CN107148471A - 一种诱导的多巴胺能前体组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于体细胞(例如成纤维细胞向多巴胺能前体)的转分化的一般方法和组合物。具体地，本发明涉及诱导的多巴胺能前体(iDP)细胞，主转录因子(TF)，制备iDP细胞的方法，以及例如治疗神经变性疾病如帕金森病中使用它们的方法和组合物。

Description

一种诱导的多巴胺能前体组合物及其制备方法

政府支持声明

本发明是由美国和中国政府支持根据美国国立卫生研究院授予的合同编号1R01NS41858-01和R01NS061642-01作出的；中国国家自然科学基金资助项目编号81271419,81028007,81329002；中国国家基础研究计划资助项目编号2014CB965001。政府可以在本发明中享有特定权利。

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2014年8月19日提交的申请号62/038,914美国临时专利申请的优先权，并通过引用将其全部包括在内。

技术领域

本发明总体涉及用于体细胞，例如成纤维细胞向多巴胺能前体细胞的转分化的方法和组合物。特别地，本发明涉及诱导的多巴胺能前体(iDP)细胞，其主转录因子(TFs)，制备iDP细胞的方法，以及用于在例如治疗神经退行性疾病如帕金森病中使用它们的方法和组合物。

背景技术

功能性神经元的选择性变性是许多神经变性疾病中的关键病原性事件。通过干细胞/祖细胞移植的细胞替代表示对于这些疾病是特别有希望的治疗策略。用于细胞替代的最受追捧的疾病之一是帕金森病(PD)，其典型疾病特征在于黑质致密部(SNpc)中多巴胺能(DA)神经元的丧失和纹状体中降DA神经支配的降低。干细胞生物学的最近突破已建立通过引入关键的细胞命运决定细胞直接重编程一个谱系的细胞到另一个细胞，例如神经元的可行性。作为这些进展的结果，诱导的神经元和诱导的神经干细胞(iNPC)已经成功产生，并且研究显示这些细胞具有治疗效果。直接重编程代表了获得安全和较少争议的PD治疗细胞来源的重要方向。然而，源自直接重编程的多巴胺能神经元的低产量和非增殖性质限制了广泛的应用。多功能神经干/祖细胞(NSC/NPC)，包括能产生所有类型的神经细胞的iNPC，可以增加可移植细胞的产量；然而，从NPCs/iNPCs来源的同种DA神经元的特异性和有效的诱导仍然是一个重大的挑战。NSCs/NPC经常对具有低分化效率的特定神经元亚型的前形成图案的形态因子反应较差，并且倾向于胶质受限状态。此外，移植的NSCs/NPCs更可能最终分化为星形胶质细胞而不是分化为响应受损的功能神经元。因此，对于DA神经元分化具有巨大潜力的多巴胺神经元谱系限制性前体对于实验性PD治疗是非常理想的。

因此，需要多巴胺能前体细胞，特别是体外诱导的多巴胺能前体(iDP)。之前研究揭示Brn2/Brn4和Sox2是成纤维细胞直接转换成诱导神经祖细胞的关键。在策略上，许多团队通过在Brn2/Brn4和Sox2之外表达确定的转录因子，一直致力于将体细胞直接重编程为区域特异性iNPCs以及亚型特异性iNPCs。直接将体细胞重编程为神经元谱系限制性祖细胞的转录因子已经扩展到Brn2/Brn4和Sox2与c-Myc19的组合。此外，在Brn2和Sox2的存在下，FoxG1(主要在前脑中表达的转录因子)有助于在iNPCs中获得前脑同一性。相比之下，源自中脑的底板细胞的中脑DA神经元由转录决定子，如Foxa2关键调节。此外，DA神经元的发展不仅取决于多巴胺能祖细胞的初始音猬因子(SHH)/成纤维细胞生长因子8(FGF8)和Wnt1信号通路，而且还取决于SHH-Foxa2和Wnt1-Lmx1α通路的联合。然而，在本文发现之前，没有鉴定到转录因子的完整组能够在体外将体细胞转分化成iDP。相反，由于DA神经元的低分化效率，来自人多能干细胞的可移植DP的衍生已被证明是困难的，并且初级DP不容易获得。

发明内容

一方面，本发明提供了诱导的多巴胺能前体(iDP)，其包含选自以下的异位表达的基因和/或蛋白：(1)Brn2和Brn4中的一个或两个，(2)Sox2和(3)Foxa2和Lmx1a中的一个或两个，或前述任何一种或多种的变体，在不是多巴胺能前体的体细胞中。此基因或其变体可以是全长基因，其片段或cDNA，任选地在组成型或条件启动子的控制下。

在一些实施方案中，iDP包括异位表达的Brn2，Sox2和Foxa2，或前述任何一种或多种的变体。异位表达的基因可以由携带它们的一种或多种载体表达，或者可以由编码它们的一种或多种mRNA表达异位表达的蛋白质。在许多实施方案中，iDP是多巴胺能神经元谱系限制性祖细胞，并且不分化成神经胶质细胞。在特定的实施方案中，iDP的分化不依赖于选自SHH和FGF8的形态生成素。在某些实施方案中，iDP还可以包括异位表达的L-Myc，其选择性地在多西环素的控制下条件性表达。在一些实施方案中，体细胞是成纤维细胞。体细胞可以在体外存在。

本文公开声明iDP可用于治疗帕金森病，抑郁症，痴呆和精神分裂症的神经退行性疾病。

另一方面，本文提供了本文公开的iDP群体，其中超过80％或超过90％的iDP能够分化成多巴胺能神经元。

在另一方面，提供了将体细胞转分化为iDP的方法，其包括异位表达选自以下的基因：(1)Brn2和Brn4中的一个或两个，(2)Sox2和(3)Foxa2和Lmx1a或任何一种或多种前述的变体，在不是多巴胺能前体的体细胞中。

在一些实施方案中，所述方法包括在体细胞中异位表达Brn2，Sox2和Foxa2，或前述任何一种或多种的变体。体细胞可以是成纤维细胞。体细胞可以在体外存在。体细胞可以从需要用iDP进行细胞或组织替代治疗的患者获得。患者可以患有帕金森病，抑郁症，痴呆或精神分裂症。

本文还提供了治疗神经退行性疾病的方法，包括向有需要的患者施用本文公开的iDP。

另一方面，本发明涉及鉴定调节多巴胺能神经元发育的药剂的方法，包括使本文公开的iDP群体受试试剂，其中iDP分化为多巴胺能神经元的变化指示是多巴胺能神经元发育中的测试剂。在一些实施方案中，所述变化是以下的一种或多种：酪氨酸羟化酶(TH)，Sox1，PAX6，ZBTB16，Sox3，CD133，Nestin，Aldh1A1，Corin(Lrp4)中的一种或多种的细胞生长，细胞存活或基因表达变化，Lmx1a，Msx1，Ngn2，Otx2，Mash1，Pitx3和Nkx6.1，部分酸性神经细胞粘附分子(PSA-NCAM)和/或双皮层蛋白(DCX)。在某些实施方案中，所述iDP由患者的体细胞转分化而来，其中所述患者患有帕金森病，抑郁症，痴呆或精神分裂症，并且其中所述方法鉴定用于治疗帕金森病，抑郁症，痴呆或精神分裂症的药剂。

另一方面，本发明涉及包含一种或多种携带分离的基因的载体的组合物，所述分离的基因选自：(1)Brn2和Brn4中的一个或两个，(2)Sox2和(3)Foxa2和Lmx1a中的一个或两个，或更多。在一些实施方案中，所述一种或多种载体可携带Brn2，Sox2和Foxa2，或前述任何一种或多种的变体。载体是病毒载体。

可以看出前面一般性描述和以下详细描述都仅是示例性和说明性的，并且不限制或限定本文所描述和要求保护的本发明的范围。

附图说明

图1A-1E通过确定的因子从小鼠皮肤成纤维细胞产生诱导的多巴胺能前体通过三种转录因子(Brn2，Sox2和Foxa2，BSF)的异位过表达产生iDP的示意性程序(图1A)。通过在7dpi处的GFP发生和在14dpi处的克隆形成(由箭头指示)监测iDP产生的动力学(图1B)。通过实时RT-PCR分析表达特定组的神经祖细胞标志物基因(图1C)，腹侧中脑(VM)相关基因(图1D)和端脑相关基因(图1E)，以及GAPDH特异性引物对用于内部对照。成纤维细胞(Fbb)作为阴性对照，初级神经祖细胞(WT-NPC)和前脑神经祖细胞(NPs)作为阳性对照。Fbb和iDPs相比P<0.05。

图2A-2D iDP的特性

iDPs培养物进行Nestin(绿色)，Corin(绿色)，DCX和PSA-NCAM(红色)和DAPI(蓝色)的免疫染色(图2A)。在PLO/层粘连蛋白包被的盖玻片上培养的iDP在SHH和FGF8存在下进行多巴胺能神经元分化，然后用抗βIII-微管蛋白(绿色)和酪氨酸羟化酶(TH，红色)的抗体进行免疫染色，DAPI(蓝色)(图2B)。从Fbb，WT-NPC和iDP收集mRNA，然后用对胶质细胞株特异性的引物进行实时RT-PCR分析(参见表2)，并且将GAPDH特异性引物对用于内部对照(图2C)。在涂布的盖玻片上培养的WT-NPC和iDP分别用星形细胞培养基分化10天和少突胶质细胞培养基14天，然后用GFAP和O4(红色)进行免疫染色，并用DAPI(蓝色)进行核染色(图2D)。(比例尺：20μm)

图3A-3B iDPs具有中脑区域同一性并分化为独立于SHH和FGF8信号通路的DA神经元

iDPs用SHH和FGF8处理6天，然后在BDNF，GDNF，IGF1，TGF-β3，dbcAMP和抗坏血酸的存在下终末分化另外3周(图3A，上图)。或者，在BDNF，GDNF，IGF1，TGF-β3，dbcAMP和抗坏血酸的存在下，iDPs直接终末分化另外3周(图3A，下图)。将细胞固定，然后用βIII-微管蛋白(绿色)和酪氨酸羟化酶(TH，红色)进行免疫染色，并用DAPI(蓝色)进行核染色(图3A)。显示了从iDPs分化的总神经元(Tuj+)的TH+神经元的百分比。没有观察到显着差异(n.s)(图3B)。分化后，来自iDPs的MAP2+神经元(绿色)与突触泡蛋白(红色)标记的突触前点紧密相关。C4中的箭头，C3中方框区域的放大图像显示突触前点。(比例尺：20μm)

图4A-4F iDP衍生的DA神经元表达成熟神经元标记物并显示出电生理学特性

在BDNF，GDNF，IGF1，TGF-β3，dbcAMP和抗坏血酸的存在下，在PLO/层粘连蛋白包被的盖玻片上培养的iDPs终末分化3周，然后用成熟的DA神经元标记物进行免疫染色，包括MAP2，TH，AADC，DAT和VMAT2抗体，并用DAPI(蓝色)进行核染色(图4A)。在施加去极化脉冲以引起向内Na+和外向K+电流之前，细胞超极化至-80mV(图4B)，统计结果显示电压依赖性内向Na+和外向K+电流(图4C，4D)。在iDP分化3周后由DA神经元产生的步进电流注射(全细胞记录，电流钳模式)引起的膜电位变化和动作电位的代表性痕迹(图4E)和动作电位的统计结果。4F(n＝5)。(比例尺：20μm)

图5A-5D通过L-Myc的条件表达增强iDP的增殖和自我更新

用于iDPs中L-Myc过表达的Tet-On/Off高级系统的示意图(图5A)。通过使用对L-myc特异性的引物(参见表2)和GAPDH特异性引物对的实时RT-PCR分析，将iDPs中myc(同种型L-myc)的Dox调节的表达用于内部对照(图5B)。对在Dox(+)或Dox(-)培养基中生长72小时的细胞的Ki67(红色)和细胞核的免疫荧光染色用DAPI(蓝色)染色(图5C，左图)。结果显示为总细胞的Ki67+细胞的百分比(图5C，右图)。与用Dox(-)培养基培养72小时的细胞相比p<0.001。分别用Dox(+)或Dox(-)培养基培养的iDPs用Corin和DCX(红色)抗体进行免疫染色，并用DAPI(蓝色)进行核染色(图5D)。(比例尺：20μm)

