JP6316938B2 - Ｈｍｇａ２を用いて非神経細胞からリプログラミングされた誘導神経幹細胞を調製する方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＨＭＧＡ２を用いて非神経細胞からリプログラミングされた誘導神経幹細胞を調製する方法に関する。

幹細胞は、一般的に、全能性または多能性に分類される。全能性幹細胞は、全ての細胞を生じる分化能を有する。これは、体内における異なる種類の細胞の全てを生成させる。受精卵細胞は全能性幹細胞の一例である。多能性幹細胞は、３つの主要な胚葉または胚そのものに由来する体内における任意の細胞型を生成させる。

胚性幹細胞（ＥＳＣ）のような多能性幹細胞は、多能性、即ち、多様な細胞型に分化する能力を維持しつつ迅速に増殖する。胚性幹細胞は、細胞移植治療に対する有望な供給源である。

これまで多能性幹細胞は、主に核移植及び細胞融合により生成された（非特許文献１）。しかし、前記の２つの方法は、胚性幹細胞を使用するため、研究及び治療用の両方において倫理的ジレンマが提起される。

最近、誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）の発見により、胚性幹細胞の使用における前記問題を克服することができるようになった。「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」とは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）と類似した特性を示す細胞である。誘導多能性幹細胞は、２００６年にマウス線維芽細胞において（非特許文献２）、及び２００７年にはヒト線維芽細胞において（非特許文献３、４）、特定因子（ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒ）の発現を増加させることで最初に生成された。

これらの研究では、成熟した体細胞のｉＰＳＣへのリプログラミングを開始するために、Ｏｃｔ-３/４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ-Ｍｙｃを含み（非特許文献５、６）、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８を使用した（非特許文献７）。しかし、ｉＰＳＣは、胚性幹細胞のようにテラトーマという癌が発生すると共に、生体に移植する際に、分化がうまく調整できず、目的とする細胞への生体内での変換ができないという限界を有している。

従って、このような限界を克服するために、最近では、直接的な誘導法または直接リプログラミング法（直接変換/リプログラミング）を通じて、特定の系統の細胞へと分化させる技術が注目を集めている。当該技術は、完全に分化が終わった細胞、即ち、線維芽細胞に特定の系統特異的遺伝子等を導入し、多分化能の状態を経ずに直接特定の細胞を誘導する技術であり、多分化能細胞の腫瘍形成（テラトーマ）のリスクを排除することができる技術である。特に、一度損傷されると、恒久的にダメージを受け得る神経細胞の場合、世界の多くの研究者が活発に直接誘導を試みた。その結果、２０１０年に米国のＭａｒｉｕｓ Ｗｅｒｎｉｇ教授チームが、線維芽細胞から機能することのできるニューロンを直接誘導することに成功した（非特許文献８）。しかし、自己再生能のない誘導されたニューロンは、体外で一定期間以上の培養が困難であり、従って、十分な量の細胞を確保することができないため、直接リプログラミングに関与する分子細胞学的メカニズムを含め、細胞治療に必要な十分な量の細胞を得ることが現実的に不可能である。

その後、ドイツの２つの研究チームでは、マウス線維芽細胞に遺伝子導入をすることにより誘導神経幹細胞（ｉＮＳＣ；ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を調製することに成功した（非特許文献９）。ヒトの場合、線維芽細胞にＳＯＸ２遺伝子１つを導入してｉＮＳＣ誘導が成功したという報告があった（非特許文献９）。

しかし、従来、このような因子を用いて誘導神経幹細胞を調製する場合、これらは誘導効率が低く、神経細胞の増殖が困難であることから、治療目的で使用するには限界があるという問題があった。

Shinya Yamanaka、Pluripotency and Nuclear Reprogramming、Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.363（1500）、2079-2087、June 27、2008 Takahashi,Y.,及びS.Yamanaka,Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors,Cell 126：663-676（2006） Yu Junyingら、Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic cells, Science 318: 1917-1920 (2007) Takahashi, K. ら, Induction of Pluripotent Stem Cell From Adult Human Fibroblasts by Defined Factors, Cell 131: 861-872 (2007) Takahashi、Cell、126：663-676 Takahashi、Cell、131：861-872 Junying、Cell 318：1917-1920 Vierbuchen T, Ostermeier A, Pang ZP, Kokubu Y, Sudhof TC, Wernig M (2010) Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature 463(7284):1035-1041. doi:10.1038/nature08797 Thier M. Worsdorfer P, Lakes YB, Gorris R, Herms S, Opitz T, Seiferling D, Quandel T, Hoffmann P, Nothen MM, Brustle O, Edenhofer F (2012) Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell 10(4):473-479. doi:10.1016/j.stem.2012.03.003

本発明は、前記のような従来技術の問題を解決するために、分化した細胞から誘導神経幹細胞または神経細胞を生成できる新規な方法、及びこれにより生成される誘導神経幹細胞または神経細胞を提供することを目的とする。

本発明の一つの目的は、ＳＯＸ２（ＳＲＹ(ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ)-ｂｏｘ２）タンパク質またはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ２（Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ＡＴ-ｈｏｏｋ２）タンパク質またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を含む、非神経細胞の神経幹細胞（ＮＳＣ）へのリプログラミングを誘導するためのキットを提供することである。

本発明の他の目的は、（ａ）ＳＯＸ２タンパク質もしくはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ２タンパク質もしくはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を非神経細胞に送達するか、または非神経細胞においてＳＯＸ２タンパク質及びＨＭＧＡ２タンパク質の発現を増加させる段階、及び（ｂ）段階（ａ）の細胞を培養する段階を含み、非神経細胞からリプログラミングされた誘導神経幹細胞またはそこから分化した神経細胞を調製する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、前記方法によって調製された誘導神経幹細胞または前記誘導神経幹細胞から分化した神経細胞を提供することである。

本発明の他の目的は、前記誘導神経幹細胞または前記誘導神経幹細胞から分化した神経細胞を有効成分として含む、神経細胞の再生のための細胞治療用生成物を提供することである。

本発明の他の目的は、ＳＯＸ２タンパク質またはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ２タンパク質またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を有効成分として含む、神経細胞の損傷に関連する疾患の予防または治療のための薬学的組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、１）単離した非神経細胞を準備する第１段階、２）ＳＯＸ２タンパク質もしくはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ２タンパク質もしくはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を非神経細胞に送達するか、または非神経細胞においてＳＯＸ２タンパク質及びＨＭＧＡ２タンパク質の発現を増加させることにより、誘導神経幹細胞の生成を誘導する第２段階、３）任意で、第２段階で生成された誘導神経幹細胞から神経細胞を形成する第３段階、及び４）第１段階の後または第２段階の後に候補物質で処理し、候補物質処理に応じて誘導神経幹細胞または神経細胞が生成されたか否かまたは生成レベルを確認する第４段階を含む、神経幹細胞または神経細胞の再生促進剤または再生抑制剤のスクリーニング法を提供することである。

本発明の他の目的は、１）単離した非神経細胞を準備する第１段階、２）ＳＯＸ２タンパク質もしくはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ２タンパク質もしくはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を非神経細胞に送達するか、または非神経細胞においてＳＯＸ２タンパク質及びＨＭＧＡ２タンパク質の発現を増加させることにより、誘導神経幹細胞の生成を誘導する第２段階、３）第２段階において生成された誘導神経幹細胞から神経細胞を形成する第３段階、及び４）第３段階において形成された神経細胞を候補物質で処理し、前記候補物質が、前記非神経細胞が由来する対象に対してカスタマイズされた、神経細胞の治療剤であるか否かを確認する第４段階を含む、個人用にカスタマイズされた、神経細胞の治療剤のスクリーニング法を提供することである。

本発明の他の目的は、ＨＭＧＡ２タンパク質またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を有効成分として含む、非神経細胞の神経幹細胞（ＮＳＣ）へのリプログラミングを促進するための組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、ＨＭＧＡ２タンパク質またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を有効成分として含む、細胞増殖のための組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、ＨＭＧＡ２タンパク質またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を有効成分として含む、細胞老化を抑制するための組成物を提供することである。
[本発明1001]
ＳＯＸ2（ＳＲＹ(ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ)-ｂｏｘ2）タンパク質またはＳＯＸ2タンパク質をコードする核酸分子、及び
ＨＭＧＡ2（Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ＡＴ-ｈｏｏｋ2）タンパク質またはＨＭＧＡ2タンパク質をコードする核酸分子
を含む、非神経細胞の神経幹細胞（ＮＳＣ）へのリプログラミングを誘導するためのキット。
[本発明1002]
前記ＳＯＸ2タンパク質をコードする核酸分子及びＨＭＧＡ2タンパク質をコードする核酸分子は、それぞれ独立して発現ベクターに含まれる、本発明1001のキット。
[本発明1003]
前記ＨＭＧＡ2タンパク質をコードする核酸分子は、クロマチン調節因子（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）である、本発明1001のキット。
[本発明1004]
（ａ）ＳＯＸ2タンパク質またはＳＯＸ2タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ2タンパク質またはＨＭＧＡ2タンパク質をコードする核酸分子を非神経細胞に送達するか、または非神経細胞においてＳＯＸ2タンパク質及びＨＭＧＡ2タンパク質の発現を増加させる段階、及び
（ｂ）段階（ａ）の細胞を培養する段階
を含む、非神経細胞からリプログラミングされた誘導神経幹細胞またはそこから分化した神経細胞を調製するための方法。
[本発明1005]
（ｃ）段階（ｂ）で得られた培養物から神経幹細胞様コロニーを分離する段階をさらに含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
段階（ｂ）は、神経細胞分化培地上で培養する段階を含み、非神経細胞から誘導神経幹細胞が形成され、前記誘導神経幹細胞から神経細胞が形成されることを特徴とする、本発明1004の方法。
[本発明1007]
段階（ａ）は、ＳＯＸ2タンパク質もしくはＳＯＸ2タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ2タンパク質もしくはＨＭＧＡ2タンパク質をコードする核酸分子を、非神経細胞の培地に添加すること、ＳＯＸ2タンパク質もしくはＳＯＸ2タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ2タンパク質もしくはＨＭＧＡ2タンパク質をコードする核酸分子を、非神経細胞に直接注入すること、またはＳＯＸ2タンパク質をコードする核酸分子及びＨＭＧＡ2タンパク質をコードする核酸分子を挿入したウイルスベクターをトランスフェクションしたパッケージング細胞から取得したウイルスを用いて非神経細胞を感染させることにより行われる、本発明1004の方法。
[本発明1008]
前記非神経細胞においてＳＯＸ2タンパク質またはＨＭＧＡ2タンパク質の発現を増加させる段階は、前記非神経細胞内にＳＯＸ2またはＨＭＧＡ2の発現調節因子をそれぞれ導入することを特徴とする、本発明1004の方法。
[本発明1009]
前記ＨＭＧＡ2の発現調節因子は、ｌｅｔ-7ｍｉＲＮＡクラスター阻害剤またはＰＤＥ4Ｄ阻害剤である、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記ＳＯＸ2の発現調節因子はＰＤＥ4Ｄ阻害剤である、本発明1008の方法。
[本発明1011]
前記細胞はヒトに由来する、本発明1004の方法。
[本発明1012]
前記非神経細胞は体細胞または成体幹細胞である、本発明1004の方法。
[本発明1013]
前記体細胞は血液細胞である、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記成体幹細胞は間葉系幹細胞である、本発明1012の方法。
[本発明1015]
本発明1004〜1014のいずれかの方法により調製された誘導神経幹細胞、または前記誘導神経幹細胞から分化した神経細胞。
[本発明1016]
本発明1015の誘導神経幹細胞または前記誘導神経幹細胞から分化した神経細胞を有効成分として含む、神経細胞再生のための細胞治療用生成物。
[本発明1017]
ＳＯＸ2タンパク質またはＳＯＸ2タンパク質をコードする核酸分子、及び
ＨＭＧＡ2タンパク質またはＨＭＧＡ2タンパク質をコードする核酸分子
を有効成分として含む、神経細胞の損傷に関連する疾患の予防または治療のための薬学的組成物。
[本発明1018]
前記神経細胞の損傷に関連する疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、虚血性脳症、脱髄疾患、多発性硬化症、癲癇、神経変性疾患及び脊髄損傷からなる群より選択される、本発明1017の薬学的組成物。
[本発明1019]
1）単離した非神経細胞を準備する第1段階、
2）ＳＯＸ2タンパク質もしくはＳＯＸ2タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ2タンパク質もしくはＨＭＧＡ2タンパク質をコードする核酸分子を非神経細胞に送達するか、または非神経細胞においてＳＯＸ2タンパク質及びＨＭＧＡ2タンパク質の発現を増加させることにより、誘導神経幹細胞の生成を誘導する第2段階、
3）任意で、第2段階で生成された誘導神経幹細胞から神経細胞を形成する第3段階、及び
4）第1段階または第2段階の後に候補物質で処理し、候補物質処理に応じて誘導神経幹細胞または神経細胞が生成されたか否かまたはその生成レベルを確認する第4段階
を含む、神経幹細胞または神経細胞の再生促進剤または再生抑制剤のスクリーニング法。
[本発明1020]
第4段階で誘導神経幹細胞または神経細胞の生成レベルが増加する場合に、前記候補物質を、神経幹細胞または神経細胞の再生促進剤として判定する段階をさらに含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
患者から単離した非神経細胞を用いて、神経幹細胞または神経細胞のための、患者に合わせてカスタマイズされた再生促進剤または患者に合わせてカスタマイズされた再生抑制剤をスクリーニングする、本発明1019または1020の方法。
[本発明1022]
1）単離した非神経細胞を準備する第1段階、
2）ＳＯＸ2タンパク質もしくはＳＯＸ2タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ2タンパク質もしくはＨＭＧＡ2タンパク質をコードする核酸分子を非神経細胞に送達するか、または非神経細胞においてＳＯＸ2タンパク質及びＨＭＧＡ2タンパク質の発現を増加させることにより、誘導神経幹細胞の生成を誘導する第2段階、
3）第2段階で生成された誘導神経幹細胞から神経細胞を形成する第3段階、及び
4）第3段階で形成された神経細胞を候補物質で処理し、前記候補物質が、前記非神経細胞が由来する対象に対してカスタマイズされた、神経細胞の治療剤であるか否かを確認する第4段階
を含む、神経細胞のための個人用にカスタマイズされた治療剤のスクリーニング法。
[本発明1023]
ＨＭＧＡ2タンパク質またはＨＭＧＡ2タンパク質をコードする核酸分子を有効成分として含む、非神経細胞の神経幹細胞（ＮＳＣ）へのリプログラミングを促進するための組成物。
[本発明1024]
ＨＭＧＡ2タンパク質またはＨＭＧＡ2タンパク質をコードする核酸分子を有効成分として含む、細胞増殖のための組成物。
[本発明1025]
ＨＭＧＡ2タンパク質またはＨＭＧＡ2タンパク質をコードする核酸分子を有効成分として含む、細胞老化を抑制するための組成物。
[本発明1026]
前記細胞は臍帯血由来の間質細胞である、本発明1024または1025の組成物。
[本発明1027]
本発明1015の誘導神経幹細胞または前記誘導神経幹細胞から分化した神経細胞を、これを必要とする対象に投与する段階を含む、神経細胞の損傷に関連する疾患を予防または治療するための方法。
[本発明1028]
ＳＯＸ2タンパク質またはＳＯＸ2タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ2タンパク質またはＨＭＧＡ2タンパク質をコードする核酸分子を、これを必要とする対象に投与する段階を含む、神経細胞の損傷に関連する疾患を予防または治療するための方法。

