente 1 x 103 a 1 x 106 células, y más preferiblemente 5 x 104 a 6 x 104 células. El método principal es la cirugía extereotáxica, en la que una suspensión celular se transplanta al cerebro. Además, las células también se pueden transplantar mediante microcirugía. Para los métodos de transplante de tejidos neuronales, véanse Backlund et al. (Backlund et al. (1985) J. Neurosurg. 62: 169-73), Lindvall 20 et al. (Lindvall et al. (1987) Ann. Neurol. 22: 457-68), o Madrazo et al. (Madrazo et al. (1987) New Engl. J. Med. 316: 831-4).
Además, las células de la presente invención también se pueden usar para aislar genes específicos para células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas, y genes específicos para cada etapa de maduración desde células progenitoras proliferativas hasta neuronas dopaminérgicas. También se pueden usar para la investigación de 25 dianas terapéuticas para la enfermedad de Parkinson, para elucidar el proceso de maduración de neuronas dopaminérgicas, y en las identificaciones usando como indicador la maduración.
<Comparación de los niveles de expresión génica>
Las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas, obtenidas usando las sondas polinucleotídicas y anticuerpos de la presente invención, se pueden usar como materiales para aislar genes expresados específicamente en estas 30 células. También se pueden usar para investigar y aislar genes expresados específicamente en células que se han diferenciado, inducido o proliferado a partir de las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas de la presente invención. Además, también se pueden usar para investigar los genes requeridos para la diferenciación in vivo de neuronas dopaminérgicas, investigando genes que tienen diferentes niveles de expresión en células que se han diferenciado, inducido o proliferado, y las células progenitoras originales. Puesto que tales genes son candidatos 35 potenciales para tratar enfermedades causadas por defectos en las neuronas dopaminérgicas, su determinación y aislamiento es extremadamente útil.
La comparación de los niveles de expresión génica en las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas de la presente invención con aquellos en células que se han diferenciado, inducido o proliferado a partir de ellas, u otras células, o la comparación de los niveles de expresión génica de células diferenciadas, inducidas o proliferadas con 40 aquellos de otras células, se puede realizar usando métodos usados habitualmente, tales como hibridación in situ de células, hibridación de transferencia Northern, hibridación de transferencia de punto de ARN, PCR de transcripción inversa, ensayo de protección de ARNasa, hibridación de micromatriz de ADN, análisis en serie de expresión génica (SAGE) (Velculescu et al. (1995) Science 270: 484-487), hibridación sustractiva, y análisis de diferencia de representación (RDA) (Lisitsyn (1995) Trends Genet. 11: 303-307). 45
Para la hibridación in situ celular, los lugares en los que se produce el procesamiento, transporte y localización del ARN en el citoplasma en células individuales se pueden investigar hibridando ARN total o ARN de poli A+ preparado a partir de células con una sonda marcadora específica para una secuencia de ARN dada. Además, el tamaño del ARN se puede determinar a partir de fraccionamiento por tamaños usando electroforesis en gel. Además, los productos de la transcripción del ARN se pueden visualizar in situ usando hibridación fluorescente cuantitativa in situ 50 (FISH) y un microscopio de formación de imágenes digital (Femino et al. (1998) Science 280: 585-90), que son aplicables a la presente invención.
Cuando se usa la PCR de transcripción inversa para el análisis de la expresión génica, la expresión de genes específicos se puede cuantificar de forma aproximada. Usando los presentes métodos, también se pueden detectar y analizar diversas isoformas de un único producto de transcripción del ARN. Para la PCR de transcripción inversa, 55 cuando la reacción se lleva a cabo usando cebadores específicos de los exones, y se detectan productos de amplificación distintos del producto predicho, las isoformas de ARNm producidas mediante ayuste alternativo se pueden identificar analizando estos productos. Para más detalles, véase, por ejemplo, el método descrito en Pykett et al. (1994) Hum. Mol. Genet. 3: 559-64. Cuando se requiere un análisis rápido y aproximado del patrón de
expresión, se prefieren particularmente los métodos que usan PCR de la presente invención, en términos de su velocidad elevada, sensibilidad elevada, y simplicidad.
La eficiencia de la identificación de la expresión génica se puede mejorar usando chips de ADN. Aquí, un chip de ADN se refiere a una matriz en miniatura en la que oligonucleótidos, clones de ADN, o similares se inmovilizan a una densidad elevada sobre una superficie de un soporte, tal como vidrio. Por ejemplo, a fin de llevar a cabo la 5 identificación de la expresión múltiple, se inmovilizan clones de ADNc para cada gen de interés, u oligonucleótidos específicos de cada gen, sobre un chip para producir una micromatriz. A continuación, los ARN se preparan a partir de las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas de la presente invención, o células diferenciadas, inducidas o proliferadas a partir de ellas, y se tratan con transcriptasa inversa para producir los ADNc. Después, las muestras de ADNc resultantes se marcan con etiquetas fluorescentes u otras etiquetas, y después se hibridan a la 10 micromatriz. Como resultado, los genes que son expresados activamente en las células tienen un mayor porcentaje de ADNc marcado total, mientras que los genes que no son expresados significativamente tienen un menor porcentaje. Concretamente, la intensidad de señal fluorescente, que representa una hibridación entre un ADNc marcado y un clon de ADNc o un oligonucleótido en el chip, refleja el nivel de expresión de cada secuencia en el ADNc marcado, y de ese modo permite la cuantificación de la expresión génica. 15
Además, múltiples genes en las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas de la presente invención, o células diferenciadas, inducidas o proliferadas a partir de ellas, se pueden analizar simultáneamente mediante presentación diferencial de ARNm, que implica la PCR de transcripción inversa usando cebadores de PCR degenerados. En primer lugar, se prepara un cebador oligo dT modificado, en el que se ha alterado uno o dos nucleótidos en el término 3’ en la cola de poli A de un ARNm dado. Después, se lleva a cabo una reacción de 20 transcripción inversa usando los ARN totales aislados de las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas de la presente invención, células diferenciadas o proliferadas a partir de ellas, o células de control a usar para la comparación de la expresión (Liang et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21: 3269-3275). Si el nucleótido alterado es una “G”, entonces se pueden amplificar selectivamente los ARNm con una “C” inmediatamente antes de la cola de poli A. Si los polinucleótidos alterados son “CA”, entonces se pueden amplificar selectivamente los ARNm con “TG” 25 inmediatamente antes de la cola de poli A. A continuación, se prepara una secuencia nucleotídica arbitraria de alrededor de 10 nucleótidos de longitud para uso como un segundo cebador, y se lleva a cabo una reacción de amplificación mediante PCR usando el cebador de oligo dT modificado y este segundo cebador. El producto de la amplificación se somete a fraccionamiento por tamaños mediante electroforesis usando un gel de poliacrilamida largo. Usando tales métodos, los ADNc derivados de los ARNm expresados específicamente en las células de la 30 presente invención o en las células de control se pueden detectar como bandas presentes solamente en las muestras que se han sometido a electroforesis. Estos métodos también se pueden usar para analizar la expresión de genes sin identificar.
El análisis de SAGE no requiere un dispositivo especial para la detección, y es uno de los métodos analíticos preferidos para detectar simultáneamente la expresión de un gran número de productos de transcripción. En primer 35 lugar, se extrae ARN de poli A+ a partir de las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas de la presente invención, o de células diferenciadas, inducidas o proliferadas a partir de ellas, usando métodos estándar. A continuación, los ARN se convierten en ADNc usando un cebador biotinilado de oligo (dT), y entonces se tratan con una enzima de restricción que reconoce cuatro bases (enzima de anclaje: AE). Aquí, los fragmentos tratados con la AE contienen un grupo biotina en su término 3’. A continuación, los fragmentos tratados con AE se incuban con 40 estreptoavidina para la unión. El ADNc unido se divide en dos fracciones, y cada fracción se enlaza entonces a un adaptador (enlazador) oligonucleotídico bicatenario diferente A o B. Estos enlazadores están compuestos de: (1) una porción monocatenaria que sobresale que tiene una secuencia complementaria a la secuencia de la porción que sobresale formada por la acción de la enzima de anclaje, (2) una secuencia de reconocimiento nucleotídica en 5’ de la enzima de restricción de tipo IIS (escinde en una localización predeterminada no más de 20 pb lejos del sitio de 45 reconocimiento) que sirve como una enzima etiquetadora (TE), y (3) una secuencia adicional de longitud suficiente para construir un cebador específico de la PCR. Aquí, el ADNc enlazado al enlazador es escindido usando la enzima etiquetadora, y solamente permanece la porción de la secuencia de ADNc enlazada al enlazador, que está presente en forma de una etiqueta de secuencia de hebra corta. A continuación, los conjuntos de etiquetas de secuencia de hebra corta procedentes de los dos tipos diferentes de enlazadores se enlazan entre sí, seguido de la amplificación 50 mediante PCR usando cebadores específicos para los enlazadores A y B. Como resultado, el producto de la amplificación se obtiene como una mezcla que comprende una miríada de secuencias de dos etiquetas de secuencia adyacentes (dietiquetas) unidas a los enlazadores A y B. El producto de la amplificación se trata con la enzima de anclaje, y las porciones de las dietiquetas libres se enlazan a hebras en una reacción de enlazamiento estándar. Entonces, el producto de amplificación se clona. La secuencia nucleotídica determinada por los clones se 55 puede usar para obtener una lectura de dietiquetas consecutivas de longitud constante. La presencia de ARNm que corresponde a cada etiqueta se puede identificar entonces de una vez a partir de la determinación de la secuencia nucleotídica de los clones y la información sobre las etiquetas de secuencia así obtenidas.