图6A-6D移植iDPs存活，分化成多巴胺能谱系和部分逆转MPTP纹状体病理

(图6A)在时间线中显示了培养，预实验，MPTP施用，iDPs接种，运动功能测试和用于处死小鼠的实验终点。(图6B)MPTP中毒后一周，将GFP+iDPs颅内注射到C57BL/6小鼠的纹状体中。在iDPs植入后3周制备脑标本的自由漂浮切片。显示了PBS注射(a)，MPTP中毒与盐水IC注射(b)和MPTP与iDPs IC注射(c)后纹状体的代表性显微照片。量化DA末端的纹状TH+密度，数据表示纹状体密度的平均值±SEM。使用来自每只小鼠的四个纹状体切片进行分析。N＝10只小鼠用于盐水IC注射组；N＝7只小鼠用于MPTP组，MPTP用iDPs IC注射组。(图6C)在IC注射后3周评估IC注射到小鼠纹状体中后GFP⁺iDPs的存活和分化。(图6D)通过用针对GFP，TH和GFAP(红色)的抗体和用DAPI(蓝色)进行的核染色的免疫染色来检测移植细胞。(比例尺：20μm)

图7A-7C iDPs改善MPTP中毒小鼠的旋转性能

在iDPs植入后3周，用旋转运动功能测试每周测试两次小鼠。(图7A)用旋转测定所有小鼠组的MPTP前的性能值。(图7B)显示了第2周时所有小鼠组的每周性能值。(图7C)显示了在第1-3周的所有小鼠组的每周性能值。数据表示归一化至基线旋转性能的每组的平均值±SEM。使用双尾t检验进行统计分析。N＝10只小鼠用于盐水IC注射组；N＝7只小鼠用于MPTP组，MPTP用iDPs IC注射组。

图8A-8D Lmx1a和Foxa2的异位表达抑制5F-iNPCs的增殖并赋予5F-iNPCs的中脑区域同一性

用于5F-iNPCs中Lmx1α和Foxa2过表达的Tet-On/Off高级系统的示意图(图8A)。用Dox(+)和Dox(-)培养基处理感染的5F-iNPCs 4天，通过使用特异性引物的实时RT-PCR研究5F-iNPCs中Lmx1a和Foxa2的总和转基因水平(参见表 2)(图8B)。在具有或不具有Dox的6孔板中分别培养1×10⁵ 5F-iNPCs，并在第2天，第4天和第6天计数细胞数(图8C)。5F-iNPCs用或不用Dox(1μg/ml)培养4天，收集mRNA，然后用于胶质谱系，神经元谱系和多巴胺能神经元相关基因的特异性引物进行实时RT-PCR(图8D)。GAPDH特异性引物对用于内部对照。p<0.05。

图9A-9B Lmx1α和Foxa2的过表达增加了TH⁺细胞群，但对胶质细胞再生具有最小的影响

在具有Dox可调的Lmx1α和Foxa2的5F-iNPCs中，在星形胶质细胞分化条件(DMEM/F-12添加10％FBS)下用或不用Dox处理10天，并且神经元分化条件(DMEM/F12带有N2，GDNF，和BDNF)培养14天。通过分别用MAP2和GFAP的免疫荧光染色显现神经元和星形胶质细胞的分化(图9A)。具有Dox可调Lmx1α和Foxa2的5F-iNPCs在GDNF，BDNF，AA和存在或不存在Dox的情况下分化为DA神经元8天。进行MAP2(红色)和TH(绿色)的免疫荧光染色(图9B，左图)，并且定量TH⁺与MAP2⁺的比率(平均值±SD)(图9B，右图)。p<0.05。(比例尺：50μm)

图10A-10B iDP中转基因和内源基因的分析

使用特异性引物对用于检测转基因基因(图10A)和用于iDP产生的内源基因(图10B)的iDPs的实时RT-PCR分析，包括Brn2，Sox2和Foxa2。GAPDH特异性引物对用于内部对照；Fbb作为阴性对照，WT-NPC作为内源性检测的阳性对照。

图11A-11D SCID小鼠中iDPs的细胞注射，存活和安全评价

用pLenti-CMV-GFP-Purovirus感染iDPs并用嘌呤霉素筛选(图11A)。在SCID小鼠中立体定向注射GFP-标记的iDPs的示意图(图11B)。将GFP标记的iDPs颅内注射到SCID小鼠脑的纹状体中，并使用Leica共焦显微镜和Metamorph分析软件(Molecular Devices)捕获图像(图11C)。注射后6周制备福尔马林固定的脑标本的石蜡切片，Ventana公司的Coreo AuSlider扫描仪显示苏木精和伊红(HE)染色(图1)注射(L，左)和未注射(图11D)。

图12A-12B源自PD患者(图12A)和105d胎儿的iDPs的表征(图12B)。Corin(左边)和DCX(中间)在iDPs细胞中的共定位。

附图中英文的中译文如下：Nestin巢蛋白；bright field明场；forebrain前脑；Advanced先进的；Transcription转录；Saline生理盐水；Merge融合。

具体实施方式

本文公开了用于体细胞，例如成纤维细胞向多巴胺能前体(DP)的转分化的组合物和方法。一方面，令人惊讶地发现，体外第一次，通过Brn2(和/或Brn4)和Sox2与Foxa2(和/或Lmx1a)的异位表达可以实现中脑特性和多巴胺能神经命运的详述在终末分化的细胞的直接重编程。特别出人意料的是，高百分比(例如，大于80％或大于90％)的细胞可以在异位表达Brn2，Sox2和Foxa2的细胞中转分化成iDPs。在一些实施方案中，将Foxa2(和/或Lmx1a)加入由Brn2(和/或Brn4)和Sox2起始的重编程过程中成功地将成年皮肤成纤维细胞转化成具有中脑特性和选择性多巴胺能分化潜能的神经祖细胞。结果，诱导的DPs(iDPs)在体外和体内是多巴胺能神经元限制的，并且不在脑中形成肿瘤或神经过度生长。此外，MPTP小鼠模型的纹状体中移植的iDPs终末分化为DA神经元而不是星形胶质细胞，并且功能上减轻PD症状。此外，可在诱导剂(例如多西环素(Dox))的控制下在iDPs中设计L-Myc表达，使得iDPs可安全地扩增至所需的移植产量，为PD治疗提供有用的细胞来源。

在一些实施方案中，Brn2(和/或Brn4)，Sox2和Foxa2(和/或Lmx1a)是主转录因子，其可用于通过例如异位表达主体转录因子来诱导体细胞向iDP的转分化。所得iDPs不仅表现出原代多巴胺能祖细胞的性质，而且还具有多巴胺能神经元谱系限制性潜能。iDPs可用于细胞或组织替代疗法中，用于治疗神经退行性疾病，例如帕金森病，精神分裂症，抑郁症和痴呆。在一些实施方案中，从患者获得的自体体细胞经受转分化，使得所得细胞可以移植回同一患者，以使可能针对所述细胞的免疫应答最小化并避免潜在的免疫抑制需要。

本文公开的优于当前可用技术的一些优点包括以下：

1.本文公开的某些转录因子的异位表达可导致不分化成神经胶质细胞的排他的多巴胺能神经元谱系限制性祖细胞。相比之下，已经发现大多数现有的干细胞分化成神经胶质细胞。因此，与其他技术相比，本公开的iDPs提供增加的治疗效率。

2.与其它前体不同，令人惊讶地，本文公开的iDPs的分化不依赖于形态发生素如SHH和FGF8。相比之下，迄今为止研究的其他前体都需要形态发生素来诱导分化。

3.与仅仅范围为5％至60％的当前可用技术相比，本文公开的iDPs具有更高的多巴胺能神经元产生的潜力和效率(例如，大于80％或大于90％)。

4.iDPs可以进一步修饰(例如通过转导L-Myc表达)，以便具有有限的增殖，从而降低细胞移植后的致肿瘤性。

定义

为方便起见，本文所使用的某些术语，在本说明书，例子和所附的权利要求此处集中。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如普通技术人员通常到本公开所属本领域所理解的相同的含义。

术语“转分化(transdifferentiation)”或“转分化(transdifferentiating)”在本文中与短语“重编程(reprogramming)”互换使用，是指一种分化的体细胞类型转化为不同的分化的体细胞类型。

如本文所用，术语“体细胞(somatic cell)”是指形成生物体的任何细胞，而不是种系细胞。在哺乳动物中，种系细胞包括配子(精子和卵子)，其在受精期间融合以产生称为受精卵的细胞，整个哺乳动物胚胎从该细胞发育。哺乳动物身体中的每一种细胞类型-除了精子和卵子，它们产生的细胞(配子细胞)和未分化的干细胞-是体细胞：内部器官，皮肤，骨骼，血液和结缔组织都由体细胞组成。除非另有说明，用于将体细胞(例如成纤维细胞)直接转化为iDP细胞的方法可以在体内和体外进行(其中当体细胞例如成纤维细胞存在于受试者体内时在体内，并且其中使用分离的体细胞例如维持在培养物中的成纤维细胞在体外)。

术语“多巴胺能前体(dopaminergic precursor)”或“多巴胺能祖细胞(dopaminergic progenitor)”或“DP”是指有丝分裂后的细胞，其从心室区沿着径向神经胶质迁移至其在脑盖套层的最终目的地。在他们的迁移过程中，他们开始表达酪氨酸羟化酶(TH)，多巴胺合成中的限速酶，并最终分化成多巴胺能神经元。一组多巴胺能神经元参与自主运动的控制，并且在帕金森病中受到严重影响。另一组多巴胺能神经元参与情感相关行为的调节，并且在抑郁症和精神分裂症中受影响。因此，iDP细胞可用于通过例如移植或细胞替代疗法来治疗这些疾病。

如本文所用，术语“内源DP细胞(endogenous DP cell)”是指体内DP细胞或通过胚胎干细胞分化为DP细胞产生的DP细胞，并显示DP细胞表型。DP细胞的表型是本领域普通技术人员熟知的，包括例如基因表达特征，例如酪氨酸羟化酶(TH)，Sox1，PAX6，ZBTB16，Sox3，CD133，Nestin，Aldh1A1，Corin(Lrp4)，Lmx1a，Msx1，Ngn2，Otx2，Mash1，Pitx3和Nkx6.1，部分酸性神经细胞粘附分子(PSA-NCAM)，双皮质素(DCX)和/或多巴胺能神经元谱系限制性分化潜能。

如本文所用的术语“诱导的多巴胺能前体细胞(induced dopaminergicprecursor cell)”或“iDP细胞(iDP cell)”是指具有通过从体细胞直接转化产生的一种或多种DP特征(例如形态，基因表达和功能)的DP或DP样细胞，例如成纤维细胞。

术语“异位的(ectopic)”是指存在于细胞或生物体中而不是其天然或天然位置和/或水平的物质。例如，术语“异位表达(ectopic expression)”是指基因在生物体的异常或非天然位置(例如，细胞，组织或器官)中和/或异常(增加或降低)水平的表达，或在体外培养。

术语“表达(expression)”是指参与产生RNA和蛋白质的细胞过程，包括(如果适用)但不限于例如转录，翻译，折叠，修饰和加工。“表达产物(Expression products)”包括从基因转录的RNA和通过翻译从基因转录的mRNA获得的多肽。

如本文所用，“Brn2”，“Brn4”，“Sox2”，“Foxa2”和“Lmx1a”是指Genbank登录号：NM_005604(人)，NM_000307(人)，NM_003106.3(人)，NM_021784.4(人)和NM_001174069.1(人)。这些术语还包括物种变体，同源物，等位基因形式，突变形式及其等同物，包括其中不会不利地影响结构或功能的保守取代，添加，缺失。除了可能存在于群体中的序列的天然存在的等位基因变体(“野生型序列”)之外，应当理解，与实际上所有蛋白质的情况一样，可以将多种变化引入野生型序列，而基本上不改变多肽的功能(生物学)活性。这些变体包括在术语“Brn2”，“Brn4”，“Sox2”，“Foxa2”和“Lmx1a”的范围内。小鼠和人Brn2，Brn4，Sox2，Foxa2和Lmx1a序列列于下表1中。

表1.示例性序列

基因(Gene)	小鼠(Mouse)	人(Human)
			Brn2	SEQ ID NO.:1	SEQ ID NO.:6
Brn4	SEQ ID NO.:2	SEQ ID NO.:7
			Sox2	SEQ ID NO.:3	SEQ ID NO.:8
Foxa2	SEQ ID NO.:4	SEQ ID NO.:9
			Lmx1a	SEQ ID NO.:5	SEQ ID NO.:10

