CN109674809B - 一种包括miR-124-3P的组合物及其在诱导神经元形成的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种包括miR‑124‑3P的组合物及其在诱导神经元形成的药物中的应用,属于中枢神经损伤修复技术领域,所述组合物包括miR‑124‑3P和诱导剂;所述诱导剂选自JAK抑制剂、p38‑MAPK的抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂中的一种或多种。利用本发明所述组合物诱导反应性星形胶质细胞转分化为神经元的时间短,且步骤简便,诱导组分少,经济有效且方便。

Description

一种包括miR-124-3P的组合物及其在诱导神经元形成的药物 中的应用
技术领域
本发明属于中枢神经损伤修复技术领域,尤其涉及一种包括miR-124-3P的组合物及其在诱导神经元形成和制备减少胶质瘢痕形成的药物中的应用。
背景技术
星形胶质细胞(Astrocyte,As)是脊椎动物中枢神经系统(Central nervoussystme,CNS)中神经胶质细胞的主要组成部分。在正常生理条件下,As对于CNS的结构支撑、神经元的营养代谢以及调节脑血流量等都具有极其重要的作用。但在CNS疾病或损伤时,除了会造成病损部位轴突断裂和功能性神经元坏死外,还会使病损周围的As发生一系列的表型变化,处于静息态的幼稚型As被损伤刺激激活,发生胞体的肿胀、肥大,于损伤亚急性期(4-14天)变为反应性星形胶质细胞(RAs),随后RAs会发生增殖,并迁移至损伤部位与胞外基质、蛋白多糖等形成胶质瘢痕。胶质瘢痕在早期能封闭病变组织,防止炎症扩散,对机体起到一定保护作用。但随着时间延长,胶质瘢痕又会产生硫酸软骨蛋白多糖(CSPG)生长抑制因子,可阻止轴突生成和再髓鞘化,最终阻碍神经组织再生修复。要解决这个问题的关键是如何获得功能性神经元,减少胶质瘢痕的形成。
根据文献报道(BuffoA,Rite I,Tripathi P,et al,2008.Origin andprogeny ofreactive gliosis:A source ofmultipotent cells in the injured brain.Proc NatlAcad Sci U S A.105(9):3581-3586.;Robel S,Berninger B,
Figure BDA0001924537110000011
M.,2011.The stemcell potential of glia:lessons from reactive gliosis.Nat Rev Neurosci.12(2):88-104),RAs在体外诱导条件下可分化为神经元和少突胶质细胞。这表明,在体外RAs具有神经干细胞特性。但在体内损伤的微环境中,RAs却不能转分化为神经元促进神经组织的再生修复。如何运用RAs向神经元分化的潜在干细胞特性,人为诱导RAs向神经元分化,在体内既减少胶质瘢痕的形成,又利于神经网络的再形成和神经组织功能的恢复,这成为一个科学难题。
miR-124是哺乳动物脑中最丰富的特征性microRNA之一。有发表的文献证实非神经细胞如成纤维细胞和Hela细胞等人为高表达miR-124后细胞表达神经元细胞特有的标志基因(Lim LP,Lau NC,Garrett-Engele P,et al,2005.Microarray analysis shows thatsome microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.Nature.433(7027):769-773.;Mondanizadeh M,Arefian E,Mosayebi G,et al,2015.MicroRNA-124regulates neuronal differentiation of mesenchymal stem cells by targeting Sp1mRNA.J Cell Biochem.Jan 5.doi:10.1002/jcb.25045.;Ambasudhan R,Talantova M,Coleman R,et al,2011.Direct reprogramming of adult human fibroblasts tofunctional neurons under defined conditions.Cell Stem Cell.9(2):113-118.;YooAS,Sun AX,Li L,et al,2011.MicroRNA-mediated conversion of human fibroblaststo neurons.Nature.476(7359):228-231.;Matheus B Victor,Michelle Richner,TraceyO Hermanstyne,et al,2014.Generation of human striatal Neurons by MicroRNA-dependent direct conversion of fibroblasts.Neuron.84(2):311–323.),这些结果提示如果人为的提高RAs中miR-124的表达量,可能调控RAs向神经元方向分化。
