KR20140121329A - 비신경 세포로부터 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법 및 이에 의하여 생산되는 유도 신경 줄기 세포 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법 및 이에 의하여 생산되는 유도 신경 줄기 세포에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 신경분화 전사인자로 잘 알려진 Sox-2 전사조절 패밀리에 속하는 인자와 HMGA2의 2개 인자를 표적 세포로 도입하여 효율적인 유도 신경 줄기 세포를 생산할 수 있는 방법 및 이에 의하여 생산되는 유도 신경 세포에 관한 것이다.

Description

비신경 세포로부터 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법 및 이에 의하여 생산되는 유도 신경 줄기 세포{METHOD FOR PRODUCING INDUCED NEURAL STEM CELL FROM NON-NEURONAL CELL, AND INDUCED NEURAL STEM CELL PRODUCED BY THE SAME}
본 발명은 비신경 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법 및 이에 의하여 생산되는 유도 신경 줄기 세포에 관한 것으로서, 비신경 세포 내에서의 특정 유도 인자의 발현을 증가시킴으로써 높은 효율로 유도 신경 줄기 세포를 생산할 수 있는 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법 및 이에 의하여 생산되는 유도 신경 줄기 세포에 관한 것이다.
줄기 세포는 일반적으로 전능 또는 만능으로 분류된다. 전능 줄기 세포는 전체로 분화능을 갖는다: 이는 신체에서 상이한 세포 유형 모두를 생성시킨다. 수정란 세포는 전능 줄기 세포의 일례이다. 만능 줄기 세포는 3개의 주요 배엽 또는 배아 그 자체로부터 유래하는 신체에서 임의의 세포 유형을 생성시킨다.
배아 줄기 세포(ESC)와 같은 만능 줄기 세포는 만능성, 즉 다양한 세포 유형으로 분화하는 능력을 유지하면서 신속히 증식한다. 배아 줄기 세포는 세포 이식 치료에 대한 유망한 공여 공급원이다.
지금까지 만능 줄기 세포는 주로 핵 이식 및 세포 융합에 의해 생성되었다(Shinya Yamanaka, Pluripotency and Nuclear Reprogramming, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363(1500): 2079-2087(2008년 6월 27일)). 그러나, 상기 두 방법 모두는 배아 줄기 세포를 사용하기 때문에 연구 및 치료용 모두에 있어서 윤리적 딜레마(ethical dilemma)가 제기된다.
최근 유도 만능 줄기(induced, pluripotent stem cell, iPSC) 세포를 발견함에 따라 배아 줄기 세포를 사용함에 따른 이러한 문제점을 극복할 수 있게 되었다. "유도 만능 줄기세포(iPSC)"은 배아 줄기세포(ESCs)와 비슷한 특성을 나타내는 세포이다. 유도 만능 줄기 세포는 2006년에 마우스 섬유아세포(Takahashi, Y. 및 S. Yamanaka, Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors, Cell 126: 663-676 (2006)) 및 2007년에는 인간 섬유아세포(Yu Junying, 등, Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic cells, Science 318: 1917-1920 (2007), Takahashi, K. 등, Induction of Pluripotent Stem Cell From Adult Human Fibroblasts by Defined Factors, Cell 131 : 861-872 (2007))로부터 지정 인자(defined factor)들의 발현을 증대시킴으로써 최초로 생성되었다.
이들 연구에서는 성숙한 체세포의 iPSC 로의 리프로그래밍을 개시하기 위해 Oct-3/4, SOX-2, Klf4 및 c-Myc를 포함하고(Takahashi, Cell 126: 663-676; Takahashi, Cell 131:861-872); Oct4, SOX-2, Nanog 및 Lin28 을 사용하였다(Junying, Cell 318: 1917-1920). 그러나, iPSC는 배아줄기세포에서처럼 테라토마(teratoma)라는 암이 발생함과 동시에 생체에 이식시 분화조절이 잘 되질 않아, 원하는 세포로의 생체내 전환이 안된다는 한계를 가지고 있다.
