CN110592004B - 一种诱导人iPSCs或ESCs分化为棕色脂肪细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种iPSCs或ESCs分化为棕色脂肪细胞的方法，体外贴壁培养人iPSCs或ESCs，将消化下来的细胞进行悬浮培养以形成具有三维结构的拟胚体；添加小分子化合药物一种或多种组合诱导EB分化；消化EB形成单细胞或细胞团块，接种于包被过的培养板中；给予促棕色脂肪细胞分化因子诱导；培养数天后，给予成脂分化的培养基进行诱导。本发明建立的诱导人iPSCs或ESCs分化成脂肪细胞的方法，具有培养周期短、分化效率高、安全性高等特点。PSCs或hESCs来源的脂肪细胞经鉴定符合棕色脂肪细胞形态学及功能标志分子的基本特征，并且与成人棕色脂肪具有类似的功能，可以用于肥胖以及相关代谢疾病的治疗。

Description

一种诱导人iPSCs或ESCs分化为棕色脂肪细胞的方法
技术领域
本发明属于生物医学和生物技术领域，具体涉及一种诱导人iPSCs或ESCs分化为棕色脂肪细胞的方法。
背景技术
近年来，全球肥胖和超重人口迅猛增长(至2013年已达21亿)、我国肥胖形势更为严峻(人口已经超越美国位列全球第一)，使肥胖俨然成为公共卫生健康领域迫切需要解决的重点之一。因此，在合理膳食、运动疗法难以控制肥胖的今天，寻找新型、有效、无毒副作用的肥胖防治手段已十分必要。随着既往被人们忽视、具有独特耗能方式和强大代谢能力的棕色脂肪组织(Brown adipose tissue，BAT)进入研究者视野。2009年，New England JMed上来自3个不同课题组的临床研究证实人体中BAT含量与身体质量指数(BMI)呈负相关，约40-50g活性BAT即可代谢掉每天20％的能量摄入，展示出BAT用于肥胖治疗的可能性。进一步，动物实验已经证实棕色脂肪组织移植能够逆转小鼠肥胖表型包括减轻体重、改善胰岛素抵抗和葡萄糖耐受等。然而，进一步研究显示棕色脂肪的含量与活性均在新生儿期达到顶峰，成人体内虽有一定数量的活性BAT分布，但其含量却难以满足肥胖治疗要求，因此，解决棕色脂肪来源问题是肥胖治疗的关键。
目前，间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)和脂肪组织来源的血管基质细胞(Adipose-derived Stromal Vascular Cells，ADSVCs)是获得脂肪细胞的重要来源。然而，MSCs或ADSVCs存在增殖潜能有限、持续传代会降低分化效率、不同个体或组织来源异质性等特点使得MSCs或ADSVCs用于临床转化的潜力受到限制。人胚胎干细胞(hESCs)和诱导多能干细胞(hiPSCs)逐渐成为获得脂肪细胞的最佳来源。目前已建立诱导hiPSCs或hESCs成为棕色脂肪细胞的方案，是参照白色脂肪细胞的诱导方案，主要是通过形成拟胚体(EB)获得MSC样细胞，为了获得高纯度的MSC样细胞，需要反复传代、流式分选等培养，周期较长，通常需要15-30天。某些方案显示，与人ADSVCs诱导的脂肪细胞相比，人iPSCs或ESCs来源MSC样细胞诱导成脂的分化效率比较低；尽管采用携带分化关键基因的慢病毒感染能够提高干细胞来源MSC样细胞向白色或棕色脂肪细胞分化的效率(仍不是很高)，还引入了异种外源物质，使其安全性得不到保障。另外，诱导干细胞来源的MSC样细胞分化为棕色脂肪细胞的培养基，添加因子众多，成本高昂，且引入胎牛血清等异种外源物质，使其临床应用价值受到局限。
因此，建立一种简单、快速、高效的大量制备治疗级人iPSCs或ESCs来源的棕色脂肪细胞的方法将具有广阔的应用前景和市场价值。
发明内容
发明目的：为克服现有技术中存在的不足，本发明采用小分子药物组合、结合RNA转染技术，建立了一种简单、新颖、安全、无异种外源物质导入一种诱导人iPSCs或ESCs分化为棕色脂肪细胞的方法，可以快速、高效地获得人iPSCs或ESCs来源的功能性棕色脂肪细胞。
本发明还要解决的技术问题是提供了该iPSCs或ESCs来源的棕色脂肪细胞制备治疗在肥胖及相关并发症药物中的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种诱导人iPSCs或ESCs分化为棕色脂肪细胞的方法，包括以下步骤：
1)贴壁培养人iPSCs或ESCs，维持其未分化的状态；
2)采用消化液消化人iPSCs或ESCs进行悬浮培养，形成拟胚体(EB)；
3)拟胚体(EB)培养数天后，更换为培养基A，并添加一种或多种小分子化合药物，诱导拟胚体分化；
4)拟胚体(EB)诱导3～10天后，消化形成单细胞或细胞团块，接种于包被的培养板中；
5)待细胞贴壁后，给予促棕色脂肪分化因子诱导；若细胞汇合后，可传代后继续诱导；
6)采用成脂分化培养基进行诱导，获得功能性人棕色脂肪细胞。
其中，所述步骤1)的培养基为无异种动物源成分的TeSRTM-E8TM(STEMCELLTechnologies，Catalog#5990)或者mTeSR1(STEMCELL Technologies，Catalog#85850)或TeSRm2(STEMCELL Technologies，Catalog#05860)培养基培养中的任意一种。
其中，所述步骤2)的消化液为Versene Solution(Gibco，CAT#15040066)、0.5mM的EDTA中的一种。
其中，所述步骤3)的培养基A包括DMEM/F12培养基或DMEM高糖培养基或DMEM低糖培养基中的任意一种、降低血清需求的替代物1％～20％KOSR或1×B27(去胰岛素)或1×B27(含胰岛素)或1×胰岛素-转铁蛋白-硒溶液或1×N2溶液中的的任意一种；和脂质牛血清白蛋白溶液，终浓度30％；和1×脂质混合物、1×非必需氨基酸溶液、人成纤维细胞生长因子、维生素C中的一种或多种，其中脂肪酸混合物(1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM)。
其中，所述步骤3)的小分子化合药物包括CHIR-99021(CT99021)、CHIR-99021(CT99021)HCl、AR-A014418、CHIR-98014、TWS119、1-Azakenpaullone和IWP-2中的任何一种或多种成分的组合，单种的终浓度范围为1-25μM，若为两种及以上化合物，则各化合物的物质的量浓度的总和(视总体积相同，将各物质的物质的量浓度相加)不超过25μM。
其中，所述步骤4)在诱导后，加入Tyrp酶消化2min～10min进行消化，所述包被试剂选自以下试剂中一种：基质胶、明胶、多聚鸟氨酸或纤连蛋白。
其中，所述步骤5)的促棕色脂肪分化因子诱导，包括过表达PPARγ、BMP7、PRDM16、CEBPβ中的任意一种或多种，可通过mRNA转染或加入重组蛋白形式实现上述基因的过表达；PPARγ过表达也可通过PPARγ激动剂GW1929、罗格列酮和罗格列酮-马来酸盐中的任意一种或多种，每种激动剂的终浓度范围为1nM-10μM。
其中，具体地，所述步骤5)中本发明通过采用
Figure GDA0004151180000000031
T7转录试剂盒(Ambion，AM1334)体外转录获得促棕色脂肪细胞分化关键基因Peroxisome ProliferatorActivated receptor gamma(PPARγ)、Bone Bone Morphogenetic Protein 7(BMP7)、PR/SET domain 16(PRDM 16)及CCAAT enhancer binding protein beta(CEBPβ)mRNAs，利用RNA转染试剂盒(StemfectTM，00-0069)转染上述mRNA中的一种或几种组合，每种mRNA转染用量10ng～200ng/约2x104细胞数，其中BMP7 mRNAs转染可由重组蛋白替代(每种蛋白终浓度范围2ng/ml～100ng/ml)。促棕色化因子还包含PPARγ激动剂GW1929、罗格列酮、罗格列酮-马来酸盐中的任意一种或多种组合，单种激动剂的终浓度范围为1nM-10μM。若为两种及以上化合物，则各化合物的物质的量浓度的总和(视总体积相同，将各物质的物质的量浓度相加)不超过10μM。
其中，具体地，步骤5)所述若细胞汇合后，加入普通的Tyrp酶消化2min～5min，用培养基A重悬，按照1/2或1/3或1/4的比例接种于包被的普通孔培养板中，细胞贴壁后可继续诱导。
其中，所述步骤6)中的成脂分化培养基包括DMEM/F12、罗格列酮、地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、三碘甲状腺原氨酸、生物素、泛酸盐、转铁蛋白、吲哚美辛和2.5％～20％血清替代物(KnockOutTM SR)，每隔两天进行换液，成脂分化培养基加入3～20天，即分化成功能性人棕色脂肪细胞。
本发明内容还包括所述的诱导方法获得的iPSCs或ESCs来源的棕色脂肪细胞。
本发明内容还包括上述的诱导人iPSCs或ESCs分化获得棕色脂肪细胞在形态学、标志分子、功能性等特征的鉴定。
本发明内容还包括所述的iPSCs或ESCs来源的棕色脂肪细胞制备治疗在肥胖及相关并发症药物中的应用。
有益效果：相对于现有技术，本发明具有以下优点：
1)本发明建立的新型制备人iPSCs或ESCs来源的棕色脂肪细胞的方法，具有无异种外源物质、培养周期短(最快12d可完成)、操作简单、安全高效等特点。
2)本发明获得的人iPSCs或ESCs来源的棕色脂肪细胞经鉴定符合形态学、标志分子表达、功能性等特征，可为肥胖及相关代谢疾病的细胞治疗提供理想的种子细胞，具有广阔的临床应用前景。
附图说明
图1：小分子化合物CHIR-99021(CT99021)加入后悬浮培养的EB典型形态；
图2：iPSCs及ESCs来源的EB消化后获得的贴壁细胞的典型形态；
图3：iPSCs及ESCs来源的来源的棕色脂肪细胞油红O染色；
图4：iPSCs及ESCs来源的来源的棕色脂肪细胞分化及标志基因mRNA表达；
图5：iPSCs来源的棕色脂肪细胞在肾上腺素受体激动剂刺激下的耗氧速的检测；
图6：在体水平评估iPSCs来源的棕色脂肪细胞对小鼠代谢与产热能力的影响。
具体实施方式
以下通过实施例来具体说明本发明，这些实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1BAT诱导方案
1.1人iPSCs的培养及EB形成
采用无异种动物源成分的TeSRTM-E8TM(STEMCELL Technologies，Catalog#5990)培养基以无饲养层细胞的培养方式培养人iPSCs(取正常人的皮肤成纤维细胞参见参考文献Warren L，Ni Y，Wang J，Guo X.Feeder-free derivation of human inducedpluripotent stem cells with messenger RNA.Sci Rep.2012；2：657.doi：10.1038/srep00657.Epub 2012Sep 14.的方法培养获得)，培养条件为37度，2.5％-20％O2及10％-15％CO2，95％湿度。将人iPSCs培养于人重组玻璃粘连蛋白(Vitronectin，STEMCELLTechnologies，07180，终浓度为10μg/ml)包被的6孔培养板中，培养条件为37度，每天换液，传代时，培养皿中加入300μl Versene Solution(Gibco，CAT#15040066)，37℃孵育5min得到消化液，吸取上述消化液，将细胞温柔的吹打下来，转移至含有TeSRTM-E8TM培养基的Costar Ultra Low吸附的6孔板中进行悬浮培养，形成拟胚体(EB)。
1.2悬浮培养EB诱导分化
在悬浮培养过程中采用诱导培养基组合A诱导EB分化。诱导培养基组合A包括：①DMEM/F12基础培养基(Gibco，11330032)；②1×B27(去胰岛素，体积比1∶100；Gibco，A1895601；)；③体积分数为30％高脂牛血清白蛋白(
Figure GDA0004151180000000051
