KR20190000596A

KR20190000596A - 신규한 동물 혀 조직-유래 중간엽줄기세포 및 이의 제작 방법

Info

Publication number: KR20190000596A
Application number: KR1020170079795A
Authority: KR
Inventors: 차상호; 이지현; 박미정; 변정수; 구나연; 조인수
Original assignee: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)
Priority date: 2017-06-23
Filing date: 2017-06-23
Publication date: 2019-01-03
Also published as: KR102054645B1

Abstract

본 발명은 소 혀 조직-유래 중간엽줄기세포 및 이의 제작 방법에 관한 것으로, 동물의 혀 조직 유래 줄기세포(stem cells)의 제조방법; 상기 방법에 의해 제조된 동물의 혀 조직 유래 줄기세포; 및 동물의 혀 조직 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 골 또는 연골 질환 치료용 세포 치료제를 제공한다. 본 발명에 따르면, 본 발명은 동물의 혀 조직 유래 줄기세포를 분리하는 방법 및 줄기세포의 특성을 분석할 수 있는 특이 마커와 해당 세포의 장기 계대를 위한 배양배지 등 최적의 세포 배양법을 확립함으로써 향후 해당 세포를 이용한 특정 질환의 치료 및 연구에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

신규한 동물 혀 조직-유래 중간엽줄기세포 및 이의 제작 방법{Novel Mesenchymal stem cells derived from Tissue of Animal Tongue and Method for Preparing Thereof}

본 발명은 동물 혀 조직-유래 중간엽줄기세포 및 이의 제작 방법에 관한 것이다.

줄기세포는 자기 재생능(self-renewal)과 분화능(differentiation potentials)이라는 특성을 이용하여 조직 재생은 물론 항암, 항염, 항노화, 바이러스성 질병 등 다양한 분야에 활용되고 있으며, 이러한 잠재력으로 치료 분야에서도 각광받고 있다. 줄기세포의 유래 조직은 골수(bone marrow), 지방 조직(adipose tissue), 제대혈(cord blood), 배아(embryo) 등 매우 다양하다. 세포의 기원은 자가 유래(Autologous)와 동종 유래(Allogenic)로 나누며, 줄기세포의 종류는 중간엽줄기세포(MSCs), 배아줄기세포(ESCs), 유도만능줄기세포(iPSCs) 등으로 구분한다.

이러한 줄기세포가 다수의 조직을 모두는 아니지만 재증식시키고 생리학적 및 해부학적 기능을 회복시키는데 사용될 수 있음을 입증하는 추가의 증거들이 보고되고 있다. 또한, 조직 공학, 유전자 치료, 세포 치료제 또는 생물학적 연구에서의 줄기세포의 적용이 급속도로 진행되고 있다.

또한, 특정 질환에 대한 치료 뿐만 아니라 이러한 치료를 위한 중간엽줄기세포의 특성을 분석할 수 있도록 연구에 활용할 수 있는 유용성이 높은 확립된 줄기세포주에 대한 관심이 증대되면서 더욱 다양한 조직으로부터 줄기세포의 개발 및 제조가 절실히 요구되고 있는 실정이다.

그러나 중간엽줄기세포는 인간을 포함하여 다양한 축종 및 조직으로부터 확립된 바가 있으나, 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포는 이제까지 그 확립에 관한 연구가 없다.

따라서, 보다 효과적으로 혀 조직으로부터 세포의 성장이 느리지 않고 장기간 배양이 가능한 중간엽줄기세포를 획득하는 방법이 요구되고 있다.

본 발명자들은 신규한 중간엽줄기세포주를 확립하기 위하여 예의 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 소 혀 조직으로부터 중간엽줄기세포를 성공적으로 분리하는 방법, 해당 세포의 줄기세포로서의 성능을 확인하는 특이 분석 방법 및 장기 계대가 가능하도록 최적의 세포 배양 조건을 확립하였고, 10 계대 이상의 장기 계대시에도 줄기세포로서의 특성이 우수하게 발현되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 동물의 혀 조직 유래 줄기세포(stem cells)의 제조방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 동물의 혀 조직 유래 줄기세포를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 동물의 혀 조직 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 골 또는 연골 질환 치료용 세포 치료제를 제공하는 데 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

이때, 여기서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복되는 설명은 생략하기로 한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 동물의 혀 조직 유래 줄기세포(stem cells)의 제조방법을 제공한다:

(1) 동물의 혀 조직에서 상피 부위의 과립층만을 분리하는 단계; 및

(2) 상기 (1) 단계의 분리한 과립층에 효소를 처리하고, 저글루코오스(low glucose) DMEM, 저글루코오스(low glucose) DMEM/Ham's F12 (1:1) 및 IMDM/Ham's F12 (1:1) 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 배양액에서 배양하여 혀 조직 유래 줄기세포를 획득하는 단계.

