CN109370988A - 干细胞体外扩增培养体系及其方法 - Google Patents
干细胞体外扩增培养体系及其方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109370988A CN109370988A CN201811317448.0A CN201811317448A CN109370988A CN 109370988 A CN109370988 A CN 109370988A CN 201811317448 A CN201811317448 A CN 201811317448A CN 109370988 A CN109370988 A CN 109370988A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- stem cell
- niacinamide
- cultivating system
- amplification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/14—Erythropoietin [EPO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2301—Interleukin-1 (IL-1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2303—Interleukin-3 (IL-3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/231—Interleukin-10 (IL-10)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2312—Interleukin-12 (IL-12)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/235—Leukemia inhibitory factor [LIF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
Abstract
一种干细胞的体外扩增方法,采用含有烟酰胺类物质的扩增培养体系,以无血清培养基为基础培养基,添加了8%~12%胎牛血清、细胞因子组合物和烟酰胺类物质。所述细胞因子组合物包括干细胞因子、促血小板生成素、FLt3配体、G‑CSF、IL‑3和IL‑6。与常规培养体系相比,用本发明的培养体系培养CD34+细胞1周~12周,可以有效增加造血干细胞数量,提高CD34+/Lin‑和CD34+/CD38‑细胞比例,有助于解决造血干细胞移植中细胞数量不足的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域,具体涉及一种用于体外扩增干细胞的组合物,尤其是一种用于体外扩增造血干细胞的培养体系,以及造血干细胞的体外快速扩增培养方法。
背景技术
造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)是存在于造血组织和血液中的一类成体干细胞,具有自我更新能力和分化为所有成熟血细胞的潜能。HSCs是最早被人们发现和研究的干细胞,它在人胚胎发育第二周时出现于卵黄囊,大约在第四周时转移至胚胎肝,在妊娠五个月时进入骨髓进行造血。
临床发现,大部分恶性血液疾病,如急性髓系白血病、慢性髓性白血病的发生和进展,都直接或间接地与HSCs异常有关。自从20世纪60年代发展至今,HSCs移植已经成为治疗各型白血病、再生障碍性贫血、β-地中海贫血等严重血液病和免疫系统疾病的重要医疗手段,同时也被应用于某些实体瘤的治疗,如淋巴瘤、小细胞肺癌等。目前临床应用的HSCs有三大来源,即骨髓、外周血和脐带血。
造血干细胞数量不足是全球范围内限制其临床应用的主要障碍之一。骨髓或外周血HSCs移植对供、受者间配型要求极高,患者常常需要等待较长时间才能找到合适的供体,当单次采集所得的干细胞数量不足,则需要进行多次采集,对供者造成较大伤害;对于脐带血HSCs移植,单份脐带血中干细胞数量有限,这会导致一部分成人患者找不到符合临床移植条件的单份脐带血。因此,一种安全、有效的造血干细胞体外扩增方法亟需被建立。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种干细胞的体外培养体系,实现干细胞,尤其是造血干细胞数量的体外扩增。
本发明的另一个目的在于提供一种干细胞的体外培养体系,抑制CD38的表达和/或活性。
本发明的又一个目的在于提供一种干细胞的体外培养方法,增加可供临床移植应用的造血干细胞资源,如:用于移植治疗血液疾病、免疫系统疾病等。
本发明的再一个目的在于提供一种干细胞的体外培养方法,以提供或增加造血干细胞资源用于科学研究,如:造血遗传调控机制研究、造血干细胞诱导分化研究、获得性免疫疗法开发等。