I Lipid-Rich BSA，Gibco，11020-021)(占培养基的体积百分比浓度，以下实施例均是)；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(体积比1∶100，NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)；⑤CHIR-99021(CT99021)，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。诱导培养基组合A加入后，原本具有光滑边界的EB，会变得边界不光滑，并且有细胞团散落，典型形态(50×)见图1A。分别于诱导的第2天进行下一步操作。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
首先，制备细胞悬液，收集诱导分化的EB到15ml无菌无酶的EP管中，静置3min后，1×PBS洗一遍，加入300ul普通的TrypLETM(Gibco，12604039)，37度，2.5％-20％O2及10％-15％CO2，95％湿度条件下，消化2min～10min，形成单细胞或细胞团块，加入诱导培养基组合A，终止消化。其次，收集消化后的单细胞或细胞团块，300g离心3min后，加入诱导培养基组合A重悬，接种于基质胶(Matrigel，BD，354234，稀释比例1/20)包被好的12孔板中，贴壁6小时后，可以开始棕色化因子的诱导。
1.4棕色化因子的诱导
促棕色脂肪细胞分化的关键基因的转染，摒弃以往具有潜在安全隐患的慢病毒转染方法，采用体外转录的mRNA经商业化的脂质体混合物转染。采用
Figure GDA0004151180000000061
T7转录试剂盒(Ambion，AM1334)体外转录获得促棕色脂肪细胞分化关键基因Bone MorphogeneticProtein 7(BMP7)，利用RNA转染试剂盒(StemfectTM，00-0069)转染上述mRNA，mRNA的单次转染量范围在100ng/2x104细胞数，连续转染5次。参照RNA转染试剂盒说明书对转染方法做部分改进：配置脂质体(按照每100ng mRNA加入0.4μl脂质体)及mRNA混合液，以DMEM/F12培养基为稀释液，为了降低mRNA转染后的引起免疫反应，补充牛痘病毒B18R/B19R蛋白(SinoBiological，40020-V08B，终浓度为100ng/ml)，转染培养基加入细胞1h后，换成培养基A继续培养。若细胞汇合达80％～90％后，加入普通的Tyrp酶消化3min，用培养基A重悬，按照1/2比例接种于包被的普通12孔培养板中，细胞贴壁后可继续培养诱导。棕色化因子诱导过程中细胞的典型形态(100×)见图2A。
1.5成脂分化的诱导
促棕色化诱导细胞3天后，加入成脂分化培养基，其成分及浓度如下：DMEM/F12；罗格列酮(0.5uM～5uM均可，本实施案例选用1μM；占培养基的终浓度，以下实施例均是)；地塞米松(0.5uM～5uM均可，本实施案例选用1μM)；胰岛素(0.1uM～1uM均可，本实施案例选用860nM)；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(0.1mM～1mM均可，本实施案例选用0.5mM)；三碘甲状腺原氨酸(0.1nM～1nM均可，本实施案例选用1nM)；生物素(10uM～100uM均可，本实施案例选用33μM)；泛酸盐(10uM～100uM均可，本实施案例选用17μM)；转铁蛋白(1～100ug/ml均可，本实施案例选用10μg/m1)；血清替代物(KnockOutTM SR)(2.5％～30％均可，本实施案例选用20％，占培养基的体积百分比浓度，以下实施例均是)。其中，血清替代物(KnockOutTM SR)替代了胎牛血清(FBS)组分，用于排除异种源性引入。每隔两天进行换液，诱导剂加入20天后，即为分化成功能性人棕色脂肪细胞。
实施例2
1.1人iPSCs的培养及EB形成
培养基为mTeSR1(STEMCELL Technologies，Catalog#85850)，其余同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例3
1.1人iPSCs的培养及EB形成
培养基为TeSRTM2(STEMCELL Technologies，Catalog#05860)其余同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例4
1.1人iPSCs的培养及EB形成
消化液为0.5mM的EDTA，其余同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例5
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基中①成分为DMEM高糖培养基(Gibco，11965-092)其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例6
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基中①成分为DMEM低糖培养基(11885-084)其余同例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例7
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(含胰岛素，体积比1∶100，Gibco，17504-044)。
其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例8
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×胰岛素-转铁蛋白-硒(体积比1∶100，Gibco，41400-045)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例9
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×N2溶液(体积比1∶100，Gibco，17502-048)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例10
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为1％(体积百分比)。其余同例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例11
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为5％(体积百分比)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例12
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTMSerum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为20％(体积百分比)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例13
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导的第5天进行下一步操作。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例14
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导的第10天进行下一步操作。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例15
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(去胰岛素，体积比1∶100；Gibco，A1895601)；⑤成分为CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例16
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(含胰岛素，体积比1∶100，Gibco，17504-044)；⑤成分为CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例17
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×胰岛素-转铁蛋白-硒(体积比1∶100，Gibco，41400-045)；⑤成分为CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例18
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×N2溶液(体积比1∶100，Gibco，17502-048)；⑤成分为CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例19
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为1％；⑤成分为CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例20
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为5％；⑤成分为CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例21
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为20％；⑤成分为CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例22
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(去胰岛素，体积比1∶100；Gibco，A1895601)；⑤成分为AR-A014418，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例23
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(含胰岛素，体积比1∶100，Gibco，17504-044)；⑤成分为CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例24
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×胰岛素-转铁蛋白-硒(体积比1∶100，Gibco，41400-045)；⑤成分为AR-A014418，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导同实施例1。
实施例25
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×N2溶液(体积比1∶100，Gibco，17502-048)；⑤成分为CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例26
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为1％；⑤成分为AR-A014418，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例27
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为5％；⑤成分为AR-A014418，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例28