如本文所用，涉及多肽的术语“变体(variant)”可以是例如与全长多肽至少80％，85％，90％，95％，98％或99％相同的多肽。变体可以是全长多肽的片段，例如多肽的野生型版本的至少10个或至少20个连续氨基酸的片段。在一些实施方案中，变体是天然存在的剪接变体。变体可以是与多肽的片段至少80％，85％，90％，95％，98％或99％相同的多肽，其中片段是至少50％，60％，70％，80％例如具有直接将成纤维细胞转化为iDP细胞的能力的全长野生型多肽或其结构域的至少80％，85％，90％，95％，98％或99％。在一些实施方案中，所述结构域长度为至少100,200,300或400个氨基酸，从序列中的任何氨基酸位置开始并朝向C-末端延伸。优选避免本领域已知的消除或基本上降低蛋白质活性的变化。在一些实施方案中，变体缺少全长多肽的N-和/或C-末端部分，例如，从任一末端多达10,20或50个氨基酸缺失。在一些实施方案中，多肽具有成熟(全长)多肽的序列，通过其意指具有一个或多个部分(例如在正常细胞内蛋白水解加工期间去除的信号肽的多肽)(例如，在共翻译或后-翻译加工)。在一些实施方案中，其中所述蛋白质不是通过从天然表达它的细胞中纯化而产生的，所述蛋白质是嵌合多肽，这意味着其含有来自两种或更多种不同物种的部分。在其中产生蛋白质而不是通过从天然表达蛋白质的细胞中纯化蛋白质的一些实施方案中，蛋白质是衍生物，其是指蛋白质包含与蛋白质不相关的另外的序列，只要那些序列基本上不减少蛋白质的生物活性。

本领域技术人员使用本领域已知的测定将意识到或将容易地确定特定多肽变体，片段或衍生物是否是功能性的。例如，Brn2，Brn4，Sox2，Foxa2和/或Lmx1a多肽的变体将体细胞(例如成纤维细胞)转化成iDP的能力可使用本文公开的测定法来评估。其它方便的测定包括测量包含Brn2，Brn4，Sox2，Foxa2和/或Lmx1a变体的报道基因构建体的转录的能力，所述Brn2，Brn4，Sox2，Foxa2和/或Lmx1a变体与编码可检测标记如荧光蛋白或荧光素酶的核酸序列可操作地连接。一种测定涉及确定Brn2，Brn4，Sox2，Foxa2和/或Lmx1a变体是否诱导体细胞(例如成纤维细胞)成为iDP细胞或表达DP细胞的标志物或表现本文公开的DP细胞的功能特征。DP标记的这种表达的测定可以使用任何合适的方法，例如，免疫印迹或实时定量逆转录(RT)-PCR来测定。这样的测定可以容易地适于鉴定或确认直接将体细胞例如成纤维细胞转化成iDP细胞的试剂的活性。在本公开的某些实施方案中，功能变体或片段具有全长野生型多肽的至少50％，60％，70％，80％，90％，95％或更多的活性。

如本文所用，术语“可操作地连接(operably linked)”是指将编码序列表达所必需的调节序列置于DNA分子中相对于编码序列的适当位置，以实现编码序列的表达。该相同的定义有时应用于表达载体中编码序列和转录控制元件(例如启动子，增强子和终止元件)的排列。术语“可操作地连接(operably linked)”包括在待表达的多核苷酸序列前面具有合适的起始信号(例如，ATG)，并保持正确的阅读框以允许在表达控制序列的控制下表达多核苷酸序列，以及产生由多核苷酸序列编码的所需多肽。

如本文所用，术语“病毒载体(viral vectors)”是指使用病毒或病毒相关载体作为核酸构建体的载体进入细胞。构建体可以整合并包装入非复制性缺陷病毒基因组，如腺病毒，腺相关病毒(AAV)或HeDPs单纯疱疹病毒(HSV)或其他，包括逆转录病毒和慢病毒载体，用于感染或转导入细胞。载体可以或可以不并入细胞的基因组中。如果需要，构建体可以包括用于转染的病毒序列。或者，可以将构建体掺入能够附加型复制的载体中，例如EPV和EBV载体。

如本文所使用的，术语“转录因子(transcription factor)”是指使用DNA结合结构域结合DNA的特定部分的蛋白质，并且是控制遗传信息从DNA到RNA的转移(或转录)的系统的一部分。

术语“下降(decrease)”，“减少的(reduced)”，“减少了(reduction)”，“降低(decrease)”或“抑制(inhibit)”在本文中通常用于表示降低统计学上显着的量。然而，为了避免疑义，“reduced”，“reduction”或“decrease”或“inhibit”是指与参考水平相比降低至少10％，例如降低至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％包括100％降低(即与参考样品相比不存在水平)，或与参考水平相比在10-100％之间的任何降低。

术语“增加的(increased)”，“增加(increase)”或“提高、加强(enhance)”或“活化(activate)”在本文中全部用于表示通过静态显着量的增加；为了避免任何疑问，术语““increased”，“increase”或“enhance”或“activate”是指与参考水平相比增加至少10％，例如增加至少约20％或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％并且包括与参考水平相比在10-100％之间，或至少约2倍，或至少约3倍，或至少约4倍的100％增加或任何增加，至少约5倍或至少约10倍的增加，或者与参考水平相比在2倍和10倍或更大之间的任何增加。

术语“受试者(subject)”和“个体(individual)”和“患者(patient)”在本文中可互换使用，并且是指动物，例如，可以从其获得细胞和/或对其进行治疗(包括预防性治疗)的人的细胞。为了治疗对特定动物(例如人类受试者)特异的那些病症或疾病状态，术语受试者指该特定动物。本文可互换使用的“非人动物”和“非人哺乳动物”包括哺乳动物如大鼠，小鼠，兔，绵羊，猫，狗，牛，猪和非人灵长类动物。术语“subject”还包括任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物，爬行动物，两栖动物和鱼。然而，当然受试者也可是哺乳动物，例如人，或其他哺乳动物，例如驯养的哺乳动物，例如狗，猫，马等，或生产哺乳动物，例如牛，绵羊，猪等。

当应用于分离的细胞时，术语“治(treat)”，“治疗(treating)”，“治疗(treatment)”等包括使细胞经受任何种类的过程或条件或对细胞进行任何种类的操作或程序。当应用于受试者时，术语“治疗(treating)”是指向个体提供医学或手术方法，护理或管理。个体通常患病或受伤，或者相对于普通人群成年患病风险增加，需要这种关注，关怀或管理。在一些实施方案中，术语“treating”和“treatment”是指向受试者施用有效量的组合物，例如包含iDP细胞或其分化的子代的组合物，使得受试者的至少一种疾病症状得以减轻或改善，例如，有益的或期望的临床结果。为了公开的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于减轻一种或多种症状，减少疾病程度，稳定(即不恶化)疾病状态，延迟或减缓疾病进展，改善或缓解疾病状态，以及缓解(无论部分或全部)，无论是可检测的还是不可检测的。治疗可以指与不接受治疗的预期存活相比延长的存活。因此，本领域技术人员认识到，治疗可以改善疾病状况，但可能不是该疾病的完全治愈。在一些实施方案中，治疗可以是“预防性”治疗，其中将受试者施用本文公开的组合物(例如iDP细胞群体或其后代)至处于发展本文公开的神经变性疾病的风险中的受试者。需要治疗的那些包括已经诊断患有神经变性疾病或病症(例如帕金森病(PD))的那些，以及那些可能发展为由于遗传易感性或其他因素例如家族史，暴露于易感因素，体重，年龄，饮食和健康而引起的神经变性疾病或病症。

如本文所用，术语“包含(comprising)”或“包括(comprises)”用于指存在于给定实施方案中的组合物，方法及其各自的组分，但是对于包括未指明的元件是开放的。

如本文所用，术语“实质上包括(consisting essentially of)”是指给定实施方案所需的那些元素。该术语允许存在不会实质上影响本发明的该实施方案的基本和新颖或功能特征的额外元素。

术语“由……组成(consisting of)”是指如本文所述的组合物，方法和其各自的组分，其排除在实施方案的描述中没有记载的任何要素。

如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确指示。因此，例如，对“the method”的引用包括一个或多个方法和/或本文描述的类型的步骤和/或本领域技术人员在阅读本公开内容时将变得显而易见的步骤。

如本文所用，术语“大约”是指在20％内，更优选在10％内，最优选在5％内。

如本文所使用的，词语“一个”也可以表示“任何一个”。

如本文所使用的，术语“或”可以包括“或”和“和”的含义，这取决于上下文和基本技术情况，并且可以与“和/或”互换。

应当明白，本文提供的详细描述和实施例仅是说明性的，而不应被视为对本发明范围的限制。在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对所公开的实施例进行各种改变和修改，这对于本领域技术人员将是显而易见的。此外，为了描述和公开例如在可能与本公开结合使用的这样的出版物中描述的方法的目的，所标识的所有专利，专利申请和出版物通过引用明确地并入本文。提供这些出版物仅仅是因为它们在本申请的申请日之前的公开。在这方面，任何内容不应被解释为承认发明人没有权利由于在先公开或任何其他原因而先于这样的公开。关于这些文件的内容的日期或表示的所有陈述是基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件的日期或内容的正确性的任何承认。

体细胞

虽然通常使用成纤维细胞，但基本上任何原代体细胞类型可以用本文所述的方法代替成纤维细胞。原代细胞的一些非限制性实例包括但不限于上皮，内皮，神经元，脂肪，心脏，骨骼肌，免疫细胞，肝，脾，肺，循环血细胞，胃肠，肾，骨髓和胰腺细胞。细胞可以是从任何体细胞组织分离的原代细胞，包括但不限于脑，肝，肺，肠，胃，肠，脂肪，肌肉，子宫，皮肤，脾，内分泌器官，骨头等。

当细胞维持在体外条件下时，可以使用常规的组织培养条件和方法，这是本领域技术人员已知的。各种细胞的分离和培养方法完全在本领域技术人员的能力范围内。

此外，亲本细胞可以来自任何哺乳动物物种，非限制性实例包括鼠，牛，猿，猪，马，绵羊或人细胞。为了清楚和简单，本文方法的描述涉及成纤维细胞作为亲本细胞，但应理解，本文所述的所有方法可容易地应用于其它原代亲本细胞类型。在一些实施方案中，体细胞衍生自人个体。

在一些实施方案中，本公开的方法和组合物可以在完全分化和/或限于仅产生该特定类型的细胞的体细胞上实施。体细胞可以在直接转化为iDPs或其他感兴趣的细胞类型之前部分或终末分化。在一些实施方案中，被分化成iDPs或其他感兴趣的细胞类型的体细胞是成纤维细胞。

重编程(转分化)

将分化细胞(即第一细胞)的细胞表型改变(例如将体细胞的表型改变为不同表型的分化细胞(即第二细胞)的过程称为“重编程”或“转分化”。换句话说，一种类型的细胞可以通过本领域中通常称为转分化，直接重编程，细胞重编程或谱系重编程的方法转化为另一种类型。

如本文所公开的，本公开涉及用于将体细胞例如成纤维细胞直接转化为iDP的组合物和方法。iDP的主转录因子可以包括Brn2，Brn4，Sox2，Foxa2和/或Lmx1a中的一种或多种。在某些实施方案中，主转录因子可以是Brn2，Sox2和Foxa2。在另外的实施方案中，主转录因子可以是Brn4，Sox2和Foxa2。在一些实施例中，主转录因子可以是Brn2，Sox2和Lmx1a。在一些实施方案中，主转录因子可以是Brn4，Sox2和Lmx1a。在一些实施方案中，主转录因子可以是Brn2，Brn4，Sox2和Foxa2。在一些实施方案中，主转录因子可以是Brn2，Brn4，Sox2和Lmx1a。在一些实施方案中，主转录因子可以是Brn2，Brn4，Sox2，Foxa2和Lmx1a。

通过增加某些主体转录因子在体细胞中的表达水平，可以诱导向DP的转分化。可以使用本领域已知的增加表达水平的各种方法，包括但不限于，使体细胞与增加主体转录因子表达的试剂接触，所述试剂例如核苷酸序列(例如，编码一个或多个主体转录因子)，蛋白质，适体，小分子，核糖体，RNAi试剂，肽-核酸(PNA)或其类似物或变体。在一些实施方案中，主体转录因子在体细胞中的异位表达诱导向DP的转分化。异位表达可以通过导入转录因子的转基因(由例如载体，例如病毒载体例如逆转录病毒，慢病毒，腺病毒，腺相关病毒和/或纳米颗粒携带)的转基因实现。或者或另外，内源基因表达也可以通过调节转录机制来增加，例如激活其相应的启动子和/或增强子，募集转录因子和/或RNA聚合酶到启动子/增强子区域，去活化沉默子，减少或去除抑制子等。在一些实施方案中，染色质结构的表观遗传修饰可用于增强内源基因表达。

在一些实施方案中，编码多个主转录因子的核酸可以在单独的启动子控制下或在相同启动子控制下掺入载体中。例如，可以使用其中编码多肽的核酸序列被2A肽或IRES序列分开的多顺反子载体。本领域普通技术人员知道2A肽，IRES序列及其在细胞中共表达多个多肽的用途，其中多个多肽由单个mRNA编码。例如，参见美国专利申请公开号20120028821，用于进一步描述2A肽及其在细胞中共表达多种多肽的用途。在一些实施方案中，包含编码转录因子的核酸的转基因可以整合在选定的位置，例如人细胞中的安全港基因座(例如人腺相关病毒整合位点1(AAVS1)，可以使用基因组编辑系统例如CRISPR/Cas9，TALENs或锌指核酸酶来实现核酸在基因组中选定位置的整合。

