KR20110094940A

KR20110094940A - 중간엽 줄기세포를 ｇａβａ성 신경세포로 분화시키는 방법 및 ｂｄｎｆ를 포함하는 ｇａβａ성 신경세포 분화유도용 조성물

Info

Publication number: KR20110094940A
Application number: KR1020100014681A
Authority: KR
Inventors: 조성래
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2010-02-18
Filing date: 2010-02-18
Publication date: 2011-08-24
Also published as: KR101548616B1

Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포를 GABA성 신경세포로 분화시키는 방법 및 BDNF를 포함하는 중간엽 줄기세포의 GABA성 신경세포 분화유도용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 중간엽 줄기세포를 GABA성 신경세포로 분화시키는 방법은 BDNF를 사용하여 중간엽 줄기세포를 GABA성 신경세포로 대량으로 분화시키므로, 이렇게 생산된 GABA성 신경세포는 뇌신경계 질환의 세포치료 요법에 대한 우수한 공급원으로서 역할을 할 수 있다.
또한, 본 발명의 BDNF를 포함하는 중간엽 줄기세포의 GABA성 신경세포 분화유도용 조성물은 체외 및 체내에서 중간엽 줄기세포를 GABA성 신경세포로 대량으로 분화시키므로 난치성 신경계 질환에 중간엽 줄기세포 이식 치료에의 사용을 기대할 수 있다.

Description

중간엽 줄기세포를 ＧＡΒＡ성 신경세포로 분화시키는 방법 및 ＢＤＮＦ를 포함하는 ＧＡΒＡ성 신경세포 분화유도용 조성물{Method of Inducing Mesenchymal Stem Cell to Differentiate into GABAergic Neuronal Cell and Compostion Comprising BDNF for Inducing Differentiation into GABAergic Neuronal Cell}

본 발명은 중간엽 줄기세포를 GABA성 신경세포로 분화시키는 방법 및 BDNF를 포함하는 GABA성 신경세포 분화유도용 조성물에 관한 것이다.

감마아미노부틸산(GABA)은 중추신경계의 주요한 억제성 신경전달물질이며, 뇌신경계에 널리 분포되어 모든 시냅스의 약 70%를 구성한다(Schwartz RD, Biochem Pharmacol , 37:3369-75(1988)). 그러나 뇌졸중과 같은 뇌신경계 질환에서 해마와 같은 부위의 GABA성 세포는 퇴화될 수 있다(Nishino and Borlongan, Prog Brain Res , 127:461-76(2000)). 이에 대한 신경보호 요법으로 GABA성 효현제, 칼슘 길항제, 글루탐산 길항제 및 항산화제와 같은 약물이 개발되었거나 연구가 진행 중이며(Stutzmann et al, CNS Drug Rev , 8:1-30(2002); Rocelle et al., J Neurochem , 77:353-71(2001); Blezer et al, Eur J Pharmacol , 444:75-81(2002)), GABA성 약물도 뇌신경계 질환을 치료하는데 특히 효과적일 것으로 생각된다. 또한 세포치료 요법은 각종 뇌손상에 의해 야기되는 일차적 및 이차적 손상을 포괄적으로 치료하기에 유용한 수단일 수도 있다. 예를 들어, 파킨슨 병 환자에 도파민성 뉴런의 이식 치료를 시도하듯이(Grisolia, Brain Res Bull , 57:823-6(2002)). 뇌졸중과 같은 뇌신경계 환자에서 GABA성 뉴론이 손상 받은 경우, GABA성 뉴론의 이식 치료는 이상적인 요법일 수 있다. 미성숙 신경세포로부터 GABA성 세포를 생성하는 한가지 방법이 보고되었다(미국 특허 제6,602,680호). 루벤스타인 등은 미성숙 뉴런 세포에서, DLX 유전자(예: DLX1, DLX2, DLX5)의 활성을 증가시킴으로써 GABA성 세포의 생산을 보고하였다. 또한 쥐 배아 줄기세포로부터 GABA성 세포를 분화 유도하는 방법이 보고되었으나(Hancock et al., Biochem Biophys Res Commun, 271(2):418-21(2000); Westmoreland et al., Biochem Biophys Res Commun , 284(3):674-80(2001)) 이 방법은 세포치료를 시행할 수 있을 만큼 고효율로 GABA성 뉴런을 생성하지 않았다. 따라서 뇌신경계 질환에서 기능회복을 위한 세포치료를 위해, 보다 대량으로 기능성 GABA성 뉴론을 분화 유도할 수 있는 방법의 개발이 요구된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자는 뇌신경계 질환의 세포 치료 요법에 사용할 수 있는 GABA성 신경세포를 생체 외 또는 생체 내에서 효과적으로 유도하고 대량으로 생산할 수 있는 방법의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였고 그 결과 BDNF를 사용하여 중간엽 줄기세포를 GABA성 신경세포로 대량으로 분화시키는데 성공함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 중간엽 줄기세포를 GABA성 신경세포로 분화시키는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 BDNF를 유효성분으로 포함하는 중간엽 줄기세포를 GABA성 신경세포로의 분화유도용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계; 및 (b) BDNF(brain-derived neurotrophic factor)를 포함하는 배지에서 상기 중간엽 줄기세포를 배양하여 GABA성 신경세포로 분화시키는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 GABA(gamma-aminobutyric acid)성 신경세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