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为20％；⑤成分为AR-A014418，，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例29
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(去胰岛素，体积比1∶100；Gibco，A1895601)；⑤成分为CHIR-98014，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例30
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(含胰岛素，体积比1∶100，Gibco，17504-044)；⑤成分为CHIR-98014，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例31
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×胰岛素-转铁蛋白-硒(体积比1∶100，Gibco，41400-045)；⑤成分为CHIR-98014，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例32
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×N2溶液(体积比1∶100，Gibco，17502-048)；⑤成分为CHIR-98014，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例33
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为1％；⑤成分为CHIR-98014，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例34
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为5％；⑤成分为CHIR-98014，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例35
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为20％；⑤成分为CHIR-98014，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例36
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(去胰岛素，体积比1∶100；Gibco，A1895601)；⑤成分为TWS119，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例37
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(含胰岛素，体积比1∶100，Gibco，17504-044)；⑤成分为TWS119，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例38
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×胰岛素-转铁蛋白-硒(体积比1∶100，Gibco，41400-045)；⑤成分为TWS119，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例39
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×N2溶液(体积比1∶100，Gibco，17502-048)；⑤成分为TWS119，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例40
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为1％；⑤成分为TWS119，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例41
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为5％；⑤成分为TWS119，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例42
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为20％；⑤成分为TWS119，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例43
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(去胰岛素，体积比1∶100；Gibco，A1895601)；⑤成分为1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例44
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(含胰岛素，体积比1∶100，Gibco，17504-044)；⑤成分为1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例45
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×胰岛素-转铁蛋白-硒(体积比1∶100，Gibco，41400-045)；⑤成分为1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例46
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×N2溶液(体积比1∶100，Gibco，17502-048)；⑤成分为1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例47
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为1％；⑤成分为1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例48
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为5％；⑤成分为1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例49
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为20％；⑤成分为1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例50
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(去胰岛素，体积比1∶100：Gibco，A1895601)；⑤成分为IWP-2，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例51
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(含胰岛素，体积比1∶100，Gibco，17504-044)；⑤成分为IWP-2，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例52
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×胰岛素-转铁蛋白-硒(体积比1∶100，Gibco，41400-045)；⑤成分为IWP-2，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例53
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×N2溶液(体积比1∶100，Gibco，17502-048)；⑤成分为IWP-2，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例54
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为1％；⑤成分为IWP-2，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例55
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为5％；⑤成分为IWP-2，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例56
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为20％；⑤成分为IWP-2，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例57
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
首先，制备细胞悬液，收集诱导分化的EB到15ml无菌无酶的EP管中，静置3min后，1×PBS洗一遍，加入300ul普通的TrypLETM(Gibco，12604039)，37度，2.5％-20％O2及10％-15％CO2，95％湿度条件下，消化2min～10min，形成单细胞或细胞团块，加入诱导培养基组合A，终止消化。其次，收集消化后的单细胞或细胞团块，300g离心3min后，加入诱导培养基组合A重悬，接种于明胶(Gelatin，Sigma Aldrich，1288485，终浓度0.1％，质量/体积百分比)包被好的12孔板中，贴壁6小时后，可以开始棕色化因子的诱导。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例58-109
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
实施例58-109此步骤条件分别对应实施例5至实施例56。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
首先，制备细胞悬液，收集诱导分化的EB到15ml无菌无酶的EP管中，静置3min后，1×PBS洗一遍，加入300u1普通的TrypLETM(Gibco，12604039)，37度，2.5％-20％O2及10％-15％CO2，95％湿度条件下，消化2min～10min，形成单细胞或细胞团块，加入诱导培养基组合A，终止消化。其次，收集消化后的单细胞或细胞团块，300g离心3min后，加入诱导培养基组合A重悬，接种于明胶(Gelatin，Sigma Aldrich，1288485，终浓度0.1％，质量/体积百分比)包被好的12孔板中，贴壁6小时后，可以开始棕色化因子的诱导。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例110
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