바람직하게는, 본 발명의 상기 회수된 혀 조직 유래 줄기세포는 다음과 같은 특성을 나타낸다:

(a) 중간엽줄기세포 마커인 CD29, CD45, CD90, CD105, a-SMA 및 비멘틴(Vimentin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내고; CD44에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타내며;

(b) 중배엽 세포로 분화하는 분화능을 나타내고;

(c) 미분화상태로 15계대 이상 배양가능함.

보다 상세하게는, 상기 방법은 동물 혀 조직에서 세포를 분리하는 단계; 상기 분리한 세포를 저글루코오스 DMEM, 저글루코오스 DMEM/Ham's F12 (1:1) 또는 IMDM/Ham's F12 (1:1) 배양액, 바람직하게는 저글루코오스 DMEM에서 배양하는 단계; 및 배양된 세포를 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 상기 동물 혀 조직에서 세포를 분리하는 단계는 다음과 같이 실시된다:

소 혀 조직으로부터 수술용 집게와 칼을 이용하여 상피 부위만을 분리하는 단계; 및 상기 상피부위에서 다시 과립층을 제외한 각질층, 유극층, 기저층 및 혈관을 수술용 가위와 칼을 이용하여 제거하는 단계; 및 적절한 효소 반응을 위하여 분리된 과립층을 1 mm 직경으로 촘촘히 자르는 단계; 및 촘촘히 자른 과립층을 화학적 방법(효소 처리)으로 단일세포로 분리하는 단계.

화학적 방법의 효소는, 상기 조직을 용해할 수 있는 한, 당업계에 공지된 어떠한 종류의 효소도 이용할 수 있으며, 본 발명에서는 제1형 콜라겐 분해 효소(0.1% collagenase type I)를 사용하였으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 방법은 상기 세포를 안정적으로 부착하여 배양한다.

상기 저글루코스 DMEM은 글루코스의 농도가 1 내지 2000 mg/L일 수 있으며, 바람직하게는 100 내지 1500 mg/L, 보다 바람직하게는 500 내지 1500 mg/L, 가장 바람직하게는 1000 mg/L이다.

또한, 본 발명의 방법은 상기 배양액에 우태아혈청(FBS)을 10%로 첨가한다.

또한, 본 발명은 추가적으로 상기 조직을 균질화하는 단계를 포함할 수 있으며, 조직의 균질화를 위해 당해 기술분야에 사용되는 임의의 방법이 이용될 수 있다.

본 발명에서 상기 동물은 소과 동물, 개과 동물, 고양이과 동물, 멧돼지과 동물, 사슴과 동물, 기린과 동물, 페커리과 동물, 낙타과 동물, 하마과 동물, 말과 동물, 맥과 동물, 코뿔소과 동물, 족제비과, 토끼과 및 설치류로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상이고, 가장 바람직하게는 소과 동물이다.

상기 소과동물은 소, 염소, 흑염소, 산양, 영양, 야크, 임팔라, 가젤, 물소 및 들소로 구성된 군에서 선택되는 1 종 이상이고, 가장 바람직하게는 소이다.

본 발명에서 상기 줄기세포는 다능성 중간엽 줄기세포, 다능성 조혈모 줄기세포, 다능성 신경 줄기세포, 다능성 간 줄기세포, 다능성 췌장 줄기세포 및 다능성 표피줄기세포로 이루어진 군에서 선택되고, 가장 바람직하게는 다능성 중간엽 줄기세포이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "다능성 중간엽 줄기세포"는 중간엽 줄기세포와 혼용하여 사용된다.

본 발명의 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포는 소 혀 조직으로부터 분리된 최초의 중간엽줄기세포이며, 본 발명은 상술한 소 혀 유래 중간엽줄기세포 분리 방법과 해당 세포의 줄기세포 성능 분석 방법, 및 장기 계대를 위한 최적의 세포 배양 조건을 포함한다.

줄기세포를 장기 배양하는 능력은 줄기세포 연구 분야에서 아주 중요한 일이다. 이러한 줄기세포를 장기 배양하는데 있어서 가장 중요한 점은, 해당 세포가 잘 자랄 수 있는 최적의 환경을 찾아주는 일이며, 이러한 환경은 세포의 성장뿐만 아니라 줄기세포의 성능과 직접적인 관련이 있다.