줄기세포는 크게 두 종류로 구별된다: 배아줄기세포 (ES) 및 배아생식세포 (EG)를 포함하는 전능성 줄기세포(pluripotent stem cell)와 다능성 줄기세포 (multipotent stem cell). 본 발명의 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)는 다능성 줄기세포의 일종이다. 본 발명의 중간엽 줄기세포는 이에 제한되는 것은 아니나 바람직하게는 골수, 제대혈 또는 지방조직으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 중간엽줄기세포는 성체줄기세포의 일종으로서 뼈를 만드는 조골 모세포, 연골세포, 지방세포, 근육세포, 섬유아세포와 골수의 기질등 다양한 세포 유형으로 분화될 수 있는 능력을 갖으며, 자가재생산(self-renewal) 능력을 갖는다.

본 발명의 중간엽줄기세포는 세포표면항원 CD14+, CD31+, CD45+, CD34-, CD133- 및 CD166- 으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 면역학적 특성을 나타낸다.

바람직하게는, 본 발명에서 이용하는 중간엽줄기세포는 포유동물의 골수, 제대혈 또는 지방조직으로부터 수득할 수 있다. 보다 바람직하게는 인간, 돼지, 소, 양, 토끼, 마우스(mouse) 또는 랫트(rat), 보다 더 바람직하게는 인간, 돼지 또는 마우스, 가장 바람직하게는 인간의 골수, 제대혈 또는 지방조직에서 수득할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 중간엽줄기세포는 하기에 기재된 방식으로 수득할 수 있다. 예컨대, 지방조직을 절단하고 절단된 지방조직을 직접 배양하여 세포를 성장(outgrowth)시킨다. 이어, 상기 성장된 세포를 계대 배양함으로써, 중간엽줄기세포를 수득한다. 상기 배양 과정에서 이용되는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat . New Biol . 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc . Soc . Exp . Bio . Med ., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer . Med . Assoc . 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp . Cell Res . 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal . Biochem . 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst . 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc . Soc . Exp . Biol . Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다.

상기 계대 배양에서 70-80% 컨플루언시(confluency)를 나타낼 때 까지 배양하며, 이어 부착성(adherent) 세포를 수확하고, 이 수확된 세포의 일부를 다음 계대 배양에 이용한다. 상술한 과정을 통하여 골모세포, 지방세포, 연골세포 등의 중배엽성 조직으로의 분화능 및 줄기세포 특성을 갖는 중간엽줄기세포가 생성된다.

본 발명자는 생체 외에서 중간엽 줄기세포(골수, 제대/제대혈, 지방세포 유래)의 GABA성 신경세포로의 분화유도 가능성과 분화 효율을 확인하였다. 즉, GABA성 신경세포로의 분화 가능성 및 분화에 필요한 최적의 배양 조건(세포 성장인자, 분화 관련인자)을 연구, 탐색하여 세포치료제로 이용할수 있도록 분화유도 및 배양 기술을 확립하고, 분화 유도된 세포의 표현형과 함께 기능성 측면에서 생화학적, 분자생물학적 특성을 분석하여 신경질환에 대한 세포치료제로서 유효하게 적용될 수 있는지에 대한 평가 기준을 확립하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 중간엽줄기세포는 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) 배지에서 분화를 유도한다. HG-DMEM(High glucose - Dulbecco's modified eagle media) 배지를 사용하는 것도 가능하나, DMEM/F12를 분화 배지로 사용하는 경우에, 보다 효과적인 분화로 인해 GABA성 신경세포를 대량으로 생산할 수 있다.

