KR101430708B1 - 인간 침샘 줄기세포, 그 제조방법, 그 배양액, 및 침샘 손상 치료를 위한 그 용도 - Google Patents

인간 침샘 줄기세포, 그 제조방법, 그 배양액, 및 침샘 손상 치료를 위한 그 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 침샘 조직에 콜라게나제를 가하고 진탕배양 하여 조직을 용해하는 단계, 용해된 조직을 균질화하는 단계, 및 균질화된 조직에 콜라게나제 및 히알루로니다제-1를 가하고 진탕배양 하여 조직 내의 글리코시드 결합을 가수분해하는 단계를 포함하는 침샘줄기세포를 생성시킬 수 있는 용해된 침샘조직을 제조하는 방법; 그 제조방법으로 제조된 용해된 침샘조직을 덱사메타손, 머캅토에탄올, 온코스타틴 M, 및 LIF(leukemia inhibitory factor)을 함유하는 배지에 가하여 배양한 다음, 배양액으로부터 줄기세포를 회수하는 단계을 포함하는 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 제조하는 방법; 그 방법으로 제조되고 줄기세포성 세포표면표지인자 CD44, CD49f, CD90, 및 CD105가 발현되는 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포; 및 그 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 침샘 손상 치료용 세포치료제를 제공한다.

Description

인간 침샘 줄기세포, 그 제조방법, 그 배양액, 및 침샘 손상 치료를 위한 그 용도{Stem cells from human salivary glands, a process for the preparation thereof, a culture solution thereof, and a use thereof for the treatment of salivary gland damage}
본 발명은 인간 침샘조직 유래 줄기세포, 그 제조방법, 그 배양액, 및 침샘 손상 치료를 위한 그 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 인간 침샘조직으로부터 성체 줄기세포를 제조하는 방법, 그 제조를 위해 사용되는 침샘줄기세포 배양액, 그 제조방법으로부터 얻어진 인간 침샘줄기세포, 그 인간 침샘 줄기세포를 포함하는 침샘 손상 치료용 세포 치료제에 관한 것이다.
두경부암은 구강, 식도 및 후두에서 발생하는 암으로 전체 암의 약 3 ~ 4 %를 차지하여 전세계 암 발생율 8 위를 차지하고 있으며, 사망률이 무려 30 ~ 40% 에 이르는 암 질환으로 알려져 있다. 특히, 국내의 두경부암 환자 발생빈도가 2002년에는 12,500명에서 2007년에는 25,000명으로 1 년에 약 2,500명 씩 점차 증가되는 추세에 있다.
두경부암의 치료법은 발생조직의 기능 보존을 위해 방사선 치료가 적극적으로 이용되어 왔고, 최근에는 항암화학방사선 병용요법으로 우수한 치료 결과가 다수 보고되어 주요 치료 방법으로 자리 잡아 가고 있다. 방사선 단독 요법 및 항암화학방사선 병용요법의 가장 흔한 합병증은 침샘 손상으로, 거의 모든 환자들이 입마름을 호소하고, 정도의 차이는 있지만 평생 지속적으로 남는 부작용으로 알려져 있다. 보고에 따르면, 치료 후 2년 이상 지난 후에도 50% 이상의 환자에서 입마름을 호소하고 타액 분비가 감소되어, 충치, 불면, 소화불량, 세균감염, 미각 저하 등 삶의 고통을 호소하고 있다.
전 세계적으로 항암화학방사선 동시 병용요법의 부작용의 예방 및 치료제로 사용되고 있는 아미포스틴(상품명: Ethyol)이 있으나, 이는 어지러움 증 등 여러 가지 부작용을 동반하고 있고, 이미 손상된 침샘을 재생시킬 수는 없으며, 손상된 침샘을 재생시키는 치료제는 전무한 실정이다. 이러한 문제를 극복하기 위해서는 침샘 자가 줄기세포치료 연구가 현실적인 대안이다.