줄기세포는 배양 조건이 조금이라도 적절치 않으면, 쉽게 분화하거나 세포 사멸 과정을 거쳐 사멸하게 된다. 줄기세포로부터 분화된 세포는, 줄기세포의 역할을 다하고 더 이상 줄기세포로서의 성능을 잃게 되는 것으로 미분화단계를 장기간 유지하는 점은 무엇보다도 중요하다.

본 발명은 소 혀 중간엽줄기세포를 성공적으로 분리하고 줄기세포임을 확인할 수 있는 특이 분석 방법을 제공하고 있으며, 해당 세포의 미분화능을 오랜 기간 유지하기 위해서 최적의 세포 배양 조건을 확립하여 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 줄기세포를, 덱사메타손(dexamethasone), 인도메타신(indomethacin), 인슐린(insulin) 및 3-이소부틸-1-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine)을 포함하는 분화용 배양액에 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 지방세포로의 분화 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 배양액은 덱사메타손 1 uM, 인도메타신 100 uM, 인슐린 10 ug/ml 및 3-이소부틸-1-1-메틸잔틴 0.5 mM을 포함한다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 줄기세포를, 덱사메타손(dexamethasone), b-글리세로포스페이트(b-glycerophosphate) 및 L-아스코르브산 2-포스페이트(L-ascorbic acid 2-phosphate)를 포함하는 분화용 배양액에 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 골세포로의 분화 방법 및 상기 방법에 의해 분화된 골세포를 유효성분으로 함유하는 골질환 치료용 세포 치료제를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 배양액은 덱사메타손 0.1 uM, b-글리세로포스페이트 10 mM, L-아스코르브산 2-포스페이트 50 uM을 포함한다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 줄기세포를, 덱사메타손(dexamethasone), b-글리세로포스페이트(b-glycerophosphate) 및 TGF-b3을 포함하는 분화용 배양액에 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 연골세포로의 분화 방법 및 을 상기 방법에 의해 분화된 연골세포를 유효성분으로 함유하는 연골 질환 치료용 세포 치료제 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 상술한 본 발명의 방법에 의해 제조된 동물의 혀 조직 유래 줄기세포 및 상기 동물의 혀 조직 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 골 또는 연골 질환 치료용 세포 치료제를 제공할 수 있다.

본 발명의 세포 치료제는 정맥주사, 피하주사, 또는 근육주사와 같은 비경구 투여 뿐만 아니라, 침샘 손상 부위에 직접 투여할 수 있다. 상기 세포 치료제는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적절한 투여경로에 적합한 제형으로 제제화될 수 있다.

상기 각각의 제형으로 제제화 시, 각각의 제형의 제조에 필요한 약학적으로 허용 가능한 담체를 부가하여 제조할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 약학적 활성 성분을 제외한 임의의 구성 성분을 지칭하기 위해 사용된다. "약학적으로 허용가능한"은 조성물 중에 존재하는 다른 구성 성분들과 상호작용하여 (예를 들면, 담체들 상호 간 또는 약학적 활성 성분과 담체 간의 상호작용) 약학적으로 바람직하지 않은 변화를 야기하지 않는 성질을 의미한다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체의 선택은 특정한 투여 제형의 특성, 투여 방식, 용해도 및 안정성에 대한 상기 담체의 효과와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다.

상기 약학적 조성물은 주사제로서 제제화될 수 있으며, 주사제로 제제화될 경우 혈액과 등장인 무독성 완충용액을 희석제로서 포함할 수 있으며, 예를 들어 pH 7.4의 인산완충용액 등이 있다. 상기 약학적 조성물은 완충용액 이외에 기타 다른 희석제 또는 첨가제를 포함할 수 있다.

상기 언급된 제제에 사용되는 담체와 제제의 제조방법은 당해 기술분야에 널리 알려져 있는 바에 따라 선택하고 제조할 수 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Science 최신판에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.

상기 세포 치료제의 투여량은 질환의 진행 정도, 투여대상의 나이, 성별, 체중, 투여경로, 투여 횟수에 따라서 달라질 수 있다. 세포치료제의 통상적인 투여량은 10⁴~10¹⁰ cells/body, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.

상기 본 발명에 따른 세포치료제는 골세포 및 연골세포로의 분화능이 있으므로, 각 관련 질환에 대한 세포치료제로서 유용할 수 있다.