2017年发表在stem cell reports上一篇题为“Direct Generation of HumanNeuronal Cells from Adult Astrocytes by Small Molecules”的文章中提到用小分子化合物法诱导成人As为神经元。即将人病理脑组织分离的正常As以5×104个/cm2细胞铺于24孔板,给予As培养液培养,待两天后细胞密度达90%汇合时,更换培养液为含有1X B27、1X N2、20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、20ng/ml IGF、0.2μMAscorbic acid、100μMdibutyryl-cAMP、1ug/ml laminin、0.5mM VPA、3μM Chir99021、1μM Repsox、10μMForskolin、2μM i-BET151和10μM ISX-9的Neurobasal诱导液,每4天换液一次,第20天时,再次更换培养液为Neurobasal中含有1X B27、1X N2、20ng/ml BDNF、20ng/ml GDNF、20ng/ml IGF、0.2μMAscorbic acid、100μM dibutyryl-cAMP、1μg/ml laminin、10μM forskolin和2μM i-BET151的神经元成熟诱导液中继续诱导至30天,可获得DCX、MAP2、Tuj1、NeuN阳性的神经元。
在CNS疾病或损伤时,病损周围的As会发生一系列表型变化,在损伤的亚急性期(4-14天)变为RAs。随后,RAs又会分泌一些细胞粘附分子,于损伤慢性期(14天以后)变为瘢痕形成性星形胶质细胞。而CNS受损后的最佳治疗时间是在损伤的亚急性期,现有的方法转分化为神经元需要的时间较长,步骤繁琐,培养出神经元时已经是损伤的慢性期,并不利于中枢神经的再生修复。其次,诱导过程中所需要的诱导组分较多,小分子化合物种类多,需添加6种小分子,成本高。总之,并不经济方便。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种包括miR-124-3P的组合物及其在诱导反应性星形胶质细胞为神经元进而减少胶质瘢痕形成中的应用,利用所述组合物诱导RAs转分化为神经元的时间短,且步骤简便,诱导组分少,经济有效且方便。
为了实现上述发明目的,本发明提供了以下技术方案:
一种包括miR-124-3P的组合物,包括miR-124-3P和诱导剂;所述诱导剂选自JAK抑制剂、p38-MAPK的抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂中的一种或多种。
优选的,所述诱导剂包括JAK抑制剂、p38-MAPK的抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂。
优选的,所述诱导剂包括Ruxolitinib、SB203580和Forskolin。
优选的,所述miR-124-3P的使用浓度为25~150nmol/L。
优选的,所述Ruxolitinib的使用浓度为0.5~2μmol/L。
优选的,所述SB203580的使用浓度为3~8μmol/L。
优选的,所述Forskolin的使用浓度为5~15μmol/L。
本发明提供了所述的组合物在制备诱导反应性星形胶质细胞转分化为神经元的药物中的应用。
本发明提供了所述的组合物在制备抑制反应性星形胶质细胞的细胞特性的药物中的应用。
本发明还提供了所述的组合物在制备减少胶质瘢痕形成的药物中的应用。
本发明的有益效果:本发明提供的组合物包括miR-124-3P和诱导剂;所述诱导剂选自JAK抑制剂、p38-MAPK的抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂中的一种或多种。本发明中所述组合物能够组合应用于诱导反应性星形胶质细胞转分化为神经元,诱导获得神经元的时间短,且步骤简便,有利于中枢神经的再生修复。所述组合物在诱导过程中所需要的诱导组分少,成本低。
附图说明
图1-1为纯化后的RAs细胞形态;
图1-2为RAs的标志物鉴定;
图2-1为RAs内miR-124转染效率检测结果;
图2-2为RAs内miR-124转染后标志性蛋白检测及定量分析
图3-1为诱导细胞的细胞形态;
图3-2为诱导细胞神经元标志物的检测结果;
图3-3为大乳鼠RAs、诱导细胞和神经元相关标志物检测结果;
图4为不同组分诱导液诱导细胞神经元标志物鉴定结果。