따라서, 이러한 한계를 극복하기 위해 최근에는 직접적인 유도법 또는 직접 리프로그래밍법(Direct Conversion/ reprograming) 을 통해 특정 lineage의 세포로 분화시키는 기술이 주목받고 있다. 해당 기술은 완전히 분화가 끝난 세포, 즉, fibroblast에 특정 lineage 특이 유전자 등을 도입하여 전분화능(pluripotent) 상태를 거치지 않고 직접 특정 세포를 유도하는 기술로 전분화능 세포의 종양 형성 (teratoma) 위험을 배제할 수 있는 기술이다. 특히 한번 손상되면 영구적인 데미지를 받을 수 있는 신경 세포의 경우 세계 여러 연구진들이 활발하게 직접유도를 시도하였다. 그 결과 2010년 미국 Marius Wernig 교수팀에 의해 fibroblast로 부터 기능을 할 수 있는 신경세포를 직접 유도하는데 성공했다 [Vierbuchen T, Ostermeier A, Pang ZP, Kokubu Y, Sudhof TC, Wernig M (2010) Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature 463 (7284):1035-1041. doi:10.1038/nature08797]. 하지만 유도된 신경세포 (induced neurons)의 경우 유도 효율이 낮고 증식이 어려워 향후 치료목적으로 사용되기에 한계가 있다는 지적이 제기되었다.
그 후 독일의 두 연구팀은 마우스 fibroblast에 유전자 도입을 통해 유도신경줄기세포 (iNSC; induced neural stem cell)를 생성하는데 성공했다 [Thier M, Worsdorfer P, Lakes YB, Gorris R, Herms S, Opitz T, Seiferling D, Quandel T, Hoffmann P, Nothen MM, Brustle O, Edenhofer F (2012) Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell 10 (4):473-479. doi:10.1016/j.stem.2012.03.003]. 인간의 경우 fibroblast에 SOX-2유전자 1개를 도입하여 iNSC 유도를 성공했다는 보고가 있었다 [Thier M, Worsdorfer P, Lakes YB, Gorris R, Herms S, Opitz T, Seiferling D, Quandel T, Hoffmann P, Nothen MM, Brustle O, Edenhofer F (2012) Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell 10 (4):473-479. doi:10.1016/j.stem.2012.03.003].
그러나, 종래 이러한 인자들을 사용하여 유도 신경 줄기 세포를 제조하는 경우 유도 효율이 낮고 증식이 어려워 향후 치료 목적으로 사용되기에는 한계가 있다는 문제점이 있었다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해 비신경 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산할 수 있는 새로운 방법 및 이에 의하여 생산되는 유도 신경 줄기 세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 표적 세포 내에서 SOX-2 및 HMGA2 의 발현을 증가시킴으로써 표적 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 표적 세포 내에서 종래 신경 분화 전사인자로 잘 알려진 Sox-2 전사조절 패밀리에 속하는 인자와 HMGA2의 2개의 인자의 발현을 증가시킴으로써 표적 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 의한 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법은 유도 인자로서 Sox-2와 HMGA2 를 2개 유도인자만을 이용하여도 비신경 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 제작 가능하기 때문에, 기존의 4개의 인자, 5개의 유도 인자를 이용한 생산 방법보다 더 효율적인 유도 신경 줄기 세포를 제작할 수 있다.
본 발명에서 발현을 증가시키는 대상인 HMGA2 (High-mobility group AT-hook 2)은 DNA에 결합하여 크로마틴 구조를 변경시킬 수 있으며 이로 인해 유전자 전자(transcrption)의 변화를 유발할 수 있다. 마우스의 경우 embryogenesis 단계에서 다양한 기관에서 HMGA2가 높게 발현되고 성체가 되었을 때는 HMGA2의 발현이 매우 낮아진다. Embryonic stem cell 혹은 neural stem cell에서 HMGA2가 높이 발현된다고 보고되어 있다. 특히 어린 마우스의 뇌에서 분리한 neural stem cell에서 HMGA2가 매우 높이 발현되고, 발현된 HMGA2가 p16INK4A, p19ARF와 같은 cyclin-dependent kinase inhibitor등을 억제하여 줄기세포능을 높게 유지한다는 보고가 있다 [Nishino J, Kim I, Chada K, Morrison SJ (2008) Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression. Cell 135 (2):227-239. doi:10.1016/j.cell.2008.09.017].
본 발명자는 인간중간엽 줄기세포 (hMSC; human mesenchymal stem cell)에서 HMGA2가 노화 및 증식에 중요한 역할을 하는 것을 최근 보고하였다 [Yu KR, Park SB, Jung JW, Seo MS, Hong IS, Kim HS, Seo Y, Kang TW, Lee JY, Kurtz A, Kang KS (2012) HMGA2 regulates the in vitro aging and proliferation of human umbilical cord blood-derived stromal cells through the mTOR/p70S6K signaling pathway. Stem Cell Res 10 (2):156-165. doi:10.1016/j.scr.2012.11.002].