La hibridación por sustracción se usa frecuentemente para clonar genes con diferentes niveles de expresión en diversos tejidos o células, y también se puede usar para clonar genes expresados específicamente en las células 60 progenitoras de neuronas dopaminérgicas de la presente invención, o células diferenciadas, inducidas, o proliferadas a partir de ellas. En primer lugar, se prepara una muestra de ADN de una célula a ensayar (aquí en lo sucesivo denominado como “ADN de ensayo”) a partir de las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas de la
presente invención. A continuación, se prepara un ADN de una célula a comparar (aquí en lo sucesivo denominado como “ADN conductor”). Los ADN de ensayo y conductor también se pueden usar de forma intercambiable. En cualquier caso, se detectan genes presentes en el ADN de ensayo pero ausentes del ADN conductor. A continuación, el ADN de ensayo preparado se mezcla con un gran exceso de ADN conductor, se desnaturaliza para formar ADN monocatenario, y después se aparean. Regulando las condiciones de apareamiento, las secuencias 5 específicas ausentes del ADN conductor se pueden aislar como ADN bicatenarios que comprenden solamente la secuencia de ADN de ensayo. Para más detalles sobre este método, véanse Swaroop et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 1954 y Yasunaga et al. (1999) Nature Genet. 21: 363-9.
El método de RDA es un método que usa PCR para amplificar selectivamente una secuencia de un ADN de ensayo que está ausente en un ADN conductor, y se puede usar en la presente invención de forma similar a otros métodos 10 descritos previamente. Para más detalles sobre el procedimiento, véanse Lisitsyn (1995) Trends Genet. 11: 303-7 y Schutte et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 5950-4.
Los genes específicos de las secuencias progenitoras de neuronas dopaminérgicas, o de células diferenciadas, inducidas, o proliferadas a partir de ellas, se detectan y se aíslan como se describió, y se pueden insertar en vectores o similares para la determinación de la secuencia y para el análisis de expresión usando los diversos 15 métodos conocidos descritos anteriormente.
<Identificación usando como índice la maduración de células progenitoras de neuronas dopaminérgicas>
La presente invención proporciona métodos de identificación que comprenden la etapa de poner en contacto sustancias de ensayo con las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas de la presente invención, y la etapa de detectar la diferenciación o proliferación de las células progenitoras que resultan de esa puesta en contacto. 20 Puesto que los compuestos obtenidos mediante este método de identificación demuestran una función reguladora en la diferenciación, proliferación, y similar, de neuronas dopaminérgicas, se consideran útiles como candidatos terapéuticos potenciales para enfermedades causadas por defectos en las neuronas dopaminérgicas. Las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas de la presente invención incluyen células seleccionadas usando las sondas polinucleotídicas o anticuerpos de la presente invención, y células obtenidas mediante la proliferación y/o 25 diferenciación y/o inducción de estas células.
Aquí, la “sustancia de ensayo” puede ser cualquier tipo de compuesto, cuyos ejemplos incluyen los productos de expresión de genotecas, bibliotecas de compuestos de bajo peso molecular sintéticos, bibliotecas de péptidos sintéticos, anticuerpos, sustancias liberadas por bacterias, extractos celulares (microbianos, vegetales, o animales), sobrenadantes de cultivo celular (microbianos, vegetales, o animales), polipéptidos purificados o parcialmente 30 purificados, organismos marinos, extractos vegetales o de animales, suelo, librerías de presentación de péptidos de fago al azar, y similares.
La diferenciación y proliferación celulares se pueden detectar comparando el estado de la célula en ausencia de la sustancia de ensayo. La diferenciación y proliferación celulares se pueden detectar mediante observación morfológica bajo un microscopio, o mediante detección o cuantificación de sustancias producidas en células, tales 35 como dopamina.
<Análisis de la región reguladora de la expresión de Lrp4>
Usando una secuencia del gen de Lrp4, se puede clonar una región reguladora de la expresión de Lrp4 a partir de ADN genómico mediante métodos conocidos. Por ejemplo, se conoce y se puede usar un método para establecer el sitio de inicio transcripcional, tal como el método de cartografiado S1 (Cell Engineering, Supplement 8, New Cell 40 Engineering Experiment Protocol, Cancer Research Division, The Institute of Medical Science, The University of Tokyo ed., Shujunsha Publishing (1993) p. 362-374). En general, la región reguladora de la expresión de un gen se puede clonar mediante identificación de genotecas de ADN genómico, usando los ADN sonda que comprenden un segmento de 15-100 pb, y preferiblemente un segmento de 30-50 pb, del término 5’ del gen (en la presente invención, todos o una porción de nucleótidos de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2). Un clon obtenido de esta manera 45 contiene una región no codificante en 5’ de 10 kpb o más, y es acortado o fragmentado mediante tratamiento con exonucleasas, o similar. Finalmente, la porción de secuencia acortada, que comprende una región reguladora de la expresión potencial, se evalúa para determinar la fuerza, regulación y similar de su expresión usando un gen informador, haciendo posible de ese modo determinar la unidad mínima requerida para mantener la actividad de la región reguladora de la expresión de Lrp4. 50
Las regiones reguladoras de la expresión génica se pueden predecir usando un programa tal como Neural Network (htttp://www.fruitfly.org./seq tools/promoter.html; Reese et al., Biocomputing: Proceedings of the 1996 Pacific Symposium, Hunter and Klein ed., World Scientific Publishing Co., Singapore, (1996)). Además, también se conoce y se puede usar un programa para predecir la unidad mínima requerida para la actividad de una región reguladora de la expresión (http://biosci.cbs.umn.edu./software/proscan/promoterscan. htm; Prestridge (1995) J. Mol. Biol. 249: 55 923-932).
La región reguladora de la expresión del gen de Lrp4 asilada de esta manera se puede usar para producir proteínas de interés específicamente en células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas in vivo.
<Ligando para Lrp4>
Los polipéptidos de Lrp4 tienen un dominio transmembránico, y de este modo se piensa que naturalmente existen embebidos en la membrana celular. Debido a su expresión en células progenitoras de neuronas dopaminérgicas, se cree que Lrp4 está implicada en la regulación de la proliferación de células progenitoras de neuronas dopaminérgicas y en la diferenciación y maduración de las neuronas. De este modo, se pueden usar ligandos 5 potenciales que pueden demostrar una función agonista o antagonista frente a Lrp4 para regular la diferenciación de neuronas dopaminérgicas in vivo, ex vivo, e in vitro. A la hora de identificar ligandos para polipéptidos de Lrp4, en primer lugar se pone en contacto un polipéptido de Lrp4 y un compuesto candidato y se ensaya para determinar la presencia de unión. En este caso, el polipéptido de Lrp4 se puede usar cuando se inmoviliza sobre un soporte, o embebido en la membrana celular. No hay limitaciones particulares sobre los compuestos candidatos, cuyos 10 ejemplos incluyen productos de expresión de genotecas, sustancias naturales derivadas de organismos marinos, extractos de diversos tipos de células, compuestos y péptidos conocidos, sustancias naturales derivadas de plantas, extractos de tejidos corporales, sobrenadantes de cultivo microbiano y grupos peptídicos producidos aleatoriamente mediante el método de presentación de fagos (J. Mol. Biol. 222: 301-10 (1991)). Además, el compuesto candidato se puede marcar para la detección de la unión. 15
<Inhibición de la expresión de Lrp4>
Puesto que la presente invención demuestra claramente que ARNm de Lrp4 es expresado transitoriamente en células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas, Lrp4 puede estar implicada en el control de la proliferación de células progenitoras así como en la diferenciación y maduración de neuronas. De este modo, las sustancias que inhiben la expresión del gen de Lrp4 se pueden usar para controlar la diferenciación de neuronas 20 dopaminérgicas in vivo, ex vivo, e in vitro. Los ejemplos de sustancias capaces de inhibir la expresión génica incluyen ácidos nucleicos antisentido, ribozimas, y ARN bicatenarios (ARN pequeño interferente; ARNip). De este modo, la presente invención proporciona tales ácidos nucleicos antisentido, ribozimas, y ARN bicatenarios.
Los ejemplos de mecanismos antisentido que suprimen la expresión de genes diana incluyen: (1) inhibición del inicio de la transcripción mediante la formación de tríplex, (2) supresión de la transcripción a través de la formación de 25 híbridos en sitios de estructuras de bucles abiertos locales formadas mediante ARN polimerasa, (3) inhibición de la transcripción a través de la formación de híbridos con ARN durante la síntesis, (4) supresión del ayuste mediante formación de híbridos en uniones intrón-exón, (5) supresión del ayuste mediante formación de híbridos en sitios de formación de ayusteosomas, (6) supresión de la migración del ARNm hacia el citoplasma mediante la formación de híbridos con ARNm, (7) supresión del ayuste mediante la formación de híbridos en un sitio de encaperuzamiento o 30 en un sitio de adición de poli A, (8) supresión de la iniciación de la traducción mediante formación de híbridos en sitios de unión de factores de iniciación de la traducción, (9) supresión de la traducción mediante la formación de híbridos en sitios de unión al ribosoma, (10) supresión del alargamiento de la cadena peptídica mediante la formación de híbridos en regiones codificantes de ARNm o en sitios de unión a polisoma, y (11) supresión de la expresión génica mediante la formación de híbridos en sitios de interacción ácido nucleico/proteína (Hirashima e 35 Inoue, “New Biochemistry Experiment Course 2, Nucleic Acids IV, Gene Replication and Expression”, Japanese Biochemical Society edit., Tokyo Kagaku Dozin Publishing, p. 319-347 (1993)).