本発明による誘導神経幹細胞の生成方法は、誘導因子としてＳＯＸ２とＨＭＧＡ２の２つの誘導因子のみを用いて、非神経細胞から誘導神経幹細胞を調製することができるため、従来の４つまたは５つの誘導因子を利用した生成方法よりも効率的なやり方で誘導神経幹細胞を調製することができる。また、本発明の方法は、ＳＯＸ２遺伝子１つだけを導入したときよりも誘導効率及び増殖力が著しく優れているため、治療目的で活用する可能性をより高めることができる。

本発明は、神経幹細胞へのリプログラミング過程においてリプログラミング因子の組み合わせにＯｃｔ４を使用しなかったため、逆分化（脱分化）過程を経ずに、分化した細胞を神経幹細胞へと直接リプログラミングさせたと見られる。このように調製された誘導神経幹細胞は、マウスの脳組織に移植した場合にも、自己再生能と増殖力を備えているだけでなく、ニューロン、星状膠細胞、希突起膠細胞などのような神経関連細胞へと十分に分化が可能であるため、治療目的で活用されることが期待される。

明視野顕微鏡を通じて観察したヒト皮膚線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ Ｄｅｒｍａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ｈＤＦ）の形態を示す。 明視野顕微鏡を通じて観察した、ＳＯＸ２が形質導入されたｈＤＦから誘導されたｉＮＳＣを示す。 ＳＯＸ２形質導入により生成された初期ニューロスフェア様コロニーの明視野イメージを示す。 ＰＡＸ６、ネスチンに対する抗体を用いた、ｈＤＦ-ｉＮＳＣのＮＳＣ特異的マーカータンパク質における免疫細胞化学的分析結果を示す。 ビメンチン、ＳＯＸ２に対する抗体を用いた、ｈＤＦ-ｉＮＳＣのＮＳＣ特異的マーカータンパク質における免疫細胞化学的分析結果を示す。 ｈＤＦ、Ｈ９-ＮＳＣ及びｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２）における全体のｍｉＲＮＡ発現プロファイルのヒートマップを示す。 ｈＤＦ、Ｈ９-ＮＳＣ及びｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２）における神経系特異的ｍｉＲＮＡのヒートマップを示す。 ｈＤＦ、Ｈ９-ＮＳＣ及びｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２）におけるｍｉＲ-１２４-３ｐの定量的リアルタイムＰＣＲの結果を示す。 ｈＤＦ、Ｈ９-ＮＳＣ及びｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２）におけるｍｉＲ-９-５ｐ/-３ｐの定量的リアルタイムＰＣＲの結果を示す。 定量的リアルタイムＰＣＲを通じて測定したｈＤＦ、Ｈ９-ＮＳＣ、ｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２）及びｈＥＳＣにおける胚性幹細胞特異的ｍｉＲ-３０２/３６７ファミリーの相対的な発現レベルを示す。 定量的リアルタイムＰＣＲを通じて測定したｈＤＦ、Ｈ９-ＮＳＣ及びｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２）におけるｌｅｔ-７/ｍｉＲ-９８ファミリーの相対的な発現レベルを示す。 ＳＯＸ２が形質導入されたｈＤＦへの、ｍｉＲ-１２４-３ｐ、ｍｉＲ-９-５ｐ、ｍｉＲ-９-３ｐ、抗ｌｅｔ-７ｂ、及びｌｅｔ-７ｂのトランスフェクション後に測定した、ＰＡＸ６及びネスチン陽性コロニー形成の効率を示す。 ｈＤＦ対照群、ＳＯＸ２、ＳＯＸ２/ＣＭＹＣ、ＳＯＸ２/ＬＩＮ２８及びＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２が形質導入されたｈＤＦで行ったＭＴＴ細胞増殖アッセイの結果を示す。 ＳＯＸ２、ＳＯＸ２/ＣＭＹＣ、ＳＯＸ２/ＬＩＮ２８及びＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２が形質導入されたｈＤＦで測定したコロニーの形成時間を示す。 ＳＯＸ２、ＳＯＸ２/ＣＭＹＣ、ＳＯＸ２/ＬＩＮ２８及びＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２が形質導入されたｈＤＦで測定したＰＡＸ６及びネスチン陽性コロニー形成の効率を示す。 ウイルス導入から７日後にＮＳＣ細胞表面マーカー（ＣＤ４４）及び陽性マーカー（ＣＤ１８４）で行った、ｈＤＦ対照群、ＳＯＸ２、ＳＯＸ２/ＣＭＹＣ、ＳＯＸ２/ＬＩＮ２８及びＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２が形質導入されたｈＤＦのフローサイトメトリー分析結果を示す。 明視野顕微鏡を通じて観察したｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２）の形態、ならびにＰＡＸ６、ネスチン、Ｋｉ６７及びＨＭＧＡ２発現の免疫細胞化学的分析結果を示す。 ｈＤＦの発現レベルと比較したＨ９-ＮＳＣ、ｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２）及びｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２）におけるＮＳＣ特異的ｍｉＲＮＡ発現の定量的リアルタイムＰＣＲ分析結果を示す。 ｈＤＦ、Ｈ９-ＮＳＣ、ｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２）及びｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２）由来のＤＮＡにおける重硫酸塩処理によるＳＯＸ２遺伝子プロモーターのメチル化パターンの分析結果を示す。 ３つの主要な細胞型、即ち、ニューロン（α-インターネキシン、ＴＨ、ＤＣＸ、ＣｈＡＴ、ＮＦ、ＭＡＰ２及びＴＵＪ１）、星状膠細胞（ＧＦＡＰ）、及び希突起膠細胞（ＯＬＩＧ２及びＯ４）への分化後のｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２）における免疫細胞化学的分析結果を示す。 電位固定計量により記録されたｈｉＮＳＣ（ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）由来のニューロンのナトリウム電流及び活動電位を示す。 リドカインによるナトリウム電流の遮断後の電位固定計量により記録されたｈｉＮＳＣ由来のニューロンのナトリウム電流及び活動電位を示す。 洗浄（ｗａｓｈｏｕｔ）後のナトリウム電流の回復による電位固定計量により記録されたｈｉＮＳＣ由来のニューロンのナトリウム電流及び活動電位を示す。 ４週齢のマウスの海馬回部位へのＣＭ-ＤｉＩラベリングされたｈｉＮＳＣの移植後に、ｈｉＮＳＣがニューロン（ＴＵＪ１）、星状膠細胞（ＧＦＡＰ）及び希突起膠細胞（ＭＢＰ）に分化し、ＣＭ-ＤｉＩと共局在すること（ｃｏ-ｌｏｃａｌｉｚｅｄ）を示す。 ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２でヒト臍帯血由来の間葉系幹細胞からｉＮＣＳを生成する過程に関する図である。ウイルス導入後７日が経過した時にニューロスフェア様コロニーが形成され、ｈＵＣＢ-ＭＳＣ由来のｈｉＮＳＣがＰＡＸ６（赤色）、ネスチン（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）で免疫染色されたことを示す。 ＳＯＸ２、ＳＯＸ２/ＣＭＹＣ、ＳＯＸ２/ＬＩＮ２８及びＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２が形質導入された老化したｈＵＣＢ-ＭＳＣの形態（２１日経過）を示す。老化したｈＵＣＢ-ＭＳＣは、β-ガラクトシダーゼ活性により評価され、初期ｉＮＳＣクラスターは、ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２の形質導入のみによって生成された。 対照群、ＳＯＸ２、ＳＯＸ２/ＣＭＹＣ、ＳＯＸ２/ＬＩＮ２８及びＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２が形質導入された老化したｈＵＣＢ-ＭＳＣにおけるＰＡＸ６及びネスチン陽性コロニーの数を定量化した結果を示す。 ｈＵＣＢ由来のＣＤ３４+細胞からｈｉＮＳＣをリプログラミングする戦略を示した実験概要図である。 フローサイトメーターによるＣＤ３４+細胞の純度を点散布図（ｄｏｔ ｐｌｏｔ）で表す。単核細胞から単離されたＣＤ３４+細胞は、８４．１５％の純度を示した。 免疫化学分析法によるｈＵＣＢ-ＣＤ３４+ｉＮＳＣの特性を示す図であって、細胞をＮＳＣ特異的マーカーであるＰＡＸ６、ネスチン及びＳＯＸ２と、ニューロンマーカーであるＮＦ、及び星状膠細胞マーカーであるＧＦＡＰにより染色した結果を示した。 ＰＡＸ６、ネスチン、ＳＯＸ２、Ｋｉ６７及びＨＭＧＡ２により免疫染色したＨ９-ＮＳＣを顕微鏡で観察したイメージである。 図６Ａは、ｍｉＲ-ＣＴ、または５０ｎＭもしくは１００ｎＭのｌｅｔ-７ｂをトランスフェクトしたｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２）をＢｒｄＵで２．５時間処理し、ＢｒｄＵ特異的抗体（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）により免疫染色した結果を示す。図６Ｂは、ｍｉＲ-ＣＴＬ、または５０ｎＭもしくは１００ｎＭのｌｅｔ-７ｂをトランスフェクトしたｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２）におけるＢｒｄＵ陽性細胞を定量化した結果を示す。図６Ｃは、ｍｉＲ-ＣＴＬ、または５０ｎＭもしくは１００ｎＭのｌｅｔ-７ｂをトランスフェクトした細胞のニューロスフェアの直径を示す。図６Ｄは、ｍｉＲ-ＣＴＬ、または５０ｎＭもしくは１００ｎＭのｌｅｔ-７ｂをトランスフェクトした細胞の絶対数を示す。図６Ｅは、ｍｉＲ-ＣＴＬ、または５０ｎＭもしくは１００ｎＭのｌｅｔ-７ｂをトランスフェクトした細胞の一次ニューロスフェア細胞の割合を示す。 ｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２）、ｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２）及びＨ９-ＮＳＣにおけるＮＳＣの陰性細胞表面マーカー（ＣＤ４４）と、陽性マーカー（ＣＤ１８４）のフローサイトメーターの解析結果を示す。 ｈＤＦ、Ｈ９-ＮＳＣ、ｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２）及びｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２）の全般的なゲノムのヒートマップを示す。 ｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２）とｈＤＦ、及びｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２）とＨ９-ＮＳＣを比較する散布図である。 図８Ａは、ｓｉＣＴＬまたは５０ｎＭのｓｉＨＭＧＡ２をトランスフェクトしたｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２）をＢｒｄＵで２．５時間処理し、ＢｒｄＵ特異的抗体（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）により免疫染色した結果を示す。図８Ｂは、ｓｉＣＴＬまたは５０ｎＭのｓｉＨＭＧＡ２をトランスフェクトしたｈＤＦ-ｉＮＳＣ（ＳＯＸ２）におけるＢｒｄＵ陽性細胞を定量化した結果を示す。図８Ｃは、ｓｉＣＴＬまたは５０ｎＭのｓｉＨＭＧＡ２をトランスフェクトした細胞のニューロスフェアの直径を示す。図８Ｄは、ｓｉＣＴＬまたは５０ｎＭのｓｉＨＭＧＡ２をトランスフェクトした細胞の絶対数を示す。図８Ｅは、ｓｉＣＴＬまたは５０ｎＭのｓｉＨＭＧＡ２をトランスフェクトした細胞の一次ニューロスフェア細胞の割合を示す。 ３つの主要な細胞型、即ち、ニューロン（ＣｈＡＴ、ＮＦ及びＭＡＰ２）、星状膠細胞（ＧＦＡＰ）、及び希突起膠細胞（Ｏ４）への分化後のＨ９-ＮＳＣにおける免疫細胞化学的分析結果を示す。 電位固定計量により記録されたｈｉＮＳＣ由来のニューロンのナトリウム電流及び活動電位を示す。 リドカイン（０．１％）によるナトリウム電流の遮断後の電位固定計量により記録されたｈｉＮＳＣ由来のニューロンのナトリウム電流及び活動電位を示す。 洗浄（ｗａｓｈｏｕｔ）後のナトリウム電流の回復による電位固定計量により記録されたｈｉＮＳＣ由来のニューロンのナトリウム電流及び活動電位を示す。 移植されたＣＭ-ＤｉＩラベリングされたｈｉＮＳＣの免疫組織化学的結果を示す。 ｈＭＳＣ及びｈＭＳＣ由来のｉＮＳＣにおけるｈＭＳＣ表面マーカー（陰性マーカー：ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ-ＤＲ、陽性マーカー：ＣＤ７３及びＣＤ１０５）のフローサイトメーターの解析結果を示す。 ｈＵＣＢ-ＭＳＣ及びｈＤＦの３つの異なる株におけるＨＭＧＡ２の発現レベルに関するウェスタンブロッティングの解析結果を示す。 ｈＵＣＢ-ＭＳＣへのＳＯＸ２、またはＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２の形質導入後に測定したＰＡＸ６及びネスチン陽性コロニー形成率を示す。 累積集団倍加レベルの分析（Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｌｅｖｅｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ）により決定されたＨ９-ＮＳＣ、ｈＤＦ-ｉＮＳＣ及びｈＭＳＣ-ｉＮＳＣの増殖速度を示す。 ＳＯＸ２またはＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２が形質導入されたｈＵＣＢ-ＣＤ３４+細胞で測定されたＰＡＸ６及びネスチン陽性コロニー形成率を示す。 ヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）の分化能を確認した結果を示す。 ヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）がＨＭＧＡ２で形質転換された効率（導入効率）を測定した結果を示す。 ＨＭＧＡ２が形質導入された８継代以下の初期継代のヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）におけるＨＭＧＡ２の発現レベルを免疫細胞化学的方法（免疫細胞化学的分析）により測定した結果を示す。 ＨＭＧＡ２が形質導入された８継代以下の初期継代のヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）におけるＨＭＧＡ２の発現レベルをマイクロアレイにより測定した結果を示す。 ＨＭＧＡ２が形質導入されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）における継代進行に伴うＨＭＧＡ２の発現レベルをＰＣＲ法により測定した結果を示す。 ＨＭＧＡ２が形質導入されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）における継代進行に伴う細胞形態を位相差イメージ法で測定した結果を示す。 ＨＭＧＡ２が形質導入されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）における継代進行に伴うＳＡ-β-ｇａｌ（老化関連ベータガラクトシダーゼ、Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｅｔａ-ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）の発現レベルをβ-ｇａｌ染色法で測定した結果を示す。 ＨＭＧＡ２が形質導入されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）における継代進行に伴う細胞増殖をＭＴＴアッセイ法で測定した結果を示す。 ＨＭＧＡ２が形質導入されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）におけるＨＭＧＡ２過剰発現に関連するシグナル経路に関与する遺伝子と、分子細胞機能に関連する遺伝子をＩＰＡ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｙｌｓｉｓ）ソフトウェアで特定した結果を示す。 ＨＭＧＡ２が形質導入されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）における、ＨＭＧＡ２過剰発現がＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ経路及びｍＴＯＲ/ｐ７０ｓ６Ｋに及ぼす影響を評価するために、ウェスタンブロッティングを行った結果を示す。 ＨＭＧＡ２が形質導入されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）における継代進行に伴う細胞形態を位相差イメージ法で測定した結果、及びＨＭＧＡ２が抑制されたｈＵＣＢＳＣ細胞の老化のレベルを確認するために、継代進行に伴うＳＡ-β-ｇａｌ（老化関連ベータガラクトシダーゼ、Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｅｔａ-ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）の発現レベルをβ-ｇａｌ染色法で測定した結果を示す。 ＨＭＧＡ２が抑制されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）における細胞増殖をＭＴＴアッセイ法で測定した結果を示す。 ＨＭＧＡ２が形質導入されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）における、ＨＭＧＡ２発現抑制がＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ経路及びｍＴＯＲ/ｐ７０ｓ６Ｋに及ぼす影響を評価するために、ウェスタンブロッティングを行った結果を示す。 ＨＭＧＡ２が抑制されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）の脂肪組織への分化能を測定した結果を示す。 ＨＭＧＡ２過剰発現ヒト臍帯血由来間質細胞の遺伝子発現とＨＭＧＡ２抑制ヒト臍帯血由来間質細胞の遺伝子発現を比較した結果を示す。 ＨＭＧＡ２過剰発現ヒト臍帯血由来間質細胞の遺伝子発現とＨＭＧＡ２抑制ヒト臍帯血由来間質細胞の遺伝子発現を比較した結果より選択された８つの遺伝子に対してＰＣＲを行った結果を示す。 ヒト臍帯血由来の間質細胞においてＨＭＧＡ２過剰発現の際に発現が増加し、ＨＭＧＡ２抑制の際に発現が減少する遺伝子と、ＨＭＧＡ２過剰発現の際に発現が減少し、ＨＭＧＡ２抑制の際に発現が増加する遺伝子を選択し、選択された遺伝子に対してＰＣＲを行った結果を示す。 臍帯血由来の単核細胞から単離したＣＤ３４+細胞のフローサイトメトリーの解析結果を示す。 ＣＤ３４+特異的な培地における培養日数によるＣＤ３４+細胞数の増減を示す。 ＣＤ３４+細胞において誘導神経幹細胞へと形態が変化する過程を示す。 免疫染色によるＣＤ３４+ｉＮＳＣのＤＡＰＩ、ネスチン、ＨＭＧＡ２、ＳＯＸ２の発現形態を示す。