인간 침샘조직으로부터 성체 줄기세포를 분리하는 방법이 연구되었다. Rotter et al.은 이하선 조직을 절제 후, 잘게 절단한 다음 EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid)로 세척하고, 콜레게나제 타입 2 및 히알루로니다제로 처리하고, 원심분리 후 상등액을 버리고, 디스파제(dispase)를 부가한 다음 여과 및 세척 후 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 배지, FCS(fetal calf serum), 및 페니실린/스트렙토마이신 함유 배양액 중에 현탁한 다음 배양하여 성체 줄기세포를 획득하는 것을 개시하고 있다(비특허문헌 1). 그러나, 이러한 침샘 줄기세포 분리방법은 분리된 세포의 성장이 느리며 장기간 배양이 불가능하다는 문제가 있다.
성체줄기세포는 배아줄기세포 만큼 전분화능(totipotency)을 띄지는 않지만 다분화능(multipotency)을 가지고 있고, 또한 난자를 사용하지 않으므로 윤리적인 문제가 없고, 환자 본인의 세포를 추출하여 환자 개개인에 맞게 맞춤형 치료로 사용하기 때문에 면역거부반응도 없다는 점이 가장 큰 장점이다.
따라서, 보다 효과적으로 침샘 조직으로부터 세포의 성장이 느리지 않고 장기간 배양이 가능한 성체 줄기세포를 획득하는 방법이 요구되고 있다.
1. Rotter et al., Isolation and Characterization of Adult Stem Cells from Human Salivary Glands, STEM CELLS AND DEVELOPMENT 17:509-518, 2008
본 발명의 목적은 침샘 줄기세포를 생성시킬 수 있는 용해된 침샘조직을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 용해된 인간 침샘 조직으로부터 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 용해된 인간 침샘 조직으로부터 제조된 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 증식 또는 유지하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 생성시키기 위한 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포 배양액을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 포함하는 침샘 손상 세포치료제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은
인간 침샘 조직에 콜라게나제를 가하고 진탕배양 하여 조직을 용해하는 단계;
용해된 조직을 균질화하는 단계; 및
균질화된 조직에 콜라게나제 및 히알루로니다제-1를 가하고 진탕배양 하여 조직 내의 글리코시드 결합을 가수분해하는 단계를 포함하는, 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 생성시킬 수 있는 용해된 침샘조직을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 측면은 상기 용해된 침샘조직을 덱사메타손, 머캅토에탄올, 온코스타틴 M, 및 LIF(leukemia inhibitory factor)를 함유하는 배지에 가하여 배양한 다음, 배양액으로부터 줄기세포를 회수하는 단계를 포함하는 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 방법으로 제조된 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 덱사메타손, 머캅토에탄올, 온코스타틴 M, 및 LIF(leukemia inhibitory factor)를 포함하는 배지에서 계대배양하는 단계를 포함하는 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 증식 또는 유지하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 배지 중에 덱사메타손, 머캅토에탄올, 온코스타틴 M, 및 LIF(leukemia inhibitory factor)를 포함하는 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포 배양액을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 방법으로 제조되고 줄기세포 세포표면표지인자 CD44, CD49f, CD90, 및 CD105가 발현되는 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 상기 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 침샘 손상 치료용 세포치료제를 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.
본 발명자들은 인간 침샘조직으로부터 성체줄기세포를 획득하기 위해 연구한 결과, 인간 침샘조직 유래 줄기세포를 획득할 수 있는 용해된 침샘조직을 제조하는 방법, 그러한 용해된 침샘조직으로부터 성체 줄기세포를 획득하는 방법, 그 성체 줄기세포를 획득하기 위한 배양액, 및 그러한 방법으로 획득된 새로운 성체 줄기세포를 개발하게 되었다.
따라서, 본 발명은 일 측면에 있어서,
인간 침샘 조직에 콜라게나제를 가하고 진탕배양 하여 조직을 용해하는 단계;
용해된 조직을 균질화하는 단계; 및
균질화된 조직에 콜라게나제 및 히알루로니다제-1를 가하고 진탕배양 하여 조직 내의 글리코시드 결합을 가수분해하는 단계를 포함하는, 침샘줄기세포를 생성시킬 수 있는 용해된 침샘조직을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 침샘조직은 포유류의 침샘조직, 바람직하게는 인간의 침샘조직다. 상기 침샘조직으로는 귀밑샘, 턱밑샘, 혀밑샘에서 선택된 하나 이상의 임의의 조합이 이용될 수 있다. 상기 침샘조직은 지방과 막을 제거하고, 최대한 작은 덩어리로 자른 다음 콜라게나제를 가하고 진탕 배양하는 것이 바람직하다.