본 발명은 동물의 혀 조직 유래 줄기세포를 분리하는 방법 및 줄기세포의 특성을 분석할 수 있는 특이 마커와 해당 세포의 장기 계대를 위한 배양배지 등 최적의 세포 배양법을 확립함으로써 향후 해당 세포를 이용한 특정 질환의 치료 및 연구에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1a은 유세포 분석 방법(Flow cytometry analysis)을 이용하여 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포의 세포 표면 인자(cell surface markers)의 단백질 발현을 보여준다.
도 1b는 정량적 중합효소연쇄반응을 이용하여 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포의 세포 표면 인자(cell surface markers)의 mRNA 발현을 보여준다.
도 2는 세포의 장기 계대를 위한 다양한 배양조건 하에서의 세포 성장 곡선을 보여준다.
도 3은 세포의 장기 계대를 위한 다양한 배양조건하에서의 중간엽줄기세포 전능성 인자(왼쪽 그래프) 및 중간엽줄기세포 특이 마커(오른쪽 그래프)의 발현 정도를 보여준다.
도 4는 정량적 RT-PCR을 이용한 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포의 중배엽세포로의 분화능(mesodermal differentiation potentials)을 보여준다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 소과 동물 혀 수거

도축된 소의 혀를 적출하여 오염되지 않도록 페니실린(300 U/mL)과 스트렙토마이신(300 ug/mL)을 포함한 PBS(phosphate buffered saline)이 담긴 비이커에 보관하여 멸균 지역으로 이동시켰다.

실시예 2. 소 혀로부터 줄기세포 분리 및 계대 배양

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 획득한 소혀 조직을 이용하여 신규한 중간엽줄기세포주를 확립하고자 하였다.

먼저, 상기 소혀 조직을, 멸균한 클린벤치 내에서 페니실린(300 U/mL)과 스트렙토마이신(300 ug/mL)이 포함된 PBS로 3 회 이상 세척하였다. 해당 조직을 대상으로 상피 부위만을 분리하고자 혀의 앞 끝을 수술용 집게로 잡고 수술용 칼을 이용하여 칼집을 내어 진피와 상피 부위를 분리하였다.

상피 부위는 다시 각질층(stratum corneum), 과립층(stratum granulosum), 유극층(stratum spinosum), 기저층(straum basale) 순으로 이루어지며, 과립층을 제외한 각질층, 유극층, 기저층과 혈관을 수술용 가위와 수술용 칼을 이용하여 제거하였다.

분리된 과립층은 수술용 가위를 이용, 적절한 효소 반응을 위하여 1 mm 직경으로 촘촘히 잘라 세절화시켰으며, 해당 조직은 효소(0.1% collagenase type I)와 소 유래 알부민(1% bovine serum albumin)을 포함한 PBS에 담아 37℃ 진탕배양기(shaking incubator)에서 1 시간 동안 반응시키고 10분 간격으로 진탕시켰다.

효소와 반응을 마친 해당 조직은 100 ㎛의 세포 여과체(cell strainer)를 통해 부유물을 거르고 400 g에서 5 분간 원심 분리하여 상층액을 제거한 다음, 펠렛(pellet)만을 포집하였다. 해당 펠렛에 우태아혈청(10% fetal bovine serum), 페니실린 (100 U/ml), 스트렙토마이신 (100 ug/mL)이 포함된 세포 배양액(low glucose DMEM)을 넣고 펠렛을 잘 혼탁시킨 후 세포 배양용 175 T-flask에 5 X 10⁵ 개의 세포를 분주하여 세포 배양기(5% CO₂, 37℃)에서 배양하였다.

24 시간 안착 후 신선한 세포 배양액으로 교체하였다. 그 후 2 일 간격으로 배양액을 교체하고 175 T-flask 상에서 세포가 전체적으로 80% 밀집하면 0.25% Trypsin-EDTA을 처리하여 계대 배양하였다.

실시예 3. 중간엽줄기세포 최적화 조건

본 발명자들은 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포의 배양 및 장기 계대를 위한 세포 배양 조건을 최적화하고자 다양한 조건(표 1)을 이용하여 세포를 배양하였다.

저-글루코스 DMEM(Low)	저-글루코스 DMEM + Ham's F12 (1 : 1) (Low+F12)	IMDM + Ham's F12 (1 : 1) (IMDM+F12)
10% FBS	10% FBS	10% FBS
페니실린 (100 U/ml)	페니실린 (100 U/ml)	페니실린 (100 U/ml)
스트렙토마이신 (100 ㎍/mL)	스트렙토마이신 (100 ㎍/mL)	스트렙토마이신 (100 ㎍/mL)

상기 3 가지 조건을 포함하여 다양한 세포 배양 조건에서 세포를 배양하고, 장기간 계대를 거쳐 중간엽줄기세포 배양의 최적화 조건을 확립하였다.