首先，制备细胞悬液，收集诱导分化的EB到15ml无菌无酶的EP管中，静置3min后，1×PBS洗一遍，加入300ul普通的TrypLETM(Gibco，12604039)，37度，2.5％-20％O2及10％-15％CO2，95％湿度条件下，消化2min～10min，形成单细胞或细胞团块，加入诱导培养基组合A，终止消化。其次，收集消化后的单细胞或细胞团块，300g离心3min后，加入诱导培养基组合A重悬，接种于纤连蛋白(Fibronectin，SigmaAldrich，设置终浓度2～10ug/m1)包被好的12孔板中，贴壁6小时后，可以开始棕色化因子的诱导。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例111-162
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
实施例111-162此步骤条件分别对应实施例5至实施例56。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
首先，制备细胞悬液，收集诱导分化的EB到15ml无菌无酶的EP管中，静置3min后，1×PBS洗一遍，加入300ul普通的TrypLETM(Gibco，12604039)，37度，2.5％-20％O2及10％-15％CO2，95％湿度条件下，消化2min～10min，形成单细胞或细胞团块，加入诱导培养基组合A，终止消化。其次，收集消化后的单细胞或细胞团块，300g离心3min后，加入诱导培养基组合A重悬，接种于纤连蛋白(Fibronectin，SigmaAldrich，设置终浓度2～10ug/ml)包被好的12孔板中，贴壁6小时后，可以开始棕色化因子的诱导。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例163
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
采用
Figure GDA0004151180000000311
T7转录试剂盒(Ambion，AM1334)体外转录获得促棕色脂肪细胞分化关键基因Peroxisome Proliferator Activated receptor gamma(PPARγ)mRNAs，利用RNA转染试剂盒(StemfectTM，00-0069)转染上述mRNA，mRNA的单次转染量范围在100ng/2x104细胞数，连续转染5次。其余同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例164-215
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
实施例164-215此步骤条件分别对应实施例5至实施例56。
同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
采用
Figure GDA0004151180000000321
T7转录试剂盒(Ambion，AM1334)体外转录获得促棕色脂肪细胞分化关键基因Peroxisome Proliferator Activated receptor gamma(PPARγ)mRNAs，利用RNA转染试剂盒(StemfectTM，00-0069)转染上述mRNA，mRNA的单次转染量范围在100ng/2x104细胞数，连续转染5次。其余同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例216
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
采用
Figure GDA0004151180000000322
T7转录试剂盒(Ambion，AM1334)体外转录获得促棕色脂肪细胞分化关键基因PR/SET domain 16(PRDM16)，利用RNA转染试剂盒(StemfectTM，00-0069)转染上述mRNA，mRNA的单次转染量范围在100ng/2x104细胞数，连续转染5次。其余同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例217-268
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
实施例217-268此步骤条件分别对应实施例5至实施例56。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
采用
Figure GDA0004151180000000331
T7转录试剂盒(Ambion，AM1334)体外转录获得促棕色脂肪细胞分化关键基因PR/SET domain 16(PRDM16)，利用RNA转染试剂盒(StemfectTM，00-0069)转染上述mRNA，mRNA的单次转染量范围在100ng/2x104细胞数，连续转染5次。其余同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例269
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
采用
Figure GDA0004151180000000332
T7转录试剂盒(Ambion，AM1334)体外转录获得促棕色脂肪细胞分化关键基因CCAAT enhancer binding protein beta(CEBPβ)，利用RNA转染试剂盒(StemfectTM，00-0069)转染上述mRNA，mRNA的单次转染量范围在100ng/2x104细胞数，连续转染5次。其余同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例270-321
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
实施例270-321此步骤条件分别对应实施例5至实施例56。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
采用
Figure GDA0004151180000000341
T7转录试剂盒(Ambion，AM1334)体外转录获得促棕色脂肪细胞分化关键基因CCAAT enhancer binding protein beta(CEBPβ)，利用RNA转染试剂盒(StemfectTM，00-0069)转染上述mRNA，mRNA的单次转染量范围在100ng/2x104细胞数，连续转染5次。其余同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例322
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
BMP7 mRNAs转染由重组蛋白替代(终浓度范围为2ng/ml～100ng/ml，此处设为5ng/m1)，连续加5天。其余同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例323-374
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
实施例323-374此步骤条件分别对应实施例5至实施例56。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
BMP7 mRNAs转染由重组蛋白替代(终浓度范围为2ng/ml～100ng/ml，此处设为5ng/ml)，连续加5天。其余同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例375
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
PPARγmRNAs转染可由PPARγ激动剂GW1929替代(终浓度范围为1nM-10μM，此处设为1μM)，连续加5天。其余同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例376
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
PPARγmRNAs转染可由PPARγ激动剂罗格列酮替代(终浓度范围为1nM-10μM，此处设为1μM)，连续加5天。其余同实施例1。
实施例377
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
PPARγmRNAs转染可由PPARγ激动剂罗格列酮-马来酸盐替代(终浓度范围为1nM-10μM，此处设为1μM)，连续加5天。其余同实施例1。
实施例378
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例1。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
采用
Figure GDA0004151180000000361
T7转录试剂盒(Ambion，AM1334)体外转录获得促棕色脂肪细胞分化关键基因PR/SET domain 16(PRDM16)、CCAAT enhancer binding protein beta(CEBPβ)、Peroxisome Proliferator Activated receptor gamma(PPARγ)、BoneMorphogenetic Protein 7(BMP7)，利用RNA转染试剂盒(StemfectTM，00-0069)同时转染上述四个mRNA，每个mRNA的单次转染量范围在50ng/2x104细胞数，连续转染3次。其余同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
实施例379-430
1.1人iPSCs的培养及EB形成
同实施例1。
1.2悬浮培养EB诱导分化
实施例379-430此步骤条件分别对应实施例5至实施例56。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例1。
1.4棕色化因子的诱导
采用
Figure GDA0004151180000000371
T7转录试剂盒(Ambion，AM1334)体外转录获得促棕色脂肪细胞分化关键基因PR/SET domain 16(PRDM16)、CCAAT enhancer binding protein beta(CEBPβ)、Peroxisome Proliferator Activated receptor gamma(PPARγ)、BoneMorphogenetic Protein 7(BMP7)，利用RNA转染试剂盒(StemfectTM，00-0069)同时转染上述四个mRNA，每个mRNA的单次转染量范围在50ng/2x104细胞数，连续转染3次。其余同实施例1。
1.5成脂分化的诱导
同实施例1。
ESC
实施例431
1.1人ESCs的培养及EB形成
采用无异种动物源成分的TeSRTM-E8TM(STEMCELL Technologies，Catalog#5990)培养基培养人ESCs(ESCs H9株)，以无饲养层细胞的培养方式，培养条件为37度，2.5％-20％O2及10％-15％CO2，95％湿度。将人ESCs培养于人重组玻璃粘连蛋白(Vitronectin，STEMCELL Technologies，07180，终浓度为10μg/ml)包被的6孔培养板中，培养条件为37度，每天换液，传代时，培养皿中加入300μl Versene Solution(Gibco，CAT#15040066)，37℃孵育5min得到消化液，吸取上述消化液，将细胞温柔的吹打下来，转移至含有TeSRTM-E8TM培养基的Costar Ultra Low吸附的6孔板中进行悬浮培养，形成拟胚体(EB)。
1.2悬浮培养EB诱导分化
在悬浮培养过程中采用诱导培养基组合A诱导EB分化。诱导培养基组合A包括：①DMEM/F12基础培养基(Gibco，11330032)；②1×B27(去胰岛素，体积比1∶100；Gibco，A1895601；)；③体积分数为30％高脂牛血清白蛋白(
Figure GDA0004151180000000372