상기 조직을 용해하는 단계는 침샘 조직을 적출한지 늦어도 24 시간 이내에 멸균 조건 하에서 수행하는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 조직을 용해시키는 단계에서는 반응용액에 멸균 조건을 향상시키는 인자, 항생제 등을 함유시키는 것이 바람직하다. 상기 항생제는 세포 배양에 통상적으로 사용되는 항생제가 사용될 수 있으며, 예를 들어 페니실린/스트렙토마이신 등이 있다. 상기 용해하는 단계에서의 콜라게나제는 콜라게나제 타입 I 및 IV의 혼합액이 사용될 수 있다. 상기 콜라게나제는 구체적으로는 0.01 ~ 1 중량%의 농도로 처리할 수 있으며, 더 구체적으로는 0.05 ~ 0.2 중량%의 농도로 처리할 수 있다.
상기 조직을 용해하는 단계는 상기 진탕배양 후 원심분리를 수행하여 상등액을 제거하고 다시 콜라게나제를 가하고 진탕배양하는 과정을 반복하여 조직을 충분히 용해시키는 것이 바람직하다.
상기 조직을 균질화하는 단계는 조직의 균질화를 위해 당해 기술분야에 사용되는 임의이 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 미세절단과 메쉬(mesh)를 이용한 방법 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 18 ~ 24 게이지의 니들을 통해 통과시킴으로써 조직을 균질화할 수 있다.
상기 가수분해 단계에서 사용되는 콜라게나제 및 히알루로니다제-1은 구체적으로는 각각 독립적으로 0.01 ~ 1 중량%의 농도로 처리할 수 있으며, 더 구체적으로는 각각 독립적으로 0.05 ~ 0.2 중량%의 농도로 처리할 수 있다. 상기 효소 처리에 의해 조직 내 글리코시드 결합을 가수분해 할 수 있다.
상기 가수분해하는 단계를 수행한 다음, 적혈구 용해 반응액을 첨가하여 상온에서 배양함으로써 적혈구를 용해시키는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.
상기 용해된 침샘 조직의 제조방법을 통해 침샘조직으로부터 혈액, 잔류세포, 세포를 둘러싼 콜라겐을 포함한 여러 가지 구조 단백질, 및 임의의 다른 잔류물질을 제거할 수 있다.
본 발명은 다른 일 측면에 있어서, 상기 방법으로 제조된 용해된 침샘조직을 덱사메타손, 머캅토에탄올, 온코스타틴 M, 및 LIF(leukemia inhibitory factor)을 함유하는 배지에 가하여 배양한 다음, 배양액으로부터 줄기세포를 회수하는 단계을 포함하는 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또 다른 일 측면에 있어서, 상기 방법으로 제조된 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 덱사메타손, 머캅토에탄올, 온코스타틴 M, 및 LIF(leukemia inhibitory factor)을 포함하는 배지에서 계대배양하는 단계를 포함하는 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 증식 또는 유지하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 배지 중에 덱사메타손, 머캅토에탄올, 온코스타틴 M, 및 LIF(leukemia inhibitory factor)을 포함하는 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포 배양액을 제공한다.
상기 배지는 구체적으로는 DMEM/F12(Dulbecco's modified Eagle medium/ Ham's F-12) 또는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium)을 포함한 통상적인 배지를 사용할 수 있다. 상기 배지는 추가적으로 FBS(fetal bovine serum), 항생제, ITS-X(insulin-transferrin-selenium supplement), 니코틴아미드, HGF(hepatocyte growth factor), 및 EGF(epidermal growth factor)를 추가로 함유할 수 있다. 상기 항생제는 세포 배양에 통상적으로 사용되는 항생제가 사용될 수 있으며, 예를 들어 페니실린/스트렙토마이신 등이 있다.