본 발명의 중간엽 줄기세포를 배양하여 분화시키는 단계에 있어서, 신경영양인자로서 BDNF를 사용한다. 이를 상기 배지에 넣어 배양하는 경우 GABA성 신경세포로까지 분화시킬 수 있으며, 효과적인 분화로 인해 GABA성 신경세포를 대량으로 생산할 수 있다.

BDNF(brain-derived neurotrophic factor)는 단백질의 신경 성장 인자 패밀리인 당단백질로서, 거대 전구체로부터 처리되어 신경 세포 집단의 생존을 촉진하는 신경영양 인자를 산출한다(Jones K.R. et al., Proc . Natl . Acad . Sci U.S.A., 87:8060-8064(1990)). 이러한 신경 세포는 모두 중추 신경계 내에 또는 이와 직접 연결되어 위치한다.

본 발명에서는 천연의 BDNF를 사용하는 것이 바람직하지만, 천연의 BDNF 분자와 동일한 기능을 수행하는 개질 BDNF 분자, 유사체 및 재조합 BDNF 분자도 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 인간 뇌유래 신경영양 인자(BDNF)의 양은 배양 배지를 기준으로 하여 20-100 ng/ml으로 첨가하여 배양한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 신경영양인자로서 BDNF는 세포증식인자로서 EGF(epidermal growth factor), FGF-2(fibroblast growth factor-2) 또는 이의 혼합물과 함께 사용될 수 있다. 상기 세포증식인자를 추가적으로 배지에 첨가하는 경우 중간엽줄기세포의 GABA성 신경세포로의 분화를 더욱 효율적으로 유도할 수 있다.

상기 방법에 의해 대량으로 생성된 GABA성 신경세포는 이렇게 대량으로 생성된 GABA성 신경세포는 뇌졸중, 외상성 뇌손상, 뇌성마비, 간질 및 헌팅턴 병과 같은 뇌신경계 질환의 세포치료 요법에 대한 우수한 공급원으로서 역할을 할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 상기 GABA성 신경세포는 10 세포/㎕ 내지 1×10⁷세포/㎕ 농도로 병변이 있는 부위에 이식하며, 보다 바람직하게는 1×10₃ 세포/㎕ 내지 1×10⁶세포/㎕1 농도로 병변이 있는 부위에 이식한다.

마우스 동물 모델을 이용해 실험하는 경우 상기 방법으로 GABA성 신경세포로 유도된 분화 세포를 총 1×10⁴세포 - 1×10⁶세포를 병변측 선조체 내로 이식할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 BDNF(brain-derived neurotrophic factor)를 유효성분으로 포함하는 중간엽 줄기세포를 GABA(gamma-aminobutyric acid)성 신경세포로의 분화유도용 조성물을 제공한다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 상기 기술한 바와 같이 생체 외에서 중간엽 줄기세포를 GABA성 신경세포로 분화시키는 용도로 사용된다. 본 발명의 본 발명은 BDNF를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 생체 외에서 증식시킨 GABA성 신경세포는 추후 병변이 있는 부위에 이식함으로써 세포 치료에 사용될 수 있다.

다른 구현예에서, 상기 조성물은 생체 내에서 중간엽 줄기세포를 GABA성 신경세포로 분화시키는 용도로 사용된다. 보다 구체적으로 중간엽 줄기세포를 병변부위로 이식 후, 본 발명의 조성물을 이식 부위로 지속적으로 주입하여 생체 내에서 GABA성 신경세포를 효과적으로 생성되도록 할 수 있다. 이는 분화에 앞서 GABA성 신경세포가 필요한 병변 부위에 중간엽 줄기세포를 이식하고 이를 GABA성 신경세포로 분화시키는 방법이므로 난치성 신경계 질환에 중간엽 줄기세포 이식 치료를 통한 신경 재생 및 기능 회복을 기대할 수 있다.

바람직한 일 구현예에서, 상기 분화전 중간엽 줄기세포는 10 세포/㎕ 내지 1×10⁶세포/㎕ 농도로 병변이 있는 부위에 이식되며, 보다 바람직하게는 1×10₃ 세포/㎕ 내지 1×10⁵세포/㎕1 농도로 이식된다.