I Lipid-Rich BSA，Gibco，11020-021)(占培养基的体积百分比浓度，以下实施例均是)；④可添加脂肪酸混合物(体积比1∶1000，Sigma，L0288)、1×非必需氨基酸溶液(体积比1∶100，NEAA，Gibco，11140-050)、人成纤维细胞生长因子(bFGF，R&D，233-FB-01M，1-50ng/mL均可，本实施案例选用20ng/mL)、维生素C(Vc，Sigma，A4403，1-10μM均可，本实施案例选用2μM)；⑤CHIR-99021(CT99021)，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。诱导培养基组合A加入后，原本具有光滑边界的EB，会变得边界不光滑，并且有细胞团散落，典型形态(50×)见图1B。分别于诱导的第2天进行下一步操作。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
首先，制备细胞悬液，收集诱导分化的EB到15ml无菌无酶的EP管中，静置3min后，1×PBS洗一遍，加入300ul普通的TrypLETM(Gibco，12604039)，37度，2.5％-20％O2及10％-15％CO2，95％湿度条件下，消化2min～10min，形成单细胞或细胞团块，加入诱导培养基组合A，终止消化。其次，收集消化后的单细胞或细胞团块，300g离心3min后，加入诱导培养基组合A重悬，接种于基质胶(Matrigel，BD，354234，稀释比例1/20)包被好的12孔板中，贴壁6小时后，可以开始棕色化因子的诱导。
1.4棕色化因子的诱导
促棕色脂肪细胞分化的关键基因的转染，摒弃以往具有潜在安全隐患的慢病毒转染方法，采用体外转录的mRNA经商业化的脂质体混合物转染。采用
Figure GDA0004151180000000381
T7转录试剂盒(Ambion，AM1334)体外转录获得促棕色脂肪细胞分化关键基因Bone MorphogeneticProtein 7(BMP7)，利用RNA转染试剂盒(StemfectTM，00-0069)转染上述mRNA，mRNA的单次转染量范围在100ng/2x104细胞数，连续转染5次。参照RNA转染试剂盒说明书对转染方法做部分改进：配置脂质体(按照每1O0ng mRNA加入0.4μl脂质体)及mRNA混合液，以DMEM/F12培养基为稀释液，为了降低mRNA转染后的引起免疫反应，补充牛痘病毒B18R/B19R蛋白(SinoBiological，40020-V08B，终浓度为100ng/m1)，转染培养基加入细胞1h后，换成培养基A继续培养。若细胞汇合达80％～90％后，加入普通的Tyrp酶消化3min，用培养基A重悬，按照1/2比例接种于包被的普通12孔培养板中，细胞贴壁后可继续培养诱导。棕色化因子诱导过程中细胞的典型形态(100×)见图2B。
1.5成脂分化的诱导
促棕色化诱导细胞3天后，加入成脂分化培养基，其成分及浓度如下：DMEM/F12；罗格列酮(0.5uM～5uM均可，本实施案例选用1μM；占培养基的终浓度，以下实施例均是)；地塞米松(0.5uM～5uM均可，本实施案例选用1μM)；胰岛素(0.1uM～1uM均可，本实施案例选用860nM)；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(0.1mM～1mM均可，本实施案例选用0.5mM)；三碘甲状腺原氨酸(0.1nM～1nM均可，本实施案例选用1nM)；生物素(10uM～100uM均可，本实施案例选用33μM)；泛酸盐(10uM～100uM均可，本实施案例选用17μM)；转铁蛋白(1～100ug/ml均可，本实施案例选用10μg/ml)；血清替代物(KnockOutTM SR)(2.5％～30％均可，本实施案例选用20％，占培养基的体积百分比浓度，以下实施例均是)。其中，血清替代物(KnockOutTM SR)替代了胎牛血清(FBS)组分，用于排除异种源性引入。每隔两天进行换液，诱导剂加入20天后，即为分化成功能性人棕色脂肪细胞。
实施例432
1.1人ESCs的培养及EB形成
培养基为mTeSR1(STEMCELL Technologies，Catalog#85850)，其余同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例433
1.1人ESCs的培养及EB形成
培养基为TeSRTM2(STEMCELL Technologies，Catalog#05860)其余同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例434
1.1人ESCs的培养及EB形成
消化液为0.5mM的EDTA，其余同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例435
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基中①成分为DMEM高糖培养基(Gibco，11965-092)其余同例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例436
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基中①成分为DMEM低糖培养基(11885-084)其余同例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例437
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(含胰岛素，体积比1∶100，Gibco，17504-044)。其余同例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例438
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×胰岛素-转铁蛋白-硒(体积比1∶100，Gibco，41400-045)。其余同例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例439
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×N2溶液(体积比1∶100，Gibco，17502-048)。其余同例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例440
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为1％(体积百分比)。其余同例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例441
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为5％(体积百分比)。其余同例431。及20％
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例442
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为20％(体积百分比)。其余同例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例443
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导的第5天进行下一步操作。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例444
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导的第10天进行下一步操作。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例445
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(去胰岛素，体积比1∶100；Gibco，A1895601)；⑤成分为CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例446
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(含胰岛素，体积比1∶100，Gibco，17504-044)；⑤成分为CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例447
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×胰岛素-转铁蛋白-硒(体积比1∶100，Gibco，41400-045)；⑤成分为CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例448
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×N2溶液(体积比1∶100，Gibco，17502-048)；⑤成分为CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例449
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为1％；⑤成分为CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例450
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为5％；⑤成分为CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例451
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为20％；⑤成分为CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例452
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(去胰岛素，体积比1∶100；Gibco，A1895601)；⑤成分为AR-A014418，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例453
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(含胰岛素，体积比1∶100，Gibco，17504-044)；⑤成分为CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例454
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×胰岛素-转铁蛋白-硒(体积比1∶100，Gibco，41400-045)；⑤成分为AR-A014418，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例455
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×N2溶液(体积比1∶100，Gibco，17502-048)；⑤成分为CHIR-99021(CT99021)HCl，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例456
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为1％；⑤成分为AR-A014418，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例457