CD38是一类细胞膜结合酶,其底物为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadenine dinucleotide,NAD),其代谢产物为环腺苷二磷酸核糖(cyclic adenosinediphosphate ribose,cADPR)和烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adeninedinucleotide phosphate,NAADP)。研究表明,CD38具有信号传导功能,能够抑制造血祖细胞的生长,促进向人B淋巴细胞的分化与成熟。烟酰胺(化学式为C6H6N2O)是一种常见的CD38抑制剂,既可以直接抑制CD38的活性,也可以间接抑制CD38信号通路各组分的表达和/或活性(如:cADPR通路、钙释放通路或其他可影响CD38活性的信号通路)。本发明通过添加外源烟酰胺,干扰造血干细胞CD38的表达和/或活性,抑制其细胞分化进程,延长细胞增殖周期,从而实现造血干细胞的体外扩增的目的。
本发明提供的一种干细胞体外扩增培养方法,所用培养体系中除了含有造血干细胞增殖所必需的营养物质之外,特别地,还添加烟酰胺类物质、早期效应细胞因子(earlyacting cytokines)和晚期效应细胞因子(late acting cytokines)。其中,烟酰胺类物质包括但不限于烟酰胺、烟酰胺类似物(如:取代苯甲酰胺、取代烟酰胺、N-取代烟酰胺、烟碱硫代酰胺等)、烟酰胺及其类似物的衍生物(如:取代苯甲酰胺、取代烟酰胺、N-取代烟酰胺、烟碱硫代酰胺等)、烟酰胺及其类似物的代谢产物(如:NAD、NADH和NADPH等)等,这些物质单独或组合应用于本发明。早期效应细胞因子包括:但不限于肝细胞生长因子(hepatocytegrowth factor,HGF)、FMS样的酪氨酸激酶3配体(FLT3ligand,Flt3L)、白介素-1(interleukin-1,IL-1)、白介素-2(interleukin-2,IL-2)、白介素-3(interleukin-3,IL-3)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)、白介素-12(interleukin-12,IL-12)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)等,这些细胞因子单独或组合应用于本发明。晚期效应细胞因子包括但不限于粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)、红细胞生成素(erythropoietin,EPO)、纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、神经生长因子(nerve growthfactor,NGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)和和HGF等,这些细胞因子也单独或组合应用于本发明。
作为优选,烟酰胺类物质选择烟酰胺、苯甲酰胺、尼古丁硫代酰胺、烟酸和α-氨基-3-吲哚丙酮酸中的一种或几种应用于本发明。具体地,烟酰胺类物质在扩增培养体系中的终浓度为0.1mM~20mM的,优先选择1mM~10mM,更优地选择1.0mM~6.0mM。
作为优选,早期效应细胞因子选择HGF、TPO、Flt3L、IL-6和IL-3中的一种或几种。具体地,HGF的终浓度为30ng/mL~300ng/mL,TPO的终浓度为2ng/mL~20ng/mL,Flt3L配体的终浓度为50ng/mL~300ng/mL,IL-6的终浓度为10ng/mL~100ng/mL,以及IL-3的终浓度为20ng/mL~200ng/mL。
作为优选,所述晚期效应细胞因子选择G-CSF、EPO中的一种或两种。具体地,G-CSF的终浓度为20ng/mL~80ng/mL,EPO的终浓度为2ng/mL~20ng/mL。
本发明提供干细胞体外扩增培养方法,其培养时长为种子细胞接种后继续培养1周~12周,使干细胞的数量得到扩增同时不因培养时间过长而发生形态异常变化。
本发明的扩增培养体系涉及的试剂、细胞因子、烟酰胺类物质均可通过商业化途径购买获得。
本发明另一种干细胞体外扩增方法的实施方式为:
首先,制备并获取造血干细胞;
接着,富集CD34+细胞(如:用免疫磁珠分选法(Direct CD34ProgenitorCellIsolation Kit,Miltenyi Biotec公司,德国)),使CD34+细胞的纯度高于20%;
然后,在培养体系中悬浮培养富集得到的CD34+细胞,培养条件为:以细胞密度1×104/mL~5×104/mL接种于细胞培养板中(corning costar公司,美国),置于37℃、5%CO2的无菌培养箱中培养,约每3天~7天为细胞全量换液,当细胞扩增至一定数量时,转移至更大规格培养瓶中培养,当细胞扩增至目标数量时,收集细胞并离心,加入冻存保护液后进行冻存。
制备并获取造血干细胞的方法如:从正常供体获得新鲜的G-CSF动员的人外周血或骨髓血或脐带血,在24h内完成造血干细胞制备;或者取深低温冻存的人脐带血造血干细胞,在1min内完成复苏操作。
本发明技术方案实现的有益效果:
本发明的干细胞体外扩增方法,通过在培养体系中外源添加烟酰胺类物质,并优化添加多种细胞因子,能够延长造血干细胞增殖周期,体外扩增造血干细胞数量。