Un ácido nucleico antisentido de Lrp4 de la presente invención puede ser un ácido nucleico que inhiba la expresión génica mediante cualquiera de los mecanismos descritos en (1) a (11) anteriores. Concretamente, puede contener una secuencia antisentido a no solamente una secuencia de una región codificante, sino también una secuencia de 40 una región no codificante de un gen diana cuya expresión se va a inhibir. Un ADN que codifica un ácido nucleico antisentido se puede usar enlazándolo a una secuencia reguladora adecuada que permita su expresión. El ácido nucleico antisentido no necesita ser completamente complementario a la región codificante o a la región no codificante de un gen diana, en tanto que pueda inhibir eficazmente la expresión de este gen. Tales ácidos nucleicos antisentido tienen una longitud de cadena de al menos 15 pb o más, preferiblemente 100 pb o más, y más 45 preferiblemente 500 pb o más, y normalmente están dentro de 3000 pb, preferiblemente dentro de 2000 pb, y más preferiblemente dentro de 1000 pb. Es preferible que tales ácidos nucleicos antisentido compartan una identidad de 90% o más, y más preferiblemente 95% o más, con la cadena complementaria de un producto de transcripción de un gen diana. Estos ácidos nucleicos antisentido se pueden preparar según los métodos de fosforotionato (Stein (1988) Nucleic Acids Res. 16: 3209-21) o similar, usando polinucleótidos de Lrp4. 50
“Ribozima” es un término genérico que se refiere a catalizadores con un componente de ARN, y las ribozimas se clasifican ampliamente en ribozimas grandes y ribozimas pequeñas. Los ribozimas grandes escinden los enlaces de éster de fosfato de un ácido nucleico, y tras la reacción, dejan el grupo ácido fosfórico en 5’ y el grupo hidroxilo en 3’ en los sitios de reacción. Las ribozimas grandes se clasifican además en (1) ARN intrónicos del grupo I, que llevan a cabo reacciones de transesterificación iniciadas por guanosina en sitios de ayuste en 5’, (2) ARN intrónicos del 55 grupo II, que realizan reacciones de autoayuste en dos etapas vía una estructura de lazo, y (3) componentes de ARN de ribonucleasa P, que escinden los ARNt precursores en su lado 5’ vía reacciones de hidrólisis. Por el contrario, las ribozimas pequeñas son unidades estructurales comparativamente pequeñas (alrededor de 40 pb) que escinden los ARN, formando grupos hidroxilo en 5’ y ácidos fosfóricos cíclicos en 2’-3’. Las ribozimas pequeñas incluyen, por ejemplo, ribozimas de tipo cabeza de martillo (Koizumi et al. (1988) FEBS Lett. 228: 225) y ribozimas 60 de tipo horquilla de pelo (Buzayan (1986) Nature 323: 349; Kikuchi y Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19: 6751;
Kikuchi (1992) Chemistry and Biology 30: 112). Puesto que las ribozimas se alteran y sintetizan fácilmente, se conocen diversos métodos para su modificación. Por ejemplo, las ribozimas de tipo cabeza de martillo, que reconocen y escinden secuencias nucleotídicas UC, UU, o UA en un ARN diana, se pueden crear diseñando la porción de unión al sustrato de una ribozima para que sea complementaria a una secuencia de ARN próxima al sitio diana (Koizumi et al. (1988) FEBS Lett. 228: 225; M. Koizumi y E. Ohtsuka (1990) Protein, Nucleic Acid and Enzyme 5 35: 2191; Koizumi et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7059). Las ribozimas de tipo horquilla de pelo también se pueden diseñar y producir usando métodos conocidos (Kikuchi y Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19: 6751; Kikuchi (1992) Chemistry and Biology 30: 112).
Los ácidos nucleicos antisentido y las ribozimas de la presente invención también se pueden usar en vectores víricos derivados de retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, y similares, o vectores no víricos que usan 10 liposomas, o ADN desnudos, para controlar la expresión génica en células usando terapia génica ex vivo o in vivo.
La interferencia mediante ARN es un fenómeno en el que la introducción de un ARN bicatenario artificial en las células hace que los ARN tengan la misma secuencia nucleotídica a degradar (Fire et al. (1998) Nature 391: 806-11). No hay limitaciones particulares sobre los ARNip de la presente invención, con tal de que inhiban la transcripción de ARNm de Lrp4. Normalmente, un ARNip es una combinación de una cadena sentido y antisentido a 15 la secuencia de un ARNm diana, y tiene una longitud nucleotídica de al menos 10 hasta el mismo número de nucleótidos que el ARNm diana. Estos ARNip tienen preferiblemente una longitud nucleotídica de 15 a 75, preferiblemente 18 a 50, y más preferiblemente 20 a 25 nucleótidos.
A fin de suprimir la expresión de Lrp4, se pueden introducir ARNip en las células usando métodos conocidos. Por ejemplo, se diseña un ADN para codificar, en una sola hebra, dos cadenas de ARN que componen un ARNip, y éste 20 se incorpora entonces en un vector de expresión, las células se transforman con el vector de expresión, y el ARNip se puede expresar en las células en forma de un ARN bicatenario con una estructura de horquilla de pelo. También se han diseñado mediante transfección vectores de expresión de plásmidos que producen continuamente ARNip (por ejemplo, RNAi-Ready pSIREN Vector, y RNAi-Ready pSIREN-RetroQ Vector (BD Biosciences Clontech)).
La secuencia nucleotídica de un ARNip se puede diseñar usando un programa de ordenador tal como el descrito en 25 el sitio web de Ambion (http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html). También existen comercialmente y se pueden usar kits para identificar ARNip funcionales (por ejemplo, BD Knockout RNAi System (BD Biosciences Clontech).
Ejemplos
La presente invención se describirá específicamente usando los Ejemplos, pero no se han de interpretar como 30 limitantes de ella.
[Ejemplo 1] Aislamiento y análisis de secuencia de un gen específico de células progenitoras de neuronas dopaminérgicas
Para aislar genes específicos de células progenitoras de neuronas dopaminérgicas, se cortó adicionalmente la región ventral del mesencéfalo de ratones E12.5 en dos regiones en la dirección dorsoventral, y los genes 35 expresados específicamente en la región más ventral que contiene neuronas dopaminérgicas se identificaron mediante el método de sustracción (N-RDA). Uno de los fragmentos de ADNc aislados fue un fragmento que codifica Lrp4/Corina. Lrp4 codifica proteínas transmembránicas de tipo II (Fig. 1).
(1) Método de N-RDA
(1)-1. Preparación del adaptador 40
Los siguientes oligonucleótidos se aparearon entre sí, y se prepararon a 100 M. (ad2: ad2S+ad2A, ad3: ad3S+ad3A, ad4: ad4S+ad4A, ad5: ad5S+ad5A, ad13: ad13S+ad13A)
ad2S: cagctccacaacctacatcattccgt (SEC ID NO: 5)
ad2A: acggaatgatgt (SEC ID NO: 6)
ad3S: gtccatcttctctctgagactctggt (SEC ID NO: 7) 45
ad3A: accagagtctca (SEC ID NO: 8)
ad4S: ctgatgggtgtcttctgtgagtgtgt (SEC ID NO: 9)
ad4A: acacactcacag (SEC ID NO: 10)
ad5S: ccagcatcgagaatcagtgtgacagt (SEC ID NO: 11)
ad5A: actgtcacactg (SEC ID NO: 12) 50
ad13S: gtcgatgaacttcgactgtcgatcgt (SEC ID NO: 13)
ad13A: acgatcgacagt (SEC ID NO: 14)
(1)-2. Síntesis de ADNc
Se cortaron regiones de mesencéfalo ventrales de embriones de ratón E12.5 (Japan SLC), y se dividieron en dos secciones en la región dorsoventral. Se preparó ARN total usando el RNeasy Mini Kit (Qiagen), y el ADNc 5 bicatenario se sintetizó usando un kit de síntesis de ADNc (Takara). Tras la digestión con la enzima de restricción RsaI, se añadió ad2. El ADNc se amplificó mediante una incubación durante 5 minutos a 72ºC, 15 ciclos de PCR de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 65ºC y 2 minutos a 72ºC, y una incubación final durante 2 minutos a 72ºC, usando ad2S como el cebador. En todos los casos, se llevó a cabo la PCR de N-RDA usando una disolución de reacción que contiene los siguientes componentes. 10
10x ExTaq 5 l
dNTP 2,5 mM 4 l
ExTaq 0,25 l
cebador 100 M 0,5 l
ADNc 2 l 15
Agua destilada 38,25 l
(1)-3 Producción del conductor
El ADNc amplificado mediante ad2S se amplificó adicionalmente incubando a 94ºC durante 2 minutos, y realizando entonces cinco ciclos de PCR de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 65ºC y 2 minutos a 72ºC, y una incubación final durante 2 minutos a 72ºC. El ADNc se purificó usando el kit de purificación mediante PCR Qiaquick (Qiagen), y 20 se digirió con RsaI. Para cada ronda de sustracción se usaron 3 g.
(1)-4. Producción de ensayador
El ADNc amplificado mediante ad2S se amplificó adicionalmente incubando a 94ºC durante 2 minutos, y realizando entonces ciclos de PCR de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 65ºC, y 2 minutos a 72ºC, y una incubación final durante 2 minutos a 72ºC. El ADNc se purificó usando el kit de purificación mediante PCR Qiaquick (Qiagen), y se 25 digirió con RsaI. Se añadió ad3 a 60 ng del ADNc digerido con RsaI.
(1)-5. Primera ronda de sustracción
El ensayador y el conductor producidos en las Secciones 1-3 y 1-4 anteriores se mezclaron, se sometieron a precipitación con etanol, y entonces se disolvieron en 1 l de 1x tampón de PCR. Después de una incubación durante 5 minutos a 98ºC, se añadió 1 l de 1x tampón de PCR + 1M de NaCl. Después de otros 5 minutos de 30 incubación a 98ºC, el ensayador y el conductor se hibridaron a 68ºC durante 16 horas.