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为5％；⑤成分为AR-A014418，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例458
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为20％；⑤成分为AR-A014418，，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例459
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(去胰岛素，体积比1∶100；Gibco，A1895601)；⑤成分为CHIR-98014，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例460
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(含胰岛素，体积比1∶100，Gibco，17504-044)；⑤成分为CHIR-98014，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例461
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×胰岛素-转铁蛋白-硒(体积比1∶100，Gibco，41400-045)；⑤成分为CHIR-98014，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例462
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×N2溶液(体积比1∶100，Gibco，17502-048)；⑤成分为CHIR-98014，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例463
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为1％；⑤成分为CHIR-98014，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例464
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为5％；⑤成分为CHIR-98014，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例465
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为20％；⑤成分为CHIR-98014，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例466
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(去胰岛素，体积比1∶100；Gibco，A1895601)；⑤成分为TWS119，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例467
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(含胰岛素，体积比1∶100，Gibco，17504-044)；⑤成分为TWS119，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例468
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×胰岛素-转铁蛋白-硒(体积比1∶100，Gibco，41400-045)；⑤成分为TWS119，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例469
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×N2溶液(体积比1∶100，Gibco，17502-048)；⑤成分为TWS119，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例470
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为1％；⑤成分为TWS119，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例471
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为5％；⑤成分为TWS119，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例472
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为20％；⑤成分为TWS119，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例473
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(去胰岛素，体积比1∶100；Gibco，A1895601)；⑤成分为1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例74
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(含胰岛素，体积比1∶100，Gibco，17504-044)；⑤成分为1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例475
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×胰岛素-转铁蛋白-硒(体积比1∶100，Gibco，41400-045)；⑤成分为1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例476
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×N2溶液(体积比1∶100，Gibco，17502-048)；⑤成分为1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例477
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为1％；⑤成分为1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例478
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为5％；⑤成分为1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例479
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为20％；⑤成分为1-Azakenpaullone，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例480
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(去胰岛素，体积比1∶100；Gibco，A1895601)；⑤成分为IWP-2，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例481
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×B27(含胰岛素，体积比1∶100，Gibco，17504-044)；⑤成分为IWP-2，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例482
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×胰岛素-转铁蛋白-硒(体积比1∶100，Gibco，41400-045)；⑤成分为IWP-2，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例483
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为1×N2溶液(体积比1∶100，Gibco，17502-048)；⑤成分为IWP-2，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例484
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为1％；⑤成分为IWP-2，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例485
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为5％；⑤成分为IWP-2，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例486
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
诱导培养基组合中②成分为KOSR(KnockOutTM Serum Replacement，Gibco，10828-028)，终浓度分别设置为20％；⑤成分为IWP-2，终浓度分别为1μM、10μM及25μM(占培养基的终浓度，以下实施例均是)。其余同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例487
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
首先，制备细胞悬液，收集诱导分化的EB到15ml无菌无酶的EP管中，静置3min后，1×PBS洗一遍，加入300ul普通的TrypLETM(Gibco，12604039)，37度，2.5％-20％O2及10％-15％CO2，95％湿度条件下，消化2min～10min，形成单细胞或细胞团块，加入诱导培养基组合A，终止消化。其次，收集消化后的单细胞或细胞团块，300g离心3min后，加入诱导培养基组合A重悬，接种于明胶(Gelatin，Sigma Aldrich，1288485，终浓度0.1％，质量/体积百分比)包被好的12孔板中，贴壁6小时后，可以开始棕色化因子的诱导。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例488-539
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
实施例488-539此步骤条件分别对应实施例435至实施例486。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
首先，制备细胞悬液，收集诱导分化的EB到15ml无菌无酶的EP管中，静置3min后，1×PBS洗一遍，加入300ul普通的TrypLETM(Gibco，12604039)，37度，2.5％-20％O2及10％-15％CO2，95％湿度条件下，消化2min～10min，形成单细胞或细胞团块，加入诱导培养基组合A，终止消化。其次，收集消化后的单细胞或细胞团块，300g离心3min后，加入诱导培养基组合A重悬，接种于明胶(Gelatin，Sigma Aldrich，1288485，终浓度0.1％，质量/体积百分比)包被好的12孔板中，贴壁6小时后，可以开始棕色化因子的诱导。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例540