在一些实施方案中，一种或多种主转录因子的异位表达可以通过将编码转录因子的合成修饰的mRNA引入细胞中来实现。在一些实施方案中，合成修饰的mRNA包含在编码主转录因子的天然存在的mRNA中通常不存在的一个或多个核苷酸。这样的核苷酸可以例如增强合成mRNA的稳定性和/或翻译。本领域普通技术人员知道用于在细胞中表达蛋白质的合适类型的合成修饰的mRNA。例如，参见US 2012/0046346和WO 2011/130624，它们的全部内容通过引用并入本文。

在某些实施方案中，提供了用于将体细胞(例如成纤维细胞)转分化为功能性DP细胞(本文称为“诱导的DP(iDP)细胞”)的组合物和方法。在某些实施方案中，体细胞(例如成纤维细胞)的转分化导致体细胞呈现DP样状态。可以通过增加Brn2，Brn4，Sox2，Foxa2和Lmx1a中的一种或多种的表达水平来实现向iDP细胞的转分化。在一些实施方案中，Brn2，Brn4，Sox2，Foxa2和Lmx1a中至少两种，至少三种，至少四种或至少五种的增加的表达诱导体细胞转分化成iDP细胞。在一个实例中，Brn2/Brn4，Sox2和Foxa2/Lmx1a是足以建立和/或维持DP细胞状态的主转录因子。

转分化细胞具有许多临床，治疗和科学应用。在一些实施方案中，可将转分化细胞移植到需要细胞替代疗法的患者。细胞可以是患者自体的，即可以首先获得来自患者的体细胞，在体外诱导以转分化成iDP，然后移植回相同的患者。在一个实例中，可以移植iDP细胞以治疗帕金森氏病或其他疾病，例如抑郁症，精神分裂症和痴呆。在其他实施方案中，转分化细胞可以在体外培养和/或进行各种体外实验作为用于改善生存力和/或研究其性质的模型，并且可以用于产生目的物质(例如蛋白质)或产生人工组织/器官。

在一些实施方案中，表达本文所述的一种或多种主转录因子的细胞可以用于鉴定试剂如小分子(分子量为1.5千道尔顿或更小的有机分子)，核酸可用于产生iDP细胞以提高直接重编程的效率和/或用于代替本文所述的一种或多种主转录因子(作为替代物)的方法中的抗体(例如，RNAi试剂，小RNA)或多肽)用于本文所述的一种或多种主转录因子和/或提高直接重编程的效率。例如，在某些实施方案中，将表达本文所述的一种或多种主转录因子的体细胞群与测试剂接触，并测定测试剂增加直接重编程为iDP的效率和/或速度的能力。直接重编程的效率可以测量为由给定数目的不同细胞类型(例如，成纤维细胞)的体细胞产生的iDP细胞的转分化细胞的集落数，所述细胞类型已被修饰以引起一种或多种iDP的主转录因子。

在一些实施方案中，iDP细胞(和/或由其产生的多巴胺能神经元)可以用作模型系统，其可以用于例如测试试剂例如候选治疗剂的潜在功效和/或毒性，或者用于评价试剂或环境条件对细胞的影响。

iDP生成

中脑多巴胺能(DA)神经元的退化是帕金森病(PD)的关键病理事件。有限的成人多巴胺能神经发生已导致新的治疗策略，例如多巴胺能前体(DP)的移植。然而，这种策略目前受到缺乏细胞来源，DPs变成胶质限制状态的倾向和移植后的肿瘤形成的抑制。在这里，我们证明通过异位表达的Brn2，Sox2和Foxa2的小鼠成纤维细胞诱导DP(iDPs)的直接转换。除了神经祖细胞标记和包括Corin，Otx2和Lmx1a的中脑基因的表达之外，iDPs在分化时局限于多巴胺能神经元谱系。移植到MPTP损伤小鼠后，iDPs分化成DA神经元，功能上减轻运动缺陷，并减少纹状体DA神经元轴突终点的损失。重要的是，在移植后的小鼠脑中没有检测到iDPs衍生的星形胶质细胞和瘤形成。我们建议从直接重编程的iDPs提供安全和有效的细胞来源的PD治疗。

Foxa2与Brn2和Sox2联合将小鼠成纤维细胞转换成具有中脑特征的神经祖细胞

我们最初的研究表明皮肤成纤维细胞可以成功的通过一套转录因子，包括Brn2，Sox2，TLX，Bmi1和c-Myc¹³成功转换成诱导的神经祖细胞(5F-iNPCs)。然而，在SHH/FGF8刺激下，5F-iNPC的多巴胺能分化效率非常低(<5％)。通过过表达限定转录因子将体细胞直接重编程为区域特异性iNPC以及亚型特异性iNPC已经成为我们的策略。已经表明Foxa2和Lmx1a是SHH和Wnt1信号传导在中脑DA神经元发育中的主要介质²³。这些因子在细胞重编程中的作用仍不清楚。我们利用Tet-On/Off系统在5F-iNPC中表达Foxa2和Lmx1a。通过在培养物中添加抗生素(嘌呤霉素和新霉素)进一步筛选成功表达Foxa2和Lmx1a基因的细胞(图8A)。在Dox的存在下，Foxa2和Lmx1a的异位表达被诱导(图8B)。如所预期的，Foxa2和Lmx1a表达都显著降低了5F-iNPC的增殖(图8C)。此外，分化相关基因，包括神经元谱系的Ngn2和Gpm6a和神经胶质谱系的Glast，显著上调。相反，神经干细胞的特异分子，如CD133和巢蛋白(Nestin)被下调(图8D)。有趣的是，酪氨酸羟化酶(TH)和负责5F-iNPCs中脑多巴胺能神经元发育的几个关键因子的表达在Foxa2和Lmx1a过表达时显着增加(图8E)，表明在决定DA神经元命运时Foxa2和Lmx1a都发挥了积极作用。Foxa2和Lmx1a对DA神经元命运的作用通过免疫细胞化学进一步证实。Foxa2和Lmx1a过表达不影响星形胶质细胞分化和神经元成熟(图9A)。在具有SHH/FGF8的神经元分化条件下，伴随着Foxa2和Lmx1a的过表达TH+细胞群显着增加(图9B，左图)。TH⁺细胞占总MAP2⁺细胞的百分比比没有Foxa2和Lmx1a过表达的5F-iNPC高约10倍(图9B，右图)。总之，这些数据表明Foxa2可与Lmx1a联合增加iNPC中的中脑多巴胺能神经元的数量，而不影响神经元成熟和星形胶质细胞生成。

虽然中脑底板起源的中脑DA神经元的特性和成熟主要由Foxa2和Lmx1a/b^24,25调节，最近的证据表明，Foxa2可以正向调节Lmx1a/b和抑制Nkx2.2在神经祖细胞中的表达²⁶。这表明单独的Foxa2足以满足中脑多巴胺能前体细胞的特征。我们检测了这个想法通过确定Foxa2的作用，以及两个已知的重编程因子Brn2和Sox2，使体细胞直接转换成神经祖细胞。我们从Nestin-EGFP转基因小鼠(E/Nestin：EGFP)中分离和培养成年小鼠真皮成纤维细胞(SF)。根据示意性程序(图1A)，用编码Brn2，Sox2和Foxa2(BSF)的逆转录病毒感染成纤维细胞。用培养物中的EGFP监测诱导的神经祖细胞的动力学。在逆转录病毒感染后7天，我们观察到培养物中的EGFP阳性细胞，并且在感染后14天，我们观察到克隆形成(图1B)。在传代培养后获得7个克隆，仅有2个被确认为为可扩增克隆。两个可扩增克隆显示相同的性质(数据未显示)。与原代皮质神经祖细胞(WT-NPC)相比，所得细胞(命名为iDP)保留了高表达水平的Foxa2，Brn2和Sox2(图10)。同时，内源性Foxa2，Brn2和Sox2基因表达也上调，表明内源性基因网络已经启动。我们通过实时RT-PCR分析(对于引物对的序列，参见表2)通过皮肤成纤维细胞(Fbb)，WT-NPC和iDP中的几个关键神经祖细胞标记基因的表达水平来表征iDP。iDP表达高水平的神经祖细胞标志物，包括Sox1，PAX6，ZBTB16，Sox3，CD133和Nestin(图1C)。重要的是，iDP还表达高水平的Aldh1A1，Corin(Lrp4)，Lmx1a，Msx1，Ngn2，Otx2，Mash1，Pitx3和Nkx6.1(图1D)。这些基因先前报道在多巴胺能神经元增殖祖细胞中特异性表达^20,23,27,28。相比之下，不同于初期前脑神经祖细胞(NPs)，iDPs表示最低水平的FoxG1，GSX2和Nkx2.1(图1E)，指示前脑特征^10,29。这些结果表明成纤维细胞可以通过转录因子Brn2，Sox2和Foxa2的强制表达获得中脑区域特征和多巴胺能神经命运。

表2.基于SYBR-Green的定量实时RT-PCR的引物对

iDPs表达特定多巴胺能祖细胞标记物并具有多能神经元限制性分化潜能。

已经使用多唾液酸-神经细胞粘附分子(PSA-NCAM)微管相关蛋白(DCX)和Corin(Lrp4)来鉴定和分离神经元限制性前体，其来自胚胎干细胞-衍生的神经衍生物^28,30,31。我们通过用针对PSA-NCAM，DCX和Corin的特异性抗体对细胞进行免疫染色来鉴定的iDP，并且观察到表达了以上三种标记基因加上NPC的标记基因Nestin(图2A)。这表明iDP是多巴胺能神经元限制的前体。我们进一步验证iDP是否是多巴胺能神经元限制性谱系，通过在SHH和FGF8刺激的存在，接着用有神经元成熟作用的BDNF，GDNF和抗坏血酸(AA)处理下将iDP分化为神经元。单独地，通过10％血清和PDGF/毛喉素分别诱导星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。iDP中所有βIII-微管蛋白阳性神经元是TH阳性的(图2B)，表明iDP的多巴胺能神经元限制性谱系的命运。相反，在星形胶质细胞和少突胶质细胞分化后没有观察到GFAP和O4阳性细胞，表明iDP已经是神经元谱系(图2C)。作为阳性对照，当WT-NPC置于相同的星形胶质细胞和少突胶质细胞分化条件下时，会产生星形胶质细胞和少突胶质细胞(图2C)。与WT-NPC不同，iDP也表达低水平的胶质细胞系相关基因，例如Glast，Olig1/2，NG2，GFAP和S100β(图2D)。由于这些基因对角质细胞系的生长起着重要作用，这些基因的低表达谱进一步验证了iDP已经放弃了其胶质分化潜能并致力于成为神经元。

接下来，测试iDPs进入多巴胺能神经元的分化效率。在测试中采用先前描述的神经元分化方案¹⁴，并且发现超过90％的Tuj⁺神经元是TH⁺多巴胺能神经元(图3A)。令人惊讶的是，iDP分化成多巴胺能神经元的效率在缺乏预先制度模式的形成因素SHH和FGF8的情况下依然非常高(图3B)，强烈地表明iDP的多巴胺能神经命运。iDP衍生的神经元也表达突触素参与神经递质胞吐和神经内分泌³²。突触素染色在典型神经元形态学的细胞中呈阳性。相反，不同形态的相邻细胞对突触素成阴性，表明突触素的特异性染色(图3C1-3)。此外，突触素具有点状分布(图3C4)，表明体外突触形成。值得注意的是，iDP衍生的DA神经元还表现出对芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)，多巴胺转运蛋白(DAT)和脑特异性亚型囊泡单胺转运蛋白(VMAT2)免疫反应性(图4A)，这是三种主要多巴胺能神经元功能相关蛋白。重要的是，源自iDP的DA神经元表现出成熟神经元的功能膜性质。在电压钳模式下，电压门控K⁺电流和Na⁺电流可以从-80mV的保持电位诱发，以10mV步长测试电位范围为-70mV至+70mV(图4B，4C和4D)。在电流钳模式中，可以以20pA步长注射从20pA至100pA的电流测试的所有iDP中诱发动作电位(图4E和4F，n＝5)。这些结果强烈建议iDPs可以有效地分化和生成成熟和具有功能的DA神经元。

L-Myc的条件表达诱导iDP的自我更新

在iDP的产生期间，我们观察到iDP表现出有限的自我更新和克隆形成的能力，限制细胞移植所需的细胞扩增。我们通过利用Tet-On/Off系统来转换L-Myc来克服这个缺点，L-Myc是一种转化缺陷，安全和有效的方法，其可以增强iDP中的自我更新^33,34。L-Myc的条件表达在多西环素(Dox)的控制下(图5A和5B)。在DOX处理72小时后，Ki67阳性细胞的比例显着增加(图5C)，而DP的标记基因Corin和DCX的表达水平不受DOX处理的影响。这些结果证实，使用L-Myc诱导用于细胞移植的iDP扩增是安全，有效和高效的策略。