상기 배지 중에 상기 성분의 함량은 구체적으로는 50 ~ 150 nM 덱사메타손, 0.1 ~ 10 mM 머캅토에탄올, 5 ~ 20 ng/ml 온코스타틴 M, 500 ~ 2000 u/ml LIF, 5 ~ 20 중량% FBS, 0.05 ~ 3 중량% 항생제, 0.05 ~ 3 중량% ITS-X, 5 ~ 20 mM 니코틴아미드, 10 ~ 30 ng/ml HGF, 및 10 ~ 30 ng/ml EGF 의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 제조하는 방법에 따라 제조되고, 세포표면표지인자 CD44, CD49f, CD90, 및 CD105가 발현되는 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 제공한다. 상기 방법에 따라 제조된 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포의 형태학적 특성 및 면역학적 특성은 다음과 같다.
상기 본 발명의 일 실시예에 따른 인간 침샘조직 유래 줄기세포의 제조방법에 따라 제조된 줄기세포를 현미경으로 관찰한 결과를 도 1에 나타내었다.
또한, 상기 줄기세포의 면역형광염색법에 의해 세포표면표지인자의 발현 여부를 확인한 결과, CD44, CD49f, CD90, 및 CD105가 발현되고 있음이 확인되었다(실시예 3).
또한, 상기 줄기세포의 다분화능에 대해 확인 시험한 결과, 지방세포, 조골세포, 및 연골세포로의 분화능이 있는 것으로 확인되어, 다분화능을 갖는 것으로 확인되었다(실시예 4 및 5).
본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 본 발명에 따른 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 침샘 손상 치료용 세포치료제를 제공한다.
본 명세서에서 "침샘 손상"이란 임의의 원인에 의해 침샘이 손상된 경우를 포함하며, 예를 들어 두경부암의 치료를 위해 방사선 단독요법 또는 항암화학방사선병용요법의 부작용에 의한 침샘손상을 포함한다. 상기 침샘손상 시 침의 분비가 감소하여, 구강 건조증이 나타날 수 있으며, 구강 건조증으로 인해 충치, 불면, 소화불량, 세균 감염, 미각저하 등이 나타날 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 침샘 손상 치료용 세포 치료제는 침샘손상, 구강 건조증, 구강 건조증으로 인한 충치, 불면, 소화불량, 세균 감염, 미각저하 등의 치료에 사용될 수 있다.
상기 본 발명에 따른 침샘 손상 치료용 세포 치료제는 정맥주사, 피하주사, 또는 근육주사와 같은 비경구 투여 뿐만 아니라, 침샘 손상 부위에 직접 투여할 수 있다. 상기 세포 치료제는 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 적절한 투여경로에 적합한 제형으로 제제화될 수 있다.
상기 각각의 제형으로 제제화 시, 각각의 제형의 제조에 필요한 약제학적으로 허용 가능한 담체를 부가하여 제조할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 약학적 활성 성분을 제외한 임의의 구성 성분을 지칭하기 위해 사용된다. "약제학적으로 허용가능한"은 조성물 중에 존재하는 다른 구성 성분들과 상호작용하여 (예를 들면, 담체들 상호 간 또는 약학적 활성 성분과 담체 간의 상호작용) 약제학적으로 바람직하지 않은 변화를 야기하지 않는 성질을 의미한다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체의 선택은 특정한 투여 제형의 특성, 투여 방식, 용해도 및 안정성에 대한 상기 담체의 효과와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다.
상기 본 발명에 따른 약학 조성물은 주사제로서 제제화될 수 있으며, 주사제로 제제화될 경우 혈액과 등장인 무독성 완충용액을 희석제로서 포함할 수 있으며, 예를 들어 pH 7.4의 인산완충용액 등이 있다. 상기 약제학적 조성물은 완충용액 이외에 기타 다른 희석제 또는 첨가제를 포함할 수 있다.
상기 언급된 제제에 사용되는 담체와 제제의 제조방법은 당해 기술분야에 널리 알려져 있는 바에 따라 선택하고 제조할 수 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Science 최신판에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 본 발명에 따른 세포 치료제의 투여량은 침샘손상의 진행 정도, 투여대상의 나이, 성별, 체중, 투여경로, 투여 횟수에 따라서 달라질 수 있다. 인간에 대한 세포치료제의 통상적인 투여량은 104~1010 cells/body, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.