본 발명에 의한 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법에 있어서, 표적 세포 내의 Sox-2 및 HMGA2 의 발현을 증가시키는 방법은 직접적으로 상기 표적 세포내로 Sox-2 유전자 및 HMGA2 유전자, 또는 Sox-2 단백질 및 HMGA2 단백질을 도입하여 표적 세포 내의 Sox-2 및 HMGA2 의 발현을 증가시키거나, 간접적으로 Sox-2 및 HMGA2 의 발현 조절 인자를 도입하는 방법이 모두 가능하다.
본 발명에 의한 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법 중 SOX-2 및 HMGA2 의 유전자를 직접 도입하는 경우 상기 유전자를 포함하는 벡터를 이용하거나, SOX-2 및 HMGA2 의 벡터를 포함하는 배지 내에서 표적 세포를 배양하는 방법등 일반적인 유전자 도입에 의한 형질 전환 방법이 사용될 수 있다. 최근에는 단백질 전달 도메인[Protein Transduction Domains (PTDs)]이 개발되어 단백질과 같은 생리활성물질을 살아 있는 세포내로 유효하게 전달할 수 있게 되었다. PTD는 세포 침투 펩타이드[Cell-penetrating peptides(CPPs)], 세포막 전이 시퀀스[membrane translocation sequences (MTSs)], 트로이 펩타이드["Trojan" peptides], 세포막 전달 펩타이드[membrane transduction peptides (MTPs)] 등으로 불리기도 한다.
본 발명에 의한 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법 중 SOX-2 및 HMGA2 단백질을 직접 도입하는 경우 일렉트로포레이션(electroporation), 마이크로인젝션(microinjection), 비-바이러스성 벡터 및 바이러스 벡터 등을 이용하여 SOX-2 및 HMGA2 단백질을 세포 내로 전달할 수 있다.
본 발명에 의한 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법 중 Sox-2 및 HMGA2 의 발현 조절 인자를 도입하는 방법의 경우 상기 Sox-2 및 HMGA2 의 발현 조절 인자는 small RNA, si RNA, mi RNA, 센스 RNA, 안티센스 RNA 및 화합물로 이루어진 그룹에서 선택되는 것이 가능하다.
구체적으로 상기 HMGA2 의 발현 조절 인자는 let-7 miRNA 클러스터 억제제 또는 PDE4D 억제제인 것을 특징으로 한다. 상기 Let-7 miRNA cluster의 경우 HMGA2를 표적하여 그 발현을 감소시키는 miRNA로 알려져 있다. 본 발명의 경우 상기 Let-7 miRNA cluster 의 억제제를 도입함으로써 표적 세포 내에서 HMGA2 의 발현양을 증가시키는 것이 가능하다.
또한, 상기 Sox-2 의 발현 조절 인자는 PDE4D 억제제인 것을 특징으로 한다.
cAMP 활성화의 일차적 세포 기전은 시클릭 뉴클레오티드 포스포디에스테라제 (PDE)로 불리는 동종효소 계열에 의한 cAMP의 분해로 알려져있다.[참조: Beavo and Reitsnyder, Trends in Pharm., 11, 150-155, 1990]. PDE 계열에는 12개의 알려진 일원이 있다. PDE IV형 (PDE4)의 억제가 염증 매개 방출의 억제 및 기도 평활근의 이완 둘 다에 있어서 특히 효과적이라고 인정된다[참조: Verghese 등, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 272(3), 1313-1320, 1995].
cAMP의 활성화는 SCI 후, 억제 신호를 극복하기 위한 신경세포 유도를 위한 유망한 전략으로 제시되었다[참조: Damien D Pearse 등, Nature Medicine, published online May 23, 2002]. 상기 문헌에서는 PDE4 억제제인 롤리프람(rolipram)에 의한 cAMP 가수분해의 억제는 척수 타박상 후 cAMP 수준의 감소를 방지하여, 신경집세포(Schwann cell) 이식편과 결합하는 경우, 상당한 위척수 및 고유감각 축삭보존 및 수초형성을 촉진함을 밝혀져 있다. PDE IV 활성의 억제제로서 SelCID™을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에 의한 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법에 있어서, 상기 표적 세포는 비신경 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법에 있어서, 상기 비신경 세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법에 있어서, 상기 비신경 세포는 체세포(somatic cell) 인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법에 있어서, 상기 체세포는 SA-β-갈락토시다아제, ATM, 또는 p53 세포성 단백질이 발현되는 노화된 상태인 것이 가능하다. 즉, 본 발명에 의한 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법은 이미 노화가 진행된 체세포로부터 유도 신경 줄기를 생산하는 것이 가능하다.