다양한 세포 배양 조건을 조정하여 분리한 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포의 세포 성장 곡선을 조사하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 10% FBS, 100 U/ml의 페니실린, 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신이 포함된 저-글루코스 DMEM 세포 배양액에서 가장 높은 세포 증식률을 나타냈다.

실시예 4. 중간엽줄기세포 세포 증식률 분석

본 발명자들은 다음의 공식을 이용하여 본 발명의 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포의 세포 증식률을 확인하였다.

CPDL = ln(Nf/Ni) ln2

Ni는 초시 세포 수, Nf는 마지막 세포수, ln은 자연로그를 나타낸다. 6-웰 플레이트의 각 3개 웰에 세포를 5 X 10⁴(Ni)으로 5 일간 배양하여 세포 수를 측정하고(Nf), 다시 세포를 5 X 10⁴(Ni)으로 배양하여 10 계대 이상까지 반복하여 계산하였다.

실시예 5. 중간엽줄기세포 확인

본 발명자들은 실시예 2에서 계대배양을 통해 수득한 본 발명의 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포가 줄기세포능을 나타내는 확인하기 위하여, FACS CaliburTM Flow Cytometer (BD)를 이용한 유세포 분석을 통해 기존에 공지된 줄기세포 마커인 세포 표면 특이 단백질의 발현 수준을 조사하였다.

유세포 분석을 위해 초기 계대로 배양한 중간엽줄기세포를 0.25% Trypsin-EDTA를 처리해 탈착한 다음, 5 X 10⁵ (tube) 개의 세포를 준비하여 세포 염색 버퍼 (BioLegend)로 상온에서 블록킹시켰다. 유세포 분석용 1.5 ml 튜브에 세포를 5 X 10⁵ cells/100 ul로 분주한 다음, 형광물질인 FITC(fluorescein isothiocyanate) 또는 PE(phycoerythrin)이 결합된 항체를 1~5 ㎕를 섞고 차광 상태의 상온에서 30 분간 반응시켰다. 항체반응을 거친 세포는 PBS로 세척하고 분석 시까지 차광상태(ice)를 유지한다. 유세포 분석 시, 항체 염색을 하지 않은 비염색(unstained) 세포를 이용하여, FSC와 SSC의 위치를 확인하여 기준을 잡았으며, 아이소타입을 이용하여 FL 수치의 기준을 잡았다. 유세포 분석 후, Cell Quest Pro (BD) 프로그램을 사용하여 결과를 분석하였다.

그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 해당 세포는 CD44 및 CD90에 대하여 강한 양성을 나타내었고 CD45 및 MHC 클래스-II에 대해서는 음성인 것으로 나타났다.

각 마커에 대한 정보는 하기 표 2에 나타내었다.

명 칭	회사명(Cat. No)	형 광	아이소타입 정보
CD44	AbD (MCA2433PE)	PE	Ms IgG1 (BD555784)
CD45	AbD (MCA832F)	FITC	Ms IgG1 (BD550617)
CD90	Novusbio (NBP2-47755F)	FITC	Ms IgG1 (BD555784)
MHC 클래스-II	Mybiosource (MBS224588)	RPE	Ms IgG1 (MCA928PE)

또한, 본 발명자들은 본 발명의 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포의 줄기세포능을 확인하기 위하여, 정량적 중합효소연쇄반응을 이용하여 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포의 세포 표면 인자(cell surface markers)의 mRNA 발현을 조사하였다.

먼저, 본 발명의 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포에 Trizol (Thermo)을 사용하여 RNA를 추출하고 Nano-drop 1000 machine (Thermo)을 이용하여 RNA 상태와 농도를 측정하고 GoScript™ Reverse Transcriptase (Promega)를 사용하여 cDNA를 합성, 정량적 중합효소연쇄반응(quantitative real-time RT-PCR, qPCR)을 실시하였다.

q-PCR은 96 웰 플레이트에 LightCycler® 480 SYBR Green I Master Mix (Roche Diagnostics)를 사용하여 전변성(95℃, 10분), 어닐링(60℃, 10초), 연장 (72℃, 10초)을 45 사이클 반복하고 2-△Ct 계산법을 이용하여 멜팅 커브를 분석하며 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 기준 유전자로 이용하여 qPCR 결과를 분석하였다.

본 실시예에 이용된 프라이머 서열은 하기 표 3에 나타내었다.