상기 본 발명에 따른 세포치료제는 지방세포, 조골세포, 및 연골세포로의 분화능이 있으므로, 상기 침샘 손상의 치료뿐만 아니라, 다양한 세포치료제로서 유용할 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 인간 침샘조직으로부터 성체줄기세포를 획득할 수 있으며 종래 공지된 분리방법에 비해 FACS 소팅(sorting)을 이용한 별도의 선별(selection) 과정과 같은 복잡한 과정을 필요로 하지 않는 등 분리 방법이 단순하고, 분리된 세포주의 배양이 쉬우며 장기 배양이 가능하고, 획득된 줄기세포를 본 발명에 따른 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포 배양액 중에서 배양할 수 있다. 또한, 본 발명의 4 실시예에 따르면 분리된 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포는 다분화능을 갖는 것으로 확인되어, 침샘 손상의 치료를 위한 세포치료제로서 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따라 분리된 침샘조직 유래 줄기세포를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따라 분리된 침샘조직 유래 줄기세포의 줄기세포성 세포표면표지인자의 존재 여부를 유세포 측정기를 통해 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따라 분리된 침샘조직 유래 줄기세포를 지방세포, 조골세포로 분화시킨 결과를 각각 Oil-red O 염색, Alizarin Red 염색을 수행한 다음 현미경으로 관찰한 결과를 촬영한 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따라 분리된 침샘조직 유래 줄기세포를 지방, 조골, 또는 연골 세포로 분화를 유도한 다음 지방, 조골, 또는 연골세포에서 발현되는 유전자들을 PCR을 수행한 다음 전기영동하여 확인한 결과를 촬영한 사진이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 침샘조직으로부터 세포 분리 및 배양
침샘조직으로부터 침샘줄기세포를 분리하기 위해 기계적인 방법과 효소를 이용한 분리 방법을 사용하였다. 환자로부터 획득한 침샘조직을 마이크로 포셉(micro forcep)을 이용하여 지방과 막을 제거한 후, 최대한 작은 덩어리로 잘랐다. 그런 다음 조직을 50 ml 코니알 튜브(coninal tube)에 옮긴 후, DMEM:F12 배지에 0.1 중량% 콜라게나제(type I & IV)가 첨가되어 있는 효소 반응액 10 ml를 첨가하여 37℃에서 20 ~ 40 분간 진탕 배양하였다. 배양 후 1,300 rpm으로 3 ~ 5분간 원심분리하고, 상등액을 제거한 다음, 0.1중량% 콜라게나제 효소 반응액 10 ml를 첨가하여 37℃에서 20 분간 진탕 배양하여 조직을 용해하였다. 용해 후 배양액을 18G 니들(needle)에 통과시켜 조직 배양액을 균질화 하였다. 균질화 후 1,300 rpm으로 3 ~ 5분간 원심분리하고, 0.1중량% 콜라게나제 + 히알루로니다제-1 효소반응액 10 ml를 첨가하여 37℃에서 20 분간 진탕 배양하여 조직 내에 글리코시드 결합을 가수분해하였다. 가수분해 후 1,300 rpm으로 3 ~ 5분간 원심분리하고, PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 다음 1,300 rpm으로 3 ~ 5분간 원심분리하고, 적혈구 용해 반응액을 5 ml 첨가하여 상온에서 5 분간 배양하여 적혈구를 용해시켰다. PBS 세척 과정을 2 회 거치고 난후, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM/F12 1:1) 배지에 10 중량% FBS, 1 중량% 페니실린/스트렙토마이신, 1 중량% ITS-X(insulin-transferrin-selenium supplement), 10 mM 니코틴아미드, 100 nM 덱사메타손, 1 mM β-머캅토에탄올, 20 ng/ml HGF(hepatocyte growth factor), 20 ng/ml OSM(Oncostatin M), 1000 U/ml LIF(leukemia inhibitory factor) 및 20 ng/ml EGF(epidermal growth factor)이 첨가된 배양액을 첨가하여 콜라겐 type I 이 코팅되어 있는 배양접시에 넣고 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 2 ~ 3일 마다 배양액을 교환해 주었다. 현미경 관찰 후 배양접시의 세포가 80%컨플루언시(confluency)일 때 계대 배양을 하였다. 계대배양 후 현미경으로 관찰한 사진을 도 1에 나타내었다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따라 분리된 침샘조직 유래 줄기세포를 현미경으로 관찰한 사진이다.