具体实施方式
本发明提供了一种包括miR-124-3P的组合物,包括miR-124-3P和诱导剂;所述诱导剂选自JAK抑制剂、p38-MAPK的抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂中的一种或多种。
在本发明中,所述组合物包括miR-124-3P;所述miR-124-3P包括miR-124-3P核苷酸序列本身外,还可以包含有miR-124前体的表达载体、含有miR-124成熟体表达载体和包含有miR-124的5`端特定种子碱基序列的其它非编码核苷酸序列的其它表达载体如质粒、慢病毒、腺病毒或其它微生物。详述如下:①包括只要能够起到提高星形胶质细胞胞质中mirbase数据库(http://www.mirbase.org/)中包括人(MIMAT0000422)在内其他种属miR-124-3P(如大鼠MIMAT0000828,5`-UAAGGCACGCGGUGAAUGCC-3`)表达量的基因携带表达载体和核苷酸序列片段;②5`端含有UAAGGCAC或AAGGCAC种子核苷酸序列,与某种mRNA的3`UTR部位结合干扰该mRNA翻译的人工干扰核苷酸序列片段或非编码基因表达载体;③本发明对所述miR-124前体和miR-124成熟体的序列不做特殊限定,根据mirbase数据库(http://www.mirbase.org)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov),所述miR-124前体和miR-124成熟体包括转录后剪切和加工后形成上述成熟体miR-124-3P核苷酸序列的各种种属pri-miR-124-1、pri-miR-124-2、pri-miR-124-3和Pre-miR-124-1、Pre-miR-124-2以及Pre-miR-124-3等。
本发明中所述诱导剂选自JAK抑制剂、p38-MAPK的抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂中的一种或多种,优选的选自JAK抑制剂、p38-MAPK的抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂中的两种或三种,更优选的包括JAK抑制剂、p38-MAPK的抑制剂和腺苷酸环化酶激活剂。
本发明对所述JAK抑制剂的种类没有特殊限定,常规的具有JAK抑制作用的JAK抑制剂均可,优选的为Ruxolitinib(芦可替尼,又称鲁索利替尼),芦可替尼磷酸盐,INCB018424(S-芦可替尼),CP-690550(枸橼酸托法替布),Momelotinib(CYT387)或LY3009104(INCB028050,巴瑞克替尼)。
本发明对所述p38-MAPK的抑制剂的种类没有特殊限定,常规的具有p38-MAPK的抑制作用的抑制剂均可,优选为SB203580、SB202190(FHPI),BMS-582949,Doramapimod(BIRB796)或Ralimetinib(LY2228820)。
本发明对所述腺苷酸环化酶激活剂的种类没有特殊限定,只要具有腺苷酸环化酶作用的腺苷酸环化酶激活剂均可,优选为Forskolin或PACAP 1-38。
在本发明的一个具体实施过程中,所述组合物优选的包括miR-124-3P、Ruxolitinib、SB203580和Forskolin。
在本发明中,所述Ruxolitinib是第一个应用于临床的有效的选择性JAK1/2抑制剂,在无细胞试验中IC50为3.3nM/2.8nM;所述Ruxolitinib作用于JAK1,JAK2与作用于JAK3相比,选择性高130多倍。As的反应性与JAK/STAT3信号通路的激活有关,应用所述Ruxolitinib可抑制As活化为RAs。
在本发明中,所述SB203580是一种p38-MAPK抑制剂,在THP-1细胞中IC50为0.3~0.5μM,与SAPK3(106T)和SAPK4(106T)选择性低10倍,且所述SB203580能够阻断PKB磷酸化,IC50为3~5μM。p38/MAPK信号通路的激活与As的反应性胶质增生有关,应用所述SB203580可抑制As的反应性胶质增生。
在本发明中,所述Forskolin是各种各样细胞类型中普遍存在的真核细胞腺苷酸环化酶(AC)激活剂,在细胞生理学研究中,通常用来提高cAMP(环磷酸腺苷)水平,应用所述Forskolin可以促进As的转化成神经元。
在本发明中,所述miR-124-3P的使用浓度优选为25~150nmol/L,更优选为30~100nmol/L,进一步的更优选为45~55nmol/L;所述Ruxolitinib的使用浓度优选为0.5~2μmol/L,更优选为0.8~1.5μmol/L,最优选为1.0μmol/L;所述SB203580的使用浓度优选为3~8μmol/L,更优选为4~7μmol/L,最优选为5μmol/L;所述Forskolin的使用浓度优选为5~15μmol/L,更优选为8~12μmol/L,最优选为10μmol/L。