Con ad3S como cebador, el ADNc hibridado se amplificó incubando a 72ºC durante 5 minutos, y realizando diez ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 65ºC, y 2 minutos a 72ºC. A continuación, el ADNc amplificado se digirió con nucleasa de judía mungo (Takara) y se purificó usando un kit de purificación mediante PCR Qiaquick. Después, se amplificó incubando a 94ºC durante 2 minutos, y realizando 13 ciclos de PCR de 30 segundos a 94ºC, 35 30 segundos a 65ºC, y 2 minutos a 72ºC, y una incubación final durante 2 minutos a 72ºC.
(1)-6. Normalización
Se añadió 1 l de 2x tampón de PCR a 8 ng del ADNc amplificado en la primera ronda de sustracción. Tras incubar a 98ºC durante 5 minutos, se añadieron 2 l de 1x tampón de PCR + 1 M de NaCl. Después de otros 5 minutos de incubación a 98ºC, el ADNc se hibridó a 68ºC durante 16 horas. 40
El ADNc hibridado se digirió con RsaI, y se purificó usando el kit de purificación mediante PCR Qiaquick. Después, se amplificó con ad3S como cebador incubando a 94ºC durante 2 minutos, y realizando 11 ciclos de PCR de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 65ºC, y 2 minutos a 72ºC, y una incubación final durante 2 minutos a 72ºC. El producto de la PCR se digirió entonces con RsaI, seguido de la adición de ad4.
(1)-7. Segunda ronda de sustracción 45
20 ng del ADNc al que se añadió ad4 en la Sección 1-6 anterior se usaron como el ensayador, y se mezclaron con el conductor de 1-3 anterior, y se realizó el mismo procedimiento de sustracción usado en la Sección 1-5 anterior. Finalmente, se añadió ad5 al ADNc, seguido de la digestión con RsaI.
(1)-8. Tercera ronda de sustracción
2 ng del ADNc al que se añadió ad5 en la sección 1-7 anterior se usaron como el ensayador, y se mezclaron con el conductor de 1-3 anterior, y se llevó a cabo el mismo procedimiento de sustracción usado en la sección 1-5 anterior. Finalmente, se añadió ad13 al ADNc digerido con RsaI.
(1)-9. Cuarta ronda de sustracción 5
2 ng del ADNc al que se añadió ad13 en la Sección 1-8 anterior se usaron como el ensayador, y se mezclaron con el conductor de 1-3 anterior, y se llevó a cabo el mismo procedimiento de sustracción usado en la Sección 1-5 anterior. El ADNc amplificado se clonó en el vector pCRII (Invitrogen), y su secuencia nucleotídica se analizó usando el analizador de secuencia ABI3100.
[Ejemplo 2] Análisis de la expresión del gen de Lrp4 10
A continuación, se llevó a cabo un análisis de la expresión del gen de Lrp4 mediante hibridación in situ según el siguiente protocolo.
En primer lugar, embriones de ratón E12.5 se embebieron en O.C.T., y se prepararon secciones congeladas recientes de 16 m de grosor. Tras secar sobre un portaobjetos, las secciones se fijaron en PFA al 4% a temperatura ambiente durante 30 minutos. Tras lavar con PBS, se llevó a cabo la hibridación a 65ºC durante 40 15 horas (1 g/ml de sonda de ARN marcada con DIG, 50% de formamida, 5x SSC, 1% de SDS, 50 g/ml de ARN de levadura, 50 g/ml de heparina). Subsiguientemente, las secciones se lavaron a 65ºC (50% de formamida, 5x SSC, 1% de SDS) y se trataron entonces con ARNasa (5 g/ml de ARNasa) a temperatura ambiente durante 5 minutos. Tras lavar con 0,2x SSC a 65ºC y lavar con 1x TBST a temperatura ambiente, se llevó a cabo el bloqueo (reactivo de bloqueo: Roche). Las secciones se hicieron reaccionar entonces con anticuerpo anti-DIG marcado con fosfatasa 20 alcalina (DAKO), se lavaron (1x TBST, 2 mM de levamisol), y el color se desarrolló usando como sustrato NBT/BCIP (DAKO).
El análisis de la expresión mediante hibridación in situ mostró que ARNm de Lrp4 es expresado específicamente en la región del mesencéfalo ventral desde el mesencéfalo hasta el rombencéfalo y la médula espinal en la etapa E12.5, que corresponde al momento del desarrollo de las neuronas dopaminérgicas. Lrp4 demuestra un patrón de 25 expresión similar a ARNm de Shh desde el rombencéfalo hasta la médula espinal, y se determinó claramente que es específica del suelo del tubo neural, que es la región organizadora (Figs. 2 y 5). En el mesencéfalo, la expresión de Lrp4 se observó de forma más central que la zona de expresión de ARNm de Shh (Figs. 3 y 5).
Los resultados de la comparación con el marcador de la maduración de neuronas ARNm de NCAM muestran que las células que expresan ARNm de Lrp4 fueron células progenitoras proliferativas en la zona ventricular (VZ) 30 negativa para ARNm de NCAM. Además, cuando se compara con la expresión del marcador de neuronas dopaminérgicas, ARNm de TH, sus regiones de expresión solaparon completamente a lo largo del eje dorsal-ventral (Figs. 3 y 5), aunque no se observó expresión tanto de ARNm de TH como de ARNm de Lrp4 en las mismas células, puesto que ARNm de TH solamente se expresa en la capa del manto (ML). En general, se sabe que las neuronas presentes en los tubos neurales proliferan primero en la VZ, salen del ciclo celular con el comienzo de la 35 diferenciación, y después maduran tras migrar a la ML exterior. De este modo, se cree que las células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas proliferan en la VZ que forra la zona de expresión de TH, y expresan ARNm de TH tras haber migrado hacia el exterior después de salir del ciclo celular. Concretamente, se cree que ARNm de Lrp4 es expresado específicamente en el mesencéfalo en células progenitoras de neuronas dopaminérgicas (Figs. 4 y 6). 40
[Ejemplo 3] Expresión de Lrp4 en neuronas dopaminérgicas inducidas para que se diferencien a partir de células ES no humanas
A continuación, se examinó si Lrp4 es expresada en células ES no humanas que han sido inducidas para que se diferencien en neuronas dopaminérgicas in vitro.
En primer lugar, las neuronas dopaminérgicas fueron inducidas para que se diferenciasen a partir de células ES no 45 humanas usando el método SDIA (Kawasaki et al. (2000) Neuron 28(1): 31-40) (véase la parte superior de la Fig. 7). Las células se recuperaron 4, 6, 8, 10, y 12 días tras la inducción, y el ARN total se recuperó usando el RNeasy Mini Kit (Qiagen) seguido de RT-PCR. En RT-PCR, inicialmente se sintetizó ADNc para 1 g de ARN total usando el Kit de PCR de ARN (TaKaRa). Entonces se llevó a cabo la PCR en el siguiente sistema de reacción, usando como molde ADNc equivalente a 10 ng, 1 ng, y 0,1 ng. 50
10x ExTaq
2 l
dNTP 2,5 mM
1,6 l
ExTaq
0,1 l
cebador 100 M
0,2 l cada uno
ADNc
1 l
Agua destilada
14,9 l
Tras incubar durante 2 minutos a 94ºC, se llevaron a cabo 35 ciclos de PCR de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 65ºC, y 2 minutos a 72ºC, seguido de la incubación durante 2 minutos a 72ºC.
Las secuencias de los cebadores usados se muestran a continuación.
Lrp4:
TAGTCTACCACTGCTCGACTGTAACG (SEC ID NO: 15)/
CAGAGTGAACCCAGTGGACATATCTG (SEC ID NO: 16)
TH:
GTTCCCAAGGAAAGTGTCAGAGTTGG (SEC ID NO: 17)/
GAAGCTGGAAAGCCTCCAGGTGTTCC (SEC ID NO: 18)
DAT:
CTCCGAGCAGACACCATGACCTTAGC (SEC ID NO: 19)/
AGGAGTAGGGCTTGTCTCCCAACCTG (SEC ID NO: 20)
Según los resultados del análisis de expresión mediante RT-PCR, aunque Lrp4 no es expresada en células ES (CCE) o células estrómicas (PA6), se indujo claramente la expresión a partir del día 4 de la misma manera que TH 5 como resultado de la inducción de la diferenciación (Fig. 8). De este modo, las sondas polinucleotídicas marcadoras de la presente invención son útiles como marcadores no solamente cuando se aíslan células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas a partir del mesencéfalo fetal, sino también cuando se aíslan células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas que han sido inducidas para que se diferencien a partir de células ES in vitro. 10
[Ejemplo 4] Análisis de la expresión de la proteína Lrp4
El anticuerpo anti-Lrp4 se produjo mediante el protocolo descrito más abajo usando la secuencia codificante de la región extracelular en el gen de Lrp4, y se llevaron a cabo los análisis de la expresión usando tinción inmunohistológica.