본 발명에 의한 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법에 있어서, 상기 비신경 세포는 성체줄기세포 (adult stem cells) 또는 만능 줄기 세포(pluripotent cell) 이고, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 상기 표적 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법은
표적 세포 내로 SOX-2 유전자 및 HMGA2의 유전자, 또는 SOX-2 단백질 및 HMGA2 단백질을 도입하는 단계; 및
상기 SOX-2 유전자 및 HMGA2 의 유전자, 또는 SOX-2 단백질 및 HMGA2 단백질이 도입된 표적 세포를 유도 신경 줄기 세포 배양 조건에서 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 SOX-2 유전자와 HMGA2 유전자는 천연 SOX-2와 HMGA2 폴리펩티드 패밀리 구성원, 및 전체 서열에 걸쳐 상기 천연 SOX-2와 HMGA2 폴리펩티드 패밀리 구성원과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 변이체를 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에 의한 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법에 있어서, 상기 표적 세포 내로 SOX-2 유전자 및 HMGA2 유전자를 도입시키는 단계에서는 상기 SOX-2 유전자 및 HMGA2 유전자를 코딩하는 헥산 분자가 도입된 벡터를 이용하여 상기 표적 세포를 형질 감염 시키는 것이 가능하다.
본 발명에 의한 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법에 있어서, 상기 표적 세포 내로 SOX-2 유전자 및 HMGA2 유전자를 도입시키는 단계에서는 SOX-2 단백질 또는 SOX-2 단백질을 코딩하는 헥산 분자, 및 HMGA2 단백질 또는 HMGA2 를 코딩하는 헥산 분자를 포함하는 조성물에서 상기 표적 세포를 배양함으로써, 상기 표적 세포 내로 SOX-2 단백질 또는 SOX-2 단백질을 코딩하는 헥산 분자, 및 HMGA2 단백질 또는 HMGA 2 를 코딩하는 헥산 분자가 도입되도록 하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 SOX-2 단백질 또는 SOX-2 단백질을 코딩하는 헥산 분자, 및 HMGA2 단백질 또는 HMGA 2 를 코딩하는 헥산 분자의 도입하기 위해 기타 나노 입자 또는 화합물등을 이용하는 것이 가능하다.
본 발명에 의한 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법에 있어서, 상기 유도 신경 줄기 세포 배양 조건에서 배양하는 단계는
DMEM (Gibco, 11885) 및 10% FBS 를 포함하는 배지에서 2일 동안 배양하는 단계;
FGM (Lonza, K-CC-3123) 및 10% FBS 를 포함하는 배지에서 3계대 내지 5계대 까지 배양하는 단계; 및
ReNcell NSC maintenance Media (Millipore, SCM005) (20ng/ml bFGF 와 EGF 첨가), StemPro NSC SFM (Invitrogen, GIB-A1050901) 각각 또는 이들의 1:1 혼합 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 상기 표적 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법은
표적 세포 내로 small RNA, si RNA, mi RNA, 센스 RNA, 안티센스 RNA 및 화합물로 이루어진 그룹에서 선택되는 SOX-2 발현 조절 인자 및 HMGA2의 발현 조절 인자를 도입하는 단계; 및
유도 신경 줄기 세포 배양 조건에서 상기 SOX-2 발현 조절 인자 및 HMGA2의 발현 조절 인자가 도입된 표적 세포를 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 본 발명에 의한 유도 신경 줄기 세포의 생산 방법에 의해 생산되는 유도 신경 줄기세포를 제공한다.
본 발명에 의한 유도 신경 줄기세포는 신경 세포 (neuron), 별아교세포(astrocyte), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte), GABA성 신경 세포 또는 도파민성 신경세포로 분화할 수 있는 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법은 표적 세포 내에서 Sox-2 및 HMGA2 의 2개의 유도 인자의 발현을 증가시킴으로써 기존의 4개의 인자, 5개의 유도인자를 이용하는 종래 방법에 비해 5배 내지 10배 이상 높은 비율로 더 효율적으로 유도 신경 줄기 세포를 제작할 수 있다.