本発明は、ＳＯＸ２（ＳＲＹ(ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ)-ｂｏｘ２）タンパク質またはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ２（Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ＡＴ-ｈｏｏｋ２）タンパク質またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を含む、非神経細胞の神経幹細胞（ＮＳＣ）へのリプログラミングを誘導するためのキットを提供する。

本発明は、非神経細胞などの標的細胞内で、神経分化の転写因子として従来よく知られるＳＯＸ２とＨＭＧＡ２の２つの因子の発現を増加させることにより、標的細胞から誘導神経幹細胞を生成することを特徴とする。本発明による誘導神経幹細胞の生成方法は、誘導因子としてＳＯＸ２とＨＭＧＡ２の２つの誘導因子のみを用いて、非神経細胞から誘導神経幹細胞を調製することができるため、従来の４つまたは５つの誘導因子を利用した生成方法よりも効率的なやり方で誘導神経幹細胞を調製することができる。また、本発明の方法は、ＳＯＸ２遺伝子１つだけを導入したときよりもリプログラミングに要される時間が顕著に短縮されるだけでなく、リプログラミングの誘導効率及び増殖力が顕著に優れているため、治療目的で活用される可能性がより高くなる。

ＳＯＸ２タンパク質は、性決定領域（Ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ）Ｙ-ｂｏｘ２（Ｓｏｘ２）遺伝子により発現されるタンパク質であり、胎生期の中枢神経系で発現し、神経幹細胞の自己複製に関与する遺伝子として知られているが、悪性神経膠腫で頻繁に発現していることが知られている。

ＨＭＧＡ２（Ｈｉｇｈ-ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ＡＴ-ｈｏｏｋ２）タンパク質は、ＤＮＡに結合してクロマチン構造を変更することができ、これにより遺伝子転写の変化を誘発する因子として知られている。

本発明において、ＳＯＸ２タンパク質及びＨＭＧＡ２タンパク質、またはこれらをコードする核酸分子は、ヒトまたはマウスなどを含む動物由来の全てのＳＯＸ２及びＨＭＧＡ２を含み、好ましくは、ヒトに由来するＳＯＸ２及びＨＭＧＡ２であり得る。また、本発明のＳＯＸ２及びＨＭＧＡ２タンパク質は、その野生型のアミノ酸配列を有するタンパク質だけでなく、その変異体も含むことができる。ＳＯＸ２及びＨＭＧＡ２タンパク質の変異体とは、ＳＯＸ２及びＨＭＧＡ２の天然型のアミノ酸配列と１つ以上のアミノ酸残基における欠失、挿入、非保全的もしくは保全的置換、またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有するタンパク質を含む。前記変異体は、天然型のタンパク質と同様の生物学的活性を示す機能的等価物であるか、または必要に応じてタンパク質の物理・化学的性質が変更された変異体であって、物理・化学的環境に対する構造的安定性が増大したり、または生理的活性が増大された変異体であってもよい。

本発明における用語「ＳＯＸ２またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子」とは、ＳＯＸ２またはＨＭＧＡ２タンパク質の野生型または前記の変異体の形態のＳＯＸ２またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、１つ以上のヌクレオチドが置換、欠失、挿入、またはこれらの組み合わせにより変異されてもよく、天然から単離されたり、化学的合成法を用いて調製することができる。

本発明の前記ＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子とＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子は、それぞれ独立して発現ベクターに含まれた形態を有することができる。

具体的には、前記ＳＯＸ２タンパク質またはＨＭＧＡ２タンパク質は、これらをコードする核酸分子を含む発現ベクターを用いてインビトロで細胞株から発現された形態のタンパク質であり得る。前記発現ベクターとしては、バキュロウイルス発現ベクター、哺乳類発現ベクターまたはバクテリア発現ベクターを用いてもよく、前記細胞株としては、昆虫細胞株、哺乳動物細胞株またはバクテリア細胞株を用いることができるが、これにより本発明で利用可能な発現ベクター及び細胞株が限定されるものではない。

本発明における用語「発現ベクター」とは、適当な宿主細胞で目的タンパク質を発現させることのできる、遺伝子挿入物が発現されるように機能的に結合された必須の調節要素を含む遺伝子構築物であり得る。本発明の発現ベクターは、非神経細胞にリプログラミング誘導因子を送達する目的で使用することができる。本発明の発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーのような発現調節要素以外にも、膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列を選択的に含むことができ、目的に応じて多様に調製することができる。ベクターのプロモーターは、構成的または誘導性であってもよい。また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択マーカーを含み、複製可能な発現ベクターである場合、複製起源を含む。発現ベクターは、自己複製したり、宿主ＤＮＡに組み込まれることができる。前記ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、エピソーマルベクター、ウイルスベクターなどを含んでもよく、好ましくは、ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターは、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）、ＡＳＬＶ（トリ肉腫・白血病）、ＳＮＶ（脾壊死ウイルス）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）、ＭＭＴＶ（マウス乳癌ウイルス）などのレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどに由来するベクターを含むが、これに限定されるものではない。

前記ＳＯＸ２またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であってもよい。

本発明における用語「リプログラミング」とは、分化能のない細胞または部分的な分化能がある細胞など、様々な特性の状態で存在する分化した細胞を、最終的に、新たなタイプの分化能を有する状態へと回復または変換することのできるプロセスである。このような細胞のリプログラミングメカニズムは、核内のエピジェネティックマーク（ヌクレオチド配列の変化なしに機能における遺伝的変化を引き起こすことと関連したＤＮＡの状態）が除かれた後、異なるセットのエピジェネティックマークが確立されることを意味するが、多細胞生物が分化及び成長する中で、異なる細胞及び組織は、異なる遺伝子発現プログラムを獲得する。このような別個の遺伝子発現パターンは、エピジェネティックな変化、例えば、ＤＮＡメチル化、ヒストンの変化及びその他のクロマチン結合タンパク質により実質的に調節されるものと考えられる。従って、多細胞生物内のそれぞれの細胞型は、一般に、一旦細胞が分化したり、細胞周期を外れると、固定され変化しなくなるが、正常の発達過程中の特定の期間または特定の疾患が進行する場合には、一部の細胞に主要なエピジェネティックなリプログラミングが進むこともある。本発明では、既に分化した対象細胞を特定のタンパク質で処理することにより、対象細胞がリプログラミングされた結果として未分化細胞の能力を有する細胞を調製する方法を提供する。

本発明における用語「リプログラミング誘導因子」とは、最終的にまたは部分的に分化した細胞が、新たな細胞型に分化する潜在力を有する誘導神経幹細胞へとリプログラミングされるように誘導する物質であって、ＳＯＸ２タンパク質またはＨＭＧＡ２タンパク質またはこれらのタンパク質をコードする核酸分子を含むことができる。前記リプログラミング誘導因子は、分化した細胞のリプログラミングを誘導する物質であれば制限なく含むことができる。

本発明において、前記のＨＭＧＡ２タンパク質またはこれをコードする核酸分子は、クロマチン調節因子（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）であり得る。ここで、クロマチンは染色質とも呼ばれ、ＤＮＡとヒストンタンパク質の複合体の基本的な構造を有するヌクレオソームである。クロマチンの調節は、ＤＮＡがヒストンを取り囲む方式を変化させながら対応する遺伝子の発現の様相が変化するように行われ、具体的な例としては、ヒストンのアセチル化、ＤＮＡのメチル化などがある。従って、ＤＮＡのメチル化/脱メチル化によりクロマチンが調節されることができ、ＨＭＧＡ２がＳＯＸ２遺伝子のプロモーター領域の低メチル化を促進することにより、クロマチン調節因子として作用することができる（実施例４-５）。

本発明における用語「非神経細胞」とは、神経細胞以外の、全ての分化または未分化の細胞を含み、本発明の標的細胞の役割をする。本発明の非神経細胞は、ヒト、サル、ブタ、馬、牛、羊、犬、猫、マウス、及びウサギなどの様々な動物に由来する細胞であってもよく、好ましくは、ヒトに由来する細胞であってもよいが、これによって誘導神経幹細胞へとリプログラミングさせる細胞が限定されるものではない。

前記非神経細胞は、体細胞、成体幹細胞または多能性幹細胞であってもよい。

本発明における用語「体細胞」とは、分化能及び自己再生能が制限された成体を構成する細胞であり、具体的には、前記体細胞は、ヒトの皮膚、毛髪、脂肪、血液などを構成する体細胞であってもよく、好ましくは、ヒト線維芽細胞またはヒト臍帯血細胞であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明における用語「成体幹細胞」とは、骨、脂肪、骨髄間質、筋肉、神経などに存在する幹細胞であり、好ましくは、間葉系幹細胞であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明における用語「誘導神経幹細胞」とは、分化した細胞にリプログラミング技術を用いて神経幹細胞と類似または同様の多分化能を有する未分化状態の幹細胞を確立する方式で調製された細胞を含む。誘導神経幹細胞は、神経幹細胞と同様または類似した特性を有しており、具体的には、類似した細胞の形態を示し、遺伝子及びタンパク質の発現パターンが類似しており、生体の内外で多分化能を有することができる。従って、本発明の誘導神経幹細胞は、神経細胞（ニューロン）、星状膠細胞、希突起膠細胞、ＧＡＢＡ性神経細胞またはドーパミン性神経細胞などに分化可能なものであってもよい。

本発明の前記キットは、それに特に限定されないが、当技術分野において通常使用され得る任意のタイプのキットを使用することができる。

本発明の前記キットは、前記ＳＯＸ２タンパク質またはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子を含む第１組成物及びＨＭＧＡ２タンパク質またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を含む第２組成物がそれぞれ個別の容器に入った形態、または２つ以上の区画に分割された一つの容器内に入った形態で包装されていてもよい。

本発明の一実施例では、分化能のないヒト線維芽細胞の誘導神経幹細胞へのリプログラミング誘導過程におけるＳＯＸ２及びＨＭＧＡ２タンパク質の寄与を確認するために、これらのタンパク質を過剰発現させ、細胞形態の変化と、ＰＡＸ６/ネスチン陽性コロニーの分析を通じてリプログラミング誘導効率とを持続的に検証した。その結果、ＳＯＸ２及びＨＭＧＡ２の発現を同時に増加させた場合、ＳＯＸ２単独で発現を増加させた場合に比べて、誘導神経幹細胞へのリプログラミング誘導効率のみならず、自己再生能、増殖能及び神経細胞への分化能の増加を確認することができた。特に、ＨＭＧＡ２と共にリプログラミングを誘導した場合、１０日程度早く誘導神経幹細胞コロニーが形成されることを確認した。

また、ＳＯＸ２及びＨＭＧＡ２が、臍帯血由来の間葉系幹細胞（ｈＵＣＢ-ＭＳＣ）及び臍帯血由来の血液細胞を誘導神経幹細胞へと効果的にリプログラミングさせるのに寄与できることを確認し、特に、ＨＭＧＡ２によってリプログラミング効率がさらに向上し、リプログラミングに要される時間が短縮されることを確認した。

本発明で使用された非神経細胞として、臍帯血由来の間葉系幹細胞は、成体幹細胞の代表例であって、臍帯血由来の血液細胞は、体細胞の代表例であり、このような結果は、ＳＯＸ２及びＨＭＧＡ２をリプログラミング誘導因子として使用することで、体細胞だけでなく、成体幹細胞も誘導神経幹細胞へと効果的にリプログラミングさせることができることを示す。

さらに他の態様として、本発明は、非神経細胞からリプログラミングされた誘導神経幹細胞またはそこから分化した神経細胞を調製する方法を提供する。具体的には、本発明の調製方法は、（ａ）ＳＯＸ２タンパク質もしくはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子及びＨＭＧＡ２タンパク質もしくはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を非神経細胞に送達するか、または、非神経細胞においてＳＯＸ２タンパク質及びＨＭＧＡ２タンパク質の発現を増加させる段階、及び（ｂ）段階（ａ）の細胞を培養する段階を含むことができる。