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실시예 3: 세포표면표지인자 발현 확인(유세포 측정기)
상기 실시예 1에서 분리된 침샘줄기세포의 줄기세포성 세포표면표지인자의 존재 여부를 확인해 보았다. 침샘줄기세포 5 x 105 (세포표면표지인자 1개당)를 준비하여 PBS로 3회 세척 후 FACS 완충액(1% FBS in PBS) 100 ul를 첨가하여 현탁하고 상온에서 1시간 동안 블러킹 하였다. 그 후 세포표면표지인자의 발현을 확인하기 위해 1차 항체(CD34, CD44, CD45, CD49f, CD90, CD105, CD117, 및 CD133)를 1:1000 비율로 FACS 완충액에 희석하여 넣고 30 분 동안 4℃에서 배양하였다. 또한, 1차 항체 배양 후, PBS로 3회 세척 후 그린 또는 레드 형광을 나타내는 2차 항체를 1:1000 비율로 FACS 완충액에 현탁하여 100 ul 넣어 30 분 동안 4℃에서 배양하였다. 배양액을 모두 제거한 후 PBS로 3회 세척하여 FACS 완충액 1 ml를 넣고, 유세포 측정기를 통해 세포표면표지인자 발현 여부를 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따라 분리된 침샘조직 유래 줄기세포의 줄기세포성 세포표면표지인자의 존재 여부를 유세포 측정기를 통해 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3에서 보여지는 것과 같이 분리된 침샘줄기세포에서 CD44, CD49f, CD90, 및 CD105가 발현되고 있음을 확인하였다. 이를 통해 침샘줄기세포에서는 줄기세포표면인자가 발현되고 있는 것으로 확인되었다.
실시예 4: 다분화능 확인
상기 실시예 1에서 분리된 침샘줄기세포의 줄기세포적 특성인 다분화능을 갖는지에 대해 알아보았다. 중간엽성 줄기세포의 분화능을 확인하는 방법으로서 지방, 조골, 연골세포로의 분화를 유도하였다.
지방세포로의 분화에 대해서는, DMEM 배지에 10% FBS, 2 mM 인슐린, 500 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴, 1 mM 덱사메타손, 및 200 mM 인도메타신이 첨가된 배지를 이용하여 3 주간 배양함으로써 지방세포로 유도하였다. 분화가 유도된 세포는 4% 파라포름알데하이드 용액에 상온에서 20 분간 고정한 후 0.5% Oil-red O 용액으로 상온에서 20분간 염색하여 현미경으로 관찰하였다.
조골세포로의 분화에 대해서는 DMEM 배지에 0.1 mM 덱사메타손, 10 mM 3-글리세로포스페이트, 50 mg/ml 아스코르빅-2-포스페이트를 첨가한 배지를 이용하여 3주간 배양함으로서 조골세포로 유도하였다. 분화가 유도된 세포는 Alizarin Red 염색법을 통하여 염색한 후 현미경으로 관찰하였다.
상기 지방세포, 조골세포로의 분화 결과를 현미경으로 관찰한 결과를 촬영한 사진을 도 4에 나타내었다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따라 분리된 침샘조직 유래 줄기세포를 지방세포, 조골세포로 분화시킨 결과를 각각 Oil-red O 염색, Alizarin Red 염색을 수행한 다음 현미경으로 관찰한 결과를 촬영한 사진이다.
도 4에서 보여지는 것과 같이 분리된 침샘조직 유래 줄기세포의 다분화능을 염색을 통해 확인한 결과로 지방, 조골 특이적인 염색결과가 관찰되었다. 따라서, 침샘조직 유래 줄기세포가 다분화능을 갖는 것으로 확인되었다.
실시예 5: 다분화능 확인 RT-PCR
상기 실시예 1에서 분리된 침샘줄기세포가 줄기세포적 특성인 다분화능을 갖는지에 대해 알아보았다. 중간엽성 줄기세포의 분화능을 확인하는 방법으로 지방, 조골, 연골세포로의 분화를 상기 실시예 4와 같이 유도하여 유전자 발현여부를 확인하였다.