移植的iDP存活，分化为多巴胺能谱系和功能上减轻MPTP小鼠PD模型的运动缺陷

我们测试条件L-Myc表达的iDP是否是安全的，并且能够存活，在体内终末分化成特异性多巴胺能神经元。首先，我们用表达绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体标记iDP，并通过载体中的嘌呤霉素抗性进一步富集GFP⁺细胞(图11A)。然后按如图11B所示，将GFP⁺iDPs注射到SCID小鼠脑的纹状体中。在移植后6周，我们观察到移植的GFP⁺iDP来源的细胞主要分布在注射部位周围(图11C)，并且iDP移植的小鼠在注射部位并没有肿瘤形成(图11D)。这些结果都表明工程iDPs对于细胞移植是安全的。为了评价体内iDP的功能性，我们使用如前所述的PD的MPTP小鼠模型³⁵，并且在PD小鼠模型中进行细胞移植，如图6A所示的实验时间过程。用旋转杆训练小鼠，并在MPTP中毒前进行两个试验以建立基线表现。在MPTP中毒后一周，iDPs通过颅内(IC)注射植入纹状体的两侧。监测小鼠运动功能3周，然后处死用于免疫组织化学。纹状体中TH⁺DA神经元轴突末端的密度通过如前所述的数字图像分析确定³⁶。MPTP处理显着降低TH⁺纹状体末端的密度，表明纹状体中DA神经元末端有实质性损失(图6B)。第3周TH⁺纹状体末端的光密度分析显示TH⁺纹状体末端有50％损失。然而，移植iDP的MPTP小鼠使纹状体末端密度增加20％(40％的总损失，图6B)。有趣的是，大多数iDP衍生细胞是Tuj和TH双阳性，但不是GFAP阳性细胞(图6C)，表明移植的细胞在体内存活三周，并且优先分化为DA神经元而不分化为星形胶质细胞。接下来，我们评估了iDP植入对MPTP小鼠运动功能的影响。所有小鼠组在MPTP处理前都具有相似的基线运动性能(图7A)。第2周MPTP小鼠的旋转试验显示运动功能降低55％。移植iDP的MPTP小鼠增加了旋转表现(图7B，7C)。到第3周(MPTP中毒后4周)，与PBS组相比，MPTP小鼠表现出24％的运动缺陷。iDP植入组具有有益的运动效果，但并没有显着的运动缺陷恢复(P＝0.059，图7C)。在一起，这些数据表明，MPTP损伤的发展在iDPs移植后增加小鼠的运动功能。

人类iDP对Brn2，Sox2和Foxa2的异位表达

根据与小鼠细胞相同的方案，在从PD患者和105d胎儿获得的成纤维细胞中Brn2，Sox2和Foxa2被异位表达并转分化为iDP。转分化细胞还显示iDP表型，例如Corin和DCX表达和共定位(图12A-12B)。重要的是，这表明可以从帕金森病(PD)的患者制备自体iDP，然后用于体外研究和/或体内细胞替代治疗。

讨论

基于干细胞的治疗神经退行性疾病的未来是非常有希望，特别是在PD的情况下。为了实现PD的细胞的治疗，已经做出了显着的努力以在形态发生刺激后将人胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPSC)分化为中脑DA神经元^37-40。最近，将一个谱系的细胞直接转化为另一个谱系作为可移植细胞来源的替代策略。结果，诱导的DA神经元^7,41和诱导的神经干/祖细胞(iNPC)^10-13的产生并且显示出生成DA神经元的希望。然而，这些细胞的分化效率，安全性和特异性仍然是具有挑战。在本研究中，我们报告了一个新的组合三个转录因子(Brn2/Brn4，Sox2和Foxa2/Lmx1a)，成功地将小鼠皮肤成纤维细胞转化成神经祖细胞。所得的iDP是多巴胺能神经元限制性的并且独立于SHH/FGF8的预先形成因素(图1-3)。最重要的是，源自iDP的DA神经元在体外表达成熟的DA神经元标记，表现出成熟DA神经元的电生理特性(图4)，并且在体内存活6周而没有肿瘤形成(图11)，表明iDP可以作为PD治疗的安全有效的细胞来源。

以前的研究已采用Brn2/Brn4和Sox2作为神经命运决定因子直接重编程成纤维细胞成神经祖细胞^10,13,17,19，但额外的因子可能需要实现区域特异性和神经元谱系限制^10,19。Foxa2和Lmx1a似乎是支持中脑DA特异性所需的调节网络和中脑多巴胺能发育的转录控制的关键因子。为了选择性地产生多巴胺能前体，我们决定在我们实验室先前的5F-iNPC中表达Foxa2和Lmx1a。Foxa2和Lmx1a的表达赋予5F-iNPCs中脑特性，并显着增加TH⁺神经元的产量(图8，图9)，表明这两个因子可用于改善PD中基于iNPC的细胞治疗。

已知Foxa2和Lmx1a/b协同调节中脑多巴胺能祖细胞的增殖和分化。更具体地，Foxa2和Lmx1a/b是强烈的发生素(分别为SHH和Wnt1)下游的关键转录因子，其通过形成两个调节环^23,42协同控制中脑多巴胺能分化。以前对Foxa1/2的研究主要集中在中脑祖细胞的特性及其对Lmx1a/b和Helt2^6,43-45的调节作用。Foxa2表达局限于中脑底板，其中它在根据DA神经元起源的底板中发挥SHH依赖性和非依赖性作用^25,46。然而，不清楚是否Foxa2可能是中脑DA祖细胞比Lmx1a和SHH更有效的决定因素，或Foxa2是否可以作为重新编程因子有利于产生DA神经元。相比之下，假设由中脑多巴胺分化能由Foxa2和Lmx1a/b协同控制，它本身不太可能是足够的。

在这项研究中，我们测试了新的一系列转录因子，在成纤维细胞的重编程中包括Brn2和Sox2与Foxa2和Lmx1a中的一个或两个，程序如(图1A)所示。我们观察到所有组合导致感染后14天的克隆形成(数据未显示)。因此，Brn2，Sox2和Foxa2的组合或Brn2，Sox2和Lmx1a的组合可以用于转分化成纤维细胞。此外，Brn2，Sox2和Foxa2的组合成功地将成纤维细胞转化为稳定和可扩增的iDP。iDP表达特定的神经祖细胞标志物，并且还展示了由多巴胺能神经祖细胞的标记分子，例如Aldh1A1，Corin(Lrp4)，Lmx1a，Msx1，Ngn2，Otx2，Mash1，Pitx3和Nkx6.1，而且也表现出了中脑特性(图。1)。在这些标志物中，Aldh1A1和Corin已被用于特异性标记大脑中的DP和从ES细胞衍生物中分离DP。此外，DCX和PSA-NCAM已被用于分离谱系限制的神经元祖细胞^24,30,31。Otx2通过抑制Nkx2.2⁴⁸来预防祖细胞的5-羟色胺命运，并且Foxa2负调节Helt以抑制腹侧中脑中的γ-氨基丁酸能神经元分化^43-45。因为重编程因子Brn2和Sox2并不能产生DA特异性的iNPC，我们的结果表明，Foxa2可以联合Brn2和Sox2协同工作以驱动成纤维细胞直接转化成具有中脑祖细胞特性的iNPC。

应当注意的是，指定的Brn2和Brn4以前在几种转分化研究中可互换使用，这里是Brn4，Sox2和Foxa2组合(或Brn4，Sox2和Lmx1a；或Brn2，Brn4，Sox2和Foxa2；或Brn2，Brn4，Sox2和Lmx1a；或Brn2，Brn4，Sox2，Foxa2和Lmx1a)也可用于转分化成纤维细胞。

我们目前的研究表明Foxa2的异位表达正向调节Lmx1a，Otx2和其他负责DA神经元发育关键转录因子，负调节与胶质细胞发育有关的转录因子(图2)。因此，所得到的iDPs具有最小胶质细胞分化潜力的多巴胺能谱系(图2)。在BDNF，GDNF和AA的存在下，可以将iDP终末分化成成熟和功能性DA神经元而不依赖于SHH/FGF8的刺激(图3和图4)。Foxa2的这个作用与先前的报告一致，该报告显示Foxa2可以通过独立和依赖SHH机制执行中脑底板生成⁴⁶。

体内移植的NSCs/NPC_S在受伤的情况下，通常终末分化成星形胶质细胞而不是功能性神经元^15,16。我们在可控L-Myc表达(图5)的工程iDPs的战略是一种有效，安全和实际控制iDPs^33,34的自我更新的方式。当按照图6A所示的时间线将iDP移植到MPTP PD小鼠模型的纹状体中时，我们发现MPTP的注射损伤纹状体中的TH⁺神经元，而移植的iDP在细胞移植后显着恢复纹状体TH密度，并且它们几乎没有终末分化为星形胶质细胞。事实上，大多数细胞在移植后6周分化为DA神经元，并且没有观察到肿瘤或细胞生长，并且细胞移植后PD小鼠模型中运动功能的部分恢复进一步表明iDP可以作为PD治疗的有效细胞来源。

总的来说，我们证明Brn2/Brn4，Sox2和Foxa2/Lmx1a可以成功地将小鼠皮肤成纤维细胞转化为诱导神经祖细胞，Foxa2/Lmx1a赋予诱导神经祖细胞中脑和DA谱系的特性。当患者皮肤成纤维细胞用Brn2/Brn4，Sox2和Foxa2/Lmx1a在体外重编程为iDPs时，这项工作的成功还可以为建立细胞模型研究PD的发病机制提供重要的基础。最后，工程化iDP的可控的扩增进一步提供了治疗PD有前景的细胞来源。

方法

细胞制备，逆转录病毒包装，感染和直接重编程

从成年Nestin-EGFP转基因小鼠(由来自Northwestern University，Chicago，IL的Richard J Miller友情提供)分离小鼠皮肤成纤维细胞，如前所述年龄在5.5-7.0周，在内布拉斯加大学医学中心机构动物管理和使用委员会批准和遵守国家卫生研究院(NIH)伦理准则。成纤维细胞在补充有10％FBS，1×非必需氨基酸，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素的Dulbecco改良的Eagle's培养基中，在37℃，5％CO 2湿润环境中培养。在2-5代中使用成纤维细胞以避免复制性衰老。将小鼠Brn2开放阅读框(EcoRI+Not I)，Foxa2开放阅读框(BamHI+Xho I)克隆到pMXs-逆转录病毒载体(Cellbiolabs，RTV-010)中，并且pMXs-Sox2购自Addgene(Plasmid#13367)。如前所述，用Plat-E包装细胞产生逆转录病毒(pMX)。简言之，将Plat-E细胞以每个100mm皿3.6×10⁶个细胞接种。接种后24小时，使用15μLLipofectamine TM LTX转染试剂(Invitrogen)将15μg编码Sox2，Brn2和Foxa2的基于pMXs的逆转录病毒载体DNA导入Plat-E细胞。在转染后24小时，用5mL含有5％FBS的DMEM更换培养基。将来自Nestin-EGFP转基因小鼠的成纤维细胞以2×10⁵个细胞每35-mm培养皿接种。在转染后48小时和72小时，回收Plat-E培养物的含病毒的上清液，并通过0.45-μm乙酸纤维素过滤器过滤。将等体积的上清液混合并补充10μg/mL聚凝胺。将细胞在含病毒/聚凝胺的上清液中温育过夜。在感染后3天将培养基更换为NSC Basal(Stem CellTechnologies，Inc.，Vancouver，BC V5Z 1B3，Canada)补充有NSC增殖补充剂(Stem CellTechnologies，Inc。)的培养基，20ng/mL基本成纤维细胞生长因子(bFGF，BioWalkersville)和20ng/mL表皮生长因子(EGF，BioWalkersville)。9-14天后，通过荧光显微镜观察预期的的iDP克隆。

实时定量PCR

根据制造商的建议，用TRIzol试剂(Invitrogen)和RNeasy Mini Kit(QIAGENInc.，Valencia，CA)分离总mRNA。使用Transcription 1^st Strand cDNA Synthesis Kit(Roche，USA)进行逆转录。使用Select Master Mix(Life Technologies，LosAngeles，CA)，用0.5μLcDNA(对应于在15μL终体积中1μg总RNA，1.5μLH 2O，7.5μLSYBRGreen，5.5μL1mM的寡核苷酸引物对(在Fisher合成)(见表2))用RT-PCR检测神经干细胞特异性mRNA。PCR程序：1.50℃2分钟，2.95℃2分钟；3.95℃15秒，4.特异性退火温度15秒，5.72℃1分钟。步骤2-4重复40次。所有样品重复三次扩增，平均值用于进一步分析。