명 칭	프라이머 서열 (5'-3')	크기	온도	Accession Number
CD29	F- TGT CGA GTG TGT GAG TGC AA(서열번호 1) R- AGA CTC CAA GGC AGG TCT GA(서열번호 2)	193	60	NM_174368
CD44	F- CCG GAA CAT AGG GTT TGA GA(서열번호 3) R- TGA GGC ATT GAA GCA GTA CG(서열번호 4)	160	60	NM_174013
CD45	F- CCA CGG GTA TTC AGC AAG TT(서열번호 5) R- CCC AGA TCA TCC TCC AGA AA(서열번호 6)	244	52	NM_001206523
CD90	F- GTG AAC CAG AGC CTT CGT CT(서열번호 7) R- GGTGGT GAA GTT GGA CAG GT(서열번호 8)	201	60	NM_001034765
CD105	F- CTG ATC CTC AGC GTG AAC AA(서열번호 9) R- GAC GAA GGA AGA TGC TTT GC(서열번호 10)	226	60	NM_001076397
MHC 클래스-II	F- AGC CTC TGT GGA GGT GAA GA(서열번호 11) R- GCT GCC AGA CAG TCT CCT TC(서열번호 12)	157	60	NM_001013601
GAPDH	F- CCT TCA TTG ACC TTC ACT ACA TGG TCT A(서열번호 13) R- TGG AAG ATG GTG ATG GCC TTT CCA TTG(서열번호 14)	127	60	U85042

그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 해당 세포는 CD29, CD44 및 CD90에 대하여 고발현을 나타내었고 CD45 및 MHC 클래스-II에 대해서는 저발현인 것으로 나타났다.

실시예 6. 다양한 조건 하에서 배양한 중간엽줄기세포의 전능성 확인

본 발명자들은 본 발명의 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포의 줄기세포능을 확인하기 위하여, 정량적 중합효소연쇄반응 분석을 통해 실시예 3에서 수득한 다양한 세포 배양 조건하에서의 본 발명의 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포의 줄기세포 전능성(stemness) 인자 발현 정도를 조사하였다.

본 실시예에 이용된 프라이머 서열은 하기 표 4 및 표 5에 나타내었다.

명 칭	프라이머 서열 (5'-3')	크기	온도	Accession Number
α-SMA	F- GGT GAT GAA GCA CAA AGC AA(서열번호 15) R- TGA GAA GGG TTG GAT GCT CT(서열번호 16)	154	60	NM_001034502
Vimentin	F- CGC TCA AAG GGA CTA ACG AG(서열번호 17) R- TGA CAT TCA GCA GGT CTT GG(서열번호 18)	174	60	NM_173969.3
CK7	F- TTA CCA GAC CAA GTT TG A(서열번호 19) R- ATC TCA TTC CGG GTA TT C(서열번호 20)	78	60	NM_001046411.1
CK18	F- ATT GAT AAT GCC CGT CTT GC(서열번호 21) R- AGC CTC GAT CTC AGT CTC CA(서열번호 22)	156	60	NM_001192095.1
CK19	F- GAT GAC TTC CGC ACC AAG TT(서열번호 23) R- AGC AGA ATC CAC CTC CAC AC(서열번호 24)	234	60	NM_001015600.3

명 칭	프라이머 서열 (5'-3')	크기	온도	Accession Number
Sox2	F- CAC AAC TCG GAG ATC AGC AA(서열번호 25) R- CAT GAG CGT CTT GGT TTT CC(서열번호 26)	162	60	BC133458
Oct3/4	F- GTT TTG AGG CTT TGC AGC TC(서열번호 27) R- CTC CAG GTT GCC TCT CAC TC(서열번호 28)	182	55	NM_174580
Nanog	F- GTC CCG GTC AAG AAA CAA AA(서열번호 29) R- TGC ATT TGC TGG AGA CTG AG(서열번호 30)	107	60	dq069776

그 결과, 도 3의 왼쪽 그래프에 나타낸 바와 같이, 10% FBS, 100 U/ml의 페니실린, 100 ug/ml의 스트렙토마이신이 포함된 저-글루코스 DMEM 세포 배양액에서 현저하게 우수한 전능성 인자(SOX2)의 발현을 나타내었다.

또한, 소 혀 조직으로부터 중간엽줄기세포를 분리하는 과정에 상피세포(epithelial cells)가 일부 혼재하게 되는데, 이러한 구분을 위해서 α-SMA, 비멘틴, CK17, CK18, CK19의 발현 비율을 비교하였다.