En primer lugar, la región extracelular (161 a 502 aminoácidos) que codifica la secuencia en el gen de Lrp4 se 15 introdujo en células 293E, y la región extracelular de la proteína Lrp4 se expresó y se recogió. Se inmunizaron hámsters con la proteína recogida, y se les retiraron los linfocitos y se fusionaron con células de mieloma. Las células fusionadas se cultivaron para obtener un sobrenadante de cultivo. En el día 12,5, los embriones de ratón se fijaron entonces con PFA al 4%/PBS(-) a 4ºC durante dos horas, después la disolución se sustituyó por sacarosa al 20%/PBS(-) a 4ºC toda la noche, y los embriones se embebieron con OTC. Se obtuvieron secciones de 12 m de 20 grosor, se fijaron sobre un portaobjetos de vidrio, se secaron a temperatura ambiente durante 30 minutos, y se humedecieron nuevamente con PBS(-). Las secciones se bloquearon (10% de suero de burro normal y 10% de suero de cabra normal/Block Ace) a temperatura ambiente durante 20 minutos, y después se hicieron reaccionar con el anticuerpo monoclonal anti-Lrp4 producido como se describió anteriormente (mezcla de FERM BP-10315 y FERM BP-10316 [cada uno de los sobrenadantes de cultivo diluidos 1/4, 10% de suero de burro normal, 10% de suero de 25 cabra normal, y 2,5% de Block Ace/PBS]) y el anticuerpo anti-TH (Chemicon, 0,7 g/ml, 10% de suero de burro normal, 10% de suero de cabra normal, y 2,5% de Block Ace/PBS) a temperatura ambiente durante una hora, y se hicieron reaccionar adicionalmente a 4ºC toda la noche. Las secciones se lavaron cuatro veces con 0,1% de Triton X-100/PBS(-) a temperatura ambiente durante 10 minutos. El anticuerpo anti-IgG de hámster marcado con Cy3 o el anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con FITC (Jackson, 10 g/ml, 10% de suero de burro normal, 10% de suero de 30 cabra normal, y 2,5% de Block Ace/PBS) se hizo reaccionar con las secciones a temperatura ambiente durante una hora. Después, las secciones se lavaron como se describió anteriormente, después se lavaron con PBS(-) a temperatura ambiente durante 10 minutos, y se sellaron.
Como resultado del análisis de la expresión mediante tinción inmunohistológica usando el anticuerpo monoclonal anti-Lrp4 producido, se observó expresión de la proteína Lrp4 en el mesencéfalo ventral a E12.5, la etapa cuando se 35 desarrollaron las neuronas dopaminérgicas (Fig. 8) como se muestra mediante el análisis de la expresión usando hibridación in situ. En comparación con la expresión de la proteína TH, que fue el marcador de las neuronas dopaminérgicas, la proteína Lrp4 se expresó en el mesencéfalo más ventral (lado VZ), en el que se expresó la
proteína TH. En consecuencia, parece que la proteína Lrp4 se expresa en las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas.
A continuación, usando el anticuerpo monoclonal anti-Lrp4, se detectaron células que expresan Lrp4 mediante citometría de flujo.
En primer lugar, las células ES no humanas se indujeron para que se diferenciaran hasta células progenitoras de 5 neuronas dopaminérgicas in vitro usando el método SDIA. Se dispersó una población celular que comprende las células usando un tampón de disociación celular (Invitrogen), y se tiñó con el anticuerpo monoclonal anti-Lrp4 (mezcla de FERM BP-10315 y FERM BP-10316 [cada sobrenadante de cultivo diluido 1/4, 1% de suero fetal de ternera, y 1 mM de EDTA/medio de diferenciación SDIA]) a 4ºC durante 20 minutos sin fijación ni permeabilización. Subsiguientemente, las células se lavaron tres veces con 1% de suero fetal de ternera y 1 mM de EDTA/medio de 10 diferenciación SDIA a 4ºC durante 3 minutos. Las células se tiñeron con anticuerpo anti-IgG de hámster marcado con biotina (Jackson, 10 g/ml, 1% de suero fetal de ternera y 1 mM de EDTA/medio de diferenciación SDIA) a 4ºC durante 20 minutos, y se lavaron como se describió anteriormente. Después, las células se tiñeron con estreptavidina marcada con PE (Pharmingen, 20 g/ml, 1% de suero fetal de ternera y 1 mM de EDTA/medio de diferenciación SDIA) a 4ºC durante 20 minutos, y se lavaron como se describió anteriormente. Tras la tinción, las 15 células que expresan Lrp4 se detectaron mediante citometría de flujo.
Los resultados de la detección de las células que expresan Lrp4 mediante citometría de flujo usando el anticuerpo monoclonal anti-Lrp4 producido detectaron una población que expresa la proteína Lrp4 (Fig. 9). Puesto que las células que expresan la proteína Lrp4 se pudieron detectar sin fijación ni permeabilización, parece que las células vivas que expresan la proteína Lrp4 se pueden separar usando un citómetro de flujo equipado con un clasificador de 20 células. Se piensa que la proteína Lrp4 es expresada en las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas, y de este modo parece que el anticuerpo anti-Lrp4 es útil para la separación de las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas.
[Ejemplo 5] Separación de células que expresan Lrp4 mediante anticuerpos
Se caracterizaron las células positivas para la proteína Lrp4 separadas usando el anticuerpo anti-Lrp4. 25
En primer lugar, una población celular que comprende mesencéfalo ventral de feto de ratón E12.5 y células progenitoras de neuronas dopaminérgicas, inducidas in vitro para que se diferenciasen a partir de células ES mediante el método SDIA, se tiñó con el anticuerpo anti-Lrp4 mediante el método descrito en el Ejemplo 4. Las células positivas y negativas para Lrp4 se separaron usando un clasificador de células. El ARN total se recogió de las células inmediatamente tras la separación usando un RNeasy mini kit (Qiagen). Después, se sintetizó ADNc, y se 30 amplificó mediante el mismo método como se describe en el Ejemplo 1 para uso como un molde en RT-PCR. La PCR se realizó usando los ADNc correspondientes al ADNc amplificado equivalente a 4 ng, 0,4 ng, y 0,04 ng, mediante el siguiente sistema de reacción.
10 x ExTaq
1 l
dNTP 2,5 mM
0,8 l
ExTaq
0,05 l
cebadores 100 M
0,1 l cada uno
ADNc
1 l
Agua destilada
6,95 l
La PCR se llevó a cabo en condiciones de 94ºC durante 2 minutos, 26 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 65ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 2 minutos, y finalmente 72ºC durante 2 minutos. 35
Las secuencias de los cebadores usados se muestran a continuación.
Lrp4:
TAGTCTACCACTGCTCGACTGTAACG (SEC ID NO: 15)/
CAGAGTGAACCCAGTGGACATATCTG (SEC ID NO: 16)
TH:
GTTCCCAAGGAAAGTGTCAGAGTTGG (SEC ID NO: 17)/
GAAGCTGGAAAGCCTCCAGGTGTTCC (SEC ID NO: 18)
Nurr1:
CACTCCTGTGTCTAGCTGCCAGATGC (SEC ID NO: 21)/
AGTGCGAACACCGTAGTGCTGACAGG (SEC ID NO: 22)
Nestina:
GATGAAGAAGAAGGAGCAGAGTCAGG (SEC ID NO: 23)/
ATTCACTTGCTCTGACTCCAGGTTGG (SEC ID NO:24)
MAP2:
CCATGATCTTTCCCCTCTGGCTTCTG (SEC ID NO: 25)/
TTTGGCTGGAAAGGGTGACTCTGAGG (SEC ID NO: 26)
Como se esperaba, los resultados del análisis de la expresión mediante RT-PCR indicaron la expresión del marcador de células progenitoras proliferativas Nestina. También se reveló que las células que expresan MAP2, que fue el marcador de neuronas postmitóticas, estaban incluidas en la población de células positivas para la proteína Lrp4 (Fig. 10). Por lo tanto, se encontró que la expresión de la proteína Lrp4 se mantiene después de detener la expresión de ARNm, y que la proteína Lrp4 es útil como un marcador para separar no solamente células 5 progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas sino también células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas (Fig. 11). Además, puesto que Nurr1 y TH, que son marcadores para células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas, se expresaron en mayores niveles en comparación con la población de células negativas para Lrp4, se confirmó que las células positivas para Lrp4 son células progenitoras de la estirpe de neuronas dopaminérgicas (Fig. 10). 10
A continuación, los presentes inventores analizaron la relación de células progenitoras proliferativas a células precursoras postmitóticas en la población de células positivas para la proteína Lrp4 separadas mediante el anticuerpo anti-Lrp4.
Las células separadas se sembraron sobre un portaobjetos de vidrio revestido con poli-L-ornitina (Sigma, 0,002% en PBS), laminina (Invitrogen, 5 g/ml en PBS), y fibronectina (Sigma, 5 g/ml en PBS), y se incubaron en N2 15 (Invitrogen, 1x), B27 (Invitrogen 1x), ácido ascórbico (Sigma, 200 M), y BDNF (Invitrogen, 20 ng/ml)/medio de diferenciación SDIA a 37ºC durante 40 minutos para que se adhirieran sobre él. Las células adherentes se fijaron en PFA al 4%/PBS a 4ºC durante 20 minutos, y se lavaron dos veces con PBS a 4ºC durante 10 minutos. La permeabilización con 0,3% de Triton X-100/PBS se realizó a temperatura ambiente durante 15 minutos, y el bloqueo con 10% de suero de burro normal/Block Ace realizó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después, las 20 células se hicieron reaccionar con anticuerpo anti-Nestina (Chemicon, 2 g/ml, 10% de suero de burro normal, 2,5% de Block Ace, 0,1% de Triton X-100/PBS) o anticuerpo anti-III-tubulina (BABCO, 1/2000, 0,5 g/ml, 10% de suero de burro normal, 2,5% de Block Ace, y 0,1% de Triton X-100/PBS) a temperatura ambiente durante una hora, y subsiguientemente a 4ºC toda la noche. Al día siguiente, las células se lavaron tres veces con 0,1% de Triton X-100/PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos, y se hicieron reaccionar con el anticuerpo anti-IgG de ratón 25 marcado con FITC o con el anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con Cy5 (ambos de Jackson, 10 g/ml, 10% de suero de burro normal, 2,5% de Block Ace, y 0,1% de Triton X-100/PBS) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Subsiguientemente, las células se lavaron como se describió anteriormente, después se lavaron con PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos, y se sellaron para la observación.