本发明的干细胞体外扩增方法,可以有效地实现体外扩增单份脐带血中造血干细胞数量,使其不至于因细胞数不足而被废弃,提高血量较少的脐带血、和/或骨髓血、外周血的利用率。
本发明的干细胞体外扩增方法,可以缩短待行造血干细胞移植手术患者的等待时间并降低治疗费用。
本发明的干细胞体外扩增方法,有助于降低骨髓血和/或外周血采集量,降低对成人供者的可能伤害。
本发明的干细胞体外扩增方法,有助于减少脐带血造血干细胞的实体存储量,节约存储空间。
附图说明
图1为造血干细胞体外扩增培养与常规培养1周、4周的形态学观察结果;
图2为造血干细胞体外扩增培养与常规培养4周的CD34+细胞数量的比较;
图3为造血干细胞体外扩增培养与常规培养4周的CD34+/CD38-细胞百分比的比较;
图4为造血干细胞体外扩增培养与常规培养4周的CD34+/Lin-细胞百分比的比较。
具体实施方式
以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明以脐带血造血干细胞的体外扩增为例,仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
实施例1脐带血CD34+细胞的制备与纯化
获得产妇知情同意后,由产科医生与医护人员无菌采集健康足月新生儿的脐带血,并将血样运输至万级无菌实验室中,在百级无菌生物安全柜中执行制备操作。操作人员从脐带血样本中抽取约10mL脐带血,测定全血白细胞数,在剩余血样中加入60g/L的羟乙基淀粉,脐带血∶羟乙基淀粉=1∶4(v/v),轻轻混合,目的是促进红细胞沉降,接着将血样置于大容量低温离心机中离心,条件为:630rpm离心6.5min,8-12℃,再通过人工压浆,将离心后血样中的上层血浆、中层白细胞(含造血干细胞)和下层少量红细胞压入新的血样袋中,将其再次离心,条件为:1650rpm离心13min,8-12℃,再次通过人工压浆,将血样中的上层血浆、中层白细胞(含造血干细胞)压入新的血样袋中。从脐带血采集到造血干细胞制备应在24小时内完成。最后,操作人员采用免疫磁珠分选法纯化制备后的脐带血造血干细胞,CD34+磁珠与试剂购自德国美天旎生物技术公司,纯化步骤依照试剂盒说明书进行,经流式细胞术检测CD34+细胞纯度达到20%以上。
实施例2造血干细胞的体外扩增培养
将按实施例1所述方法制备纯化后的CD34+细胞接种于12孔板(corning costar公司,美国),设置对照组和扩增组,细胞接种密度为1×104/mL。
扩增组细胞添加扩增培养基,2mL/孔,扩增培养基含:无血清培养基(StemCellTechnologies,Vancouver,BC)作为基础培养基,10%(v/v)胎牛血清(Gibco,美国)、4.5mM烟酰胺、20ng/mL TPO、50ng/mL IL-6、60ng/mL FLT-3配体、40ng/mL SCF、20ng/mL IL-3、30ng/mL G-CSF和15ng/mL EPO。对照组培养基为扩增培养基去除烟酰胺,用量为2mL/孔。将细胞置于37℃、5%CO2、饱和湿度的无菌培养箱中培养,每5天为细胞全量换液。当细胞密度增至1×105/mL时,收集细胞,1,500rpm离心5min,重新接种至新培养板中继续培养,期间CD34+细胞倒置显微镜(4×目镜、10×物镜)观察结果,参见图1。
由图1所示,培养1周时,对照组和扩增组的细胞均呈圆形或肾形,体积大小均匀,细胞器不明显,是典型造血干细胞样,两组细胞在相同大小的视野下数量相当;培养至4周时,两组细胞较其1周时均更为致密,出现明显的细胞团,扩增组细胞几乎铺满全视野,细胞团数量较对照组更多,提示含烟酰胺培养体系能够很好地扩增CD34+细胞数量。
实施例3造血干细胞集落形成能力测定
将按实施例1所述方法制备纯化后的造血干细胞用5%冰醋酸稀释,用台盼蓝染色法进行细胞计数,对照组和扩增组分别用实施例2所述不含或含烟酰胺的培养基调整细胞悬液浓度为1×104/mL,充分混匀,接着,用无菌注射器吸取细胞悬液,以2mL/孔加入六孔培养板(corning costar公司,美国),重复三孔;轻轻摇晃培养板,使细胞均匀充满整个培养板底部,然后,在培养板的培养孔上方用记号笔标明样本编号及接种时间,在培养孔底部画一个“十字”将底部分成4个区域,以便后期对集落进行计数,最后,将培养板置于37℃、5%CO2、饱和湿度的无菌细胞培养箱中培养,之后在倒置显微镜下观察细胞集落形成情况并进行计数,每个样本对应的培养孔中各区域里的集落总数即该样本的CFU集落数,造血干细胞扩增培养与常规培养2周、4周、8周和12周的CFU、CD34+细胞数量的比较如表1所示。
表1
实施例4流式细胞术检测CD34+细胞数量扩增情况
将按实施例2所述方法培养对照组和扩增组CD34+细胞,4周后收集到15mL EP管中,充分混匀。取4支流式小管,其中两支小管为对照组CD34+细胞阳性管和阴性对照管,另两支小管为扩增组CD34+细胞阳性管和阴性对照管;移液器吸取对照组和扩增组细胞样本各40μL,分别等量加入对照组和扩增组的两支流式小管中,并在对照组和扩增组细胞的阴性对照流式小管中均加入20μL CD45-FITC和20μL IgG-PE抗体,在对照组和扩增组细胞的阳性流式小管中均加入20μL CD45-FITC和20μL CD34-PE抗体,混匀后避光致敏15min。接着,对待测样本进行离心,1000rpm,5min,弃上清,加入2mL PBS,振荡器混匀,1000rpm离心5min,弃上清,加入500μL PBS,用振荡器充分混匀,通过流式细胞仪(Calibur,BD公司,美国)检测CD34+细胞数量,结果参见图2。