이식된 중간엽 줄기세포를 GABA성 신경세포로 분화시키기 위해서는 본 발명의 GABA성 신경세포로의 분화유도용 조성물을 이식 부위 내로 지속적으로 투여하여 세포 증식 및 분화에 부유한 환경을 조성하여야 한다.

바람직한 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 상기 중간엽 줄기세포 이식부위에 2일 내지 30일 동안 지속적으로 주입된다.

상기 주입 방법에는 제한이 없으나, 기술적 측면에서 투여용량, 투여속도, 투여기간에 따른 다양한 종류의 삼투압 펌프를 이용하여 뇌실 내로 본 발명의 조성물을 지속적으로 투여하는 것이 바람직하다. 현재 상업적으로 이용가능한 삼투압 펌프를 예시하면, Alzet삼투압 펌프 및 Medtronic회사의 펌프 시스템 등이 있다.상기 삼투압 펌프를 이용한 본 발명의 조성물의 투여는 배출속도 0.01 내지 10 ㎕/hr, 배출기간 2일 내지 30일, 배출용량 1㎕ 내지 1ml으로 하는 것이 바람직하다. 상기 삼투압 펌프는 중간엽 줄기세포 이식 후 바로 본 발명의 GABA성 신경세포로의 분화유도용 조성물을 바로 배출될 수 있도록 수술 시행 전날부터 37도로 전처지하는 것이 바람직하다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세포증식인자로서 EGF(epidermal growth factor), FGF-2(fibroblast growth factor-2) 또는 이의 혼합물을 추가적으로 포함하며, BDNF의 양은 조성물 전체를 기준으로 하여 1-1000 ㎍/ml인 것이 바람직하다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 중간엽 줄기세포를 GABA성 신경세포로 분화시키는 방법 및 BDNF를 포함하는 중간엽 줄기세포의 GABA성 신경세포 분화유도용 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 중간엽 줄기세포를 GABA성 신경세포로 분화시키는 방법은 BDNF를 사용하여 중간엽 줄기세포를 GABA성 신경세포로 대량으로 분화시키므로, 이렇게 생산된 GABA성 신경세포는 뇌신경계 질환의 세포치료 요법에 대한 우수한 공급원으로서 역할을 할 수 있다.

(iii) 또한 본 발명의 BDNF를 포함하는 중간엽 줄기세포의 GABA성 신경세포 분화유도용 조성물은 체외 및 체내에서 중간엽 줄기세포를 GABA성 신경세포로 대량으로 분화시키므로 난치성 신경계 질환에 중간엽 줄기세포 이식 치료에의 사용을 기대할 수 있다.

도 1은 각각 골수(BM), 제대혈(UCB), 제대(UC), 지방조직(AT)으로부터 유래한 각각의 중간엽 줄기세포 모습을 나타낸다.
도 2는 골수, 제대혈, 제대, 지방조직으로부터 유래한 각각의 중간엽 줄기세포의 세포 표현형을 나타낸다.
도 3은 인간 중간엽 줄기세포의 골, 지방, 연골로의 분화능을 확인할 수 있는 실험 결과이다.
도 4는 인간 지방줄기세포에 여러 배지를 처리한 후 GABA성 신경세포 유전자(GAD67, GAT-1)와 신경전구세포 유전자(Nestin)의 발현을 나타낸 것이다.
도 5는 인간 지방줄기세포에 여러 배지를 처리한 후 GABA성 신경세포 표지 단백질(GABA)와 성숙신경세포 표지 단백질(βⅢ tubulin)의 발현을 면역형광화학법으로 확인한 그림이다(빨간색: GABA, 초록색: βⅢ tubulin, 파란색: 세포의 핵).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 인간 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양

본 발명자는 이미 골수, 제대혈/제대, 지방조직에서 유래한 중간엽 줄기세포의 분리 배양에 성공한 바 있으며, 논문(Adel Alhadlaq et al., Stem Cells and Development, 13(4): 436-448(2004); D.T. Covas et al., Braz J Med Biol Res, 36(9):1179-1183(2003); Yu. A. Romanov et al., Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 140(1):138-143(2005))에 기재된 방법에 따라 실시하여 골수, 제대혈/제대, 지방조직으로부터 각각 인간 중간엽 줄기세포를 분리 배양하고 그 모습을 도 1에 나타내었다.