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
首先，制备细胞悬液，收集诱导分化的EB到15ml无菌无酶的EP管中，静置3min后，1×PBS洗一遍，加入300ul普通的TrypLETM(Gibco，12604039)，37度，2.5％-20％O2及10％-15％CO2，95％湿度条件下，消化2min～10min，形成单细胞或细胞团块，加入诱导培养基组合A，终止消化。其次，收集消化后的单细胞或细胞团块，300g离心3min后，加入诱导培养基组合A重悬，接种于纤连蛋白(Fibronectin，Sigma Aldrich，设置终浓度2～10ug/ml)包被好的12孔板中，贴壁6小时后，可以开始棕色化因子的诱导。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例541-592
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
实施例541-592此步骤条件分别对应实施例435至实施例486。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
首先，制备细胞悬液，收集诱导分化的EB到15ml无菌无酶的EP管中，静置3min后，1×PBS洗一遍，加入300ul普通的TrypLETM(Gibco，12604039)，37度，2.5％-20％O2及10％-15％CO2，95％湿度条件下，消化2min～10min，形成单细胞或细胞团块，加入诱导培养基组合A，终止消化。其次，收集消化后的单细胞或细胞团块，300g离心3min后，加入诱导培养基组合A重悬，接种于纤连蛋白(Fibronectin，SigmaAldrich，设置终浓度2～10ug/ml)包被好的12孔板中，贴壁6小时后，可以开始棕色化因子的诱导。
1.4棕色化因子的诱导
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例593
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
采用
Figure GDA0004151180000000631
T7转录试剂盒(Ambion，AM1334)体外转录获得促棕色脂肪细胞分化关键基因Peroxisome Proliferator Activated receptor gamma(PPARγ)mRNAs，利用RNA转染试剂盒(StemfectTM，00-0069)转染上述mRNA，mRNA的单次转染量范围在100ng/2x104细胞数，连续转染5次。其余
同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例594-645
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
实施例594-645此步骤条件分别对应实施例435至实施例486。
同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
采用
Figure GDA0004151180000000641
T7转录试剂盒(Ambion，AM1334)体外转录获得促棕色脂肪细胞分化关键基因Peroxisome Proliferator Activated receptor gamma(PPARγ)mRNAs，利用RNA转染试剂盒(StemfectTM，00-0069)转染上述mRNA，mRNA的单次转染量范围在100ng/2x104细胞数，连续转染5次。其余同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例646
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
采用
Figure GDA0004151180000000642
T7转录试剂盒(Ambion，AM1334)体外转录获得促棕色脂肪细胞分化关键基因PR/SET domain 16(PRDM16)，利用RNA转染试剂盒(StemfectTM，00-0069)转染上述mRNA，mRNA的单次转染量范围在100ng/2x104细胞数，连续转染5次。其余同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例647-698
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
实施例647-698此步骤条件分别对应实施例435至实施例486。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
采用
Figure GDA0004151180000000651
T7转录试剂盒(Ambion，AM1334)体外转录获得促棕色脂肪细胞分化关键基因PR/SET domain 16(PRDM16)，利用RNA转染试剂盒(StemfectTM，00-0069)转染上述mRNA，mRNA的单次转染量范围在100ng/2x104细胞数，连续转染5次。其余同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例699
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
采用
Figure GDA0004151180000000652
T7转录试剂盒(Ambion，AM1334)体外转录获得促棕色脂肪细胞分化关键基因CCAAT enhancer binding protein beta(CEBPβ)，利用RNA转染试剂盒(StemfectTM，00-0069)转染上述mRNA，mRNA的单次转染量范围在100ng/2x104细胞数，连续转染5次。其余同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例700-751
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
实施例700-751此步骤条件分别对应实施例435至实施例486。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
采用
Figure GDA0004151180000000661
T7转录试剂盒(Ambion，AM1334)体外转录获得促棕色脂肪细胞分化关键基因CCAAT enhancer binding protein beta(CEBPβ)，利用RNA转染试剂盒(StemfectTM，00-0069)转染上述mRNA，mRNA的单次转染量范围在100ng/2x104细胞数，连续转染5次。其余同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例752
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
BMP7 mRNAs转染由重组蛋白替代(终浓度范围为2ng/ml～100ng/ml，此处设为5ng/ml)，连续加5天。其余同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例753-804
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
实施例753-804此步骤条件分别对应实施例435至实施例486。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
BMP7mRNAs转染由重组蛋白替代(终浓度范围为2ng/ml～100ng/ml，此处设为5ng/ml)，连续加5天。其余同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例805
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
PPARγmRNAs转染可由PPARγ激动剂GW1929替代(终浓度范围为1nM-10μM，此处设为1μM)，连续加5天。其余同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例806
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
PPARγmRNAs转染可由PPARγ激动剂罗格列酮替代(终浓度范围为1nM-10μM，此处设为1μM)，连续加5天。其余同实施例431。
实施例807
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
PPARγmRNAs转染可由PPARγ激动剂罗格列酮-马来酸盐替代(终浓度范围为1nM-10μM，此处设为1μM)，连续加5天。其余同实施例431。
实施例808
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
同实施例431。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
采用
Figure GDA0004151180000000681
T7转录试剂盒(Ambion，AM1334)体外转录获得促棕色脂肪细胞分化关键基因PR/SET domain 16(PRDM16)、CCAAT enhancer binding protein beta(CEBPβ)、Peroxisome Proliferator Activated receptor gamma(PPARγ)、BoneMorphogenetic Protein 7(BMP7)，利用RNA转染试剂盒(StemfectTM，00-0069)同时转染上述四个mRNA，每个mRNA的单次转染量范围在50ng/2x104细胞数，连续转染3次。其余同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例809-860
1.1人ESCs的培养及EB形成
同实施例431。
1.2悬浮培养EB诱导分化
实施例809-860此步骤条件分别对应实施例435至实施例486。
1.3EB诱导分化后消化细胞贴壁培养
同实施例431。
1.4棕色化因子的诱导
采用
Figure GDA0004151180000000682
T7转录试剂盒(Ambion，AM1334)体外转录获得促棕色脂肪细胞分化关键基因PR/SET domain 16(PRDM16)、CCAAT enhancer binding protein beta(CEBPβ)、Peroxisome Proliferator Activated receptor gamma(PPARγ)、BoneMorphogenetic Protein 7(BMP7)，利用RNA转染试剂盒(StemfectTM，00-0069)同时转染上述四个mRNA，每个mRNA的单次转染量范围在50ng/2x104细胞数，连续转染3次。其余同实施例431。
1.5成脂分化的诱导
同实施例431。
实施例861人iPSCs及ESCs来源的棕色脂肪细胞分化及标志基因mRNA表达鉴定
2.1人iPSCs及ESCs来源的棕色脂肪细胞成脂分化能力鉴定
采用油红染色鉴定实施例1和例431分别制备的iPSCs和ESCs来源的棕色脂肪细胞的成脂分化能力。吸弃成脂分化培养基，1×PBS洗3遍后，用4％多聚甲醛室温固定20-30min，1×PBS洗3遍，加入油红染色液37度染色20-30min，双蒸水洗1 min后，倒置显微镜观察、拍照。油红O染色检测成脂分化情况，显微镜400×镜下观察可见细胞内聚集可被油红染色的红色脂滴，为多孔的小脂滴，人iPSCs和ESCs的结果相似，见图3A(iPSCs)和图3B(ESCs)，与人肩胛骨来源的血管基质细胞(Stromal vascular fraction cells，SVF)诱导分化的脂肪细胞形态相似，见图3C。实施例2～430和例432～860分别制备获得的人iPSCs和ESCs来源的棕色脂肪细胞成脂分化水平与实施例1和例432相似。