本发明提供了所述的组合物在制备诱导反应性星形胶质细胞转分化为神经元的药物中的应用。
本发明提供了所述的组合物在制备抑制反应性星形胶质细胞的细胞特性的药物中的应用。
本发明还提供了所述的组合物在制备减少胶质瘢痕形成的药物中的应用。
本发明对所述诱导反应性星形胶质细胞转分化为神经元的药物、抑制反应性星形胶质细胞的细胞特性的药物以及减少胶质瘢痕形成的药物的剂型没有特殊限定,采用本领域常规药物剂型即可。在本发明具体实施过程中,所述组合物中的miR-124-3P与诱导剂优选的先后配合使用。本发明中,所述药物的使用方法优选的包括如下步骤:1)将所述miR-124-3P转染到中枢神经系统受损区反应性星形胶质细胞中过表达获得过表达miR-124-3P的细胞;2)向所述过表达miR-124-3P的细胞中添加所述诱导剂。本发明中,所述miR-124-3P优选的以miR-124-3P的mimic的形式存在。本发明对所述药物的具体使用方法没有特殊限定,采用本领域常规方法即可,具体可参见本发明实施例的记载。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
实验材料:大鼠As,来源自制或购买的As原代细胞。
制备方法包括抗体法、胰酶法。本实施例中采用的方法如下:将Wistar大乳鼠(出生1-3天,10只)置于75%酒精中浸泡消毒15min,PBS清洗后用显微剪刀和显微镊剥取大脑,显微镜下于盛有15ml PBS的不粘附细胞皿中去除海马、脑膜等剥离大脑皮层后,放入含有10ml DME/F12(HyClone,SH30023.01)的不粘附细胞皿,随后用5ml移液枪将组织打碎并用木瓜蛋白酶40μl Papain(40.4mgP/ml,Worthington,LS003127)+100μl DNAseⅠ(4mg/ml,Worthington,LS002006)34℃振荡器消化45min,6ml FBS(TransSerum EQ Fetal BovineSerum,FS201-02)和8ml 10X EBSS(Sigma,E7510)终止消化,1500rpm,5min离心沉淀收集消化分离的细胞(约2ml);用含体积分数为5%FBS的DME/F12悬浮细胞过40μm的滤网,PBS洗三次,离心沉淀后20×105个/瓶(T25)细胞在RAs培养液5ml(含体积分数为10%FBS、1XN2、5ng/ml bFGF和10ng/ml TGF-β1的DME/F12)中培养;待细胞90%融合时,37℃摇床以280rpm,10h/天,震荡2天,去除增殖旺盛的少突胶质细胞(oligodendrocyte)和小胶质细胞(microglia),震荡完后5ml RAs培养液中加入10nM阿糖胞苷(ara-c)(Sigma,C1768)100μl/T25培养瓶(约30×105个细胞/瓶)处理24h,得到高纯度的RAs(如图1-1所示,图1-1为相差显微镜观察纯化后的RAs细胞形态,左:40倍;右:100倍),后细胞传代以3×105个/孔铺于六孔板,用上述2ml/孔的RAs培养液继续培养(用于后续细胞转染),最终获得RAs特异标志物GFAP和S100表达纯度为95%以上的RAs(如图1-2所示,免疫细胞荧光染色法鉴定体外纯化培养的大乳鼠大脑皮层RAs标志物GFAP(左)、S100(右)的表达.细胞纯度达95%以上)。该细胞培养方法有组织消化彻底,细胞损伤少和细胞状态好等优点,从而达到最大限度地分离收集细胞用于实验的目的,同时可以减少实验中应用的动物数。
miR-124-3P的mimic转染(以下方案和结果中miR-124-3P标注为miR-124):
将上述以3×105/孔接种在六孔板的RAs培养至24h,待汇合达到约50%时,进行携带miR-124的mimic转染。即在200μl Opti-MEM I(1X)培养基(Gibco,31985-062)中加入50nM ron-miR-124-3P mimic[RIBOBIO,miRNA mimic&inhibitor,R10034.5;正义链:5’-UAAGGCACGCGGUGAAUGCC-3’(SEQ ID No:1),反义链:3’-AUUCCGUGCGCCACUUACGG-5’(SEQ IDNo:2)]即miR-124组,或50nM Neg-ative control[RIBOBIO,miRNAmimic&inhibitor,R10034.5;正义链:5’-UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3’(SEQ ID No:3),反义链:3’-AAACAUGAUGUGUUUUCAUGAC-5’(SEQ ID No:4)]即NC-124组,柔和混匀。