También, las células separadas se sembraron de forma similar sobre un portaobjetos de vidrio, y se cultivaron en el 30 medio descrito anteriormente suplementado con BrdU (Roche, 5-Bromo-2’-deoxy-uridine Labeling and Detection kit II, 1x) a 37ºC durante 18 horas. Después, se llevaron a cabo de forma similar los procedimientos descritos anteriormente hasta la etapa de bloqueo. Las células se hicieron reaccionar en HCl 2 N a 37ºC durante 20 minutos, se lavaron tres veces con PBS, y después se hicieron reaccionar con anticuerpo anti-BrdU y ADNasa (Roche, 5-Bromo-2’-deoxy-uridine Labeling and Detection kit II, 1 x conc. en tampón de incubación) a 37ºC durante 30 minutos. 35 Además, las células se hicieron reaccionar con anticuerpo anti-BrdU (Sigma, 44 g/ml, 10% de suero de burro normal, 2,5% de Block Ace, y 0,1% de Triton X-100/PBS a temperatura ambiente durante una hora, y subsiguientemente a 4ºC toda la noche. Al día siguiente, las células se lavaron tres veces con 0,1% de Triton X-100/PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos, y después se hicieron reaccionar con el anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con FITC (Jackson, 10 g/ml, 10% de suero de burro normal, 2,5% de Block Ace, y 0,1% de Triton X-40 100/PBS) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Subsiguientemente, las células se lavaron, y se sellaron para la observación, como se describió anteriormente.
Como resultado de la tinción con el marcador, se reveló que una mayoría de las células positivas para Lrp4 son células progenitoras proliferativas positivas para Nestina, y que una parte de las mismas es positiva par el marcador postmitótico III-tubulina (Fig. 12). Además, se confirmó que las células separadas incorporan frecuentemente BrdU, 45 y proliferan realmente in vitro (Fig. 13).
A continuación, se confirmó que las células separadas positivas para Lrp4 se diferencian en las neuronas dopaminérgicas.
Las células separadas se sembraron en un portaobjetos de vidrio revestido con poli-L-ornitina (Sigma, 0,002% en PBS), laminina (Invitrogen, 5 g/ml en PBS), y fibronectina (Sigma, 5 g/ml en PBS), y se incubaron en N2 (Invitrogen, 1x), B27 (Invitrogen 1x), ácido ascórbico (Sigma, 200 M), BDNF (Invitrogen, 20 ng/ml), y bFGF (R&D, 5 10 ng/ml)/medio de diferenciación SDIA a 37ºC durante 24 horas. Las células se cultivaron entonces adicionalmente en el medio anterior sin bFGF durante otros seis días. Las células cultivadas se fijaron en PFA al 4%/PBS a 4ºC durante 20 minutos, y se lavaron dos veces con PBS a 4ºC durante 10 minutos. La permeabilización con 0,3% de Triton X-100/PBS se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 15 minutos, y se realizó el bloqueo con 10% de suero de burro normal/Block Ace a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después, las células se hicieron 10 reaccionar con anticuerpo anti-TH (Chemicon, 0,3 g/ml, 10% de suero de burro normal, 2,5% de Block Ace/PBS, 0,1% de Triton X-100/PBS) o con anticuerpo anti-III-tubulina (BABCO, 1/2000, 0,5 g/ml, 10% de suero de burro normal, 2,5% de Block Ace/PBS, 0,1% de Triton X-100/PBS) a temperatura ambiente durante una hora, y subsiguientemente a 4ºC toda la noche. Al día siguiente, las células se lavaron tres veces con 0,1% de Triton X-100/PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos, y se hicieron reaccionar con el anticuerpo anti-IgG de ratón 15 marcado con FITC o con el anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con Cy5 (ambos de Jackson, 10 g/ml, 10% de suero de burro normal, 2,5% de Block Ace, y 0,1% de Triton X-100/PBS) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Subsiguientemente, las células se lavaron como se describió anteriormente, después se lavaron con PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos, y se sellaron para la observación.
Como resultado del cultivo de las células separadas in vitro, fue obvio que se indujeron más neuronas 20 dopaminérgicas positivas para la proteína TH que con las células de control no separadas. Por lo tanto, se reveló que las células positivas para Lrp4 son ciertamente células progenitoras de la estirpe de neuronas dopaminérgicas, y pueden madurar in vitro (Fig. 14).
[Ejemplo 6] Transplante de células separadas positivas para Lrp4 en el estriado en ratones del modelo de enfermedad de Parkinson 25
Las células que expresan Lrp4 se separaron mediante citometría de flujo usando anticuerpo monoclonal anti-Lrp4, y las células se transplantaron en el estriado de ratones del modelo de la enfermedad de Parkinson.
En primer lugar, células ES no humanas se indujeron para que se diferenciasen hasta células progenitoras de neuronas dopaminérgicas in vitro usando el método SDIA. Una población celular que comprende las células se dispersó usando un tampón de disociación celular (Invitrogen), y se tiñó con el anticuerpo monoclonal anti-Lrp4 30 preparado en el Ejemplo 4 (mezcla de FERM BP-10315 y FERM BP-10316 [cada sobrenadante de cultivo diluido 1/4, 1% de suero fetal de ternera, 1 mM de EDTA/medio de diferenciación SDIA]) a 4ºC durante 20 minutos sin fijación ni permeabilización. Subsiguientemente, las células se lavaron tres veces con 1% de suero fetal de ternera y 1 mM de EDTA/medio de diferenciación SDIA a 4ºC durante 3 minutos. Las células se tiñeron con anticuerpo anti-IgG de hámster marcado con biotina (Jackson, 10 g/ml, 1% de suero fetal de ternera y 1 mM de EDTA/medio de 35 diferenciación SDIA) a 4ºC durante 20 minutos, y se lavaron como se describió anteriormente. Después, las células se tiñeron con estreptavidina marcada con PE (Pharmingen, 20 g/ml, 1% de suero fetal de ternera y 1 mM de EDTA/medio de diferenciación SDIA) a 4ºC durante 20 minutos, y se lavaron como se describió anteriormente. Tras la tinción, las células que expresan Lrp4 se separaron mediante un citómetro de flujo.
A continuación, se transplantaron las células separadas positivas para la proteína Lrp4 en el estriado de ratones del 40 modelo de la enfermedad de Parkinson, y se caracterizaron en el cerebro las células positivas para la proteína Lrp4.
En primer lugar, los ratones del modelo de enfermedad de Parkinson se prepararon inyectando 1,25 l de 6-OHDA (Sigma, 2 g/l) en un lado del haz prosencefálico medial de ratones de 12 semanas (sic) para entorpecer las neuronas dopaminérgicas que se proyectan desde el mesencéfalo hacia el estriado. Dos semanas después de preparar los ratones del modelo, se transplantaron 3 x 104 células positivas para Lrp4 por ratón en el estriado, al que 45 se había inyectado 6-OHDA. Las células a transplantar positivas para la proteína Lrp4 se obtuvieron: transfectando células ES no humanas para que expresen el gen de EGFP bajo el control del promotor CAG (Niwa et al., Gene 108:193-200 (1991)); induciendo a las células ES para que se diferencien en las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas in vitro mediante el método SDIA; y tiñendo la población celular que comprende las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas con el anticuerpo anti-Lrp4 como se describe en el Ejemplo 4, y 50 separándola mediante el clasificador de células.
Tres semanas después del transplante, se inyectaron intraperitonealmente 500 l de uretano al 10% en disolución salina, para anestesiar los ratones. Bajo anestesia, se realizó la toracotomía, se inyectaron 30 ml de disolución salina (Otsuka) desde el ventrículo izquierdo para perfusión, y después se llevó a cabo la fijación de la perfusión con 30 mL de PFA al 4%/PBS(-). Tras la fijación, los cerebros se retiraron, y se fijaron adicionalmente por inmersión en 55 PFA al 4%/PBS(-) durante otras ocho horas. Los cerebros se rebanaron entonces a un grosor de 2 mm, la disolución se sustituyó por 20 a 40% de sacarosa/PBS(-) toda la noche, y los cerebros se embebieron en OCT. Se realizaron secciones de 10 a 12 m de grosor, se fijaron sobre portaobjetos de vidrio, se secaron a temperatura ambiente durante 30 minutos, y se humedecieron nuevamente con PBS(-). Entonces se realizó el bloqueo (10% de suero de
burro normal/Block Ace) a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las secciones se hicieron reaccionar entonces con anticuerpo anti-GFP (Molecular probes, 20 g/ml, 10% de suero de burro normal, y 10% de Block Ace/PBS), anticuerpo anti-MAP2 (Sigma, ascitis de ratón, diluido 100 veces, 10% de suero de burro normal, y 10% de Block Ace/PBS) o anticuerpo anti-TH (Chemicon, 1 g/ml, 10% de suero de burro normal, y 10% de Block Ace/PBS) a temperatura ambiente durante una hora, y nuevamente a 4ºC toda la noche. Las secciones se lavaron cuatro veces 5 con 0,1% de Triton X-100/PBS(-) a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las secciones se hicieron reaccionar entonces con anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con Alexa Flour 488 (Molecular Probes, 4 g/ml, 10% de suero de burro normal, y 10% de Block Ace/PBS), con anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con Cy3 (Jackson, 10 g/ml, 10% de suero de burro normal, y 10% de Block Ace/PBS), o con anticuerpo anti-IgG de oveja marcado con Cy5 (Jackson, 10 g/ml, 10% de suero de burro normal, y 10% de Block Ace/PBS) a temperatura ambiente durante una 10 hora. Después, las secciones se lavaron como se describió anteriormente, se lavaron con PBS(-) a temperatura ambiente durante 10 minutos, y se sellaron.