免疫细胞化学

将培养的细胞在室温下在用4％甲醛中固定20分钟，然后用PBS洗三次。固定的细胞在PBS配置0.2％Triton X-100透化10分钟，并在室温下用PBS配置2％BSA封闭1小时。将细胞与表2所列的一抗孵育过夜，然后用PBS洗涤三次，并在室温下用二抗温育2小时(参见表3)。使用Zeiss 710激光共聚焦扫描显微镜(Carl Zeiss，Oberkochen，Germany)获得荧光图像。

分化

对于星形胶质细胞分化，将iDP培养基用含有10％FBS的DMEM/F-12替换，并培养7天，每隔一天更换培养基。对于少突胶质细胞分化，将iDP在具有1×N2,10ng/mL PDGF(R&DSystems，Minneapolis，MN)，10ng/mL FGF-2和10μM forskolin(Sigma-Aldrich，SaintLouis，MO)的DMEM/F12)培养4天。然后，用30ng/mL 3,3,5-三碘甲状腺氨酸(T3)激素和200mM抗坏血酸(均来自Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO)替换PDGF和forskolin培养7天。对于神经元分化，不依赖SHH/FGF8方案：将iDPs在补充有1×N2,1×B27,1.0mM Glutamax，0.11mMβ-β-巯基乙醇，1.0mM双丁酰环磷腺苷(Sigma)，0.2mM抗坏血酸(Sigma)，10ng/mL脑源性神经营养因子(BDNF)(Peprotech)和10ng/mL神经胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)(Peprotech)的DMEM/F12培养基，在24-孔板中用多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的盖玻片培养4周。每3-4天更换一次培养基。除非另有说明，所有试剂均购自Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)；SHH/FGF8依赖性方案：将细胞接种在含有1×N2,10ng/mL bFGF(Peprotech)，100ng/mL SHH(Peprotech)，100ng/mL FGF8(Peprotech)的DMEM/F12的培养基中在24-孔板含多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的盖玻片上培养6天，然后换到含有1×N2,1×B27,1.0mM Glutamax，0.11mMβ-巯基乙醇，1.0mM双丁酰环磷腺苷(Sigma)，0.2mM抗坏血酸(Sigma)，10ng/mL脑源性神经营养因子(BDNF)(Peprotech)和10ng/mL胶质细胞系来源的神经营养因子(GDNF)(Peprotech)的DMEM/F12培养基中再培养4周，每3-4天换一次培养基。

逆转录病毒感染，分离和iDPs的扩增

将L-Myc克隆到Tet-All逆转录病毒载体中，其含有反向四环素控制的反式作用因子(rtTA)和四环素反应元件(TRE)启动子。用于Tet-All载体的原始骨架是来自ClontechLaboratories(Mountain View，CA，USA)的pRetroX-Tight和pRetro-rtAT-Advanced。将编码L-Myc的逆转录病毒包装在Plat-E细胞中，并用病毒感染iDP，并用新霉素(neo)筛选。

记录动作电位和总电流

通过使用Axonpatch 200B膜片钳放大器(Axon Instruments，Sunnyvale，CA)的全细胞膜片钳技术记录动作电位和总电流。pClamp 10.2程序用于数据采集。电极液由(以mM计)：105K-天冬氨酸盐，20KCl，1CaCl 2，5MgATP，10HEPES，10EGTA和25Glucose(pH7.2；320mOsm/L)组成。槽液由(以mM计)：140NaCl，5.4KCl，0.5MgCl₂，2.5CaCl₂，5.5HEPES，11葡萄糖和10蔗糖(pH7.4；330mOsm/L)组成。相同的电极液和槽液用于动作电位和总电流测量。电极液的电阻为3-5MΩ。6-13MΩ的串联电阻被电子补偿80-90％。通过一系列1-s去极化电流注射从20pA至100pA以20pA增量引发动作电位。以-80mV的保持电位诱发总电流，在500ms内通过以10mV增量步从-70到+70mV。记录的迹线在10kHz下取样并在5kHz下过滤。所有实验均在室温下进行。

MPTP处理和iDPs移植

成年雄性8周龄C57BL/6J小鼠购自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)，并在12:12小时光照/黑暗循环下饲养，在内布拉斯加大学医疗中心的动物设施中随意获取的食物和水内布拉斯加医疗中心。所有动物实验根据由内布拉斯加大学医学中心的机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。在运动功能和行为训练之前将小鼠随机分配到实验组(图6A)。MPTP处理按先前所述进行³⁵。简而言之，小鼠接受四次皮下注射，每2小时一次载体(以10ml/kg的磷酸盐缓冲液(PBS))或MPTP-HCL(20mg/kg，无碱PBS？；Sigma-AldrichCo.Louis，MO，USA)。MPTP处理和安全措施符合公布的指南⁵⁰。对于iDPs移植，在MPTP处理后7天，通过腹膜内给予氯胺酮(120mg/kg)和甲苯噻嗪(16mg/kg)将小鼠麻醉，放置在立体定位装置(Stoelting，Wood Dale，IL，www.stoeltingco.com)用于皮内注射(图6A)。在前囟上进行线性皮肤切口，并且使用手持钻孔机在前囟板后部0.2mm和前囟板侧面3.5mm处钻两个1-mm钻孔。iDP(每次注射025万个细胞)用表达GFP的逆转录病毒标记并注射到两个半球的纹状体中。生理盐水用作iDPs注射的对照。接种的坐标设置为：前囟后0.22mm，从矢状中线横向3.25mm，垂直线2.9mm的深度。使用Hamilton 10-μl注射器(Fisher)进行细胞注射。在心内灌注后，在注射后21天处死小鼠，并迅速除去脑。如前所述，以盲法方式进行TH⁺神经末梢的免疫组织化学和定量。

运动功能和行为测试

使用旋转试验来评估由移植iDPs引起的MPTP诱导的运动缺陷的恢复。装置装配有7cm直径的杆，并与自动定时仪器(Rotamex，Columbus Instruments，Inc.，Columbus，OH，USA)衔接。使小鼠习惯并在施用MPTP之前连续三天以2-12rpm的速度在加速旋转杆上进行5分钟转四个时间段。在MPTP处理前两次，以10rpm评价所有小鼠，每次试验最多90秒，以获得治疗前基线性能。在iDP植入后，在旋转杆上每周两次重新评估小鼠，持续3周。每周处理后旋转性能计算为两次试验的平均值，以及动物组的基线性能的相对比率。有或没有iDP植入的MPTP小鼠的评分标准化为PBS对照组的平均表现^35_,51。

统计分析

数据表示为平均值±SD，并通过方差分析(ANOVA)进行统计学评价，随后对配对观察数据进行Tukey检验，除非另有说明。显着性差异被认为是p值<0.05。所有测定进行至少两次，每个实验中一式三份样品。

细胞标记，移植和组织学

具有可控L-Myc(Tet-On/Off高级系统)的iDPs通过由pLenti-CMV-GFP-Puro用psPAX2和pMD2.G(Addgene)包装的慢病毒转导到293T细胞中，使用带PLUS^TM试剂的LTX试剂Invitrogen^TM)。使用293T细胞测定慢病毒制备物的滴度，范围为10⁷-10⁸IFU/ml。iDP在补充有NSC增殖补充物(Stem Cell Technologies，Inc.)，20ng/mLbFGF(BioWalkersville)和20ng/mL EGF(BioWalkersville)的NSC基础培养基中扩增，并通过加入Dox(4μg/ml)和G418(400ng/ml)筛选。从Charles River实验室购买4周龄的雄性C.B.-17SCID小鼠。所有小鼠被养在内布拉斯加大学医学中心的动物设施中。所有实验过程根据内布拉斯加大学医学中心的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案进行。简言之，将小鼠用氯胺酮(120mg/kg)和甲苯噻嗪(16mg/kg)通过腹腔注射麻醉，置于立体定位装置(Stoetling，Wood Dale，IL)中，用于在左大脑半球的颅内注射。用10-μl注射器将表达GFP的iDP(0.5×10 6/5μL)注射到小鼠脑的纹状体中。接种的坐标设置为：前囟后0.5-0.8mm，矢状中线外侧3.5mm，与垂直线的深度和角度为3.6mm和35°。将小鼠麻醉并在注射后6周用4％多聚甲醛(PFA)灌注，立即取出脑，然后置于4％PFA中固定过夜。在30％蔗糖溶液中脱水后，将大脑冷冻并在低温恒温器中切片(30μm)，然后使用Leica共聚焦显微镜和Metamorph分析软件(Molecular Devices)扫描切片。此外，将固定的脑包埋在石蜡中，切片用苏木精和伊红(H&E)染色，并且通过Ventana’s Coreo Au Slider Scanner获取并分析图像。

表3. 1^stand2^nd免疫荧光抗体

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可以单独、组合地或以未在前述实施例中特别讨论的各种排列来使用本发明的各个方面，因此本发明各方面的应用就不限于在前的描述或示出的附图中所阐述的组件的细节和排列。例如，在一个实施例中描述的各个方面能够与在其他实施例中描述的各个方面以任何方式组合。

虽然已经讨论了本发明的具体实施例，但是上述说明书是说明性的而不是限制性的。在阅读本说明书后，本发明的许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。本发明的全部范围应当通过参考权利要求及其等同物的全部范围以及说明书和这些变化来确定。