好ましくは、本発明の方法は、（ｃ）段階（ｂ）で得られた培養物から神経幹細胞様コロニーを分離する段階をさらに含むことができる。

本発明による誘導神経幹細胞の生成方法において、標的細胞内のＳＯＸ２及びＨＭＧＡ２の発現を増加させる方法は、前記標的細胞内にＳＯＸ２及び/またはＨＭＧＡ２の発現調節因子を導入して標的細胞内のＳＯＸ２及びＨＭＧＡ２の発現を増加させる方法のすべてが可能である。

具体的には、前記段階（ａ）のＳＯＸ２タンパク質またはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ２タンパク質またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子のようなリプログラミング誘導因子を細胞に送達する方法は、当技術分野において通常使用される、細胞に核酸分子またはタンパク質を提供する方法を制限なく使用することができ、好ましくは、リプログラミング誘導因子を非神経細胞の培地に添加する方法、またはリプログラミング誘導因子を非神経細胞に直接注入する方法を使用することができ、この際、使用されるリプログラミング誘導因子は、当該因子の遺伝子、即ち、ＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子及びＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子をそれぞれ挿入したウイルスベクターをトランスフェクトしたパッケージング細胞から得られたウイルス、インビトロ転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）により生成されたメッセンジャーＲＮＡ、または様々な細胞株内で産生されたタンパク質などの形態で使用することができる。

前記リプログラミング誘導因子を分化した細胞に直接注入する方法は、当技術分野において公知となった任意の方法を選択して使用することができ、これに限定されないが、微量注入法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、直接筋肉注入法、ならびにインシュレーター（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）及びトランスポゾンを利用した方法の中から適宜選択して適用することができる。

使用される前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどに由来するベクターを使用してもよく、これに限定されるものではないが、好ましくは、レトロウイルスベクターを使用してもよい。また、前記パッケージング細胞としては、使用されるウイルスベクターに応じて、当技術分野において公知の様々な細胞を選択して使用してもよい。

また、ＳＯＸ２及び/またはＨＭＧＡ２の発現調節因子を導入して標的細胞内のＳＯＸ２及びＨＭＧＡ２の発現を増加させることもできる。

具体的には、前記ＨＭＧＡ２の発現調節因子は、ｌｅｔ-７ｍｉＲＮＡクラスター阻害剤またはＰＤＥ４Ｄ阻害剤であってもよい。前記ｌｅｔ-７ｍｉＲＮＡクラスターは、ＨＭＧＡ２を標的としてその発現を低下させるｍｉＲＮＡとして知られている。本発明の場合、前記ｌｅｔ-７ｍｉＲＮＡクラスターの阻害剤を導入することによって標的細胞内でＨＭＧＡ２の発現量を増加させることが可能である。

また、前記ＳＯＸ２の発現調節因子は、ＰＤＥ４Ｄ阻害剤であり得る。ｃＡＭＰ活性化の一次的な細胞機序は、環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）と呼ばれる同種酵素の系列によるｃＡＭＰの分解として知られている。ＰＤＥファミリーには、１２個の既知のメンバーがある。ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）ＩＶ型（ＰＤＥ４）の阻害が炎症媒介性放出の抑制及び気道平滑筋の弛緩の両方において特に効果的であると認められる。ｃＡＭＰの活性化は、ＳＣＩの後、抑制シグナルを克服するための神経細胞の誘導のための有望な戦略として提案された。ＰＤＥ４阻害剤であるロリプラム（ｒｏｌｉｐｒａｍ）によるｃＡＭＰ加水分解の抑制は、脊髄打撲傷の後、ｃＡＭＰレベルの低下を防ぎ、シュワン細胞の移植片と結合する場合、脊髄及び固有受容感覚性軸索の多くの保存ならびに髄鞘形成を促進することが明らかになっている。ＰＤＥ ＩＶ活性の阻害剤としてＳｅｌＣＩＤ（商標）を使用することが可能である。

従って、ＳＯＸ２及びＨＭＧＡ２の共通した発現調節因子であるＰＤＥ４Ｄ阻害剤を使用することにより、ＳＯＸ２及びＨＭＧＡ２の発現量を共に増加させ、リプログラミングの誘導効率などを顕著に増加させることができる。

前記リプログラミング誘導因子には、本発明のＳＯＸ２及びＨＭＧＡ２のリプログラミング誘導因子以外に、ＯＣＴ４、Ｋ１Ｆ４、ＣＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＮａｎｏｇからなる群より選択される１つ以上のタンパク質、またはこれらのタンパク質をコードする１つ以上の核酸分子がさらに含まれてもよい。前記タンパク質は、既に公知のリプログラミング誘導因子であって、特に、このうち、ＣＭＹＣ、ＬＩＮ２８はｌｅｔ-７ｍｉＲＮＡクラスターに属するため、追加で発現を増加させることによってリプログラミングの誘導効率を増加させることができる。

また、本発明において、前記ＳＯＸ２タンパク質またはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ２タンパク質またはＨＭＧＡ２をコードする核酸分子を導入するためにその他のナノ粒子または化合物などを用いることができる。

本発明の段階（ｂ）において、前記細胞の培養は、当技術分野において公知の適切な培地と培養条件に応じて行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば、選択された細胞に応じて容易に調整して使用することができる。

段階（ｂ）は、神経細胞分化用培地で培養する段階を含み、前記誘導神経幹細胞から神経細胞が形成されるようにすることができる。

さらに一態様として、本発明は、前記調製方法により調製された誘導神経幹細胞またはそこから分化した神経細胞を提供する。

前記誘導神経幹細胞については、前述の通りである。

実施例で確認されたように、前記誘導神経幹細胞がニューロン、星状膠細胞及び希突起膠細胞に分化でき、前記誘導神経幹細胞から分化した神経細胞を取得することもできる。

さらに一態様として、本発明は、前記調製方法によって調製された誘導神経幹細胞またはそこから分化した神経細胞を有効成分として含む、神経細胞の再生のための細胞治療用生成物を提供する。

本発明に係る誘導神経幹細胞は、ニューロンに関連する細胞に分化することができる細胞であるため、神経細胞の再生に有用であり、これを細胞治療用生成物として使用することができる。

本発明の細胞治療用生成物は、１ｍｌ当たり１．０×１０^５個〜１．０×１０^９個、好ましくは１．０×１０^６個〜１．０×１０^８個、より好ましくは１．０×１０^７個の細胞を含むことができるが、これらに限定されるものではない。

本発明の細胞治療用生成物は、凍結しないで使用されるか、または今後の使用のために凍結することができる。凍結すべきである場合、標準的な冷凍保存剤（例えば、ＤＭＳＯ、グリセロール、エピライフ（Ｅｐｉｌｉｆｅ）細胞凍結培地（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を凍結前の細胞集団に添加することができる。

また、前記細胞治療用生成物は、薬学的分野における通常の方法により、患者の身体内投与に適した単位投与剤形に製剤化させて投与することができ、前記製剤は、１回または数回の投与により効果的な投与量を含む。この目的に適した製剤としては、非経口投与製剤として注射アンプルのような注射剤、注入バックのような注入剤、及びエアゾール製剤のような噴霧剤などが好ましい。前記注射用アンプルは、使用直前に注射液と混合調製することができ、注射液としては、生理食塩水、ブドウ糖、マンニトール、リンゲル液などを使用することができる。また、注入バッグは、ポリ塩化ビニルまたはポリエチレン材質のものを使用することができ、バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）、ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、メドセップ（Ｍｅｄｃｅｐ）、ナショナルホスピタル・プロダクツ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）またはテルモ（Ｔｅｒｕｍｏ）社の注入バッグを例示することができる。

前記細胞治療用生成物には、１つまたはそれ以上の薬学的に許容可能な通常の不活性担体、例えば、注射剤の場合には、保存剤、無痛化剤、可溶化剤または安定化剤などを、局所投与用製剤の場合には、基剤（ｂａｓｅ）、賦形剤、潤滑剤、または保存剤などをさらに含むことができる。

このように調製された本発明の細胞治療用生成物は、当技術分野において通常に使用する投与方法を用いて移植及びその他の用途に使用されている他の幹細胞と共に、またはそのような幹細胞との混合物の形態で投与することができ、好ましくは、治療が必要な患者の疾患部位に直接生着もしくは移植するか、または腹腔内に直接移植もしくは注入することが可能であるが、これに限定されるものではない。また、前記投与はカテーテルを用いた非外科的投与方法、及び疾患部位の切開後のそこへの注入もしくは移植による外科的投与方法が全て可能であるが、カテーテルを用いた非外科的投与方法がより好ましい。また、通常の方法により非経口的に投与すること、例えば、直接病変に投与すること以外に、造血系幹細胞移植の一般の方法である血管内注入による移植も可能である。

前記細胞の１日の投与量は、１．０×１０^４〜１．０×１０^１０細胞/ｋｇ体重、好ましくは１．０×１０^５〜１．０×１０^９細胞/ｋｇ体重を１回または数回に分けて投与することができる。しかし、有効成分の実際の投与量は、治療しようとする疾患、疾患の重症度、投与経路、患者の体重、年齢及び性別などの種々の関連因子に照らして決定されるべきであると理解されなければならず、従って、前記の投与量は、如何なる面においても発明の範囲を限定するわけではない。

さらに一態様として、本発明は、前記リプログラミングされた誘導神経幹細胞またはそこから分化した神経細胞を対象に投与する段階を含む、対象の神経細胞の損傷を抑制または回復するための方法を提供する。具体的には、本発明のＳＯＸ２タンパク質またはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子及びＨＭＧＡ２タンパク質またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を含むリプログラミング誘導因子を分化した細胞に送達する段階、及び前記細胞を培養する段階によりリプログラミングされた誘導神経幹細胞またはそこから分化した神経細胞を投与することによって対象の神経細胞の損傷を抑制または回復させることができる。

本発明における用語「対象」とは、牛、犬、豚、鶏、羊、馬、及びヒトを含む哺乳動物を含むが、これらに限定されるものではない。好ましくは、リプログラミングされた誘導神経幹細胞またはその培養物の投与は、腹腔内または血管内投与、病変への直接投与または関節の滑膜腔（Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｃａｖｉｔｙ）内投与などであってもよい。

前記神経細胞の損傷の抑制または回復は、神経細胞の損傷に関連する疾患の予防または治療を含むことができる。

さらに一態様として、本発明は、ＳＯＸ２（ＳＲＹ(ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ)-ｂｏｘ２）タンパク質またはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ２（Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ＡＴ-ｈｏｏｋ２）タンパク質またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を有効成分として含む、神経細胞の損傷に関連する疾患の予防または治療のための薬学的組成物を提供する。

前述のように、ＳＯＸ２（ＳＲＹ(ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ)-ｂｏｘ２）タンパク質またはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ２（Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ＡＴ-ｈｏｏｋ２）タンパク質またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を含む組成物を、非神経細胞内に導入して神経幹細胞へのリプログラミングを誘導することにより、神経細胞の損傷に関連する疾患の予防または治療の目的で使用することができる。

また、前記ＳＯＸ２及び/またはＨＭＧＡ２遺伝子は、当技術分野において公知となった細胞内遺伝子送達システム、または遺伝子輸送体をさらに含む形で提供されてもよい。例えば、リポプレックス、ポリプレックス、細胞透過性ペプチド（ｃｅｌｌ ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＰＰ）またはタンパク質形質導入ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ、ＰＴＤ）などであることができるが、これらに限定されるものではない。

前記ＰＴＤは、ＳＯＸ２及び/またはＨＭＧＡ２の細胞内への導入効率を向上させることができるものであれば、種類に制限されることなく使用することができる。

また、ＳＯＸ２及び/またはＨＭＧＡ２は、プラスミドＳＯＸ２及び/またはＨＭＧＡ２と、これを細胞内に送達するための輸送体とが結合されたコンジュゲートがコードする融合タンパク質の形態であってもよい。例えば、ＳＯＸ２及び/もしくはＨＭＧＡ２と、ＣＰＰもしくはＰＴＤとが結合された融合タンパク質である形態、またはＳＯＸ２及び/もしくはＨＭＧＡ２と低分子型プロタミンコンジュゲート（低分子量プロタミン）とが結合された融合タンパク質の形態であってもよい。

本発明における用語「神経細胞の損傷に関連する疾患」とは、神経細胞の変形、損失などが原因となって発生する疾患であり、パーキンソン病、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、虚血性脳症（脳卒中）、脱髄疾患、多発性硬化症、癲癇、神経変性疾患、脊髄損傷などを含むことができるが、前記の例に限定されるものではない。

本発明における用語「予防」とは、前記組成物の投与により神経細胞の損傷に関連する疾患の発症を抑制または遅延させる全ての行為を含み、「治療」とは、前記組成物の投与により神経細胞の損傷に関連する疾患の症状が好転したり、有利に変化する全ての行為を含む。

さらに一態様として、本発明は、１）単離した非神経細胞を準備する第１段階、２）ＳＯＸ２タンパク質もしくはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ２タンパク質もしくはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を非神経細胞に送達するか、または非神経細胞においてＳＯＸ２タンパク質及びＨＭＧＡ２タンパク質の発現を増加させることにより、誘導神経幹細胞の生成を誘導する第２段階、３)任意で、第２段階で生成された誘導神経幹細胞から神経細胞を形成する第３段階、及び４）第１段階または第２段階の後に候補物質で処理し、候補物質処理に応じて誘導神経幹細胞または神経細胞が生成されたか否かまたはその生成レベルを確認する第４段階、を含む神経幹細胞または神経細胞の再生促進剤または再生抑制剤のスクリーニング法を提供する。

本発明において、非神経細胞のリプログラミングによる神経幹細胞または神経細胞の生成の有無または生成レベルは、候補物質の接触の前後での非神経細胞の形態学的変化、神経幹細胞特異的マーカーの発現の有無、自己再生能、増殖能及び神経細胞への分化能などの変化を観察することにより評価することができる。

また、本発明は、前記第３段階で誘導神経幹細胞または神経細胞の生成レベルが増加する場合に、前記の候補物質を、神経幹細胞または神経細胞の再生促進剤として判定する段階をさらに含むことができる。

好ましくは、前記スクリーニング法は、患者から単離した非神経細胞を用いて、神経幹細胞または神経細胞のための、患者に合わせてカスタマイズされた再生促進剤または患者に合わせてカスタマイズされた再生抑制剤をスクリーニングするものであってもよい。

具体的には、患者個人の体質や環境を個別に調査し、これに適した神経細胞の再生促進剤または再生抑制剤を決定して治療法を提供することができる。従って、前記スクリーニング方法により神経細胞の再生促進剤または再生抑制剤の候補薬物を選定し、神経疾患の患者を該薬物で治療して、治療効果を確認し、それをマッピング・保存することにより、カスタマイズされた治療薬を選択することができる。即ち、インビトロでのスクリーニング法とインビボでの検証方法の両方を含み、神経細胞の損傷に関連する疾患の患者のためのカスタマイズされた治療剤をより効果的に選定して検証することができる。