La expresión de los diversos marcadores se analizó mediante tinción inmunohistológica.
Como resultado, se observaron células positivas para EGFP en el estriado de los ratones transplantados (Tabla 1). Esto sugiere que las células transplantadas positivas para la proteína Lrp4 se injertaron con éxito en el estriado de 15 los ratones del modelo de la enfermedad de Parkinson.
También se observó que la mayoría de las células injertadas con éxito son positivas para el marcador de neuronas maduras MAP2, y se observó que los axones positivos para EGFP se extienden muy adentro en el estriado (Tabla 1 y Fig. 16).
Tabla 1 20
CÉLULAS EGFP+ CÉLULAS TH+ TH+
#6 SEC ID Nº 20
95 19 20%
#7 SEC ID Nº 12
131 21 16%
(La Tabla 1 muestra la diferenciación in vivo de las células transplantadas positivas para Lrp4 en células positivas para TH. Dos semanas después del entorpecimiento de las neuronas dopaminérgicas con 6-OHDA, las células positivas para la proteína Lrp4 se transplantaron en los ratones nº 6 y nº 7. La perfusión se realizó tres semanas después del transplante. 25
Los resultados indicaron que las células transplantadas positivas para la proteína Lrp4 son células progenitoras nerviosas, mientras que la mayoría de las células injertadas con éxito se diferencian y maduran en células nerviosas maduras. Alrededor de 20% de las células injertadas con éxito fueron positivas para TH, sugiriendo fuertemente que al menos una parte de las células transplantadas positivas para la proteína Lrp4 se diferencian en neuronas dopaminérgicas. 30
Por lo tanto, las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas separadas según la presente invención son capaces de diferenciarse en neuronas dopaminérgicas al ser transplantadas en el cerebro, y de este modo se cree que las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas separadas según la presente invención son útiles para terapias.
[Ejemplo 7] Expresión de Lrp4 en neuronas dopaminérgicas que han sido inducidas para que se diferencien 35 a partir de células ES no humanas usando el método de 5 etapas
Se examinó si Lrp4 es expresada o no cuando las células ES no humanas son inducidas para que se diferencien en las neuronas dopaminérgicas in vitro usando el método de 5 etapas.
En primer lugar, las células ES (CCE) se indujeron para que se diferenciaran en neuronas dopaminérgicas usando el método de 5 etapas (Lee et al., Nat. Biotech., 18:675-679 (2000), kit de diferenciación de neuronas dopaminérgicas 40 de ratón [R&D Systems]). Las células se recogieron en el día 2 en la Etapa 1, en el día 4 en la Etapa 2, en el día 6 en la Etapa 3, en los días 4 y 6 en la Etapa 4, y en los días 4 y 7 en la Etapa 5. Los ARN totales se prepararon usando RNeasy mini kit (Qiagen) para llevar a cabo RT-PCR. En la RT-PCR, el ADNc se sintetizó en primer lugar a partir de 1 g del ARN total usando el kit de PCR de ARN (TaKaRa): la PCR se realizó mediante el siguiente sistema de reacción, usando los ADNc correspondientes a 10 ng, 1 ng, y 0,1 ng, como moldes. 45
10 x ExTaq
2 l
dNTP 2,5 mM
1,6 l
ExTaq
0,1 l
cebadores 100 M
0,2 l cada uno
ADNc
1 l
Agua destilada
14,9 l
La PCR se llevó a cabo en condiciones de 94ºC durante 2 minutos, 32 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 65ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 2 minutos, y finalmente 72ºC durante 2 minutos.
A continuación se muestran las secuencias de los cebadores usados.
Lrp4:
TAGTCTACCACTGCTCGACTGTAACG (SEC ID NO: 15)/
CAGAGTGAACCCAGTGGACATATCTG (SEC ID NO: 16)
TH:
GTTCCCAAGGAAAGTGTCAGAGTTGG (SEC ID NO: 17)/
GAAGCTGGAAAGCCTCCAGGTGTTCC (SEC ID NO: 18)
Los resultados del análisis de la expresión mediante RT-PCR revelaron que Lrp4 no es expresada en la Etapa 1, en la que las células son células ES no humanas no diferenciadas, pero es inducida a expresarse en la Etapa 4, en la 5 que se desarrollan las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas (Fig. 17A).
A continuación, se detectaron las células que expresan Lrp4 mediante citometría de flujo usando el anticuerpo monoclonal anti-Lrp4 cuando las células ES fueron inducidas para que se diferenciaran en las neuronas dopaminérgicas in vitro usando el método de 5 etapas.
En primer lugar, la población de células (día 7 en la Etapa 4) que comprende las células progenitoras de neuronas 10 dopaminérgicas inducidas para que se diferenciaran a partir de células ES in vitro usando el método de 5 etapas se dispersó usando la disolución dispersante de células Accumax (Innovative Cell Technologies, Inc.). Sin las etapas de fijación ni permeabilización, las células se tiñeron con anticuerpo monoclonal anti-Lrp4 (mezcla de FERM BP-10315 y FERM BP-10316 [cada sobrenadante de cultivo diluido 1/2]) a 4ºC durante 20 minutos. Las células se lavaron entonces tres veces con 1% de suero fetal de ternera, 1 mM de EGTA, 4,5 mg/ml de glucosa, y 40 ng/ml de ADNasa 15 I/disolución salina balanceada de Hanks libre de Ca y de Mg (HBSS-) a 4ºC durante 3 minutos. Las células se tiñeron con el anticuerpo anti-IgG de hámster marcado con PE (8 g/ml [BD Biosciences], 1% de suero fetal de ternera, 1 mM de EGTA, 4,5 mg/ml de glucosa, y 40 ng/ml de ADNasa I/disolución salina balanceada de Hanks libre de Ca y de Mg (HBSS-)) a 4ºC durante 30 minutos, y se lavaron como se describió anteriormente. Tras la tinción, las células que expresan Lrp4 se detectaron usando un citómetro de flujo. 20
Los resultados de detectar células que expresan Lrp4 mediante citometría de flujo usando anticuerpo monoclonal anti-Lrp4 detectaron una población que expresa la proteína Lrp4 en el grupo de células que comprende las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas inducidas para que se diferencien a partir de las células ES in vitro usando el método de 5 etapas (Fig. 17B). Esto sugirió que Lrp4 es expresada en las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas que son inducidas para que se diferencien a partir de las células ES, pero no solamente 25 mediante el método SDIA sino también mediante el método de 5 etapas, y es útil como un marcador para la separación de células.
[Ejemplo 8] Diferenciación y maduración in vitro de células que expresan Lrp4 separadas mediante anticuerpos
Se examinó si las células positivas para la proteína Lrp4, separadas usando anticuerpo anti-Lrp4, se diferencian o no 30 en neuronas dopaminérgicas in vitro.
La población de células que comprende las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas inducidas para que se diferencien a partir de células ES no humanas in vitro usando el método de 5 etapas se tiñó usando el anticuerpo anti-Lrp4 mediante el método descrito en el Ejemplo 4. Las células positivas para Lrp4 se separaron entonces usando un clasificador de células. Las células separadas se sembraron en un portaobjetos de vidrio revestido con 35 poli-L-ornitina (Sigma, 0,002% en PBS) y fibronectina (Sigma, 5 g/ml en PBS), y se incubaron en N2 (Invitrogen, 1x), ácido ascórbico (Sigma, 200 M), y BDNF (R&D Systems, 20 ng/ml)/DMEM/F12 a 37ºC durante 7 días. Las células cultivadas se fijaron en PFA al 2% y ácido pícrico al 0,15%/PBS a 4ºC durante 20 minutos, y se lavaron dos veces con PBS a 4ºC durante 10 minutos. La permeabilización con 0,3% de Triton X-100/PBS se realizó a temperatura ambiente durante 30 minutos, y el bloqueo con 10% de suero de burro normal y 10% de suero de cabra 40 normal/Block Ace se realizó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después, las células se hicieron reaccionar
con anticuerpo anti-TH (Chemicon, 0,4 g/ml, 10% de suero de burro normal, 10% de suero de cabra normal, 2,5% de Block Ace, 0,1% de Triton X-100/PBS) o con anticuerpo anti-MAP2 (Sigma, ascitis 1/200, 0,5 g/ml, 10% de suero de burro normal, 10% de suero de cabra normal, 2,5% de Block Ace, 0,1% de Triton X-100/PBS) a temperatura ambiente durante una hora, y subsiguientemente a 4ºC toda la noche. Al día siguiente, las células se lavaron cuatro veces con 0,1% de Triton X-100/PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos, y se hicieron 5 reaccionar con el anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con FITC o con el anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con Cy3 (ambos de Jackson, 10 g/ml, 10% de suero de burro normal, 10% de suero de cabra normal, 2,5% de Block Ace, y 0,1% de Triton X-100/PBS) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Subsiguientemente, las células se lavaron como se describió anteriormente, después se lavaron con PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos, y se sellaron para la observación. 10
El cultivo de las células separadas positivas para Lrp4 in vitro indujo muchas neuronas dopaminérgicas positivas para la proteína TH (Fig. 17C). Por lo tanto, se reveló que las células positivas para Lrp4 inducidas mediante el método de 5 etapas son células progenitoras de neuronas dopaminérgicas, y pueden madurar in vitro. La Lrp4 se expresó en las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas inducidas mediante dos métodos de diferenciación diferentes (método SDIA y método de 5 etapas), y las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas inducidas 15 mediante cualquier método se pudieron separar usando el anticuerpo anti-Lrp4. En consecuencia, parece que Lrp4 es útil como un marcador para células progenitoras de neuronas dopaminérgicas derivadas de cualquier fuente celular. El método de 5 etapas es capaz de inducir diferenciación de células progenitoras de neuronas dopaminérgicas sin el contacto con células y componentes derivados de animales, y es de esperar que se aplique clínicamente. Lrp4 es útil como un marcador de la separación de células en los métodos, y de este modo parece que 20 muy probablemente se aplicará a terapia de transplante para enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Parkinson.