얻어진 다분화능 줄기세포는 세포표면항원 CD14+, CD31+, CD45+, CD34-, CD133-, CD166- 등의 특징을 보였으며, 골모세포, 지방세포, 연골세포 등의 중배엽성 조직으로 분화가 가능하였다. 골수, 제대혈, 제대, 지방조직으로 부터 유래한 각각의 중간엽 줄기세포의 세포 표현형은 도 2에 나타내었고, 인간 중간엽 줄기세포의 골, 지방, 연골로의 분화능을 확인한 실험 결과는 도 3에 나타내었다.

실시예 2: 생체 외 GABA성 신경세포 분화 유도

2-1. HG-DMEM 배지 및 BDNF를 사용하여 GABA성 신경세포 분화 유도

상기 실시예 1에서 배양한 인간 지방유래 줄기세포를 5000 개/cm² 의 농도로 세포배양용기에 접종하였다. 세포를 부착시킨 후 20% FBS(Fetal Bovine Serum)가 들어있는 HG-DMEM(High glucose - Dulbecco's modified eagle media) 배지(Gibco)에 넣어서 37℃ 5% CO2 대기에서 24시간 배양하였다. 배양 후 PBS(phosphate buffered saline)로 2번 세척하고 분화배지를 첨가하였다. 분화 배지는 HG-DMEM 배지에 200 μM BHA(Butylated Hydroxyanisole)(Finetech), 5 mM 염화칼륨(potassium chloride, KCl), 2 mM 발프로산(valproic acid)(Alfa Chem), 10 μM 포스콜린(forskolin)(Spectrum), 1 μM 하이드로코르티손(hydrocortisone)(Spectrum), 5 ㎍/ml 인슐린(Alfa Chem)에 BDNF(brain-derived neurotrophic factor)(Sigma-aldrich) 50 ng/ml 를 첨가하였다. 세포는 37℃ 5% CO2 대기에서 24시간 배양하였다.

2-2. HG - DMEM 배지에서 BDNF 없이 GABA 성 신경세포 분화를 유도

분화 배지에 BDNF를 사용하지 않은 것을 제외하고는 상기 2-1과 동일한 방법으로 GABA성 신경세포 분화를 유도하였다.

2-3. DMEM /F12 배지 및 BDNF 를 사용하여 GABA 성 신경세포 분화 유도

분화 배지로 HG-DMEM 대신에 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) 배지(Gibco)를 사용한 것을 제외하고는 상기 2-1과 동일한 방법으로 GABA성 신경세포 분화를 유도하였다.

2-4. DMEM /F12 배지에서 BDNF 없이 GABA 성 신경세포 분화를 유도

분화 배지에 BDNF를 사용하지 않은 것을 제외하고는 상기 2-3과 동일한 방법으로 GABA성 신경세포 분화를 유도하였다.

실시예 3. RT - PCR 을 통한 GABA 성 신경분화 표지의 확인

RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction) 분석을 위하여 상기 2-1 내지 2-4에 따라 신경세포로의 분화유도가 끝난 세포 각각에 트리졸(Invitrogen) 1 ㎖을 5분간 처리하여 용해시키고 트리졸 1 ㎖당 클로로포름 200 ㎕를 처리하여 12,000 rpm의 속도로 15분간 원심분리 하였다. 이로부터 RNA가 포함된 상층액을 분리하여 새 튜브에 옮긴 후 트리졸 1 ㎖당 이소프로판올 500 ㎕를 첨가하여 RNA 침전을 유도하였다. 75% 냉각 에탄올로 RNA 침전물을 세척하고 상온에서 건조시킨 후 DEPC(diethyl pyrocarbonate)가 포함된 3차 증류수에 적정 농도로 RNA를 용해시켜 역전사 반응의 주형으로 사용하였다. 상기와 같이 준비된 RNA를 65℃에 5분간 두어 2차 구조를 제거하였다. 역전사 반응용액은 6× 역전사 효소 완충용액(LAROVA) 5 ㎕, 2.5 mM dNTP(LAROVA) 2 ㎕, 올리고 d(T) 프라이머(500 ng/㎕, LAROVA) 1 ㎕, RNase 억제제(LAROVA) 0.5 ㎕, 주형 RNA 2 ㎍ 및 역전사 효소(350 U/㎕, TaKaRa) 0.1 ㎕를 포함하며, DEPC 처리된 멸균 3차 증류수로 전체 반응부피를 30 ㎕로 적정하였다.