引置条款

在本说明书中引用的所有出版物，专利和专利申请书在他们的完整性中出于相同目的，如同每个单独的出版物，专利或专利申请被具体指出通过引用被并入一样。

序列表

<110> 同济大学

内布拉斯加大学董事会

<120> 一种诱导的多巴胺能前体组合物及其制备方法

<130> 160351-010100

<150> US 62/038,914

<151> 2014-08-19

<160> 74

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1338

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 1

atggcgaccg cagcgtctaa ccactacagc ctgctcacct ccagcgcctc catcgtacat 60

gccgagccgc ctggcggcat gcagcagggc gcagggggct accgcgaggc gcagagcctg 120

gtgcagggcg actacggcgc gctgcagagc aacgggcacc cgctcagcca cgctcaccag 180

tggatcaccg cgctgtccca cggcggcggc ggcgggggcg gcggcggcgg tggaggaggc 240

gggggaggcg gcgggggagg cggcgacggc tccccgtggt ccaccagccc cctaggccag 300

ccggacatca agccctcggt ggtggtacag cagggtggcc gaggcgacga gctgcacggg 360

ccaggagcgc tgcagcaaca gcatcaacag caacagcaac agcagcagca gcagcagcag 420

cagcagcagc agcaacagca gcagcaacaa cagcgaccgc cacatctggt gcaccacgct 480

gccaaccacc atcccgggcc cggggcatgg cggagtgcgg cggctgcagc tcacctccct 540

ccctccatgg gagcttccaa cggcggtttg ctctattcgc agccgagctt cacggtgaac 600

ggcatgctgg gcgcaggagg gcagccggct gggctgcacc accacggcct gagggacgcc 660

cacgatgagc cacaccatgc agaccaccac ccgcatccgc actctcaccc acaccagcaa 720

ccgcccccgc cacctccccc acaaggccca ccgggccacc caggcgcgca ccacgacccg 780

cactcggacg aggacacgcc gacctcagac gacctggagc agttcgccaa gcaattcaag 840

cagaggcgga tcaaactcgg atttactcaa gcagacgtgg ggctggcgct tggcaccctg 900

tacggcaacg tgttctcgca gaccaccatc tgcaggtttg aggccctgca gctgagcttc 960

aagaacatgt gcaagctgaa gcctttgttg aacaagtggt tggaagaggc agactcatcc 1020

tcgggcagcc ccaccagcat agacaagatc gcagcgcaag ggcgcaaacg gaaaaagcgg 1080

acctccatcg aggtgagcgt caagggggct ctggagagcc atttcctcaa atgccctaag 1140

ccctcggccc aggagatcac ctccctcgcg gacagcttac agctggagaa ggaggtggtg 1200

agagtttggt tttgtaacag gagacagaaa gagaaaagga tgacccctcc cggagggact 1260

ctgccgggcg ccgaggatgt gtatgggggt agtagggaca cgccaccaca ccacggggtg 1320

cagacgcccg tccagtga 1338

<210> 2

<211> 1086

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 2

atggccacag ctgcctcgaa tccctacagc attctcagtt ccagctccct tgtccatgcg 60

gactccgcgg gcatgcagca gggaagtcct ttccgcaatc ctcagaaact tctccaaagt 120

gactacttgc agggagttcc cagcaatggg catcccctcg ggcatcactg ggtgaccagt 180

cttagcgacg ggggcccgtg gtcctccaca ttggccacca gccccctgga ccagcaagac 240

gtgaagccgg gacgcgaaga tctgcaactg ggcgcaatca tccatcaccg ctcgccgcac 300

gtagcccacc actcgccgca cactaaccat ccgaacgcct ggggagcgag ccctgctcca 360

aactcgtcca tcacgtccag cggccaaccc ctcaatgtgt actcgcagcc aggcttcacc 420

gtgagcggta tgctggagca cgggggactc actccaccac cagctgctgc ctccacacag 480

agcctgcatc cagtgctccg ggagcctcca gaccatggtg agctgggctc gcaccactgc 540

caggaccact ctgatgaaga gactccaacc tctgatgagt tggaacagtt cgccaaacaa 600

ttcaaacaaa gaagaatcaa gttgggcttc acgcaagccg acgtggggct ggcactgggc 660

acactgtatg gcaacgtgtt ctcgcagact accatctgca ggttcgaggc cttacaactg 720

agcttcaaga acatgtgcaa gctgaaaccg ctattaaata agtggctgga ggaggctgat 780

tcatccacag gaagcccgac cagcattgac aagatcgctg ctcaaggccg caaacgcaag 840

aagcgaacct ccatcgaggt gagtgtcaag ggcgtactgg aaacacattt cctcaagtgt 900

cccaagcctg cagcgcagga gatctcctcg ctggcagaca gtctccagtt ggagaaagaa 960

gtggtgcgtg tctggttctg taatagaaga caaaaagaaa aaagaatgac tccgccaggg 1020

gatcagcagc cacacgaggt ttattcgcac acggtgaaaa cagacgcgtc ctgccacgat 1080

ctctga 1086

<210> 3

<211> 969

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 3

atgtataaca tgatggagac ggagctgaag ccgccgggcc cgcagcaagc ttcggggggc 60

ggcggcggag gaggcaacgc cacggcggcg gcgaccggcg gcaaccagaa gaacagcccg 120

gaccgcgtca agaggcccat gaacgccttc atggtatggt cccgggggca gcggcgtaag 180

atggcccagg agaaccccaa gatgcacaac tcggagatca gcaagcgcct gggcgcggag 240

tggaaacttt tgtccgagac cgagaagcgg ccgttcatcg acgaggccaa gcggctgcgc 300

gctctgcaca tgaaggagca cccggattat aaataccggc cgcggcggaa aaccaagacg 360

ctcatgaaga aggataagta cacgcttccc ggaggcttgc tggcccccgg cgggaacagc 420

atggcgagcg gggttggggt gggcgccggc ctgggtgcgg gcgtgaacca gcgcatggac 480

agctacgcgc acatgaacgg ctggagcaac ggcagctaca gcatgatgca ggagcagctg 540

ggctacccgc agcacccggg cctcaacgct cacggcgcgg cacagatgca accgatgcac 600

cgctacgacg tcagcgccct gcagtacaac tccatgacca gctcgcagac ctacatgaac 660

ggctcgccca cctacagcat gtcctactcg cagcagggca cccccggtat ggcgctgggc 720

tccatgggct ctgtggtcaa gtccgaggcc agctccagcc cccccgtggt tacctcttcc 780

tcccactcca gggcgccctg ccaggccggg gacctccggg acatgatcag catgtacctc 840

cccggcgccg aggtgccgga gcccgctgcg cccagtagac tgcacatggc ccagcactac 900

cagagcggcc cggtgcccgg cacggccatt aacggcacac tgcccctgtc gcacatgtga 960

gggctggac 969

<210> 4

<211> 1398

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 4

atgcactcgg cttccagtat gctgggagcc gtgaagatgg aagggcacga gccatccgac 60

tggagcagct actacgcgga gcccgagggc tactcttccg tgagcaacat gaacgccggc 120

ctggggatga atggcatgaa cacatacatg agcatgtccg cggctgccat gggcggcggt 180

tccggcaaca tgagcgcggg ctccatgaac atgtcatcct atgtgggcgc tggaatgagc 240

ccgtcgctag ctggcatgtc cccgggcgcc ggcgccatgg cgggcatgag cggctcagcc 300

ggggcggccg gcgtggcggg catgggacct cacctgagtc cgagtctgag cccgctcggg 360

ggacaggcgg ccggggccat gggtggcctt gccccctacg ccaacatgaa ctcgatgagc 420

cccatgtacg ggcaggccgg cctgagccgc gctcgggacc ccaagacata ccgacgcagc 480

tacacacacg ccaaacctcc ctactcgtac atctcgctca tcaccatggc catccagcag 540

agccccaaca agatgctgac gctgagcgag atctatcagt ggatcatgga cctcttccct 600

ttctaccggc agaaccagca gcgctggcag aactccatcc gccactctct ctccttcaac 660

gactgctttc tcaaggtgcc ccgctcgcca gacaagcctg gcaagggctc cttctggacc 720

ctgcacccag actcgggcaa catgttcgag aacggctgct acctgcgccg ccagaagcgc 780

ttcaagtgtg agaagcaact ggcactgaag gaagccgcgg gtgcggccag tagcggaggc 840

aagaagaccg ctcctgggtc ccaggcctct caggctcagc tcggggaggc cgcgggctcg 900

gcctccgaga ctccggcggg caccgagtcc ccccattcca gcgcttctcc gtgtcaggag 960

cacaagcgag gtggcctaag cgagctaaag ggagcacctg cctctgcgct gagtcctccc 1020

gagccggcgc cctcgcctgg gcagcagcag caggctgcag cccacctgct gggcccacct 1080

caccacccag gcctgccacc agaggcccac ctgaagcccg agcaccatta cgccttcaac 1140

caccccttct ctatcaacaa cctcatgtcg tccgagcagc aacatcacca cagccaccac 1200

caccatcagc cccacaaaat ggacctcaag gcctacgaac aggtcatgca ctacccaggg 1260

ggctatggtt cccccatgcc aggcagcttg gccatgggcc cagtcacgaa caaagcgggc 1320

ctggatgcct cgcccctggc tgcagacact tcctactacc aaggagtgta ctccaggcct 1380

attatgaact catcctaa 1398

<210> 5

<211> 1153

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 5

atgttggacg gcctgaagat ggaggagaac tttcaaagtg cgattgagac ctcggcatct 60

ttctcctctt tgctgggcag agcggtgagc cccaagtctg tctgcgaggg ctgtcagcgg 120

gtcatctcgg acaggtttct gctgcggctc aacgacagct tctggcacga gcaatgcgtg 180

cagtgtgcct cctgcaaaga gcccctggag accacctgct tctaccggga caagaagctc 240

tactgcaagt accactacga gaaactgttt gctgtcaaat gtgggggctg cttcgaggcc 300

attgcgccca atgagtttgt catgcgtgcc cagaagagcg tataccacct gagctgcttc 360

tgctgctgcg tctgtgagcg acagctgcag aagggtgacg agtttgtcct gaaggagggc 420

cagctgctct gcaaagggga ctatgagaaa gaacgggagc tgctgagcct ggtgagccct 480

gcggcctcag actcaggcaa aagcgatgat gaggagagcc tttgcaagtc agcccatggg 540

gcaggaaaag gagcatcaga ggacggcaag gaccataagc gacccaaacg tcccagaacc 600

atcctgacca ctcagcagag gagagcattc aaggcctcgt ttgaagtatc ctccaagccc 660

tgcagaaagg tgagggagac tctggctgcg gagacagggc tgagtgtccg tgtggttcag 720

gtgtggttcc agaaccagcg agccaagatg aagaagctgg cccggcgaca gcagcaacag 780

caacaggacc aacagaacac ccagaggctg acttctgctc agacaaatgg tagtgggaat 840

gcgggcatgg aagggatcat gaacccctat acaacgttgc ccaccccaca gcagctgctg 900

gccattgaac agagcgtcta caactctgat cccttccgac agggtctcac cccaccccag 960

atgcctggag atcacatgca cccctatggt gctgaacctc ttttccatga cttggatagt 1020

gatgacacat ctctcagtaa cctgggagac tgcttcctgg caacctcaga agctgggccc 1080

ctgcagtcca gagtgggaaa ccccattgac catctgtact ccatgcagaa ttcctatttc 1140

acctcttgag tct 1153

<210> 6

<211> 1332

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

atggcgaccg cagcgtctaa ccactacagc ctgctcacct ccagcgcctc catcgtgcac 60

gccgagccgc ccggcggcat gcagcagggc gcggggggct accgcgaagc gcagagcctg 120

gtgcagggcg actacggcgc tctgcagagc aacggacacc cgctcagcca cgctcaccag 180

tggatcaccg cgctgtccca cggcggcggc ggcgggggcg gtggcggcgg cggggggggc 240

gggggcggcg gcgggggcgg cggcgacggc tccccgtggt ccaccagccc cctgggccag 300

ccggacatca agccctcggt ggtggtgcag cagggcggcc gcggagacga gctgcacggg 360

ccaggcgccc tgcagcagca gcatcagcag cagcaacagc aacagcagca gcaacagcag 420

caacagcagc agcagcagca gcaacagcgg ccgccgcatc tggtgcacca cgccgctaac 480

caccacccgg gacccggggc atggcggagc gcggcggctg cagcgcacct cccaccctcc 540

atgggagcgt ccaacggcgg cttgctctac tcgcagccca gcttcacggt gaacggcatg 600

ctgggcgccg gcgggcagcc ggccggtctg caccaccacg gcctgcggga cgcgcacgac 660

gagccacacc atgccgacca ccacccgcac ccgcactcgc acccacacca gcagccgccg 720

cccccgccgc ccccgcaggg tccgcctggc cacccaggcg cgcaccacga cccgcactcg 780

gacgaggaca cgccgacctc ggacgacctg gagcagttcg ccaagcagtt caagcagcgg 840

cggatcaaac tgggatttac ccaagcggac gtggggctgg ctctgggcac cctgtatggc 900

aacgtgttct cgcagaccac catctgcagg tttgaggccc tgcagctgag cttcaagaac 960

atgtgcaagc tgaagccttt gttgaacaag tggttggagg aggcggactc gtcctcgggc 1020

agccccacga gcatagacaa gatcgcagcg caagggcgca agcggaaaaa gcggacctcc 1080

atcgaggtga gcgtcaaggg ggctctggag agccatttcc tcaaatgccc caagccctcg 1140

gcccaggaga tcacctccct cgcggacagc ttacagctgg agaaggaggt ggtgagagtt 1200

tggttttgta acaggagaca gaaagagaaa aggatgaccc ctcccggagg gactctgccg 1260

ggcgccgagg atgtgtacgg ggggagtagg gacactccac cacaccacgg ggtgcagacg 1320

cccgtccagt ga 1332

<210> 7

<211> 1086

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

atggccacag ctgcctcgaa tccctacagc attctcagtt ccacctccct agtccatgcg 60

gactctgcgg gcatgcagca ggggagtcct ttccgcaacc ctcagaaact tctccaaagt 120

gattacttgc agggagttcc cagcaatggg catcccctcg ggcatcactg ggtgaccagt 180

ctgagcgacg ggggcccatg gtcctccaca ctggccacca gccccctgga ccagcaggac 240

gtgaagcccg ggcgcgaaga cctgcaactg ggtgcgatca tccatcaccg ctcgccacac 300

gtagcccacc actcaccgca cactaaccac cccaacgcct ggggggccag cccggcaccg 360

aacccgtcta tcacgtcaag cggccaaccc ctcaacgtgt actcgcagcc tggcttcacc 420

gtgagcggca tgctggaaca cgggggactc accccacctc cagctgccgc ctctgcacag 480

agcctgcacc cggtgctccg agagcccccg gatcacggcg aactgggctc gcaccattgc 540

caggatcact ccgacgagga gacgccaacc tctgatgagt tggaacagtt cgccaaacaa 600

ttcaaacaaa gaagaatcaa gttgggcttc acgcaggccg acgtggggtt ggcgctgggc 660

acactgtatg gtaacgtgtt ctcgcagacc accatctgca ggttcgaggc cttgcagctg 720

agcttcaaaa atatgtgcaa gctgaagccc ctgctgaaca agtggctgga ggaggcggat 780

tcgtccacag ggagcccgac cagcattgac aagatcgctg cacagggccg caagcgcaag 840

aagcggacct ccatcgaggt gagtgtcaag ggcgtactgg agacgcattt cctcaagtgt 900

cccaagcctg ccgcgcagga gatctcctcg ctggcagaca gcctccagtt ggagaaggaa 960

gtggtgcgtg tctggttctg taatcgaaga caaaaagaga aaagaatgac tccgccaggg 1020

gatcagcagc cgcatgaggt ttattcgcac accgtgaaaa cagacacatc ttgccatgat 1080

ctctga 1086

<210> 8

<211> 954

<212> DNA

<213> 智人

<400> 8

atgtacaaca tgatggagac ggagctgaag ccgccgggcc cgcagcaaac ttcggggggc 60

ggcggcggca actccaccgc ggcggcggcc ggcggcaacc agaaaaacag cccggaccgc 120

gtcaagcggc ccatgaatgc cttcatggtg tggtcccgcg ggcagcggcg caagatggcc 180