稀释并混匀lipofectamin试剂:200μl Opti-MEM I(1X)培养基稀释5μl转染试剂Lipofectamine RNAiMAX Reagent(Invitrogen,13778-075),轻轻混匀,室温放置5min;
将稀释好的mimic/NC与转染试剂Lipofectamine RNAiMAX Reagent混合得到混合物:轻柔混匀,室温放置20min,以便形成复合物;
将混合物加到含有细胞和培养基(1.6ml/孔,无血清或双抗的DME/F12)的六孔板中,来回轻柔摇晃细胞培养板;
将孔板放于CO2培养箱中37℃温育,4-6h时换回上述RAs培养液继续培养(用于后续诱导实验)。随后对不同时间和浓度的转染效率进行荧光定量PCR检测,具体方法如下:
①RAs的RNA提取(RNA提取试剂盒,QIAGEN)
吸弃转染的RAs培养液,PBS洗两遍。700μl Trizol均匀覆盖细胞,室温裂解5min,分别收集裂解液至去RNA酶的EP管中;
每管加入140μl三氯甲烷,手动剧烈震荡15s,室温静置3min;
12000g,4℃,15min离心;
上层相转移至新的去RNA酶EP管中,约300μl,加入1.5倍体积约450μl的100%无水乙醇,用移液器彻底混匀;
将上述混匀液体转移至分离柱中,9000g,15s室温离心,弃液相;
加入700μl RWT至分离柱,9000g,15s,室温离心,弃液相;
加入500μl RPE至分离柱,9000g,15s,室温离心,弃液相;
加入500μl RPE至分离柱,9000g,2min,室温离心,弃液相;
换新的2ml收集管,9000g,1min,室温离心,使分离柱干燥;
换新的1.5ml收集管,以10μl去RNA酶水加入分离柱,使RNA溶解,9000g,1min,室温离心,离心后将样品置于冰上;
紫外分光光度计测量RNA浓度及纯度;
②逆转录反应(将提取的RNA合成cDNA作为荧光定量PCR的反应模板,检测miR-124及相关基因的表达。包括miRNAs检测和非miRNAs检测两种。)
A.miRNAs检测(GeneCopoeiaTM,All-in-OneTM First-Strand cDNA SynthesisKit)
a.逆转录体系
Figure BDA0001924537110000091
b.反应条件
37℃ 60min
85℃ 5min
4℃+∞
B.非miRNAs检测(TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix,AU311)
a.逆转录体系
Figure BDA0001924537110000092
b.反应条件
42℃ 15min
85℃ 5s
③荧光定量PCR检测(RT-qPCR检测)
A.miRNAs检测(GeneCopoeiaTM,All-in-OneTM First-Strand cDNA SynthesisKit)
a.qPCR体系
Figure BDA0001924537110000101
b.反应条件
Figure BDA0001924537110000102
B.非miRNAs检测(Vazyme,miRNAUniversal SYBR qPCR Master Mix,MQ101-01)
a.qPCR体系
Figure BDA0001924537110000103
b.反应条件
Figure BDA0001924537110000111
④统计分析
RT-qPCR实验结果均采用2-△△Ct的方法进行统计学分析。
实验数据均来自至少3次独立实验,计量数据以均数±标准差(X±S)表示。应用GraphPadPrism 6软件进行统计学分析,P﹤0.05视为差异显著并具有统计学意义。
miRNAs引物由广州复能公司合成,其余引物均由上海生物工程有限公司合成,序列如表1。
表1扩增引物序列
Figure BDA0001924537110000112
荧光定量PCR检测到miR-124的表达水平与对照组相比,在48h、50nM时的转染效率最高(约23倍),最终获得高表达miR-124的RAs(如图2-1所示)。图2-1为荧光定量PCR分析体外培养的RAs经miR-124mimic转染后细胞内miR-124的表达量,各组的miR-124的表达量以各自对照组NC-124表达量设定为1时相对表达量表示。25nM,50nM,100nM和150nM,RAs转染mimic的不同浓度;24h,48h,72h,96h和120h,以50nM浓度RAs转染mimic的不同时间miR-124的表达量。(*P<0.05)
此外,RAs在高表达miR-124后,Westernblot检测其标志性蛋白GFAP、SOX9、NFIA和与神经分化相关的负性调控分子Hes1表达量,检测方法如下:
①收集蛋白样品及蛋白浓度测定
吸弃六孔板细胞培养基,预冷PBS洗5min×3次,加入30μl RIPA/孔裂解液(RIPA裂解液:PMSF=100:1),置于冰上裂解30min,期间不断摇晃以充分裂解细胞,用细胞刮刮取裂解后的细胞至1.5ml EP管中,12000g,4℃,离心30min。取上清弃沉淀,-80℃冰箱保存备用;