역전사 반응은 44℃에서 50분간 반응시킨 후, 94℃에서 5분간 역전사 효소를 불활성화시켜 cDNA를 합성함으로써 이후 PCR에 사용될 주형 cDNA를 제조하였다. PCR에 사용한 프라이머는 가바성 신경세포에 특이적인 GAD67 유전자를 위한 primer쌍(정방향; 5'-CGAGGACTCTGGACAGTAGAGG-3', 역방향; 5'-GATCTTGAGCCCCAGTTTTCTG-3'), GAT-1 유전자를 위한 프라이머쌍 (정방향; 5'-TGGCTGATGGCTCTGTCTTC-3', 역방향; 5'-ACAGTGTCTTCGCTGGGCTG-3')과 신경분화초기에 발현하는 인자인 네스틴(nestin) 유전자를 위한 프라이머쌍 (정방향; 5'- gccctgaccactccagttta -3', 역방향; 5'- ggagtcctggatttccttcc -3') 그리고 GAPDH를 통해 농도를 보정하기 위한 프라이머쌍 (정방향; 5'-ATCTCCATCTTCCAGGAGCG-3', 역방향; 5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3')을 사용하였다.

반응튜브에 각 프라이머(10 pmole) 0.5 ㎕, 2.5 mM dNTP 혼합액 2 ㎕, 10× Taq DNA 중합효소 완충용액(염화마그네슘 포함) 2.5 ㎕, 주형 cDNA 2 ㎕ 및 Taq DNA 중합효소(KOMA biotech) 0.1 ㎕를 첨가하고 멸균된 3차 증류수로 전체 반응부피를 25 ㎕로 적정한 후 각 프라이머 쌍에 대한 반응조건에서 PCR을 실시하였다. DNA의 증폭을 위한 PCR은 94℃에서 먼저 5분간 변성시킨 후, 35 사이클로 94℃에서 30초 동안 변성시키고, 48℃ 내지 62℃에서 30초간 결합 및 72℃에서 1분간 증폭한다. 마지막 사이클이 끝난 후 72℃에서 7분 동안 증폭시켰다. 이때, 각각의 유전자에 대한 프라이머의 어닐링 온도는 GAD67 58℃, GAT-1 67℃ 및 네스틴 57℃이다. PCR 결과 증폭된 DNA 산물은 2% 아가로스 젤에 전기영동한 후 에티디움 브로마이드 염색하여 Gel Doc XR (BIO-RAD)을 이용하여 밴드를 확인하고 그 결과를 도 4에 나타내었다(라인 1: 상기 2-2의 세포를 시료로 사용한 것임, 라인 2: 상기 2-1 세포를 시료로 사용한 것임, 라인 3: 상기 2-4 세포를 시료로 사용한 것임, 라인 4: 상기 2-3 세포를 시료로 사용한 것임, 대조군(control): 미분화한 줄기세포를 시료로 사용함).

그 결과 GABA성 신경세포 표지자인 GAD67과 GAT-1의 발현이 DMEM/F12배지에 BDNF를 처리한 군(상기 2-3)이 가장 발현이 높게 나왔고, 신경전구세포 표지자인 네스틴의 발현이 감소하였다. 즉 DMEM/F12배지에 BDNF를 처리하여 분화를 유도하는 경우 GABA성 신경세포를 대량으로 생성시킬 수 있음을 확인하였다. 미분화한 지방조직 줄기세포인 대조군에서는 표지자의 발현이 나타나지 않았다.