本発明の一実施例では、前記のスクリーニング方法を通じてＳＯＸ２などの遺伝子を導入する場合よりＨＭＧＡ２の遺伝子を追加で導入する場合に誘導神経幹細胞への誘導効率が約２倍以上向上することを確認することができ、従って、ＨＭＧＡ２タンパク質が神経細胞の再生促進剤として使用できることを確認した。

さらに一態様として、本発明は、１）単離した非神経細胞を準備する第１段階、２）ＳＯＸ２タンパク質もしくはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ２タンパク質もしくはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を非神経細胞に送達するか、または非神経細胞においてＳＯＸ２タンパク質及びＨＭＧＡ２タンパク質の発現を増加させることにより、誘導神経幹細胞の生成を誘導する第２段階、３）第２段階で生成された誘導神経幹細胞から神経細胞を形成する第３段階、及び４）第３段階で形成された神経細胞を候補物質で処理し、前記候補物質が、前記非神経細胞が由来する対象に対してカスタマイズされた、神経細胞の治療剤であるか否かを確認する第４段階、を含む神経細胞のための個人用にカスタマイズされた治療剤のスクリーニング法を提供する。

具体的には、患者個人の体質や環境に応じて個人用にカスタマイズされた神経細胞治療用生成物をスクリーニングするために、第２段階で誘導した神経幹細胞または第３段階で形成された神経細胞を候補物質で処理し、神経再生に関するメカニズムの変化及びそれに関与するタンパク質などの発現変化などを確認することで、前記誘導神経幹細胞を生成するために使用された非神経細胞が由来する対象に対するカスタマイズされた神経細胞治療用生成物になり得るか否かを確認及び検証することができる。

さらに一態様として、本発明は、ＨＭＧＡ２タンパク質またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を有効成分として含む、非神経細胞の誘導神経幹細胞（ｉＮＳＣ）へのリプログラミングを促進するための組成物を提供する。

本発明の一技術的特徴として、ニューロン分化の転写因子として従来よく知られたＳＯＸ２因子だけでなく、ＨＭＧＡ２タンパク質の発現を共に増加させることにより、従来のＳＯＸ２を単一因子としてリプログラミングする場合よりも、非神経細胞から誘導神経幹細胞への誘導効率及び増殖力が顕著に優れていることを確認した。従って、ＨＭＧＡ２タンパク質またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子は、非神経細胞の神経幹細胞へのリプログラミングを促進する目的で使用することができる。

さらに一態様として、本発明は、ＨＭＧＡ２タンパク質またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を有効成分として含む、細胞増殖のための組成物または細胞の老化を抑制するための組成物を提供する。

本発明における用語「細胞増殖」とは、細胞数の増加を含み、従って、前記細胞増殖は、ＤＮＡ複製、細胞分裂と各種の細胞成分の増加を伴い、細胞増殖速度は、生体内で調節され得る。

また、用語「細胞の老化」とは、細胞の形質及び機能の退化とそれに続く細胞死もしくは増殖の停止が起こるまでの過程であり、老化現象の原因については、細胞の代謝産物による代謝阻害、細胞表面の変化、コラーゲンなどの細胞骨格分子間の架橋結合の増加、遊離ラジカルによる細胞内の劣化分子の蓄積、遺伝情報の転写・翻訳の過誤蓄積、致死遺伝子により遺伝的に細胞の寿命がプログラム化されていること、細胞内ＤＮＡの損傷と修復能の低下などが知られている。本発明における老化は、細胞の老化だけでなく、組織または生物体の老化の意味も包括する。特に、幹細胞の老化は、継代培養回数の増加に応じて、幹細胞において老化関連β-ガラクトシダーゼ発現が増加したり、幹細胞の大きさが増加したり、幹細胞の増殖率が減少したり、増殖期間が減少したり、テロメラーゼ活性が減少したり、または幹細胞の分化能が減少する現象を伴い得る。

本発明の実施例１１〜２０では、ＨＭＧＡ２が形質導入されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）が、形態学的変化が小さくなるだけでなく、ＳＡ-β-ｇａｌ発現レベルの減少、細胞増殖の維持を示すことを確認した。一方、ＨＭＧＡ２を抑制させた場合には、形態学的変化が大きくなり、ＳＡ-β-ｇａｌ発現レベルの増加と共に細胞増殖が顕著に減少することを確認した。従って、ＨＭＧＡ２タンパク質が過剰発現されると、間質細胞の増殖が促進され、老化が抑制されることを確認した。本発明に係る間質細胞の増殖、維持、及び老化の調節方法は、間質細胞をトランスフェクションしてＨＭＧＡ２タンパク質の発現を調節することにより間質細胞の増殖を誘導し、分化能及び幹細胞機能を維持して、老化を防止することができるため、培養時の継代培養を施行すればするほど間質細胞の老化が急速に進行して細胞分裂が急激に減少するという問題を解決することができる。このような増殖及び老化の調節方法は、幹細胞にも適用することができる。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例により制限されるものではない。

調製例１：細胞培養
（１）ヒト臍帯血由来の間葉系幹細胞（ｈＵＣＢ-ＭＳＣ）は、２０代、３０代の産婦から臨月出産直後の臍帯血を採取し、採取した血液試料は、分娩後２４時間以内に収集されたものだけを実験に使用した。ＨｅｔａＳｅｐ溶液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を、臍帯血の試料と５：１（ｖ/ｖ）の割合で混合し、赤血球が枯渇するまで、室温でインキュベートした。インキュベートした後、上清を収集し、Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）密度勾配遠心分離器を用いて２，５００ｒｐｍで２０分間遠心分離させて単核細胞を収集した。前記得られた単核細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含む内皮細胞成長培地-２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）が含有されたペトリ皿に播種した。本実験で使用された単離及び調査プロトコルは、ボラメ病院の臨床試験審査委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ(ＩＲＢ)）及びソウル大学の臨床試験審査委員会（(１１０９/００１-００６）により承認を得て行われた。

（２）一方、ヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ、Ｃ-０１３-５Ｃ）は、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ ｔｈｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社から購入し、１０％のＦＢＳを含有した線維芽細胞成長培地-２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で培養した。

（３）Ｈ９由来のヒト神経幹細胞（Ｈ９-ｈＮＳＣ、ＮＡ８００-１００）は、Ｇｉｂｃｏ社から購入し、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｎｅｕｒａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、塩基性ＦＧＦ、及びＥＧＦ組換えタンパク質を含むノックアウトＤＭＥＭ/Ｆ１２基本培地で培養した。

（４）ヒト臍帯血由来の間質細胞は、次のように単離及び培養した。具体的には、臍帯血（Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）の赤血球を除去するために、Ｈｅｔａｓｅｐ溶液（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を臍帯血と５：１の体積比で混合した後、３０分間室温でインキュベートした。上清を注意して収集し、単一細胞を収集するためにＦｉｃｏｌｌ溶液を添加して２，５００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。分離された細胞のみを得てＰＢＳで２〜３回洗浄し、ヘパリン、アスコルビン酸、上皮細胞成長因子（組換えヒト上皮細胞成長因子、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ｒｈＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（組換えヒト線維芽細胞成長因子、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ｒｈＦＧＦ-Ｂ）、インスリン様成長因子-１(組換えロングＲインスリン様成長因子-１、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｌｏｎｇ Ｒ ｉｎｓｕｌｉｎ-ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ-１、Ｒ３-ＩＧＦ-１)、硫酸ゲンタマイシン、アムホテリシンＢ（ＧＡ-１０００）、及び１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）が添加されたＥＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）培地に２×１０^５個/ｃｍ^３の濃度で培養した。インキュベートしてから４日後、底部に付着していない細胞を除去し、細胞が８０％コンフルエントになったときに継代培養した。

調製例２：形質導入による線維芽細胞（ｈＤＦ）からヒト誘導神経幹細胞（ｈｉＮＳＣ）の調製
ＳＯＸ２プラスミド、ＨＭＧＡ２プラスミド、ＣＭＹＣプラスミド及びＬＩＮ２８プラスミドをそれぞれ、ＶＳＶ-Ｇ及びｇａｇ/ｐｏｌプラスミドとＦｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）と共に２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間及び７２時間に産生されるウイルスを集め、５μｇ/ｍＬのポリブレン（Ｓｉｇｍａ、Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ、ＮＹ）を添加することにより、ｈＤＦ、ｈＵＣＢ-ＭＳＣ、及びｈＵＣＢ-ＣＤ３４+ＭＮＣに、前記遺伝子を１つずつ、または２つ以上の組み合わせで導入した。形質導入後、ＰＢＳで２回洗浄してウイルスを洗い流し、増殖のために増殖培地で培養した。

神経幹細胞の誘導のために、培地をｂＦＧＦ（Ｓｉｇｍａ）及びＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ）を含有した神経幹細胞誘導用培地であるＲｅＮｃｅｌｌ ＮＳＣ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に取り換えた。ｈｉＮＳＣはアキュターゼ（ａｃｃｕｔａｓｅ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で継代培養した。

実施例１：ｉＮＳＣの単離と特性の確認
レトロウイルスＳＯＸ２を用いて、ＳＴＯフィーダー細胞と共にポリ-Ｌ-オルニチン（ＰＬＯ）及びフィブロネクチン（ＦＮ）がコーティングされたガラス製カバースリップ上で、ｈＤＦをＳＯＸ２が形質導入されたｈｉＮＳＣへと転換させた。転換させてから２〜３週間以内にＳＯＸ２-ＮＳＣ-様コロニーが、形質導入されたｈＤＦから生成された。

誘導神経幹細胞コロニーを単離し、反復的な継代培養及びニューロスフェア培養を通じて誘導神経幹細胞を安定化させた。誘導神経幹細胞の付着のためにカバーガラスをＰＬＯ/ＦＮでコーティングし、誘導神経幹細胞５×１０^４個を分散させた。２４時間後、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて２０分間細胞を固定し、０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００ ＰＢＳを用いて１０分間透過処理した。その後、５％の正常ヤギ血清を用いて１時間ブロッキングした後、１次抗体を１：１００で入れた後、一晩静置した。翌日、２次抗体を１：１０００で入れて１時間おいた後、ＤＡＰＩを用いて核染色を行い、マウンティングした後、乾燥させた。

その結果、ＳＯＸ２が形質導入されたｉＮＳＣは、Ｈ９由来のＮＳＣ（Ｈ９-ＮＳＣ）と類似した形態学的特性を示し、ＰＡＸ６、ネスチン、ビメンチン、及びＳＯＸ２のようなＮＳＣ特異的マーカーの発現を示した（図１ａ〜１ｄ）。

実施例２：ＳＯＸ２が形質導入されたｈｉＮＳＣにおけるｍｉＲＮＡ発現プロファイルの分析
実施例２-１：マイクロＲＮＡのマイクロアレイ分析
Ｔｒｉｚｏｌ試薬を用いて細胞からトータルＲＮＡを抽出し、蛍光標識したｍｉＲＮＡを生成するために、１００ｎｇのトータルＲＮＡ試料をｇｉｌｅｎｔのｍｉＲＮＡｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｈｙｂ． ｋｉｔを用いてラベリング及びハイブリダイゼーションした。ラベリングされたｍｉＲＮＡのシグナルをＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイスキャナーを用いてスキャンした。生データは、ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ１１．０．１．１））を用いて抽出し、Ｒ統計学的言語ｖ．２．１５．０を用いて分析し、視覚化した。

実施例２-２：ｍｉＲＮＡ発現プロファイルの分析結果
前記実施例２-１のようなマイクロアレイ分析を通じてｈＤＦ、Ｈ９-ＮＳＣ及びＳＯＸ２が形質導入されたｈｉＮＳＣのｍｉＲＮＡプロファイルを分析した。

その結果、ＳＯＸ２が形質導入されたｈｉＮＳＣのｍｉＲＮＡの発現パターンは、ｈＤＦよりも、Ｈ９-ＮＳＣとより類似していることを確認した（図１ｅ）。

具体的には、線維芽細胞から機能性ニューロンへと変化するのに核心的な役割を果たしていることが知られている神経系に特異的なｍｉＲ-９-５ｐ、ｍｉＲ-９-３ｐ及びｍｉＲ-１２４の発現レベルは、ｈＤＦに比べてＨ９-ＮＳＣ及びＳＯＸ２が形質導入されたｈｉＮＳＣで、より上方調節されていたことを確認した。

また、ＮＳＣの維持及び自己再生の調節における役割を担っていることで知られているｌｅｔ-７についても、全てのｌｅｔ-７/ｍｉＲ-９８ファミリーの発現レベルが、ｈＤＦに比べてＨ９-ＮＳＣ及びＳＯＸ２が形質導入されたｈｉＮＳＣで、より下方調節されていたことを確認した（図１ｆ及び１ｊ）。

しかし、胚性幹細胞特異的ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ-３０２/３６７ファミリーの発現レベルは、ｈＤＦ、Ｈ９-ＮＳＣ及びＳＯＸ２が形質導入されたｈｉＮＳＣではそれほど差がなく、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）でのみ発現レベルが高いことを確認した。

実施例３：ｌｅｔ-７ｂによるｉＮＳＣのリプログラミング効率、増殖、及び自己再生の調節機能の分析
実施例３-１：ｍｉＲＮＡ活性によるｉＮＳＣリプログラミング効率の分析
ｍｉＲＮＡ活性がｈＤＦからｉＮＳＣへのリプログラミングを促進するか否かを確認するために、ＳＯＸ２でリプログラミングさせる間、ｍｉＲ-９-５ｐ、ｍｉＲ-９-３ｐ、ｍｉＲ-１２４、抗ｌｅｔ-７ｂ、ｌｅｔ-７ｂ、ｍｉＲ-ＣＴＬ及び抗ｍｉＲ-ＣＴＬをトランスフェクトした。

具体的には、市販されているｈｓａ-ｌｅｔ-７ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＭ１１０５０）、ｍｉＲ-１２４-３ｐ（Ｉｎｖｔｉｒｏｇｅｎ、ＰＭ１０６９１）、ｍｉＲ-９-５ｐ（Ｉｎｖｔｉｒｏｇｅｎ、ＰＭ１００２２）、ｍｉＲ-９-３ｐ（Ｉｎｖｔｉｒｏｇｅｎ、ＰＭ１３０７２）、抗ｌｅｔ-７ｂ（Ｉｎｖｔｉｒｏｇｅｎ、ＡＭ１１０５０）でｍｉＲＮＡを過剰発現させ、適切なｐｒｅ-ｍｉＲＮＡ前駆体陰性対照群（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＡＭ１７１１０）及び抗ｍｉＲＮＡ阻害剤陰性対照群（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＡＭ１７０１０）を使用した。

コロニー形成率アッセイのために、ＳＯＸ２が形質導入されたｈＤＦを、トランスフェクションの前に２４-ウェルプレートに２×１０^４個プレーティングした。５０ｎＭのｈｓａ-ｌｅｔ-７ｂ、ｍｉＲ-１２４-３ｐ、ｍｉＲ-９-５ｐ、ｍｉＲ-９-３ｐ及び抗ｌｅｔ-７ｂを用いてトランスフェクションを行い（０日）、３日後にさらにトランスフェクションした（３日）。