도 1은 표적 세포로서 인간중간엽 줄기 세포를 사용하고, 유도 인자로서 SOX-2 와 HMGA2 유전자를 상기 표적 세포에 도입하여 과발현시킨 후, NSC 배지에서 배양하면서 유도 신경 줄기 세포를 생산하였으며, 시간에 따른 세포의 모폴로지를 사진으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예 1, 2 의 인간중간엽 줄기 세포, 인간 상피 섬유아세포로부터 유도된 신경 줄기 세포 및 및 WT NSC를 도입하여 과발현 시킨 비교예 1의 세포들의 신경 줄기 세포의 특성을 측정하기 위해 면역 염색을 수행한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예 1, 2 의 인간중간엽 줄기 세포, 인간 상피 섬유아세포로부터 유도된 신경 줄기 세포 및 및 WT NSC를 도입하여 과발현시킨 비교예 1의 세포들의 특성을 측정하기 위해 RT-PCR 을 수행한 결과를 나타낸다.
도 4 는 본 발명의 실시예 2에서 제조된 피부 섬유아 세포로부터 유도된 신경 줄기 세포의 분화능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 유도 인자로서 SOX-2 만을 도입한 경우, SOX-2/CMYC 를 도입한 경우, SOX-2/HMGA2 를 도입한 경우에 대해서 각각 형성되는 콜로니의 숫자를 측정한 결과를 나타내었다.
도 6은 피부 섬유아 세포 중 senescence-associated beta-galactosidase 염색 결과 양성으로 염색된 세포에 대해서 유도 인자로서 SOX-2 만을 도입한 경우, SOX-2/CMYC 를 도입한 경우, SOX-2/HMGA2 를 도입한 경우 유도 신경 줄기 세포로 유도된 효율을 측정한 결과를 나타내었다.
도 7은 OCT4, SOX-2, KLF4를 도입하는 경우와 OCT4, SOX-2, KLF4 및 HMGA2를 도입하는 경우에 대해서 유도 신경 줄기 세포로의 유도 효율을 측정한 결과를 나타내었다.
도 8은 비신경 세포인 인간 상피 섬유아세포, 인간 상피 섬유아세포로부터 SOX-2 만을 이용하여 유도 제조된 유도 신경(SOX-2-hDF-iNSC), 인간 상피 섬유아세포로부터 SOX-2 와 HMGA2 를 이용하여 유도 제조된 유도 신경 (SH-hDF-iNSC) 및 WTNSC간의 let-7 miRNA cluster의 발현 레벨을 비교한 결과를 나타내었다.
도 9는 SOX-2 유전자와 miR-CTL 혹은 anti-let-7b를 동시에 처리한 경우 상기 실시예 3 과 같은 방법으로 25000 개의 피부 섬유아 세포 중 유도 신경 세포로 유도된 세포의 갯수로 효율을 측정한 결과를 나타낸다.
도 10은 피부 섬유아세포에 PDE4D 억제제를 처치하였을 때 피부 섬유아세포에서의 SOX-2 및 HMGA2 발현 레벨을 측정한 결과를 나타낸다.
이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이하의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
표적 세포로서 인간중간엽 줄기 세포를 사용하고, 유도 인자로서 SOX-2 와 HMGA2 의 유전자를 벡터를 이용하여 상기 표적 세포인 인간중간엽 줄기 세포에 도입하여 과발현시킨 후, DMEM (Gibco, 11885) 및 10% FBS 를 포함하는 배지에서 2일 동안 배양하고, FGM (Lonza, K-CC-3123) 및 10% FBS 를 포함하는 배지에서 3계대 내지 5계대까지 배양하였다.
이후, ReNcell NSC maintenance Media (Millipore, SCM005) (20ng/ml bFGF 와 EGF 첨가) 및 StemPro NSC SFM (Invitrogen, GIB-A1050901) 각각의 배지 또는 1:1 혼합 배지에서 배양하여 유도 신경 줄기 세포를 생산하였으며, 시간에 따른 세포의 모폴로지를 사진으로 측정하여 도 1에 나타내었다. 도 1에서 3일 후부터 세포의 모양 변화가 나타났으며, 6일 후에는 콜로니가 형성되는 것을 확인할 수 있다.
< 실시예 2>
표적 세포로서 인간 상피 섬유아세포(human dermal fibroblast)를 사용하고, 유도 인자로서 SOX-2 와 HMGA2 유전자를 상기 표적 세포인 인간 상피 섬유아세포(human dermal fibroblast)에 직접 도입하여 과발현시킨 후, 상기 실시예 1에서와 같이 배양하면서 유도 신경 줄기 세포를 생산하였다.