실시예 4. 세포면역형광화학법에 의한 GABA 성 신경분화 표지의 확인

면역형광염색법을 실시하기 위하여 우선, 분리된 지방 유래 줄기세포를 챔버 슬라이드에 부착 시킨 후 실시예 1에 따라 GABA성 신경세포분화 방법으로 분화 배양하였다. 분화유도 후 먼저 챔버 슬라이드를 PBS로 헹구고, 상기 2-1 내지 2-4의 세포 시료를 각각 실온에서 10% 포르말린 솔루션으로 15분간 고정하였다. 그런 다음 0.2% 트리톤 X-100이 들어있는 PBS용액으로 실온에서 5분간 침투시키고, 비특이적 결합을 막기 위해 실온에서 2% FBS이 들어있는 PBS로 30분간 차단시켰다. GABA성 신경세포에 특이적인 GABA/βⅢ 튜블린 1차 항체를 PBS에 1:100으로 희석하여 4℃에서 18시간 반응시켰다: 폴리클로날 GABA 항체(Sigma), 모노클로날 βⅢ 튜블린 항체(chemicon).

1차 항체 반응이 끝난 세포를 PBS로 3번 세척한 후 FITC(Fluorescein isothiocyanate)와 로다민(Rhodamine)이 표지된 2차 항체(Vector)로 30분간 실온에서 암반응 시켰다. 그런 다음 PBS로 2번 세척한 후 핵을 염색하기 위하여 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 PBS에 1:1000으로 희석하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 다시 PBS로 2번 세척한 후 형광 현미경에서 관찰하여 면역 양성 세포를 평가하고 그 결과를 도 5에 나타내었다.

그 결과, DMEM/F12에 BDNF를 처리한 군(상기 2-3)에서 성숙신경세포 표지 단백질인 βⅢ 튜블린과 GABA성 신경세포 표지 단백질인 GABA의 발현이 가장 높은 분포를 나타내었다. 즉 DMEM/F12배지에 BDNF를 처리하여 분화를 유도하는 경우 GABA성 신경세포를 대량으로 생산할 수 있음을 확인하였다. 미분화한 지방조직 줄기세포인 대조군에서는 전혀 발현하지 않았다.

실시예 5. 생체내 GABA 성 신경세포 분화 유도법

중간엽 줄기세포 1×10⁴세포 내지 1×10⁶세포를 병변측 선조체 내로 이식 후, 신경영양인자 및 세포증식인자를 Alzet 오스모틱 펌프(model 2002; 배출속도 0.5 ㎕/hr, 배출기간 14일, 배출용량 200 ㎕; Durect, Cupertino, CA)를 사용하여 2주 동안 뇌실내로 지속적으로 주입하였다. 카뉼라(Cannula, Brain Infusion Kit)를 우측 뇌실내로 정위고정 좌표(stereotaxic coordinate)를 이용하여 삽입하고, 오스모틱 펌프는 등 뒤의 피하조직내로 삽입하였다. 오스모틱 펌프는 증식인자 또는 영양인자가 바로 배출될 수 있도록 수술 시행 전날부터 37도로 전처지하였다.

즉, 세포증식인자인 상피 성장 인자(epidermal growth factor: EGF) 또는 섬유모세포 성장 인자(fibroblast growth factor-2: FGF-2)를 투여하여 이식된 세포의 증식을 유지하고, 신경영양인자인 뇌유래영양인자(brain-derived neurotrophic factor BDNF) 1 ㎍/ml - 1,000 ㎍/ml 를 투여하여 GABA성 뉴런의 분화 유도를 증진 시켰다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 GABA(gamma-aminobutyric acid)성 신경세포로 분화시키는 방법:
(a) 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계; 및
(b) BDNF(brain-derived neurotrophic factor)를 포함하는 배지에서 상기 중간엽 줄기세포를 배양하여 GABA성 신경세포로 분화시키는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 중간엽 줄기세포의 배양은 DMEM/F12배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 골수, 제대혈 또는 지방조직으로부터 수득한 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 BDNF의 양은 상기 배지를 기준으로 하여 20-100 ng/ml인 것을 특징으로 하는 방법.
BDNF(brain-derived neurotrophic factor)를 유효성분으로 포함하는 중간엽 줄기세포를 GABA(gamma-aminobutyric acid)성 신경세포로의 분화유도용 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 조성물은 중간엽 줄기세포가 주입된 생체 내 부위에 적용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 조성물은 삼투압 펌프를 사용하여 상기 중간엽 줄기세포가 주입된 생체 내 부위에 공급되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 조성물은 세포증식인자로서 EGF(epidermal growth factor), FGF-2(fibroblast growth factor-2) 또는 이의 혼합물을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 BDNF의 양은 상기 조성물을 기준으로 하여 1-1000 ㎍/ml인 것을 특징으로 하는 방법.