その結果、ＳＯＸ２が形質導入されたｈＤＦは、ＮＳＣ様コロニーよりもニューロン様細胞へと転換されたことを確認した。ＰＡＸ６/ネスチン陽性コロニーの形成率はｍｉＲ-１２４、ｍｉＲ-９-５ｐまたはｍｉＲ-９-３ｐをトランスフェクトした細胞では、ｍｉＲ-ＣＴＬをトランスフェクトした細胞に比べてわずかに減少するか、または変化がなかった。

しかし、ｌｅｔ-７ｂ過剰発現は、リプログラミング効率を減少させた一方、ｌｅｔ-７ｂの抑制は、抗ｍｉＲ-ＣＴＬに比べて３．５倍以上リプログラミング効率を増加させた（図１ｌ）。

実施例３-２：ｌｅｔ-７ｂによるｈｉＮＳＣ増殖調節能
ｌｅｔ-７ｂがｈｉＮＳＣ増殖を調節するか否かを確認するために、ｌｅｔ-７ｂをＳＯＸ２が形質導入されたｈｉＮＳＣにトランスフェクションし、分裂する細胞の５-ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）ラベリングにより、細胞増殖を測定した。

具体的には、細胞の増殖速度を測定するために、次のようにｉＮＳＣを５-ブロモ-２-デオキシウリジン（ＢｒｄＵ、Ｓｉｇｍａ）で染色した。１０μＭのＢｒｄＵを細胞培養培地に添加し、３７℃で５時間インキュベートし、その後、ＰＢＳで洗浄し、室温で１０分間、４％ＰＦＡで固定した。透過処理のために８５℃で１５分間クエン酸ナトリウム緩衝液を使用し、細胞をブロッキング溶液（５％ＮＧＳ）でインキュベートした。その後、細胞をブロッキング溶液（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）で希釈したＢｒｄＵ一次抗体で、４℃で一晩インキュベートした。前記細胞を２次Ａｌｅｘａ-４８８抗体で１時間処理し、核を染色するためにＤＡＰＩをＰＢＳ中に１：１０００で希釈して１０分間細胞と共にインキュベートした。共焦点顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ２００、Ｎｉｋｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）でイメージを撮影した。

その結果、ＢｒｄＵ陽性細胞の割合が減少することを確認し、特に、ｌｅｔ-７ｂのトランスフェクションはｈｉＮＳＣの増殖を用量依存的に減少させることを確認した（図６Ａ及び６Ｂ）。

実施例３-３：ｌｅｔ-７ｂによるｈｉＮＳＣの自己再生調節能
ｌｅｔ-７ｂがＳＯＸ２が形質導入されたｈｉＮＳＣの自己再生を調節するかどうかを調べるために、ニューロスフェア形成アッセイを行った。

具体的には、ｍｉＲＮＡの処理の後、一次ニューロスフェアを形成させるために２，０００個の細胞を非付着性培養皿で培養した。一次ニューロスフェア細胞を、アキュターゼ（ａｃｃｕｔａｓｅ）を用いて単一細胞へと分離し、その後、二次ニューロスフェアを形成させるために、非付着性培地でクローン密度で再播種した。二次ニューロスフェアの数とサイズは、培養７日後に測定した。

その結果、ｌｅｔ-７ｂをトランスフェクトしたｈｉＮＳＣは、ｍｉＲ-ＣＴＬをトランスフェクトしたｈｉＮＳＣよりサイズが小さく、ｌｅｔ-７ｂの濃度を増加させると、サブクローニング中、二次ニューロスフェアがほとんど発生しなかったことを確認した（図６Ｃ〜７Ｅ）。

実施例４：ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２の同時導入によるｈｉＮＳＣリプログラミングの活性化
前記実施例３においてｌｅｔ-７ｂの過剰発現がｈｉＮＳＣリプログラミング効率を減少させることを確認したため、ｌｅｔ-７ｂの発現を抑制することが知られているＣＭＹＣ、ＬＩＮ２８と、ｌｅｔ-７ｂにより抑制されるＨＭＧＡ２を過剰発現させることによってｈｉＮＳＣリプログラミング効率を向上させることができるかどうかを確認しようとした。

実施例４-１：ＨＭＧＡ２による細胞増殖の確認
ＳＯＸ２と組み合わせたＣＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＨＭＧＡ２の過剰発現がＳＯＸ２単独の過剰発現に比べて細胞増殖を増加させるかどうかを調べるために、ＭＴＴアッセイを行った。具体的には、１×１０^４個の細胞を２４-ウェルプレートに播種した。４８時間のインキュベートの後、５０μｌのＭＴＴストック液（５ｍｇ/ｍｌ）を培地に添加した。３７℃で４時間インキュベートした後、ＭＴＴ溶液を含む培地を除去した。ホルマザン結晶を溶解させるためにＤＭＳＯを添加し、その後、溶液を９６-ウェルプレートに移動させた。ＥＬ８００マイクロプレートリーダー（ＢＩＯ-ＴＥＫ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）により５４０ｎｍの波長における吸光度を測定した。

その結果、これらの要素の中でＨＭＧＡ２は、最も少ない増殖力を有することを確認し、これはＣＭＹＣよりも３２％少なく、及びＬＩＮ２８よりも１７％少なかった（図２ａ）。

実施例４-２：ＨＭＧＡ２によるｉＮＣＳリプログラミング効率の向上の確認
ＳＯＸ２と組み合わせたＣＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びＨＭＧＡ２の過剰発現がＳＯＸ２単独の過剰発現に比べてｈｉＮＳＣに対してリプログラミングを促進させるか否かを調べるために、各場合に対してＰＡＸ６/ネスチン陽性コロニー形成の効率を測定した。

その結果、ＳＯＸ２に加えてＨＭＧＡ２の発現がｈｉＮＳＣに対するリプログラミング効率を大幅に増加させ（図２ｃ）、ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２の同時過剰発現でＰＡＸ６/ネスチン陽性コロニーの形成時間を、ＳＯＸ２単独過剰発現による１７日から７．４日に短縮させたことを確認した（図２ｂ）。

実施例４-３：ＨＭＧＡ２による免疫表現型の変化の確認
免疫表現型の変化がリプログラミングの初期段階で誘導されるかどうかを確認するために、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）を使用した。

その結果、ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２過剰発現細胞のみが、トランスフェクションの７日後に細胞全体の約１０％の細胞でＣＤ４４陽性から陰性への細胞集団の変化を示したことを観察し、これと同時に、細胞集団の約７％はＣＤ１８４陰性から陽性に変化したことを観察した（図２ｄ）。

ｈｉＮＳＣ及びＨ９-ＮＳＣの大部分は、ＣＤ４４陰性及びＣＤ１８４陽性の細胞集団を示し（図７ａ）、ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２が形質導入されたｈｉＮＳＣもＳＯＸ２が形質導入されたｈｉＮＳＣ及びＨ９-ＮＳＣと類似した形態学的特性、ならびにＰＡＸ６、ネスチン、ＳＯＸ２、Ｋｉ６７及びＨＭＧＡ２のようなＮＳＣ特異的マーカーの発現を示したことを確認した（図２ｅ）。

実施例４-４：ＨＭＧＡ２によるトランスクリプトームのリプログラミングレベルの評価
ＨＭＧＡ２によるトランスクリプトームのリプログラミングレベルを評価するために、マイクロアレイ分析を通じて比較による全般的遺伝子発現データ（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ）を分析し、前記マイクロアレイデータを評価するために、定量的リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ（ｑＲＴ-ＰＣＲ）を行った。

その結果、全般的なゲノムヒートマップ及びペアワイズ分布図では、ｈｉＮＳＣがＨ９-ＮＳＣと非常に類似しているが、親ｈＤＦとは異なることを示し（図７ｂ、７ｃ）、ＳＯＸ２、ＨＭＧＡ２、ＰＡＸ６、ネスチン、ＯＬＩＧ２、ＭＳＩ１及びＧＬＡＳＴは、ＳＯＸ２及びＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２が形質導入されたｉＮＳＣの全てにおいて誘導され、その発現レベルは、Ｈ９-ＮＳＣと類似していることを確認した（図２ｆ）。

実施例４-５：ＳＯＸ２プロモーターのメチル化状態の分析
ｈＤＦ、Ｈ９-ＮＳＣ、ならびにＳＯＸ２及びＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２が形質導入されたｈｉＮＳＣにおけるＳＯＸ２のＤＮＡメチル化状態を分析するために、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ-Ｇｏｌｄ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）を用いて非メチル化チミンをシトシンに変換させた。

具体的には、ＣｐＧ島内の非メチル化シトシンを、ＣＴ変換試薬（ＣＴ-ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ）と熱変性及び硫酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｂｉｓｕｌｆａｔｅ）処理の統合により、ウラシルに変換させた。ＤＮＡの重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）変換に続くＤＮＡの回復により、変換されたＤＮＡは脱スルホン化され、これはその後洗浄して溶出した。その後、重亜硫酸塩で改変されたＤＮＡをＰＣＲによって増幅させ、-２０℃以下で貯蔵した。重亜硫酸塩で変換されたＤＮＡの増幅のために、ＭｅｔｈＰｒｉｍｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｒｏｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｍｅｔｈｐｒｉｍｅｒ）でプライマーをデザインし、ＰＣＲを行った。プライマー配列及びアニーリング温度は、下記の通りである。
Ｓｏｘ２センス

Ｓｏｘ２アンチセンス

生成されたＰＣＲ産物は、ｐＧＥＭ Ｔ-ＥＡＳＹ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）でライゲーションした後、バクテリア（ＤＨ５α）でプラスミドＤＮＡをクローニングした。バクテリアクローンから抽出されたプラスミドＤＮＡは、ＡＢＩ３７３０ＸＬキャピラリーＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＭ１３逆方向プライマー

でシーケンスして分析した。その結果、非メチル化ＣｐＧは白丸で示し、一方、メチル化ＣｐＧは黒丸で示した。

その結果、Ｈ９-ＮＳＣと同様に、ｈｉＮＳＣでＳＯＸ２プロモーターが低メチル化（ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）されていることを確認した。これは、ＳＯＸ２が転写的に活性化していることを示唆する（図２ｇ）。従って、ＨＭＧＡ２がＳＯＸ２のプロモーターの低メチル化を促進するクロマチン調節因子（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）としての役割を果たしていることが分かる。

まとめると、前記実施例は、ｌｅｔ-７ｂの標的であるＨＭＧＡ２が、ｈｉＮＳＣへのＳＯＸ２誘導リプログラミングの効率及び時間を非常に増加させ、ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２が形質導入されたｈｉＮＳＣは、細胞表面マーカー、転写レベル及びメチル化パターンなどにおいてＨ９-ＮＳＣと類似した特性を示すことを示唆する。

実施例５：ＨＭＧＡ２の下方調節を通じたｈｉＮＳＣの増殖及び自己再生の抑制の確認
ＨＭＧＡ２がｈｉＮＳＣの増殖を調節するかどうかを確認するために、ｈｉＮＳＣにＨＭＧＡ２を標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＨＭＧＡ２）をトランスフェクトし、分裂する細胞のＢｒｄＵラベリングにより細胞増殖を測定した。具体的には、市販されているＨＭＧＡ２を抑制するｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＯＮ Ｔａｒｇｅｔ ｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴ ｐｏｏｌ、Ｃａｔ＃Ｌ-０１３４９５-００-０００５、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）と、対照群としての非標的化ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＯＮ Ｔａｒｇｅｔ ｐｌｕｓ ＳＭＡＲＴ ｐｏｏｌ、Ｃａｔ ＃Ｄ-００１８１０-０１）を用いて行った。

細胞は、２４-ウェルプレートに１×１０^４個の細胞を播種し、５０ｎＭのｓｉＲＮＡは、抗生物質なしの培養培地に添加されたＤｈａｒｍａＦＥＣＴトランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）によってトランスフェクトした。

その結果、ＨＭＧＡ２の下方調節は、ＢｒｄＵ陽性細胞の割合を急激に減少させた（図８Ａ、８Ｂ）。また、ｓｉＨＭＧＡ２をトランスフェクトしたｈｉＮＳＣはニューロスフェアのサイズが非常に減少したことを確認し、一次ニューロスフェアの中で二次ニューロスフェアを発生させる細胞の数及び割合の測定を通じて自己再生も減少させることを確認した。まとめると、ＨＭＧＡ２に対するｓｉＲＮＡによるＨＭＧＡ２の下方調節は、ｈｉＮＳＣの増殖及び自己再生を抑制することを示唆する。

実施例６：ｈｉＮＳＣの多分化能の確認
ｉＮＳＣの神経分化のために、ｉＮＳＣをｉＮＳＣ維持培地（ＲｅＮｃｅｌｌ ＮＳＣ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））が含まれた２４-ウェルプレート内に、それぞれポリ-Ｌ-オルニチン/フィブロネクチンがコーティングされたカバーガラス上に１，０００の密度で播種した。２４時間後、ランダムな分化のために培地をＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に取り換えた。ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ培地で１週間培養した後、培地を３つの特定の系統（ニューロン、星状膠細胞、及び希突起膠細胞）を誘導するための培地に取り換えた。

一方、前述のように分化を誘導した後、ｉＮＳＣを免疫細胞化学法によって、各系統に関連するマーカーで確認した。

実施例６-１：ニューロンへの分化能の確認
前記のニューロン誘導培地は、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、Ｇｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ）、アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、ＢＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）、ＧＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及びホルスコリン（Ｓｉｇｍａ）を含有したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）とＤＭＥＭ/Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）の１：１混合物を使用した。

分化させた結果、ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２が形質導入されたｈｉＮＳＣをニューロン誘導（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）してから１０〜１５日後に、未成熟ニューロンのマーカー、ニューロン特異的クラスＩＩＩβ-チューブリン（ＴＵＪ１）、ダブルコルチン（ＤＣＸ）、及びニューロン中間径フィラメント、アルファ-インターネキシン及びニューロフィラメント（ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ、ＮＦ）が発現したことを確認した（図３ａ）。

また、ｈｉＮＳＣの自己再生能を評価するために、クローン分析を行った結果、多重継代（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐａｓｓａｇｅ）におけるクローンで、ニューロン分化が誘導され、ＮＦ及びアルファ-インターネキシンが染色されたことを確認した。ニューロン誘導の１０〜２５日後に成熟ニューロンのマーカーであるＭＡＰ２、ドーパミン作動性及びノルアドレナリン作動性ニューロンのマーカーである、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）及びコリン作動性ニューロンのマーカーであるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）がＨ９-ＮＳＣと比較して類似したレベルで発現することを確認した（図３ａ及び９ａ）。