< 비교예 >
유도 인자로서 WT NSC를 인간중간엽 줄기 세포에 도입하여 과발현 시킨 후 배양한 것을 비교예 1로, 유도 인자로서 SOX-2 유전자를 단독으로 도입하여 배양한 것을 비교예 2로, 유도 인자로서 SOX-2 유전자와 WT NSC 를 도입하여 배양한 것을 비교예 3으로 하였다.
< 실험예 1> 면역 염색 사진
상기 실시예 1, 2 및 비교예 1에서 배양된 세포들의 신경 줄기 세포의 특성을 측정하기 위해 면역 염색을 수행하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 실시예 1, 2 및 비교예에서 배양된 세포들에서 신경 줄기 세포의 주요 마커인 PAX6, NESTIN, SOX-2 가 발현되어 신경 줄기 세포로 유도된 것을 확인할 수 있다.
< 실험예 2> RT - PCR
상기 실시예 1, 2 에서 배양된 인간중간엽 줄기 세포, 인간 상피 섬유아세포및 WT NSC를 도입하여 과발현 시킨 비교예 1에서 배양된 세포들의 신경 줄기 세포의 특성을 측정하기 위해 RT-PCR 을 수행하였다.
총 세포의 RNA는 NSC 세포로부터 Trizol (Life Technologies, Frederick, MA)을 이용하여 추출하였고, oligo dT 프라이머를 이용하여 일차 표준 cDNA로 역전하였다. 이후 cDNA를 20 pM의 특이 프라이머를 포함한 PCR 반응물에서 증폭시켰다. 또한, 실시간 PCR을 SYBR green kit (Applied Biosystems, Foster, CA)를 이용하여 ABI7700 Prism Sequence Detection System에서 수행하였다. 프라이머 서열은 Primer Express software(PEApplied Biosystems, Warrington, UK)를 이용하여 GeneBank 데이터베이스로부터 얻은 유전자 서열로 설계되었다. RT-PCR 수행 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 실시예 1, 2 및 비교예에서 배양된 세포들에서 신경 줄기 세포의 마커인 PAX6, MASHI1, SOX-2 가 강하게 발현되어 유도 신경 줄기 세포가 생산된 것을 확인할 수 있다.
< 실험예 3> 유도 신경 줄기 세포의 분화능 확인
< 실험예 3-1> neuron 으로의 분화능 확인
상기 실시예 2에서 제조된 피부 섬유아 세포로부터 유도된 신경 줄기 세포를 NSC 유지 배지에서 EGF, bFGF 를 제외시킨 후 RA, FRK 및 BDNF 를 첨가하여 배양하여 신경 세포(neuron)로 분화를 유도하였다.
유도된 세포에 대해 면역 염색을 수행하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 Neuron 의 마커인 NF, DCX, TUJ1 에 대해 양성 반응을 나타내고, 이로부터 상기 실시예 2에서 제조된 피부 섬유아 세포로부터 유도된 신경 줄기 세포가 신경 세포(neuron)으로 분화능이 있다는 것을 확인할 수 있었다.
< 실험예 3-2> 희소돌기아교세포( oligodendrocyte )로의 분화능 확인
상기 실시예 2에서 제조된 피부 섬유아 세포로부터 유도된 신경 줄기 세포를 NSC 유지 배지에서 EGF, bFGF 를 제외시킨 후 FBS 를 첨가 배양하여 희소돌기아교세포(induced oligodendrocyte)로의 분화능을 확인하였다.
배양된 세포에 대해 면역 염색을 수행한 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 상기 실시예 2에서 제조된 피부 섬유아 세포로부터 유도된 신경 줄기 세포가 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)의 마커인 O4 에 대해 양성 반응을 나타내어, 상기 실시예 2에서 제조된 피부 섬유아 세포로부터 유도된 신경 줄기 세포가 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)로 분화능이 있다는 것을 확인할 수 있었다.
< 실험예 4> 유도 효율 측정
유도 인자로서 SOX-2 만을 도입한 경우, SOX-2/CMYC 를 도입한 경우, 본 발명의 실시예에 의해 SOX-2/HMGA2 를 도입한 경우 유도 신경 줄기 세포의 유도 효율을 측정하였다.
25000 개의 세포에 대해서 유도 인자로서 SOX-2 만을 도입한 경우, SOX-2/CMYC 를 도입한 경우, SOX-2/HMGA2 를 도입한 경우에 대해서 각각 형성되는 콜로니의 숫자를 측정한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 유도 인자로서 SOX-2 만을 도입한 경우 평균 콜로니가 5.5 개 형성되고, SOX-2/CMYC 를 도입한 경우 평균 17.3 개의 콜로니가 형성되고, 본 발명의 실시예에 의해 SOX-2/HMGA2 를 도입한 경우 평균 61 개 형성되어, 본 발명에 의하여 SOX-2/HMGA2 를 도입한 경우 콜로니 형성 효율이 4배 내지 10배 효율이 높다는 것을 알 수 있다.