그 결과, 도 3의 오른쪽 그래프에 나타낸 바와 같이, CK17, CK18, CK19 (epithelial cell markers)의 발현과 비교하여 중간엽줄기세포는 α-SMA와 비멘틴의 발현이 높았다. 다양한 세포 배양 조건을 조정하여 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포의 α-SMA와 비멘틴의 발현을 비교한 결과, 10% FBS, 100 U/ml의 페니실린, 100 ug/ml의 스트렙토마이신이 포함된 저-글루코스 DMEM 세포 배양액에서 비멘틴의 발현이 우수하게 나타났다.

실시예 6. 최적화된 조건에서 배양된 중간엽줄기세포의 분화능 확인

본 발명자들은 본 발명의 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포의 줄기세포능을 확인하기 위하여, 상기 실시예 3에서 확인된 최적화된 세포 배양 조건하에서의 본 발명의 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포의 중배엽세포로의 분화능(mesodermal differentiation potentials)을 정량적 중합효소연쇄반응 분석을 통해 조사하였다.

정량적 중합효소연쇄반응은 상기 실시예 5에 기재된 방법과 동일하게 실시하였고, 본 실시예에 이용된 프라이머 서열은 하기 표 6 내지 표 8에 나타내었다.

명 칭	프라이머 서열 (5'-3')	크기	온도	Accession Number
C/EBPα	F- ATC GAC ATC AGC GCC TAC AT(서열번호 31) R- CGG GTA GTC AAA GTC GTT GC(서열번호 32)	138	60	NM_176784
PPARγ	F- CAG TGT CTG CAA GGA CCT CA(서열번호 33) R- GAT GTC AAA GGC ATG GGA GT(서열번호 34)	128	60	NM_181024
LPL	F- TGC TGG TAT TGC AGG AAG TC(서열번호 35) R- AAA ATC CGC ATC ATC AGG AG(서열번호 36)	124	60	NM_001075120

명 칭	프라이머 서열 (5'-3')	크기	온도	Accession Number
Osteocalcin	F- TGA CAG ACA CAC CAT GAG AAC CC(서열번호 37) R- AGC TCT AGA CTG GGC CGT AGA AG(서열번호 38)	320	60	X53699

명 칭	프라이머 서열 (5'-3')	크기	온도	Accession Number
Collagen type II	F- CTC AAG TCC CTC AAC AAC CAG(서열번호 39) R- TTG GGG TCG ATC CAG TAG TC(서열번호 40)	134	60	NM_001113224
Sox9	F- AGA AGG ACC ACC CGG ACT AC(서열번호 41) R- CGT TCT TCA CCG ACT TCC TC(서열번호 42)	57	60	XM_015459016.1
Aggrecan	F- CAG TCA CAC CTG AGC AGC AT(서열번호 43) R- CCT TCG ATG GTC TTG TCG TT(서열번호 44)	104	60	NM_173981

그 결과, 도 4의 상단 패널에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포에서 지방세포 마커인 C/EBPα, PPARγ 및 LPL이 발현되었으며, 이는 본 발명의 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포가 중배엽세포인 지방세포로 분화될 수 있음을 나타낸다.

또한, 도 4의 중간 패널에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포에서 골세포 마커인 오스테오칼신(Osteocalcin)이 발현되었으며, 이는 본 발명의 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포가 중배엽세포인 골세포로 분화될 수 있음을 나타낸다.

또한, 도 4의 하단 패널에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포에서 연골세포 마커인 Collagen type II, Sox9 및 아그레칸(Aggrecan)이 발현되었으며, 이는 본 발명의 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포가 중배엽세포인 연골세포로 분화될 수 있음을 나타낸다.