実施例６-２：星状膠細胞への分化能の確認
星状膠細胞誘導用培地は、Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、Ｇｍａｘ、及び１％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ（高グルコース）培地を使用した。

その結果、ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２が形質導入されたｈｉＮＳＣが神経膠原線維性酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＦＡＰ）陽性細胞を生成することを確認することにより、ｈｉＮＳＣの星状膠細胞への分化を確認した（図３ａ）。

実施例６-３：希突起膠細胞への分化能の確認
希突起膠細胞誘導用培地は、２つのタイプがある。最初に、細胞を、Ｎ２、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（ＭＥＭ ＮＥＡＡ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ヘパリン（Ｓｉｇｍａ）、ＲＡ、ＳＨＨ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、Ｂ２７を含有したＤＭＥＭ/Ｆ１２培地で２週間培養し、その後、Ｎ２、Ｂ２７、ＭＥＭ ＮＥＡＡ、Ｔ３、ｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）、ＰＤＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＩＧＦ（Ｒ＆Ｄ）及びＮＴ３（Ｓｉｇｍａ）を含有したＤＭＥＭ/Ｆ１２で２週間培養した。

その結果、希突起膠細胞のマーカーである、Ｏ４及びＯＬＩＧ２の二重陽性細胞を、オリゴデンドログリアへと運命づけることを目的とした誘導の２０〜３５日後に検出したことで、ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２が形質導入されたｈｉＮＳＣの希突起膠細胞への分化を確認した（図３ａ）。

実施例７：ｈｉＮＳＣの電気生理学的特性の分析
ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２が形質導入されたｈｉＮＳＣの機能性を評価するために、パッチクランプ記録（ｐａｔｃｈ ｃｌａｍｐ ｒｅａｄｉｎｇ）を通じて電気生理学的特性をテストした。具体的には、ｉＮＳＣに由来するニューロンにおける細胞全体のパッチクランプ記録を、室温（２２±１℃）でＥＰＣ１０ＵＳＢアンプリファイア（ＨＥＫＡ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｋ、Ｌａｍｐｒｅｃｈｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて記録した。記録チャンバーは、継続的に流れるタイロード液（流速１０ｍＬ/分）で満たされており、パッチ電極は、ＰＣ-１０プラー（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ ｃｏｍｐａｎｙ）を用いてホウケイ酸ガラス管（ｂｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅ ｇｌａｓｓ ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ）で作られたものを用いた。電極の抵抗は、ピペット液で充填されたとき４-７ＭΩであり、データはＰｕｌｓｅ ｐｒｏｇｒａｍ ｖｅｒｓｉｏｎ８．６７（ＨＥＫＡ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｋ）及びＯｒｉｇｉｎ６．１ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＭｉｒｃｏＣａｌ）を用いて取得し分析した。電流は、４ポールベッセルフィルタを用いて３ｋＨｚでフィルターされ、１０ｋＨｚでデジタル化された。タイロード液は、１４３ｍＭのＮａＣｌ、５．４ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１．８ｍＭのＣａＣｌ_２、０．５ｍＭのＮａＨＰＯ_４、１０ｍＭのグルコース、及び５ｍＭのＨＥＰＥＳ（４-(２-ヒドロキシエチル)-１-ピペラジンエタンスルホン酸）を含み、ｐＨはＮａＯＨで７．５に調整した。ピペット液は、１５０ｍＭのＫＣｌ、１．０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＭｇ-ＡＴＰを含み、ｐＨはＮａＯＨで７．２に調整した。リドカイン（０．１％）は、ナトリウム電流を遮断するために使用された。

その結果、ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２が形質導入されたｈｉＮＳＣが、ナトリウム電流を伝達するニューロンを生じ、多様な活動電位を発生させることを確認した。ナトリウム電流（または内部電流）及び活動電位は、ナトリウムチャネル遮断剤リドカインにより抑制され、洗浄後に定常状態を回復した（図３ｂ〜３ｄ、９ｂ〜９ｄ）。これらのデータは、ｈｉＮＳＣから分化されたニューロンは、機能的な膜特性及び正常なニューロンの活性を有することを示唆する。

実施例８：動物モデルにおけるｈｉＮＳＣの分化及び生存可能性の試験
実施例８-１：ＣＭ-ＤｉＩでラベリングされたｈｉＮＳＣの移植
アキュターゼを用いてＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２が形質導入されたｈｉＮＳＣを剥離させ、ＰＢＳ中に浮遊させた。ｈｉＮＳＣは注射後の跡を確認するために、ＣＭ-ＤｉＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でラベリングした。ｈｉＮＳＣを３７℃の水浴で１５分間ＣＭ-ＤｉＩとインキュベートし、その後、４℃で１０分間さらにインキュベートした。ＣＭ-ＤｉＩでラベリングされたｈｉＮＳＣを１×１０^５細胞/μｌの密度でＰＢＳ中に浮遊させた。ＣＭ-ＤｉＩでラベリングされたｈｉＮＳＣは脳定位固定装置及びウルトラマイクロポンプ（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）を用いて脳室下帯（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ、ＳＶＺ）に移植した。移植の後、縫合し、動物は麻酔から回復されるようにして、４週齢のマウスモデルを準備した。

実施例８-２：ＩＨＣ凍結切片
移植３週間後、前記マウスモデルから脳を単離し、４％ＰＦＡに一晩浸漬させ、その後、４８時間３０％スクロースに移動させた。単離された脳は、浸潤混合物（Ｏ.Ｃ.Ｔ.コンパウンド；Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で成形し、−７０℃で一晩維持し、低温保持装置（クライオスタット(ＣＭ３０５０、Ｌｅｉｃａ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ)）上で低温切開を行った。具体的には、組織を０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００で２０分間インキュベートした。非特異的な抗体結合を防止するために、前記組織を５％ＮＧＳでインキュベートした。そして、前記組織を、５％ＮＧＳの希釈率で一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。前記組織は、室温で１時間、二次Ａｌｅｘａ４８８-またはＡｌｅｘａ５９４-ラベル抗体（１：１０００）でインキュベートした。核は１０分間ＤＡＰＩで染色された。共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）を用いてイメージを撮影した。

その結果、移植された細胞は、免疫染色により検出され、また、検出された細胞は、３つの異なる系統のマーカーで同時に染色されたことを確認した。つまり、移植されたｈｉＮＳＣがＣＭ-ＤｉＩ蛍光と共局在するＴＵＪ１（ニューロン）、ＧＦＡＰ（星状膠細胞）及びＭＢＰ（希突起膠細胞）に対して陽性であることを確認した（図３ｅ、Ｓ５Ｅ）。これは、移植されたＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２が形質導入されたｈｉＮＳＣは、生体内でのニューロン、星状膠細胞及び希突起膠細胞への分化及び生存が可能であることを示唆する。

実施例９：ＨＭＧＡ２による多様な体細胞のｈｉＮＳＣへの効率的なリプログラミング
実施例９-１：ＨＭＧＡ２によるｈＵＣＢ-ＭＳＣのｉＮＳＣリプログラミング
ヒト臍帯血細胞は、線維芽細胞に比べて侵襲なしに得ることができ、最少の遺伝的変異を有しているという長所があるため、ヒト臍帯血細胞がｉＮＳＣリプログラミングの供給源になることができるかを評価した。

前記調製例１で記載されたように、ヒト臍帯血から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を単離した。ヒト臍帯血間葉系幹細胞（ｈＵＣＢ-ＭＳＣ）にＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２を形質導入させた後、ｈＵＣＢ-ＭＳＣ由来のｈｉＮＳＣコロニーは、トランスフェクション後７日〜１２日が経過した後に観察され、ＰＡＸ６及びネスチンで陽性に染色されたｉＮＳＣであることを免疫細胞化学的に立証した（図４ａ）。

ＭＳＣは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５に対して陽性であると知られているが、造血性マーカーであるＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ-ＤＲに対して陰性であることが知られている。ｈＵＣＢ-ＭＳＣ由来のｈｉＮＳＣは、ＣＤ７３及びＣＤ１０５に対して陰性であることが確認され、これは、細胞表面マーカーのシグナルが変化したことを示唆する（図１０ａ）。

また、ＨＭＧＡ２の発現をｈＤＦと比較した場合、ｈＵＣＢ-ＭＳＣで非常に高いことを確認し（図１０ｂ）、ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２が形質導入されたｈＵＣＢ-ＭＳＣは、ＳＯＸ２が形質導入されたｈＵＣＢ-ＭＳＣに比べて３〜４倍以上のＰＡＸ６/ネスチン陽性コロニーを発生させた（図１０ｃ）。

実施例９-２：Ｈ９-ＮＳＣとｈｉＮＳＣの間の増殖力の差
異なる細胞供給源及び導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）の組み合わせからのｈｉＮＳＣとＨ９-ＮＳＣとの間の増殖力の違いを確認するために、累積集団倍加レベルの分析（Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｌｅｖｅｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ）によって細胞の成長速度を測定した。具体的には、成長速度は、式（ＣＰＤＬ = ｌｎ（Ｎ_ｆ/Ｎ_ｉ）ｌｎ２、式中、Ｎ_ｉは初期の播種細胞数、Ｎ_ｆは最終的な回収細胞数、ｌｎは自然対数）を使用した全累積集団倍加レベルにより決定された。細胞（５×１０^４個）は、６ウェル培養プレートに三つ組で植え付け、毎４日ごとに継代培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）し、生存した細胞のみを検出するためにトリパンブルーを用いて最終的な細胞数を計数し、５×１０^４個の細胞を再度植え付けた。累積された倍加レベルを算出するために、各継代の集団倍加レベルを計算し、これを以前の継代の集団倍加レベルに合算した。

その結果、Ｈ９-ＮＳＣ及びｈｉＮＳＣ細胞株の細胞成長速度は、それほど差がなかったことを確認した。これは、Ｈ９-ＮＳＣとｈｉＮＳＣ細胞株との間の類似した増殖力を示唆する（図１０ｄ）。

実施例９-３：老化したｈＵＣＢ-ＭＳＣの神経幹細胞への誘導可能性の確認
リプログラミング効率に関するｌｅｔ-７ｂ/ＨＭＧＡ２の役割を調べるために、ＳＯＸ２単独またはこれとｌｅｔ-７ｂが標的とする因子の組み合わせの形質導入により、老化したｈＵＣＢ-ＭＳＣが神経幹細胞に誘導され得るかどうかを確認した。このために、老化関連ベータガラクトシダーゼ（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ-ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ(ＳＡ)-β-ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）アッセイを用い、老化が確認されたｈＵＣＢ-ＭＳＣにＳＯＸ２、ＳＯＸ２/ＣＭＹＣ、ＳＯＸ２/ＬＩＮ２８及びＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２を形質導入した（図４ｂ）。

ガラクトシダーゼアッセイは、ｈＵＣＢ-ＭＳＣを６ウェルプレートに播種した後、集団が４０〜５０％に達するまでインキュベートし、その後、ＰＢＳで２回洗浄し、室温で５分間、ＰＢＳ中０．５％のグルタルアルデヒドで固定した。細胞は、１ｍＭのＭｇＣｌ_２（ｐＨ７．２）を含有したＰＢＳで洗浄し、Ｘ-ｇａｌ溶液（１ｍｇ/ｍＬのＸ-ｇａｌ、０．１２ｍＭのＫ_３Ｆｅ(ＣＮ)_６（フェリシアン化カリウム）、０．１２ｍＭのＫ_４Ｆｅ(ＣＮ)_６（フェロシアン化カリウム）及び１ｍＭのＭｇＣｌ_２、ｐＨ６．０）で３７℃で一晩インキュベートした。翌日顕微鏡（ＩＸ７０、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）を用いてイメージを撮影した。

ＳＯＸ２/ＣＭＹＣとＳＯＸ２/ＬＩＮ２８の組み合わせは、形態学的変化はあったが、ｈｉＮＳＣコロニーを生成するには失敗したのに対し、ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２過剰発現のみが顕著にｈｉＮＳＣコロニーの生成を促進させたことを確認した（図４ｂ）。ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２の過剰発現は、転換３週間後に１×１０^５個の老化したｈＵＣＢ-ＭＳＣの中から２〜４個のコロニーの形成を導いた（０．００４〜０．００８％の変換率）（図４ｃ）。

実施例１０：臍帯血ＣＤ３４+細胞のｈｉＮＳＣリプログラミング
実施例１０-１：臍帯血ＣＤ３４+細胞の単離及び精製
ＣＤ３４+細胞の単離は、ＣＤ３４マイクロビーズ選別システム（ＭＡＣＳ）を用いた。具体的には、ＣＤ３４マイクロビーズ（＃１３０-０４６-７０３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）５０μｌを３０分間２〜８℃で、リンホプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）密度勾配遠心分離器を用いて臍帯血から得た約１×１０^８個の単核細胞とインキュベートし、ＣＤ３４+細胞を磁気的に標識した。磁場を帯びているＭＡＣＳ選別器にＭＡＣＳ（登録商標）カラムを取り付けた後、単核細胞の浮遊液を通過させることにより、磁気的に標識されたＣＤ３４+細胞だけがカラムの内部に貯留されるようにした。カラムをＭＡＣＳ選別器から取り出した後、バッファ溶液を圧力で押し出して貯留されたＣＤ３４+細胞を単離した。ＣＤ３４+細胞は、１０％ＦＢＳ、５０ｎｇ/ｍＬのＳＣＦ、２０ｎｇ/ｍＬのＩＬ-６、５０ｎｇ/ｍＬのＴＰＯ、１００ｎｇ/ｍＬのＦｌｔ３を含有したＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｅｄｉｕｍ）培地で培養した。

ＣＤ３４+の精製効率は抗ＣＤ３４-ＦＩＴＣ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてフローサイトメトリーにより測定され、その結果、８４．１５％の純度を有するＣＤ３４+細胞を単離精製したことを確認した（図４ｅ、図２７）。

実施例１０-２：臍帯血ＣＤ３４+細胞のｈｉＮＳＣリプログラミングの確認
細胞質の分裂を刺激するために、ｈＵＣＢ-ＣＤ３４+細胞をサイトカイン（ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、及びＩＬ-６）と共に３日間培養した後、ＳＯＸ２/ＨＭＧＡ２をレトロウイルスにより導入した（図４ｄ）。導入から１０〜１４日後まで、前記細胞をフィーダー上にプレーティングし、ＮＳＣ条件下でｉＮＳＣコロニーが観察された。免疫細胞化学的染色は、ｈＵＣＢ-ＣＤ３４+ｉＮＳＣがＰＡＸ６、ＳＯＸ２、及びネスチンの陽性の発現を有することを明らかにした。さらに、これらのｈＵＣＢ-ＣＤ３４+ｉＮＳＣはニューロンまたは星状膠細胞へと発生することもできた（図４ｆ）。ＳＯＸ２単独では、ｈＵＣＢ-ＣＤ３４+ｉＮＳＣを生成させるのに十分であったが、非常に低い効率を示した。ＳＯＸ２とＨＭＧＡ２を同時に発現するｈＵＣＢ-ＣＤ３４+細胞では、ＰＡＸ６/ネスチン陽性コロニーの形成頻度が１０〜２０倍近く増加した（図１０ｅ）。