지방, 조골, 연골 세포로 분화를 유도하여 총 RNA를 추출한 후, cDNA를 합성한 다음, SEQ ID NO: 1 내지 16의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행 하였다. PCR 산물을 2% 아가로스 겔에 로딩하여 전기영동하여 확인하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따라 분리된 침샘조직 유래 줄기세포를 지방, 조골, 또는 연골 세포로 분화를 유도한 다음 지방, 조골, 또는 연골세포에서 발현되는 유전자들을 PCR을 수행한 다음 전기영동하여 확인한 결과를 촬영한 사진이다.
도 5에 나타난 바와 같이 분리된 침샘줄기세포의 다분화능을 RT-PCR로 확인한 결과로 지방, 조골, 연골세포에서 발현되는 유전자들이 발현되고 있음을 확인하였다. 도 5에서 DO는 분화하기 전의 대조군으로서 0 일째를 의미하는 것이고 D21은 분화 유도 21일째를 의미한다.
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Claims (15)

  1. 인간 침샘 조직에 콜라게나제를 가하고 진탕배양 하여 조직을 용해하는 단계;
    용해된 조직을 균질화하는 단계; 및
    균질화된 조직에 콜라게나제 및 히알루로니다제-1를 가하고 진탕배양 하여 조직 내의 글리코시드 결합을 가수분해하는 단계를 포함하는, 줄기세포성 세포표면표지인자 CD44, CD49f, CD90, 및 CD105가 발현되는 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 생성시킬 수 있는 용해된 침샘조직을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 콜라게나제는 0.01 내지 1 중량%의 농도로 처리되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 콜라게나제 및 히알루로니다제-1는 각각 독립적으로 0.01 내지 1 중량%의 농도로 처리되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조직을 용해하는 단계는 진탕배양 후 원심분리에 의해 상등액을 제거하고 다시 조직을 용해하는 단계를 반복하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 균질화 단계는 용해된 조직을 18 ~ 24 G 니들을 통해 통과시키는 것인 방법.
  6. 제1항에 따른 방법으로 제조된 용해된 침샘조직을 덱사메타손, 머캅토에탄올, 온코스타틴 M, 및 LIF(leukemia inhibitory factor)를 함유하는 배지에 가하여 배양한 다음, 배양액으로부터 줄기세포를 회수하는 단계을 포함하는, 줄기세포성 세포표면표지인자 CD44, CD49f, CD90, 및 CD105가 발현되는 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 제조하는 방법.
  7. 제6항의 방법으로 제조된 줄기세포성 세포표면표지인자 CD44, CD49f, CD90, 및 CD105가 발현되는 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 덱사메타손, 머캅토에탄올, 온코스타틴 M, 및 LIF(leukemia inhibitory factor)을 포함하는 배지에서 계대배양하는 단계를 포함하는 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 증식 또는 유지하는 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 배지는 DMEM/F12(Dulbecco's modified Eagle medium/Ham's F-12) 또는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)인 방법.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 배지는 FBS(fetal bovine serum), 항생제, ITS-X(insulin-transferrin-selenium supplement), 니코틴아미드, HGF(hepatocyte growth factor), 및 EGF(epidermal growth factor)를 추가로 함유하는 방법.
  10. 배지 중에 덱사메타손, 머캅토에탄올, 온코스타틴 M, 및 LIF(leukemia inhibitory factor)를 포함하는 줄기세포성 세포표면표지인자 CD44, CD49f, CD90, 및 CD105가 발현되는 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포 배양액.
  11. 제10항에 있어서, 상기 배지는 DMEM/F12(Dulbecco's modified Eagle medium/Ham's F-12) 또는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium)인 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포 배양액.
  12. 제11항에 있어서, 상기 배지는 FBS(fetal bovine serum), 항생제, ITS-X(insulin-transferrin-selenium supplement), 니코틴아미드, HGF(hepatocyte growth factor), 및 EGF(epidermal growth factor)를 추가로 포함하는 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포 배양액.
  13. 제6항의 방법으로 제조되고, 줄기세포성 세포표면표지인자 CD44, CD49f, CD90, 및 CD105가 발현되는 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포.
  14. 제13항의 인간 침샘조직 유래 성체 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 침샘 손상 치료용 세포치료제.
  15. 제14항에 있어서, 상기 침샘 손상은 구강 건조증을 포함하는 것인 침샘 손상 치료용 세포치료제.
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