< 실시예 3> 노화가 진행된 피부 섬유아세포로부터 유도 신경 줄기 세포 유도
본 발명에 의하여 노화가 진행된 피부 섬유아 세포로부터 신경 세포로의 유도가 가능한지 여부를 실험하였다.
피부 섬유아 세포가 노화가 진행되었는지 여부는 senescence-associated beta-galactosidase 염색 결과 양성으로 염색되는지 여부로 판단하였다. 피부 섬유아 세포 중 senescence-associated beta-galactosidase 염색 결과 양성으로 염색된 노화가 진행된 세포에 대해서 i)유도 인자로서 SOX-2 유전자만을 도입한 경우, ii)SOX-2/CMYC 를 도입한 경우, iii)SOX-2/HMGA2 유전자를 직접 도입한 경우 25000 개의 피부 섬유아 세포 중 유도 신경 세포로 유도된 세포의 갯수로 효율을 측정하고 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 SOX-2 의 유전자만을 도입한 경우와 SOX-2/CMYC 의 유전자를 도입한 경우는 콜로니가 형성되지 않았으나, SOX-2 및 HMGA2 의 유전자를 동시에 도입한 경우만 25000 개 중에 5개의 콜로니가 형성되어 본 발명에 의하여 SOX-2 및 HMGA2 유전자를 동시에 도입한 경우 노화가 진행된 피부 섬유아 세포도 신경 세포로 유도가 가능하다는 것을 확인할 수 있다.
< 실험예 5> HMGA2 에 의한 유도 신경 줄기 세포 유도효율 향상 측정
OCT4, SOX-2, KLF4의 유전자를 도입하는 경우와 OCT4, SOX-2, KLF4 및 HMGA2의 유전자를 도입하는 경우에 대해서 유도 신경 줄기 세포로의 유도 효율을 측정하고 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 유도 인자로서 OCT4, SOX-2, KLF4 및 HMGA2의 유전자를 추가적으로 도입하는 경우 유도 신경 줄기 세포로의 유도 효율이 약 3배 이상 향상되는 것을 확인할 수 있다.
< 실시예 4> anti - let -7b 에 의한 유도 신경 줄기 세포 유도효율 향상 측정
< 실시예 4-1> 신경 세포 및 비신경 세포 내에서 let -7b 발현 양상 확인
비신경 세포인 인간 상피 섬유아세포, 인간 상피 섬유아세포로부터 SOX-2 만을 이용하여 유도 제조된 유도 신경(SOX-2-hDF-iNSC), 인간 상피 섬유아세포로부터 SOX-2 와 HMGA2 를 이용하여 유도 제조된 유도 신경 (SH-hDF-iNSC) 및 WTNSC간의 let-7 miRNA cluster의 발현 레벨을 비교하고 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8 에서 비신경 세포인 인간 상피 섬유아세포에 비해 신경 줄기 세포들에서 let-7 miRNA cluster의 발현이 전체적으로 낮은 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 4-2> anti - let -7b 에 의한 유도 신경 줄기 세포 유도 효율 향상 측정
SOX-2　유전자와 anti-let-7b를 동시에 처리하는 경우 유도 신경 줄기 세포의 유도 효율을 측정하였다.
먼저 SOX-2　유전자를 도입한 후　3일 뒤　anti-let-7b를 처리하였다. 50nM의　anti-let-7b를 항생제가 첨가되지 않은 배지에 넣고,　이어서　Fugene 6 (Roche)　를 넣어 섞어주었다. 약　15분 후 혼합물을　SOX-2　유전자를 도입한 세포의 배지에 넣어주어 anti-let-7b 를 세포내로 도입하였다.
이와 같이 anti-let-7b를 동시에 처리한 경우 상기 실시예 3 과 같은 방법으로 25000 개의 피부 섬유아 세포 중 유도 신경 세포로 유도된 세포의 갯수로 효율을 측정하고 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9 에서 OX2를 이용해 직접 유도를 수행할 때 anti-let-7b를 동시에 처리한 경우 유도 효율이 3배 이상 증가함을 확인하였다.