caggagaacc ccaagatgca caactcggag atcagcaagc gcctgggcgc cgagtggaaa 240

cttttgtcgg agacggagaa gcggccgttc atcgacgagg ctaagcggct gcgagcgctg 300

cacatgaagg agcacccgga ttataaatac cggccccggc ggaaaaccaa gacgctcatg 360

aagaaggata agtacacgct gcccggcggg ctgctggccc ccggcggcaa tagcatggcg 420

agcggggtcg gggtgggcgc cggcctgggc gcgggcgtga accagcgcat ggacagttac 480

gcgcacatga acggctggag caacggcagc tacagcatga tgcaggacca gctgggctac 540

ccgcagcacc cgggcctcaa tgcgcacggc gcagcgcaga tgcagcccat gcaccgctac 600

gacgtgagcg ccctgcagta caactccatg accagctcgc agacctacat gaacggctcg 660

cccacctaca gcatgtccta ctcgcagcag ggcacccctg gcatggctct tggctccatg 720

ggttcggtgg tcaagtccga ggccagctcc agcccccctg tggttacctc ttcctcccac 780

tccagggcgc cctgccaggc cggggacctc cgggacatga tcagcatgta tctccccggc 840

gccgaggtgc cggaacccgc cgcccccagc agacttcaca tgtcccagca ctaccagagc 900

ggcccggtgc ccggcacggc cattaacggc acactgcccc tctcacacat gtga 954

<210> 9

<211> 1392

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

atgcactcgg cttccagtat gctgggagcg gtgaagatgg aagggcacga gccgtccgac 60

tggagcagct actatgcaga gcccgagggc tactcctccg tgagcaacat gaacgccggc 120

ctggggatga acggcatgaa cacgtacatg agcatgtcgg cggccgccat gggcagcggc 180

tcgggcaaca tgagcgcggg ctccatgaac atgtcgtcgt acgtgggcgc tggcatgagc 240

ccgtccctgg cggggatgtc ccccggcgcg ggcgccatgg cgggcatggg cggctcggcc 300

ggggcggccg gcgtggcggg catggggccg cacttgagtc ccagcctgag cccgctcggg 360

gggcaggcgg ccggggccat gggcggcctg gccccctacg ccaacatgaa ctccatgagc 420

cccatgtacg ggcaggcggg cctgagccgc gcccgcgacc ccaagaccta caggcgcagc 480

tacacgcacg caaagccgcc ctactcgtac atctcgctca tcaccatggc catccagcag 540

agccccaaca agatgctgac gctgagcgag atctaccagt ggatcatgga cctcttcccc 600

ttctaccggc agaaccagca gcgctggcag aactccatcc gccactcgct ctccttcaac 660

gactgtttcc tgaaggtgcc ccgctcgccc gacaagcccg gcaagggctc cttctggacc 720

ctgcaccctg actcgggcaa catgttcgag aacggctgct acctgcgccg ccagaagcgc 780

ttcaagtgcg agaagcagct ggcgctgaag gaggccgcag gcgccgccgg cagcggcaag 840

aaggcggccg ccggagccca ggcctcacag gctcaactcg gggaggccgc cgggccggcc 900

tccgagactc cggcgggcac cgagtcgcct cactcgagcg cctccccgtg ccaggagcac 960

aagcgagggg gcctgggaga gctgaagggg acgccggctg cggcgctgag ccccccagag 1020

ccggcgccct ctcccgggca gcagcagcag gccgcggccc acctgctggg cccgccccac 1080

cacccgggcc tgccgcctga ggcccacctg aagccggaac accactacgc cttcaaccac 1140

ccgttctcca tcaacaacct catgtcctcg gagcagcagc accaccacag ccaccaccac 1200

caccagcccc acaaaatgga cctcaaggcc tacgaacagg tgatgcacta ccccggctac 1260

ggttccccca tgcctggcag cttggccatg ggcccggtca cgaacaaaac gggcctggac 1320

gcctcgcccc tggccgcaga tacctcctac taccaggggg tgtactcccg gcccattatg 1380

aactcctctt aa 1392

<210> 10

<211> 402

<212> DNA

<213> 智人

<400> 10

atgaagaagc tggccaggcg acagcagcag cagcagcaag atcagcagaa cacccagagg 60

ctgagctctg ctcagacaaa cggtggtggg agtgctggga tggaaggaat catgaacccc 120

tacacggctc tgcccacccc acagcagctc ctggccatcg agcagagtgt ctacagctca 180

gatcccttcc gacagggtct caccccaccc cagatgcctg gagaccacat gcacccttat 240

ggtgccgagc cccttttcca tgacctggat agcgacgaca cctccctcag taacctgggt 300

gactgtttcc tagcaacctc agaagctggg cctctgcagt ccagagtggg aaaccccatt 360

gaccatctgt actccatgca gaattcttac ttcacatctt ga 402

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 11

gagtgtgacg tgcttccaga 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 12

tggtcccagt tgatcatggc 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 13

tgcgctgtcg ttatcggac 19

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 14

ggtagcgatt cctctggaag g 21

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 15

acggcctgaa gatggagga 19

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 未智

<220>

<223> 合成

<400> 16

cagaaacctg tccgagatga c 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 17

ctgcacagta tggccgagat g 21

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 18

ccgggttatg tgagcccaa 19

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 19

tgctgctatg acttctttgc c 21

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 20

gcttcctgtg atcggccat 19

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 21

tggaggtgcc tatcagagag a 21

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 22

gtgagatcca gtaacgcatt ca 22

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 23

gcaaccgggt caagttggt 19

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 24

gtcgttggag tagttggggg 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 25

gacattcccg gacacacacc 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 26

ctcctcgtcc tcctcctcgt 20

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 27

caaggctgac gcacttgga 19

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 28

cttgccgttc ttcttgtcgc 20

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 29

tatctaaagc aaccgcctta cg 22

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 30

aagtccatac ccgaagtggt c 21

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 31

catcatcaag gactcctcac gg 22

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 32

gacatcacca acggggacg 19

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 33

atgaagcgcc aggctaagg 19

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 34

ggtttgccgt ctttgactag g 21

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 35

ctggaacagc aaaacaaggc gctgg 25

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 36

tccagcctca ggttggtttc atc 23

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 37

accaaaagca acggagaaga g 21

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 38

ggcattccga aacaggtaac tc 22

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 39

ccctgaagtc gaggagctg 19

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 40

ctgctgcacc tctaagcga 19

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 41

tcttccaccg catcccttct 20

<210> 42

<211> 23

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 42

ccgagtaggg taggataact tcg 23

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 43

tccccagaac ccgatgatct t 21

<210> 44

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 44

cgtggacgag gacacagtc 19

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 45

aggggttcag cttttcggat t 21

<210> 46

<211> 23

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 46

agtgttatca ttctccgggg tag 23

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 47

tggttgccct cattgatgtc t 21

<210> 48

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 48

cccatcccca tcttcgtcc 19

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 49

gagatgatca gcatgtacct gcc 23

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 50

gtagtgctgt ggcagcgagt 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 51

tggcaaacaa cctgcctatg 20

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 52

tgcacgagta tgaggaggtc t 21

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 53

tgttgttggc gcaaatgtgg 20

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 54

tgttccttga gcagataggg a 21

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 55

cagctcgaga gaacgcatca 20

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 56

acggggttct tgagttcagt 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 57

ctgggacttt gtgcgatgtg 20

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 58

cggtggaaga ggatctcaaa ca 22

<210> 59

<211> 21

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 59

ttctacgact atgactgcgg a 21

<210> 60

<211> 22

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 60

tgatggaagc ataattcctg cc 22

<210> 61

<211> 24

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 61

agctggagaa ggaggtggtg agag 24

<210> 62

<211> 31

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 62

cacctgctac ctgatatagg atagtccagt g 31

<210> 63

<211> 24

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 63

agctggagaa ggaggtggtg agag 24

<210> 64

<211> 23

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 64

tttatcgtcg accactgtgc tgg 23

<210> 65

<211> 24

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 65

cctccgggac atgatcagca tgta 24

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 66

cggcatcacg gtttttgcgt 20

<210> 67

<211> 24

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 67

cctccgggac atgatcagca tgta 24

<210> 68

<211> 23

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 68

tttatcgtcg accactgtgc tgg 23

<210> 69

<211> 27

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 69

tcaaccaccc cttctctatc aacaacc 27

<210> 70

<211> 26

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 70

tgggtagtgc atgacctgtt cgtagg 26

<210> 71

<211> 23

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 71

gatcccttcc gacagggtct cac 23

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 72

agactgcctt gggaaaagcg 20

<210> 73

<211> 27

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 73

tcaaccaccc cttctctatc aacaacc 27

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 合成

<400> 74

agactgcctt gggaaaagcg 20

Claims (25)

1.诱导的多巴胺能前体(iDP)，包括选自以下的异位表达的基因或蛋白质：

(1)Brn2和Brn4中的一个或两个，或其变体，

(2)Sox2或其变体，和

(3)Foxa2和Lmx1a中的一种或两种，或其变体，

在不是多巴胺能前体的体细胞中。

2.如权利要求1所述的iDP，其特征在于，其包含异位表达的Brn2或其变体，Sox2或其变体和Foxa2或其变体。

3.如权利要求1或2所述的iDP，其特征在于，所述异位表达的基因由携带它们的一种或多种载体表达，或所述异位表达的蛋白由编码它们的一种或多种mRNA表达。

4.如权利要求1或2所述的iDP，其特征在于，所述iDP是多巴胺能神经元谱系限制性祖细胞，并且不分化成神经胶质细胞。

5.如权利要求1或2所述的iDP，其特征在于，iDP的分化不依赖于选自SHH和FGF8的形态发生素。

6.如权利要求1或2所述的iDP，其特征在于，所述iDP还包含异位表达的L-Myc。

7.如权利要求6所述的iDP，其特征在于，所述异位表达的L-Myc在多西环素的控制下表达。

8.如权利要求1,2或7中任一项所述的iDP，其特征在于，所述体细胞是成纤维细胞。

9.如权利要求8所述的iDP，其特征在于，所述体细胞在体外存在。

10.如权利要求1,2或7中任一项所述的iDP，其特征在于，其用于治疗神经变性疾病，所述神经变性疾病选自：帕金森病，抑郁症，痴呆和精神分裂症。

11.如权利要求1,2或7中任一项所述的iDP群体，其特征在于，所述群体总数超过80％或超过90％能够分化成多巴胺能神经元。

12.一种将体细胞转分化为iDP的方法，其特征在于，在不是多巴胺能前体的体细胞中，包括异位表达选自以下的基因：(1)Brn2和Brn4中的一个或两个，(2)Sox2和(3)Foxa2和Lmx1a中的一个或两个，或任何一种或多种前述的变体。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括在体细胞中异位表达Brn2，Sox2和Foxa2，或前述任何一种或多种的变体。

14.如权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述体细胞是成纤维细胞。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述体细胞在体外存在。

16.如权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述体细胞来自需要用iDP进行细胞或组织替代治疗的患者。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述患者患有帕金森病，抑郁症，痴呆或精神分裂症。

18.一种治疗神经变性疾病的方法，其特征在于，包括对有需要的患者施用权利要求1，2和7中任一项所述的iDP。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述神经变性疾病是帕金森病，抑郁症，痴呆或精神分裂症。

20.一种鉴定调节多巴胺能神经元发育药剂的方法，其特征在于，包括权利要求1，2和7中任一项所述iDP群体受测试剂，其中所述iDP分化为多巴胺能神经元的变化指示测试试剂在多巴胺能神经元发育中的调节作用。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述变化是以下的一种或多种：细胞生长，细胞存活或一种或更多基因表达变化，如酪氨酸羟化酶(TH)，Sox1，PAX6，ZBTB16，Sox3，CD133，巢蛋白(Nestin)，Aldh1A1，Corin(Lrp4)，Lmx1a，Msx1，Ngn2，Otx2，Mash1，Pitx3和Nkx6.1，多唾液酸神经细胞粘附分子(PSA-NCAM)和/或微管相关蛋白(DCX)。

22.如权利要求20或21的方法，其特征在于，所述iDP从患者的体细胞转分化而来，其中所述患者患有帕金森病，抑郁症，痴呆或精神分裂症，并且其中所述方法鉴定用于治疗帕金森病，抑郁症，痴呆或精神分裂症的药剂。

23.一种组合物，其特征在于，其包含一种或多种携带独立基因的载体，所述基因选自：

(1)Brn2和Brn4中的一个或两个，或其变体，

(2)Sox2或其变体，和

(3)Foxa2和Lmx1a中的一种或两种，或其变体。

24.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，所述一种或多种载体携带Brn2或其变体，Sox2或其变体和Foxa2或其变体。

25.如权利要求23或24所述的组合物，其特征在于，所述载体是病毒载体。