[Ejemplo 9] Eliminación de células ES no humanas no diferenciadas separando células progenitoras de neuronas dopaminérgicas usando anticuerpo anti-Lrp4
Cuando se preparan células de transplante derivadas de células ES no humanas, lo más importante en términos de 25 seguridad es eliminar las células ES no humanas no diferenciadas que dan como resultado teratoma. Puesto que Lrp4 no es expresada en células ES no humanas no diferenciadas (Ejemplo 3), se espera que la separación usando como marcador Lrp4 elimine las células ES no diferenciadas. Para confirmar esta hipótesis, se usó RT-PCR para examinar la expresión de ERas (Nature, 423(6939):541-5 (2003)) y Nanog (Cell, 113(5):631-42 (2003)), que son genes específicos de células ES, para investigar si las células ES no diferenciadas estaban contenidas en células 30 separadas usando anticuerpo anti-Lrp4 de células inducidas para que se diferenciaran en células ES in vitro usando el método SDIA.
En primer lugar, usando el método descrito en el Ejemplo 5, las células positivas y negativas para Lrp4 se separaron mediante un clasificador de células de una población de células que comprende células progenitoras de neuronas dopaminérgicas inducidas para que se diferencien a partir de células ES no humanas in vitro usando el método 35 SDIA. El ARN total se recogió inmediatamente tras la separación, y se preparó el ADNc a amplificar. La PCR se realizó usando los ADNc correspondientes a 4 ng, 0,4 ng, y 0,04 ng, como moldes para el siguiente sistema de reacción:
10 x ExTaq
1 l
dNTP 2,5 mM
0,8 l
ExTaq
0,05 l
cebadores 100 M
0,1 l cada uno
ADNc
1 l
Agua destilada
6,95 l
La PCR se llevó a cabo en condiciones de 94ºC durante 2 minutos, 26 ciclos (para Lrp4 y Nestina) o 30 ciclos (para ERas y Nanog) de 94ºC durante 30 segundos, 65ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 2 minutos, y finalmente 40 72ºC durante 2 minutos.
A continuación se muestran las secuencias de los cebadores usados (las secuencias de Lrp4 y de Nestina se describieron en el Ejemplo 5).
ERas:
TGCTCTCACCATCCAGATGACTCACC (SEC ID NO: 27)/

Claims (22)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método para seleccionar y/o detectar células progenitoras proliferativas dopaminérgicas en una muestra celular aislada, comprendiendo el método poner en contacto dicha muestra celular con una sonda polinucleotídica que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de
    (1) una secuencia nucleotídica complementaria a o que se hibrida en condiciones restrictivas a la secuencia 5 nucleotídica de SEC ID NO:1 o SEC ID NO:2;
    (2) una secuencia nucleotídica complementaria a o que se hibrida en condiciones restrictivas a una secuencia nucleotídica que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3 o SEC ID NO:4;
    (3) una secuencia nucleotídica complementaria a o que se hibrida en condiciones restrictivas a una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID 10 NO:3 o SEC ID NO:4 que carece del dominio transmembránico; o
    (4) una primera secuencia nucleotídica que se hibrida en condiciones restrictivas a una segunda secuencia nucleotídica, segunda secuencia nucleotídica la cual se hibrida en condiciones restrictivas a la secuencia nucleotídica de SEC ID NO:1 o SEC ID NO:2.
  2. 2. Un método para seleccionar y/o detectar células progenitoras de neuronas dopaminérgicas en una muestra 15 celular aislada, comprendiendo el método poner en contacto dicha muestra celular con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a una secuencia de aminoácidos seleccionada de
    (1) la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3 o SEC ID NO:4;
    (2) una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3 o SEC ID NO:4 que carece del dominio transmembránico; 20
    (3) la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3 o SEC ID NO:4 mutada mediante una o más supresiones, sustituciones o adiciones de aminoácidos, o combinaciones de las mismas, secuencia de aminoácidos la cual está unida específicamente mediante el anticuerpo producido por el hibridoma FERM BP-10315 o FERM BP-10316; o
    (4) una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido que se hibrida en condiciones restrictivas 25 a una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 1 o SEC ID NO:2.
  3. 3. El método de la reivindicación 2, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es el anticuerpo producido por el hibridoma FERM BP-10315 o FERM BP-10316, o un fragmento del mismo.
  4. 4. Un método para producir u obtener una célula de la estirpe de neurona dopaminérgica, comprendiendo dicho 30 método
    (1) cultivar las células progenitoras proliferativas dopaminérgicas seleccionadas según la reivindicación 1 o las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas seleccionadas de la reivindicación 2 o 3; y
    (2) identificar las células cultivadas usando un marcador para células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas o neuronas dopaminérgicas. 35
  5. 5. El método de la reivindicación 4, en el que dicha célula de la estirpe de neurona dopaminérgica es una célula progenitora proliferativa dopaminérgica, y en el que dicho método comprende además eliminar las células identificadas en la etapa (2) como positivas para un marcador de células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas o neuronas dopaminérgicas.
  6. 6. El método de la reivindicación 4, en el que dicha célula de la estirpe de neurona dopaminérgica es una célula 40 precursora de neurona dopaminérgica postmitótica, y en el que dicho método comprende además seleccionar las células identificadas en la etapa (2) como positivas para un marcador de células precursoras de neuronas dopaminérgicas postmitóticas.
  7. 7. El método de la reivindicación 4, en el que dicha célula de la estirpe de neurona dopaminérgica es una neurona dopaminérgica, y en el que dicho método comprende además seleccionar las células identificadas en la etapa (2) 45 como positivas para un marcador de neuronas dopaminérgicas.
  8. 8. Un método para producir una célula progenitora proliferativa dopaminérgica seleccionando dicha célula según el método de la reivindicación 1.
  9. 9. Un anticuerpo anti-Lpr4 producido mediante el hibridoma FERM BP-10315 o FERM BP-10316.
  10. 10. El anticuerpo de la reivindicación 9, para uso como una sonda para un marcador de célula progenitora 50
    dopaminérgica.
  11. 11. Un método in vitro para aislar un gen específico de una célula progenitora de neurona dopaminérgica, o un gen expresado específicamente en una célula que se ha diferenciado, inducido o proliferado a partir de una célula progenitora de neurona dopaminérgica, comprendiendo dicho método detectar y aislar un gen expresado específicamente en un nivel diferente en una célula progenitora de neurona dopaminérgica seleccionada según el 5 método de la reivindicación 1, con respecto a aquél en una célula que se ha diferenciado, inducido o proliferado a partir de aquél.
  12. 12. Un método in vitro para identificar un compuesto que regula la proliferación y/o diferenciación de una célula de la estirpe de neurona dopaminérgica, comprendiendo dicho método poner en contacto dicho compuesto con una célula progenitora de neurona dopaminérgica seleccionada según el método de la reivindicación 1, y detectar un cambio en 10 la proliferación o diferenciación de dicha célula que resulta de dicho contacto.
  13. 13. El método de la reivindicación 1 o 5, en el que la célula progenitora proliferativa dopaminérgica se usa para producir un kit o medicamento para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa.
  14. 14. El método de la reivindicación 13, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es enfermedad de Parkinson.
  15. 15. Uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a una secuencia de aminoácidos seleccionada del 15 grupo que consiste en (1) a (5) para discriminar una célula progenitora de neurona dopaminérgica:
    (1) la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3 o SEC ID NO:4;
    (2) una secuencia de aminoácidos que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3 o SEC ID NO:4 que carece del dominio transmembránico;
    (3) la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:3 o SEC ID NO:4 mutada mediante una o más supresiones, 20 sustituciones o adiciones de aminoácidos, o combinaciones de las mismas, secuencia de aminoácidos la cual está unida específicamente mediante el anticuerpo producido por el hibridoma FERM BP-10315 o FERM BP-10316;
    (4) una secuencia de aminoácidos codificada por un polipéptido que se hibrida en condiciones restrictivas a una secuencia de ácidos nucleicos complementaria a la secuencia nucleotídica de SEC ID NO: 1 o SEC ID 25 NO:2; o
    (5) una secuencia parcial de la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos (1) a (4) específica de la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3 o SEC ID NO: 4.
  16. 16. El uso de la reivindicación 15, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es el anticuerpo producido por el hibridoma FERM BP-10315 o FERM BP-10316, o un fragmento del mismo. 30
  17. 17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que dicha muestra celular se obtiene diferenciando células ES no humanas en células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas o en células progenitoras de neuronas dopaminérgicas.
  18. 18. El método de la reivindicación 17, en el que el tratamiento de diferenciación se lleva a cabo mediante el método SDIA. 35
  19. 19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende además la etapa de diferenciar células ES no humanas en células progenitoras proliferativas de neuronas dopaminérgicas o en células progenitoras de neuronas dopaminérgicas para obtener una muestra celular que comprende las células progenitoras proliferativas dopaminérgicas o las células progenitoras de neuronas dopaminérgicas.
  20. 20. El método de la reivindicación 19, en el que el tratamiento de diferenciación se lleva a cabo mediante el método 40 SDIA.
  21. 21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17-20, en el que al menos una célula progenitora proliferativa dopaminérgica seleccionada o producida según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 17-20 se usa para producir un kit o medicamento para tratar una enfermedad neurodegenerativa.
  22. 22. El método de la reivindicación 21, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es enfermedad de Parkinson. 45
ES05766437.7T 2004-07-22 2005-07-22 Marcador de célula precursora de neurona que produce la dopamina Lrp4/Corina Active ES2557157T3 (es)

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