BCA试剂盒测蛋白浓度:即先将标准蛋白稀释至终浓度为0.5mg/ml,根据样品数量,工作液按A:B=50:1的比例配好,标准曲线孔按照标准蛋白0,1,2,4,8,12,16,20μl的体积加到96孔板中,PBS补齐至20μl,实验组各加2μl样品,并用PBS补齐至20μl,后各孔加入200μl工作液,37℃孵育30min。测量波长为562nm时的吸光度并绘制标准曲线,计算样品的蛋白浓度;
②电泳
SDS-PAGE凝胶配制:SDS-PAGE凝胶(10%分离胶及5%浓缩胶)
样品处理:根据测定的蛋白浓度将总蛋白质量调到30μg,加入5×loading,并用PBS补至相同总蛋白体积,后于沸水中煮5min,转移至冰上冷却,离心,上样前混合均匀。剩余样品可在-20℃冰箱保存;
③上样及电泳浓缩胶80V约30min,分离胶120V约60min;
④转膜将PVDF膜浸泡在甲醇溶液中活化约15s,转膜条件为100V,约90min;
⑤封闭将膜置于体积分数为5%脱脂奶粉的封闭液中,于摇床上,室温封闭1h;
⑥孵育一抗含体积分数为1%脱脂奶粉的TBST作为抗体稀释液,按照一抗说明书推荐的比例稀释抗体,4℃冰箱过夜;
洗膜:TBST洗膜,5min×3次;
⑦孵育二抗含体积分数为1%脱脂奶粉的TBST作为抗体稀释液,按照二抗说明书推荐的比例稀释抗体;
洗膜:TBST洗膜,5min×3次;
⑧显色使用ECL化学发光试剂盒,按说明书进行显色,并用成像分析仪检测,拍照记录;
所使用的相关抗体如表2所示。
表2使用的抗体的名称、生产厂家和货号
抗体名称 生产厂家 货号
Anti-GFAP Antibody Abcam ab7260
Anti-SOX9 Antibody Millipore AB5535
Anti-NFIA Antibody Abcam ab41851
Anti-Hes1 Antibody Abcam ab71559
Anti-GAPDH Antibody Transgen Biotech HC301-02
Goat Anti-Rab-bit IgG(H+L) Transgen Biotech HS101-01
Goat Anti-Mou-se IgG(H+L) Transgen Biotech HS201-01
检测到标志性蛋白GFAP、SOX9、NFIA和与神经分化相关的负性调控分子Hes1表达量均下降(如图2-2所示),图2-2为Western blot检测体外培养的大乳鼠RAs经miR-124的mimic转染后细胞内标志性蛋白GFAP、SOX9、NFIA和神经分化负性调控分子Hes1的表达量。NC-124,RAs未转染miR-124;miR-124,RAs转染miR-124。实验数据均来自至少3次独立实验,计量数据以均数±标准差(X±S)表示。应用SPSS17.0软件进行统计学分析。(*P<0.05)
表明RAs原有的细胞特性逐渐减弱,且极可能向神经方向分化。
小分子化合物诱导:
将上述转染miR-124至24h的RAs更换培养液为含2%FBS、1X N2、10ng/ml bFGF、1μM Ruxolitinib、5μM SB203580、10μM Forskolin、10ng/ml BDNF和15ng/ml GDNF的DME/F12诱导液诱导细胞,每3天换液一次,诱导6天时,细胞体积变小,并伴有细长突起样结构生成(如图3-1所示),经免疫细胞荧光染色法鉴定诱导细胞表达神经元标志物MAP2、β3-Tubulin(Tuj1)、DCX、NeuN和SYN1(如图3-2所示)。在mRNA水平,荧光定量PCR检测大乳鼠RAs、诱导细胞元(Induced neuron)和神经元(Rat neuron)相关标志性基因的表达变化,诱导细胞的神经元标志基因DCX和MAP2虽低于神经元,与RAs比却表达升高(如图3-3所示)。综上表明,利用miR-124和Ruxolitinib、SB203580、Forskolin三种小分子的协同作用诱导大乳鼠As转分化为具神经元特性的细胞,且在诱导过程中,miR-124和Ruxolitinib、SB203580、Forskolin组合作用,效果最好(如图4所示)。
图3-1位相差显微镜观察大乳鼠RAs在高表达miR-124后,经小分子化合物诱导6天时的细胞形态。NC-124组,RAs未高表达miR-124,经小分子化合物诱导6天(左);miR-124组,RAs高表达miR-124,经小分子化合物诱导6天(右)。
图3-2为免疫细胞荧光染色法鉴定大乳鼠RAs在高表达miR-124后,经小分子化合物诱导6天时表达神经元标志物MAP2(a图)、Tuj1(a图)、DCX(b图)和NeuN(c图),经小分子化合物诱导21天时表达神经元突触特异性标志物SYN1(d图)。