2.2人iPSCs及ESCs来源的棕色脂肪细胞分化及标志基因mRNA表达鉴定
采用实时定量PCR技术鉴定施例1和实施例431分别制备的iPSCs和ESCs来源的棕色脂肪细胞分化及标志基因mRNA表达鉴定。吸弃成脂分化培养基，1×PBS洗3遍后，12孔板每个孔加入Trizol 700ul，裂解细胞后收集到1.5ml的无菌无酶EP管中。按TianGen试剂盒说明书步骤提取细胞总RNA，抽提好的RNA按照TAKARA(047A)试剂的逆转录体系进行逆转录，获得待检测的cDNA。通过RefSeq数据库查找基因的正确序列，选择人PPIA作为内参，利用Primer blast(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)在线设计引物并验证特异性，最后送锐真生物技术公司合成，引物序列如表1：
表1本实施例中涉及到的基因引物列表
Figure GDA0004151180000000691
/>
Figure GDA0004151180000000701
参照PowerUpTM
Figure GDA0004151180000000702
Green Master Mix PCR试剂盒说明，以上述逆转录cDNA为模板进行目的基因qPCR扩增。采用2-ΔCT法计算，以人PPIA基因作为内参，计算目的相对表达量。以人iPSCs为例，结果如图4A显示，与未诱导组相比(-)，给予棕色化因子处理的诱导组(+)形成脂肪细胞不仅分化相关基因PPARγ、CEBPα、CEBPβ、FABP4、ADIPOQ表达水平显著增加(P＜0.05)，棕色脂肪细胞标志基因UCP-1、CIDEA、DIO2、PGC1α、ZIC1的表达分别增加至2.53、3.57、1.47、1.87、1.51倍(P＜0.05)，ESCs来源细胞的结果与iPSCs相似，见图4B。实施例2～430和例432～860分别制备获得的人iPSCs和ESCs来源的棕色脂肪细胞分化及标志基因mRNA表达水平与实施例1和例431相似。实施例862人iPSC来源的棕色脂肪细胞在肾上腺素受体激动剂刺激下的耗氧速率的检测
采用安捷伦公司的Seahorse能量代谢仪，应用线粒体压力检测试剂盒(Agilent，Bioscience，103015-100)检测在实施例1的BAT(brown adipose tissue)诱导方案下分化的脂肪细胞在β肾上腺素受体激动剂刺激下的耗氧速率(OCR)。我们预先将EB消化后的细胞，然后按照实施例1方案进行诱导分化，获得脂肪细胞后，采用10μM的异丙肾上腺素刺激脂肪细胞12小时后，实时监测线粒体呼吸链不同组分的抑制剂药物2μM Oligo(寡霉素，抑制ATP合酶的活性)，1μM FCCP(三氟甲氧基苯腙羰基氰化物，解偶联剂)，1μM Rotenone/Antimycin A(鱼藤酮/抗霉素A，抑制复合体I和复合体III的活性)依次加入后，脂肪细胞耗氧速率的变化。图5中的结果表明，异丙肾上腺素对在BAT诱导方案下已经分化的脂肪细胞显示出更强的耗氧速率。与未进行棕色化因子诱导组相比，棕色化诱导组均显示出更高的代谢表型(绿线和红线组)。与未刺激组(Control+棕色方案诱导)相比，异丙肾上腺素刺激组(ISOP+棕色方案诱导)的脂肪细胞，整体耗氧量更多，其中基础耗氧量可达455pmol/min，最大呼吸量可达890pmol/min。实施例2～860分别制备获得的人iPSCs来源的棕色脂肪细胞的代谢能力与实施例1相似。
实施例863人iPSCs来源的棕色脂肪细胞在肥胖及相关并发症治疗中的应用
将实施例1制备的诱导分化的棕色脂肪细胞，用1×PBS洗一遍，加入300ul普通的TrypLETM(Gibco，12604039)，37度，2.5％-20％O2及10％-15％CO2，95％湿度条件下，消化5min，与matrigel基质胶混合在一起，按照5x106个细胞/只老鼠的细胞数，移植到免疫缺陷小鼠肩胛骨皮下区域，以移植未加入棕色化诱导的细胞作为对照组，2周后通过代谢笼实验检测小鼠代谢能力的变化，红外测温仪评估细胞移植后对小鼠产热的影响。图6结果发现，棕色化诱导的细胞移植组中，早上6点(am)/下午6点(pm)小鼠氧气消耗量(VO2)分别为2500/2100ml kg-1h-1；二氧化碳产出量(VCO2)分别为2700/2300ml kg-1h-1，相比未加入棕色化诱导的细胞移植组(VO2，2000/1800ml kg-1h-1；VCO2，2200/2000ml kg-1h-1)，氧气消耗量(VO2)和二氧化碳产出量(VCO2)分别提高25％(am)/17％(pm)，22％(am)/15％(pm)，产热能力增强。实施例2～860分别制备获得的人iPSCs来源的棕色脂肪细胞对肥胖的治疗效果与实施例1相似。
序列表
<110> 南京市妇幼保健院
<120> 一种诱导人iPSCs或ESCs分化为棕色脂肪细胞的方法
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctgtgcagg agatcacaga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggctccata aagtcaccaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggacaagaa cagcaacgag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgtcactgg tcagctccag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacaagcaca gcgacgagta 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agctgctcca ccttcttctg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggccaggaat ttgacgaagt 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atcccacaga atgttgtaga gt 22
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctggaatagc ggcgtgctt 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aataacactg gacgtcgggc 20
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agtgcagaag gaggtgacaa cagt 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aaagtcaaga aggtggcatg tggc 24
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agaggtcggg aatagcgaga 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggatgtcgta ggacacggag 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acctgacaca acacggacag 20
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtctccatca tcccgcaga 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aagatccaca aaaggacgca 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cacgtgcatg tgcttcttg 19
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ttcatctgca ctgccaagac 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcgagttgtc cacagtcagc 20

Claims (5)

1.一种诱导人iPSCs或ESCs分化为棕色脂肪细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）在培养基中贴壁培养人iPSCs或ESCs，维持其未分化的状态；
2）采用消化液消化人iPSCs或ESCs进行悬浮培养，形成拟胚体；
3）拟胚体培养数天后，更换为培养基A，并添加一种或多种小分子化合药物，诱导拟胚体分化；
4）拟胚体诱导3～10天后，消化形成单细胞或细胞团块，接种于包被的培养板中；
5）待细胞贴壁后，给予促棕色脂肪分化因子诱导；若细胞汇合后，可传代后继续诱导；
6）采用成脂分化培养基进行诱导，获得功能性人棕色脂肪细胞；
所述步骤1）的培养基为无异种动物源成分的TeSR™-E8™或者mTeSR1或TeSR™2培养基培养中的任意一种，所述步骤2）的消化液为 Versene Solution和EDTA中的一种，所述步骤3）的培养基A包括DMEM/F12培养基或DMEM高糖培养基或DMEM低糖培养基，降低血清需求的替代物1%~20%KOSR或1×B27（去胰岛素）或1×B27（含胰岛素）或1×胰岛素-转铁蛋白-硒溶液或1×N2溶液中的任意一种；和脂质牛血清白蛋白溶液，浓度为30%；和1×脂质混合物、1×非必需氨基酸溶液、人成纤维细胞生长因子、维生素C中的一种或多种，所述步骤3）的小分子化合药物包括CHIR-99021 (CT99021)、CHIR-99021 (CT99021) HCl、AR-A014418、CHIR-98014、TWS119和1-Azakenpaullone中的任何一种或多种成分的组合，单种的终浓度范围为1-25μM；所述步骤5）的促棕色脂肪分化因子诱导包括过表达PPARγ、BMP7、PRDM16、CEBPβ中的任意一种或多种，可通过mRNA转染和加入重组蛋白形式实现上述基因的过表达；PPARγ 过表达或者通过给予PPARγ激动剂GW1929、罗格列酮和罗格列酮-马来酸盐中的任意一种或多种实现，每种激动剂的终浓度范围为1nM-10 μM。
2. 根据权利要求1 所述的一种诱导人iPSCs或ESCs分化为棕色脂肪细胞的方法，其特征在于，所述步骤4）在诱导3～10天后，加入Tyrp酶消化2min～10min，所述包被试剂选自以下试剂中一种：基质胶、明胶、多聚鸟氨酸或纤连蛋白。
3. 根据权利要求1 所述的一种诱导人iPSCs或ESCs分化为棕色脂肪细胞的方法，其特征在于，所述步骤6）中的成脂分化培养基包括DMEM/F12、罗格列酮、地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、三碘甲状腺原氨酸、生物素、泛酸盐、转铁蛋白、吲哚美辛和2.5%～20%血清替代物。
4.权利要求1所述的诱导方法获得的iPSCs或ESCs来源的棕色脂肪细胞。
5.权利要求4所述的iPSCs或ESCs来源的棕色脂肪细胞在制备治疗肥胖及相关并发症药物中的应用。
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Glycogen synthase kinase-3 inhibition sensitizes human induced pluripotent stem cells to thiol-containing antioxidants induced apoptosis;Chengyi Tu等;《Stem Cell Res》;20170831;第23卷;第1页 *

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