由图2所示,扩增组CD34+细胞数约为对照组的3.8倍,表明含烟酰胺的培养体系显著促进CD34+细胞增殖。
实施例5流式细胞术检测扩增培养体系对CD34+/CD38-细胞比例的影响
将按实施例2所述方法培养对照组和扩增组CD34+细胞,4周后收集到15mL EP管中,充分混匀。取4支流式小管,其中两支小管为对照组CD34+细胞阳性管和阴性对照管,另两支小管为扩增组CD34+细胞阳性管和阴性对照管;移液器吸取对照组和扩增组细胞样本各40μL,分别等量加入对照组和扩增组的两支流式小管中,并在对照组和扩增组细胞的阴性对照流式小管中均加入20μLCD45-FITC和20μLIgG-PE抗体,在对照组和扩增组细胞的阳性流式小管中均加入20μLCD38-FITC和20μLCD34-PE抗体,混匀后避光致敏15min。接着,对待测样本进行离心,1000rpm,5min,弃上清,加入2mL PBS,振荡器混匀;重复1000rpm离心5min操作,弃上清,加入500μL PBS,用振荡器充分混匀,通过流式细胞仪检测CD34+/CD38-比例,检测CD34+/CD38-的结果参见图3。
由图3所示,扩增组造血干细胞的CD34+/CD38-比例约为对照组的27.9倍,表明含烟酰胺的培养体系显著抑制了CD38阳性细胞数,从而延长CD34+种子细胞的增殖周期。
实施例6流式细胞术检测扩增培养体系对CD34+/Lin-细胞比例的影响
将按实施例2所述方法培养对照组和扩增组CD34+细胞,4周后收集到15mL EP管中,充分混匀。取4支流式小管,其中两支小管为对照组CD34+细胞阳性管和阴性对照管,另两支小管为扩增组CD34+细胞阳性管和阴性对照管;移液器吸取对照组和扩增组细胞样本各40μL,分别等量加入对照组和扩增组的两支流式小管中,并在对照组和扩增组细胞的阴性对照流式小管中均加入20μL CD45-FITC和20μL IgG-PE抗体,在对照组和扩增组细胞的阳性流式小管中均加入20μL Lin-FITC和20μL CD34-PE抗体,混匀后避光致敏15min。接着,对待测样本进行离心,1000rpm,5min,弃上清,加入2mL PBS,振荡器混匀;重复1000rpm离心5min操作,弃上清,加入500μLPBS,用振荡器充分混匀,通过流式细胞仪检测CD34+/Lin-比例,检测CD34+/Lin-的结果参见图4。
由图4可见,不表达Lin是造血干细胞的主要标志之一。图中,扩增组CD34+/Lin-细胞比例是对照组的约13.8倍,表明经含烟酰胺的培养体系扩增后的CD34+细胞依然能维持其造血干细胞特性。
Claims (25)
1.一种干细胞体外扩增培养方法,其特征在于,培养过程中使干细胞与能抑制CD38表达和/或活性及CD38相关信号通路的表达和/或活性的物质相接触,延长细胞增殖周期,扩增CD34+细胞数量。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述能抑制CD38表达和/或活性及CD38相关信号通路的表达和/或活性的物质为烟酰胺类物质。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述烟酰胺类物质是指能发挥类似烟酰胺作用的物质,选自于烟酰胺、烟酰胺类似物、烟酰胺及其类似物的衍生物、烟酰胺及其类似物的代谢产物。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:
所述烟酰胺类似物选自于苯甲酰胺、尼古丁硫代酰胺、烟酸和α-氨基-3-吲哚丙酸之一种或几种;
所述烟酰胺及其类似物的衍生物选自于取代苯甲酰胺、取代烟酰胺、N-取代烟酰胺、烟碱硫代酰胺之一种或几种;
所述烟酰胺及其类似物的代谢产物为NAD、NADH和NADPH之一种或几种。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述烟酰胺类物质选自于烟酰胺、选自于苯甲酰胺、尼古丁硫代酰胺、烟酸或α-氨基-3-吲哚丙酮酸之一种或几种。
6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述烟酰胺类物质在培养体系中的终浓度为0.1mM~20mM。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述烟酰胺类物质在培养体系中的终浓度为1.0mM~10mM。
8.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述烟酰胺类物质在培养体系中的终浓度为1.0mM~6.0mM。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,以无血清培养基为基础培养基,还添加了8v/v%~12v/v%胎牛血清。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述培养体系中还外源性添加多种细胞因子,包括:
早期效应细胞因子,其选自于肝细胞生长因子、FMS样的酪氨酸激酶3配体、白介素-1、白介素-2、白介素-3、白介素-6、白介素-10、白介素-12、肿瘤坏死因子-α和促血小板生成素之一种或几种;和
晚期效应细胞因子,其选自于粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素、纤维母细胞生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、白血病抑制因子和肝细胞因子。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述外源添加的多种细胞因子为SCF30ng/mL~300ng/mL、TPO 2ng/mL~20ng/mL、FLt3配体50ng/mL~300ng/mL、IL-610ng/mL~100ng/mL和IL-3 20ng/mL~200ng/mL。
12.根据权利要求10所述的体外扩增干细胞的培养体系,其特征在于,还添加G-CSF20ng/mL~80ng/mL,EPO 2ng/mL~20ng/mL。
13.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述干细胞可来自于健康供体的新鲜的人骨髓血、动员的外周血或脐带血,或来自于深低温冻存的人脐带血。
14.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述干细胞为含造血干细胞的细胞群,其中20%~100%是CD34+细胞。
15.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,将干细胞持续培养1周~12周。
16.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,将干细胞持续培养3周~9周。
17.一种体外扩增干细胞的培养体系,其特征在于以无血清培养基为基础培养基,添加8%~12v/v%胎牛血清,其特征在于,还加入烟酰胺、烟酰胺类似物、烟酰胺及其类似物的衍生物、烟酰胺及其类似物的代谢产物之一种或几种。
18.根据权利要求17的所述的体外扩增干细胞的培养体系,其特征在于:
所述烟酰胺类似物选自于苯甲酰胺、尼古丁硫代酰胺、烟酸和α-氨基-3-吲哚丙酸之一种或几种;
所述烟酰胺及其类似物的衍生物选自于取代苯甲酰胺、取代烟酰胺、N-取代烟酰胺、烟碱硫代酰胺之一种或几种;
所述烟酰胺及其类似物的代谢产物为NAD、NADH和NADPH之一种或几种。
19.根据权利要求18所述的体外扩增干细胞的培养体系,其特征在于,所述烟酰胺类物质选自于苯甲酰胺、尼古丁硫代酰胺、烟酸或α-氨基-3-吲哚丙酮酸之一种或几种。
20.根据权利要求18所述的体外扩增干细胞的培养体系,其特征在于,所述烟酰胺类物质在培养体系中的终浓度为0.1mM~20mM。
21.根据权利要求18所述的体外扩增干细胞的培养体系,其特征在于,所述烟酰胺类物质在培养体系中的终浓度为1.0mM~10mM。
22.根据权利要求18所述的体外扩增干细胞的培养体系,其特征在于,所述烟酰胺类物质在培养体系中的终浓度为1.0mM~6.0mM。
23.根据权利要求17所述的体外扩增干细胞的培养体系,其特征在于,所述培养体系中还外源性添加多种细胞因子,包括:
早期效应细胞因子,其选自于肝细胞生长因子、FMS样的酪氨酸激酶3配体、白介素-1、白介素-2、白介素-3、白介素-6、白介素-10、白介素-12、肿瘤坏死因子-α和促血小板生成素之一种或几种;和
晚期效应细胞因子,其选自于粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、红细胞生成素、纤维母细胞生长因子、表皮生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、白血病抑制因子和肝细胞因子。
24.根据权利要求17所述的体外扩增干细胞的培养体系,其特征在于,所述外源添加的多种细胞因子为SCF 30ng/mL~300ng/mL、TPO 2ng/mL~20ng/mL、FLt3配体50ng/mL~300ng/mL、IL-6 10ng/mL~100ng/mL和IL-3 20ng/mL~200ng/mL。
25.根据权利要求17所述的体外扩增干细胞的培养体系,其特征在于,还添加G-CSF20g/mL~80ng/mL,EPO 2g/mL~20ng/mL。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811317448.0A CN109370988A (zh) | 2018-11-03 | 2018-11-03 | 干细胞体外扩增培养体系及其方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811317448.0A CN109370988A (zh) | 2018-11-03 | 2018-11-03 | 干细胞体外扩增培养体系及其方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109370988A true CN109370988A (zh) | 2019-02-22 |