結論として、ＳＯＸ２とＨＭＧＡ２の相乗的な相互作用による効率的な直接リプログラミングの過程は、幹細胞だけでなく、血液細胞などのような多様な体細胞をｈｉＮＳＣへとリプログラミングできるようにする。

実施例１１：トランスフェクトされたｈＵＣＢＳＣ細胞におけるＨＭＧＡ２タンパク質の発現増加の確認
実施例１１-１：ＨＭＧＡ２過剰発現のためのトランスフェクション
ヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）の分化及び老化におけるＨＭＧＡ２タンパク質の役割を証明するために、８継代以下の初期継代（ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ）のヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）にＨＭＧＡ２をトランスフェクトした。

まず、ＨＭＧＡ２配列がｐＭＸレトロウイルスベクターにクローニングされた。ＨＭＧＡ２プラスミドを、ＶＳＶ-Ｇ及びｇａｇ/ｐｏｌプラスミドと共に２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間〜７２時間後、ウイルス浮遊物を採取し、ポリブレン５μｇ/ｍＬと組み合わせて、ヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）をトランスフェクションするために使用した。形質導入効率を測定した結果、図１２に示すように、８０％以上と測定された。

実施例１１-２：免疫細胞化学的分析
前記実施例１１-１で調製された、ＨＭＧＡ２をトランスフェクトした８継代以下の初期継代のヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）におけるＨＭＧＡ２タンパク質の発現が増加したことを免疫細胞化学的分析で確認し、その結果を図１３に示した。

実施例１１-３：マイクロアレイ
前記実施例１１-１で調製された、ＨＭＧＡ２をトランスフェクトした８継代以下の初期継代のヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）におけるＨＭＧＡ２のタンパク質発現が増加したことをマイクロアレイ分析で確認し、その結果を図１４に示した。

実施例１１-４：継代進行に伴うＨＭＧＡ２発現レベルの測定
前記実施例１１-１で調製された、ＨＭＧＡ２が形質導入されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）における継代進行に伴うＨＭＧＡ２の発現レベルをＰＣＲ方法により確認した。

メーカーが推奨する方法に応じて、ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、これに、オリゴ（ｄＴ）プライマーとＡｃｃｕＰｏｗｅｒＲＴＰｒｅＭｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｋｏｒｅａ）を混合してｃＤＮＡを合成し、前記ｃＤＮＡを鋳型にしてＡｃｃｕＰｏｗｅｒＰＣＲＰｒｅＭｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｋｏｒｅａ）を用いてメーカーが推奨する方法に応じてＰＣＲを行い、その結果を図１５に示した。ＰＣＲ実験の結果から、６継代〜２０継代に進むほどＨＭＧＡ２の発現レベルが低下することを確認することができた。

実施例１２：継代進行に伴う形態変化の確認
前記実施例１１-１で調製された、ＨＭＧＡ２が形質導入されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）における継代進行による細胞形態を位相差イメージ法で測定し、その結果を図１６に示した。

図１６における比較例のヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）の場合、継代が進むほど、細胞が平坦化され長くなるのに対し、ＨＭＧＡ２が形質導入されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）の場合、変化の程度が緩和されることを確認することができる。

実施例１３：ＳＡ-ｂ-ｇａｌ（老化関連ベータガラクトシダーゼ、Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｅｔａ-ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）染色
前記実施例１１-１で調製された、ＨＭＧＡ２が形質導入されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）の老化レベルを確認するために、継代進行によるＳＡ-β-ｇａｌ（老化関連ベータガラクトシダーゼ、Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｅｔａ-ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）の発現レベルをβ-ｇａｌ染色法で測定し、その結果を図１７に示した。

図１７においてＨＭＧＡ２が形質導入されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）の場合、ＳＡ-β-ｇａｌ（老化関連ベータガラクトシダーゼ、Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｅｔａ-ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）の発現レベルが減少することを確認することができる。

実施例１４：継代に伴う細胞の増殖
前記実施例１１-１で調製された、ＨＭＧＡ２が形質導入されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）における継代進行に伴う細胞増殖をＭＴＴアッセイで測定し、その結果を図１８に示した。

図１８において、ＨＭＧＡ２が形質導入されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）は継代進行に伴い、細胞の増殖が比較例よりも少なく減少することを確認することができる。

実施例１５：ＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ経路におけるＨＭＧＡ２の影響の評価
実施例１５-１：関連遺伝子の確認
前記実施例１１-１で調製された、ＨＭＧＡ２が形質導入されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）におけるＨＭＧＡ２過剰発現に関連するシグナル伝達経路に関連する遺伝子と分子細胞機能に関連する遺伝子をＩＰＡ（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウェアで特定し、その結果を図１９に示した。

図１９において、転写調節に関連するｅｌＦ４及びｐ７０Ｓ６Ｋのシグナルが多く発現しており、ｅｌＦ４及びｐ７０Ｓ６Ｋに関連するｍＴＯＲとＰＩ３Ｋ/ＡＫＴシグナル経路が多く発現していることが分かる。

実施例１５-２：ウェスタンブロッティング
前記実施例１１−１で調製された、ＨＭＧＡ２が形質導入されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）におけるＨＭＧＡ２過剰発現のＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ経路及びｍＴＯＲ/ｐ７０ｓ６Ｋに対する影響を評価するために、ウェスタンブロッティングを行った。

ウェスタンブロッティング分析は、（ｉ）ＨＭＧＡ２が過剰発現されるｈＵＣＢＳＣ細胞、及び（ｉｉ）ＬＹ２９４００２処理されたＨＭＧＡ２が過剰発現されるｈＵＣＢＳＣ細胞、（ｉｉｉ）比較例としてのＧＦＰに対して行った。

具体的には、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、１ｍＭのアプロチニン、１ｍＭのロイペプチン、１ｍＭのアンチパイン、及び０．１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウムが添加された１％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ溶液中で細胞を破砕した。ＤＣアッセイキット（Ｂｉｏ-Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いてタンパク質の含有量を確認し、１０〜１５％ポリアクリルアミドゲルに一定量のタンパク質をローディングしてＳＤＳ-ＰＡＧＥを行い、タンパク質を５０Ｖ、３５０ｍＡで５時間ニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。全ての抗体は、メーカーの指示に従って使用し、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を用いてタンパク質のバンドを確認し、その結果を図１９に示した。

図２０において、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、及びｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化は、ＨＭＧＡ２により誘導され、ＬＹ２９４００２で処理される場合は、全体のタンパク質の発現量に変化はなかったが、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、及びｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化が阻害されることを確認することができた。

ＨＭＧＡ２によりｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ}とｐ２１^ＣＩＰ１/ＷＡＦ１の発現レベルは阻害されたが、ＬＹ２９４００２の処理により発現レベルが回復された。ＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ/ｍＴＯＲ/ｐ７０Ｓ６Ｋ経路はｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ}とｐ２１^ＣＩＰ１/ＷＡＦ１の発現レベルを低下させるのに適切であることが分かる。

また、これによって、ＨＭＧＡ２過剰発現は、ＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ/ｍＴＯＲ/ｐ７０Ｓ６Ｋ経路を活性化させ、ｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ}とｐ２１^ＣＩＰ１/ＷＡＦ１の発現を阻害することが分かる。

実施例１６：ＨＭＧＡ２抑制による継代進行に伴う形態学的変化の確認
ヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）の分化及び老化におけるＨＭＧＡ２タンパク質の役割を証明するために、８継代以下の初期継代のヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）でｓｉＲＮＡを用いてＨＭＧＡ２発現を抑制した。

ＨＭＧＡ２発現が抑制されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）における継代進行による細胞形態を位相差イメージ法で測定し、その結果を図２１に示した。すなわち、ＨＭＧＡ２発現が抑制されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）の場合、細胞が平らになって長くなることを確認した。

実施例１７：ＨＭＧＡ２抑制によるＳＡ-β-ｇａｌ（老化関連ベータガラクトシダーゼ、Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｅｔａ-ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）発現レベルの測定
ＨＭＧＡ２発現が抑制されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）の老化レベルを確認するために、継代進行によるＳＡ-β-ｇａｌ（老化関連ベータガラクトシダーゼ、Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｅｔａ-ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）の発現レベルをβ-ｇａｌ染色法で測定し、その結果を図２１に示した。

ＨＭＧＡ２が形質導入されたｈＵＣＢＳＣ細胞の場合、ＳＡ-β-ｇａｌ（老化関連ベータガラクトシダーゼ、Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｅｔａ-ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）発現レベルが増加することを確認することができる。

実施例１８：細胞増殖に及ぼす継代の影響の確認
ＨＭＧＡ２の発現が抑制されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）における継代進行に伴う細胞増殖をＭＴＴアッセイにより測定し、その結果を図２２に示した。図２２において、ＨＭＧＡ２抑制ｈＵＣＢＳＣ細胞は、継代進行に伴い、細胞の増殖が大幅に減少することを確認することができる。

実施例１９：ウェスタンブロッティング
ヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）においてＨＭＧＡ２抑制がＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ経路及びｍＴＯＲ/ｐ７０ｓ６Ｋに及ぼす影響を評価するために、ウェスタンブロッティングを行い、その結果を図２３に示した。

図２３において、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、及びｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化は急激に減少し、ｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ}とｐ２１^ＣＩＰ１/ＷＡＦ１の発現のレベルは増加した。これらのことから、ＨＭＧＡ２の抑制がＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ/ｍＴＯＲ/ｐ７０Ｓ６Ｋ経路を抑制し、ｐ１６^{ＩＮＫ４Ａ}とｐ２１^ＣＩＰ１/ＷＡＦ１の発現を増加させることが分かる。

実施例１５-２及び前記実施例の結果に基づいてＨＭＧＡ２タンパク質の発現によるヒト臍帯血由来の間質細胞のシグナル伝達経路は図２４に示した。

実施例２０：脂肪組織への分化能の測定
ＨＭＧＡ２発現が抑制されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）に対して脂肪組織への分化能を測定した。

細胞内に存在する脂肪蓄積の有無で分化レベルを把握するために、培養した細胞をオイルレッドＯで染色し、１００％イソプロピルアルコールを用いて、細胞に浸透したオイルレッドＯを再抽出し、これをＯＤ５００でＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＥＬ８００、Ｂｉｏ-ＴｅｋＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）で定量し、その結果を図２５に示した。

図２５に示すように、ＨＭＧＡ２が抑制されたヒト臍帯血由来の間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）のオイルレッドＯ染色の割合が対照群よりも低く、ＰＰＡＲｒ、ａＰ２及びＣ/ＥＢＰ-ｂのような脂肪細胞の分化に関与する遺伝子の発現比率が急激に低下していた。

実施例２１：ＨＭＧＡ２の調節に関与する遺伝子の探索及びＰＣＲ
前記実施例１１-１で調製されたＨＭＧＡ２過剰発現ヒト臍帯血由来間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）の遺伝子発現と、前記実施例７で調製されたＨＭＧＡ２抑制ヒト臍帯血由来間質細胞（ｈＵＣＢＳＣ）の遺伝子発現を、図２６に示すように比較した。

図２６によれば、ＨＭＧＡ２過剰発現時に発現が増加し、ＨＭＧＡ２抑制時に発現が低下する遺伝子として、サイクリンＦ、サイクリンＥ１、及びＣＤＣ２５Ａの３つが選別され、ＨＭＧＡ２過剰発現時に発現が低下し、ＨＭＧＡ２抑制時に発現が増加するＣ１４ｏｒｆ１５３、ＥＩＤ２Ｂ、ＺＮＦ３９４、ＣＤＫＮ２ＡＩＰＮＬ及びＣ９ｏｒｆ８０の５つの遺伝子が選別された。前記選別された８つの遺伝子に対してＰＣＲを行った結果を図２７に示した。

Claims (8)

1. ＳＯＸ２（ＳＲＹ(ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ)-ｂｏｘ２）タンパク質またはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子、及び
   ＨＭＧＡ２（Ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｕｐ ＡＴ-ｈｏｏｋ２）タンパク質またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子
   を含む、非神経細胞の神経幹細胞（ＮＳＣ）へのリプログラミングを誘導するためのキット。
2. （ａ）ＳＯＸ２タンパク質またはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ２タンパク質またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を非神経細胞に送達する段階、及び
   （ｂ）段階（ａ）の細胞を培養する段階
   を含む、非神経細胞からリプログラミングされた誘導神経幹細胞またはそこから分化した神経細胞を調製するための方法。
3. （ｃ）段階（ｂ）で得られた培養物から神経幹細胞様コロニーを分離する段階をさらに含む、請求項２に記載の方法。
4. 段階（ａ）は、ＳＯＸ２タンパク質もしくはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ２タンパク質もしくはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を、非神経細胞の培地に添加すること、ＳＯＸ２タンパク質もしくはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ２タンパク質もしくはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を、非神経細胞に直接注入すること、またはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子及びＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を挿入したウイルスベクターをトランスフェクションしたパッケージング細胞から取得したウイルスを用いて非神経細胞を感染させることにより行われる、請求項２に記載の方法。
5. 前記非神経細胞は体細胞または成体幹細胞である、請求項２に記載の方法。
6. １）単離した非神経細胞を準備する第１段階、
   ２）ＳＯＸ２タンパク質もしくはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ２タンパク質もしくはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を非神経細胞に送達することにより、誘導神経幹細胞の生成を誘導する第２段階、
   ３）任意で、第２段階で生成された誘導神経幹細胞から神経細胞を形成する第３段階、及び
   ４）第１段階または第２段階の後に候補物質で処理し、候補物質処理に応じて誘導神経幹細胞または神経細胞が生成されたか否かまたはその生成レベルを確認する第４段階
   を含む、神経幹細胞または神経細胞の再生促進剤または再生抑制剤のスクリーニング法。
7. １）単離した非神経細胞を準備する第１段階、
   ２）ＳＯＸ２タンパク質もしくはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子、及びＨＭＧＡ２タンパク質もしくはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子を非神経細胞に送達することにより、誘導神経幹細胞の生成を誘導する第２段階、
   ３）第２段階で生成された誘導神経幹細胞から神経細胞を形成する第３段階、及び
   ４）第３段階で形成された神経細胞を候補物質で処理し、前記候補物質が、前記非神経細胞が由来する対象に対してカスタマイズされた、神経細胞の治療剤であるか否かを確認する第４段階
   を含む、神経細胞のための個人用にカスタマイズされた治療剤のスクリーニング法。
8. （ｉ）ＨＭＧＡ２タンパク質またはＨＭＧＡ２タンパク質をコードする核酸分子および（ｉｉ）ＳＯＸ２（ＳＲＹ(ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ Ｙ)-ｂｏｘ２）タンパク質またはＳＯＸ２タンパク質をコードする核酸分子を有効成分として含む、非神経細胞の神経幹細胞（ＮＳＣ）へのリプログラミングを誘導するための組成物。

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