图3-3为荧光定量PCR分析体外培养的各组细胞神经元标志物DCX、MAP2的表达量,各组细胞的DCX、MAP2的表达量以RAs表达量设定为1时相对表达量表示。RAs和Rat neuron,均分离培养自出生1-3天Wistar大鼠的大脑皮层;Induced neuron,分离培养自出生1-3天Wistar大鼠大脑皮层的RAs高表达miR-124后经小分子化合物组合诱导获得;RAs,体外以TGF-β1、LPS和IL-1α等因子刺激As 48h所获得。(*P<0.05,**P<0.01)
图4为免疫细胞荧光染色法鉴定含不同组分的诱导液所诱导细胞神经元标志物MAP2的表达。经ImageJ分析,A:只单独添加miR-124的诱导细胞中,MAP2+细胞率为0;B:添加Ruxolitinib+SB203580+Forskolin的诱导细胞中,MAP2+细胞率约为24.701%;C:添加miR-124+SB203580+Forskolin的诱导细胞中,MAP2+细胞率约为22.648%;D:添加miR-124+Ruxolitinib+Forskolin的诱导细胞中,MAP2+细胞率约为13.158%;E:添加miR-124+Ruxolitinib+SB203580的诱导细胞中,MAP2+细胞率约为26.933%;F:添加miR-124+Ruxolitinib+SB203580+Forskolin的诱导细胞中,MAP2+细胞率约为34.933%。综上,miR-124与三种小分子同时添加时诱导效率最高。
在中枢神经系统疾病或损伤时,病损周围的As会发生一系列表型变化,在损伤的亚急性期(4-14天)变为RAs。随后,RAs又会分泌一些细胞粘附分子,于损伤慢性期(14天以后)变为瘢痕形成性星形胶质细胞。CNS受损后的最佳治疗时间是在损伤的亚急性期,由上述实施例可知,本发明所述的组合物诱导RAs转分化为神经元的方法只需6天,且步骤简便,培养出神经元时恰于损伤的亚急性期,是损伤的最佳治疗时间,有利于中枢神经的再生修复。其次,所述诱导过程中所需要的诱导组分少,小分子化合物种类少,最多只需添加3种小分子诱导剂;总体而言,具有经济有效且方便的优点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种包括miR-124-3P的组合物及其在诱导神经元形成的药物中的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uaaggcacgc ggugaaugcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
auuccgugcg ccacuuacgg 20
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uuuguacuac acaaaaguac ug 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaacaugaug uguuuucaug ac 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttggacattt tgacgaacga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cccttcttcc agttcatcca 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaagcggcac ctcaacac 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcactgggc accaagat 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctgtgttgt ccctgtatgc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gagcgcgtaa ccctcataga 20

Claims (4)

1.一种包括miR-124-3P的诱导反应性星形胶质细胞转分化为神经元的组合物,其特征在于,由miR-124-3P和诱导剂组成;所述诱导剂为Ruxolitinib、SB203580和Forskolin;
所述miR-124-3P的使用浓度为25~150nmol/L;
所述Ruxolitinib的使用浓度为0.5~2μmol/L;
所述SB203580的使用浓度为3~8μmol/L;
所述Forskolin的使用浓度为5~15μmol/L。
2.权利要求1所述的组合物在制备诱导反应性星形胶质细胞转分化为神经元的药物中的应用。
3.权利要求1所述的组合物在制备抑制反应性星形胶质细胞的细胞特性的药物中的应用。
4.权利要求1所述的组合物在制备减少胶质瘢痕形成的药物中的应用。
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