Family
ID=65384151
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811317448.0A Pending CN109370988A (zh) | 2018-11-03 | 2018-11-03 | 干细胞体外扩增培养体系及其方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109370988A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110564687A (zh) * | 2019-11-05 | 2019-12-13 | 诺未科技(北京)有限公司 | 用于扩增造血干细胞的组合物、培养基、方法和试剂盒 |
CN110669732A (zh) * | 2019-11-05 | 2020-01-10 | 清华大学 | 组合物在将造血祖细胞重编程为造血干细胞中的用途 |
CN110951686A (zh) * | 2019-11-14 | 2020-04-03 | 武汉济源高科技有限公司 | 一种造血干细胞体外扩增培养体系和方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101063110A (zh) * | 2007-04-26 | 2007-10-31 | 上海交通大学 | 成体干细胞的培养基和培养方法 |
US20090311782A1 (en) * | 2008-06-11 | 2009-12-17 | Taipei Veterans General Hospital | Method for promoting differentiation of stem cell into insulin producing cell |
CN103060264A (zh) * | 2012-12-20 | 2013-04-24 | 上海市第十人民医院 | 一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法 |
KR20130131815A (ko) * | 2012-05-24 | 2013-12-04 | 한국원자력의학원 | 인간 침샘 줄기세포, 그 제조방법, 그 배양액, 및 침샘 손상 치료를 위한 그 용도 |
CN104830772A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-08-12 | 深圳富利鑫健康产业发展有限公司 | 一种造血干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法 |
CN106957815A (zh) * | 2017-03-16 | 2017-07-18 | 杨涛 | 一种用于人类多潜能干细胞的无血清培养基的配方 |
-
2018
- 2018-11-03 CN CN201811317448.0A patent/CN109370988A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101063110A (zh) * | 2007-04-26 | 2007-10-31 | 上海交通大学 | 成体干细胞的培养基和培养方法 |
US20090311782A1 (en) * | 2008-06-11 | 2009-12-17 | Taipei Veterans General Hospital | Method for promoting differentiation of stem cell into insulin producing cell |
KR20130131815A (ko) * | 2012-05-24 | 2013-12-04 | 한국원자력의학원 | 인간 침샘 줄기세포, 그 제조방법, 그 배양액, 및 침샘 손상 치료를 위한 그 용도 |
CN103060264A (zh) * | 2012-12-20 | 2013-04-24 | 上海市第十人民医院 | 一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法 |
CN104830772A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-08-12 | 深圳富利鑫健康产业发展有限公司 | 一种造血干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法 |
CN106957815A (zh) * | 2017-03-16 | 2017-07-18 | 杨涛 | 一种用于人类多潜能干细胞的无血清培养基的配方 |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110564687A (zh) * | 2019-11-05 | 2019-12-13 | 诺未科技(北京)有限公司 | 用于扩增造血干细胞的组合物、培养基、方法和试剂盒 |