본 발명은 기존의 보고된 바 없는 소 혀 조직 유래 중간엽줄기세포를 분리하는 방법 및 중간엽줄기세포의 특성을 분석할 수 있는 특이 마커와 해당 세포의 장기 계대를 위한 배양배지 등 최적의 세포 배양법을 확립함으로써 향후 해당 세포를 이용한 구제역 바이러스 등 중요 가축질병의 진단 및 예방 등 활용 연구에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Novel Mesenchymal stem cells derived from Tissue of Animal Tongue and Method for Preparing Thereof <130> 1-80p <160> 44 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD29 primer F <400> 1 tgtcgagtgt gtgagtgcaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD29 primer R <400> 2 agactccaag gcaggtctga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD44 primer F <400> 3 ccggaacata gggtttgaga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD44 primer R <400> 4 tgaggcattg aagcagtacg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD45 primer F <400> 5 ccacgggtat tcagcaagtt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD45 primer R <400> 6 cccagatcat cctccagaaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD90 primer F <400> 7 gtgaaccaga gccttcgtct 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD90 primer R <400> 8 ggtggtgaag ttggacaggt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD105 primer F <400> 9 ctgatcctca gcgtgaacaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD105 primer R <400> 10 gacgaaggaa gatgctttgc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MHC class-II primer F <400> 11 agcctctgtg gaggtgaaga 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MHC class-II primer R <400> 12 gctgccagac agtctccttc 20 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer F <400> 13 ccttcattga ccttcactac atggtcta 28 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer R <400> 14 tggaagatgg tgatggcctt tccattg 27 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a-SMA primer F <400> 15 ggtgatgaag cacaaagcaa 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a-SMA primer R <400> 16 tgagaagggt tggatgctct 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vimentin primer F <400> 17 cgctcaaagg gactaacgag 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vimentin primer R <400> 18 tgacattcag caggtcttgg 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK7 primer F <400> 19 ttaccagacc aagtttga 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK7 primer R <400> 20 atctcattcc gggtattc 18 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK18 primer F <400> 21 attgataatg cccgtcttgc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK18 primer R <400> 22 agcctcgatc tcagtctcca 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK19 primer F <400> 23 gatgacttcc gcaccaagtt 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK19 primer R <400> 24 agcagaatcc acctccacac 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox2 primer F <400> 25 cacaactcgg agatcagcaa 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox2 primer R <400> 26 catgagcgtc ttggttttcc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct3/4 primer F <400> 27 gttttgaggc tttgcagctc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct3/4 primer R <400> 28 ctccaggttg cctctcactc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog primer F <400> 29 gtcccggtca agaaacaaaa 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog primer R <400> 30 tgcatttgct ggagactgag 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/EBPa primer F <400> 31 atcgacatca gcgcctacat 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/EBPa primer R <400> 32 cgggtagtca aagtcgttgc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARr primer F <400> 33 cagtgtctgc aaggacctca 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARr primer R <400> 34 gatgtcaaag gcatgggagt 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPL primer F <400> 35 tgctggtatt gcaggaagtc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPL primer R <400> 36 aaaatccgca tcatcaggag 20 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Osteocalcin primer F <400> 37 tgacagacac accatgagaa ccc 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Osteocalcin primer R <400> 38 agctctagac tgggccgtag aag 23 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen type II primer F <400> 39 ctcaagtccc tcaacaacca g 21 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen type II primer R <400> 40 ttggggtcga tccagtagtc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox9 primer F <400> 41 agaaggacca cccggactac 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sox9 primer R <400> 42 cgttcttcac cgacttcctc 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aggrecan primer F <400> 43 cagtcacacc tgagcagcat 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aggrecan primer R <400> 44 ccttcgatgg tcttgtcgtt 20

Claims

다음 단계를 포함하는 동물의 혀 조직 유래 줄기세포(stem cells)의 제조방법:
(1) 동물의 혀 조직에서 상피 부위의 과립층만을 분리하는 단계; 및
(2) 상기 (1) 단계의 분리한 과립층에 효소를 처리하고, 저글루코오스(low glucose) DMEM, 저글루코오스(low glucose) DMEM/Ham's F12 (1 : 1) 및 IMDM/Ham's F12 (1 : 1) 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 배양액에서 배양하여 혀 조직 유래 줄기세포를 획득하는 단계.
제1항에 있어서,
상기 (2) 단계의 효소는 제1형 콜라겐 분해 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 (2) 단계의 배양액은 저글루코오스(low glucose) DMEM인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 (2) 단계의 혀 조직 유래 줄기세포는 다음과 같은 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) 중간엽줄기세포 마커인 CD29, CD45, CD90, CD105, a-SMA 및 비멘틴(Vimentin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타내고; CD44에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타내며;
(b) 중배엽 세포로 분화하는 분화능을 나타내고;
(c) 미분화상태로 15계대 이상 배양가능함.
제1항에 있어서,
상기 동물은 소과 동물, 개과 동물, 고양이과 동물, 멧돼지과 동물, 사슴과 동물, 기린과 동물, 페커리과 동물, 낙타과 동물, 하마과 동물, 말과 동물, 맥과 동물, 코뿔소과 동물, 족제비과, 토끼과 및 설치류로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서,
상기 소과동물은 소, 염소, 흑염소, 산양, 영양, 야크, 임팔라, 가젤, 물소 및 들소로 구성된 군에서 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 다능성 중간엽 줄기세포, 다능성 조혈모 줄기세포, 다능성 신경 줄기세포, 다능성 간 줄기세포, 다능성 췌장 줄기세포 및 다능성 표피줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 동물의 혀 조직 유래 줄기세포.
제8항의 동물의 혀 조직 유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 골 또는 연골 질환 치료용 세포 치료제.