< 실험예 6> PDE4D 억제제에 의한 SOX-2 및 HMGA2 발현 레벨 향상 측 정
피부 섬유아세포에 PDE4D 억제제를 처치하였을때 피부 섬유아세포 내의 SOX-2 및 HMGA2 발현 레벨을 측정하고 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 PDE4D 억제제는 피부 섬유아세포에서 SOX-2의 레벨을 약 7배, HMGA2의 레벨을 약 63배 향상시키는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (18)

  1. 표적 세포 내의 Sox-2 및 HMGA2 의 발현을 증가시킴으로써 표적 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 표적 세포내로 Sox-2 유전자 및 HMGA2 유전자, 또는 Sox-2 단백질 및 HMGA2 단백질을 도입하여 표적 세포 내의 Sox-2 및 HMGA2 의 발현을 증가시킴으로써 표적 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 Sox-2 유전자는 천연 SOX-2 폴리펩티드 패밀리 구성원 또는 상기 천연 SOX-2 폴리펩티드 패밀리 구성원과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 변이체이고,
    상기 HMGA2 유전자는 천연 HMGA2 또는 상기 천연 HMGA2 폴리펩티드 패밀리 구성원과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 변이체인 것인 표적 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    표적 세포 내의 Sox-2 의 발현을 증가시키기 위하여 상기 표적 세포 내로 small RNA, si RNA, mi RNA, 센스 RNA, 안티센스 RNA, 단백질 및 화합물로 이루어진 그룹에서 선택되는 Sox-2 의 발현 조절 인자를 도입하는 것인 표적 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    표적 세포 내의 HMGA2의 발현을 증가시키기 위하여 상기 표적 세포 내로 small RNA, si RNA, mi RNA, 센스 RNA, 안티센스 RNA, 단백질 및 화합물로 이루어진 그룹에서 선택되는 HMGA2 의 발현 조절 인자를 도입하는 것인 표적 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 HMGA2 의 발현 조절 인자는 let-7 miRNA 클러스터 저해제 또는 PDE4D 저해제인 것을 특징으로 하는 표적 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법.
  7. 제 4 항에 있어서,
    상기 Sox-2 의 발현 조절 인자는 PDE4D 저해제인 것을 특징으로 하는 표적 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 표적 세포는 비신경 세포인 것인 표적 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 비신경 세포는 섬유아세포인 것인 표적 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 비신경 세포는 체세포인 것인 표적 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 체세포는 SA-β-갈락토시다아제, ATM, 또는 p53 세포성 단백질이 발현되는 노화된 상태인 것인 표적 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 비신경 세포는 성체줄기세포인 표적 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 성체줄기세포는 중간엽줄기세포인 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 표적 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법은
    표적 세포 내로 SOX-2 유전자 및 HMGA2의 유전자, 또는 SOX-2 단백질 및 HMGA2 단백질을 도입하는 단계; 및
    상기 SOX-2 유전자 및 HMGA2 의 유전자, 또는 SOX-2 단백질 및 HMGA2 단백질이 도입된 표적 세포를 유도 신경 줄기 세포 배양 조건에서 배양하는 단계;를 포함하는 것인 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 SOX-2 유전자 및 HMGA2의 유전자, 또는 SOX-2 단백질 및 HMGA2 단백질이 도입된 표적 세포를 유도 신경 줄기 세포 배양 조건에서 배양하는 단계는
    DMEM 및 10% FBS 를 포함하는 배지에서 2일 동안 배양하는 단계;
    FGM 및 10% FBS 를 포함하는 배지에서 3계대 내지 5계대 까지 배양하는 단계; 및
    ReN cell NSC maintenance Media, StemPro NSC SFM 각각 또는 이들의 1:1 혼합 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 것인 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 표적 세포로부터 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법은
    표적 세포 내로 small RNA, si RNA, mi RNA, 센스 RNA, 안티센스 RNA 및 화합물로 이루어진 그룹에서 선택되는 SOX-2 및 HMGA2의 발현 조절 인자를 도입하는 단계; 및
    상기 SOX-2 및 HMGA2의 발현 조절 인자가 도입된 표적 세포를 유도 신경 줄기 세포 배양 조건에서 배양하는 단계;를 포함하는 것인 유도 신경 줄기 세포를 생산하는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 하나의 방법에 의해 생산되는 유도 신경 줄기세포.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 유도 신경 줄기 세포는 신경 세포, 별아교세포, 희소돌기아교세포, GABA성 신경 세포 또는 도파민성 신경 세포로 분화할 수 있는 세포인 것인 유도 신경 줄기 세포.
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