CN110669732A (zh) * | 2019-11-05 | 2020-01-10 | 清华大学 | 组合物在将造血祖细胞重编程为造血干细胞中的用途 |
CN110564687B (zh) * | 2019-11-05 | 2020-04-03 | 诺未科技(北京)有限公司 | 用于扩增造血干细胞的组合物、培养基、方法和试剂盒 |
WO2021088294A1 (zh) * | 2019-11-05 | 2021-05-14 | 诺未科技(北京)有限公司 | 用于扩增造血干细胞的组合物、培养基、方法和试剂盒 |
CN110951686A (zh) * | 2019-11-14 | 2020-04-03 | 武汉济源高科技有限公司 | 一种造血干细胞体外扩增培养体系和方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Bagley et al. | Extended culture of multipotent hematopoietic progenitors without cytokine augmentation in a novel three-dimensional device | |
Douay | Experimental culture conditions are critical for ex vivo expansion of hematopoietic cells | |
US20050272152A1 (en) | Stem cell populations and methods of use | |
CN101864396B (zh) | 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法 | |
CN104711225B (zh) | Nk细胞的体外制备方法 | |
CN109370988A (zh) | 干细胞体外扩增培养体系及其方法 | |
CN109652369A (zh) | 利用外周血体外制备成熟红细胞的方法及制剂 | |
CN102643784A (zh) | 一种造血干/祖细胞的体外扩增体系 | |
JPH09501324A (ja) | 細胞保持用の溝を備えた貫流バイオリアクター | |
CN1286970C (zh) | 由脐血cd34+细胞体外诱导生成巨核细胞的方法 | |
WO2005071064A1 (ja) | 造血幹細胞及び造血前駆細胞の増幅方法 | |
US20030022363A1 (en) | Device and a process for expansion of haemopoeitic stem cells for therapeutic use | |
KR20050042046A (ko) | 조혈 줄기세포의 증식방법 | |
CN101182488A (zh) | 间充质干细胞的一种新用途 | |
Engelhardt et al. | Hematopoietic recovery of ex vivo perfusion culture expanded bone marrow and unexpanded peripheral blood progenitors after myeloablative chemotherapy | |
CN101063110B (zh) | 成体干细胞的培养基和培养方法 | |
EP1743024B1 (en) | Method of expanding cord blood cells | |
CN108456658A (zh) | 促进造血干细胞扩增并抑制其分化的化合物及细胞因子组合物 | |
US9206389B2 (en) | Culture for expanding stem cells ex-vivo | |
CA2219869A1 (en) | Human cd-34 hematopoietic stem cells | |
Wu et al. | Optimization of culture conditions to enhance transfection of human CD34+ cells by electroporation | |
WO2022143675A1 (zh) | 用于扩增并维持HSCs自我更新能力和分化潜能的培养基组合物及其应用 | |
Ogawa et al. | In vitro expansion of hematopoietic stem cells | |
Moldenhauer et al. | Hematopoietic progenitor cells and interleukin-stimulated endothelium: expansion and differentiation of myeloid precursors | |
CN104498435B (zh) | 一种原代b细胞急性淋系白血病细胞的体外培养方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190222 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |