CN104498435B - 一种原代b细胞急性淋系白血病细胞的体外培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种原代B细胞急性淋系白血病细胞的体外培养方法。本发明将原代B‑ALL细胞与OP9细胞共培养，可维持原代B‑ALL细胞的存活率和增殖，并极大程度上缓解B‑ALL细胞的分化和衰老。本发明所述培养方法培养的原代B‑ALL细胞可增殖，且细胞状态良好，充分体现了肿瘤细胞的异质性。本发明所述方法操作简单，方便、经济，具有良好的应用前景。

Description

一种原代B细胞急性淋系白血病细胞的体外培养方法

技术领域

本发明涉及生物领域，特别涉及一种原代B细胞急性淋系白血病细胞的体外培养方法。

背景技术

B细胞急性淋系白血病(B-ALL，B-cell acute lymphoblastic leukemia)，也称为前体B细胞(pre B-cell)急性淋巴细胞白血病，是来源于B细胞祖细胞的恶性肿瘤。B-ALL主要为儿童高发性癌症，在成人发病率下降。在B-ALL未成年患者中预后好，长期存活率(EFS，event-free survival)可达90％，但在B-ALL成人中却是预后差、低生存率。另外在成年B-ALL患者中，传统的化疗的效果差，死亡率约为60％。因此，针对B-ALL，需要研发新的有效治疗方法。

迄今为止，B-ALL相关研究主要依赖于B-ALL细胞系，而细胞系在长期传代培养的过程中，对高浓度血清的非人体环境中逐渐适应，并形成了一些区别于原代肿瘤细胞的基因突变和细胞特性(如高表达p53突变)。尽管病人来源的B-ALL样本细胞可以通过异种移植入免疫缺陷小鼠中扩大增殖后，进行体内实验，然而体内研究花费高、耗时长，特别是对于新型治疗方法或药物筛选实验，耗费的人力物力是不可预估的。

目前已发表了一些原代B-ALL细胞体外培养的相关报道，如利用人细胞因子SCF、IL-3、IL-7和FLT-3L等刺激培养，或利用正常人骨髓内皮细胞系(HBME，human bone marrowendothelial cells)或人骨髓基质细胞(MSC，human marrow stromal cell)等进行共培养，但培养成功率低，且结果重复性差。

综上所述，现有技术利用B-ALL细胞系进行肿瘤研究不能真实模拟肿瘤的异质性、无法满足随着药物使用而突变的肿瘤的治疗需求；而原代B-ALL细胞的体外培养仍处于不成熟阶段，大部分肿瘤细胞样本因无法适应体内外环境的转变而快速凋亡(2周内)，而可在成功体外长期培养的肿瘤细胞样本比率不高。因此，亟需开发稳定而有效的原代B-ALL体外培养方法，实现在病人原代肿瘤细胞进行直接、精确的实验和分析，促进B-ALL相关疾病机制研究和新型治疗手段研发进展。

发明内容

本发明旨在提供一种成熟、简便的原代B-ALL细胞的体外培养方法，为B-ALL的疾病机制研究、治疗药物的筛选及药效评估提供一个快速、经济、重复性高的体外模型。

本发明利用OP9细胞系，一种小鼠骨髓来源的胚胎间充质干细胞系，与B细胞急性淋系白血病病人来源的原代B-ALL细胞共培养，使原代B-ALL细胞可在体外增殖并长期存活。

本发明所述培养方法是一种有效、简便、利于推广的病人来源的原代B细胞急性淋系白血病(B-ALL，B-cell acute lymphoblastic leukemia)细胞的体外长期培养方法。本发明所述病人来源的原代B-ALL细胞的体外培养方法，可用于研究B-ALL相关的特殊基因突变、染色体重排、DNA或染色体甲基化的表观遗传变化、药物耐药性、细胞标志的表达和功能、免疫原性、细胞周期和凋亡机制、治疗药物敏感性等。同时还可用于探索B-ALL的疾病起始、B-ALL细胞分化等。

实验证实，B-ALL体外培养7天后，对照组仅B-ALL已基本没有存活或状态良好的B-ALL细胞，而OP9共培养组中，还有大量的状态良好的具有完整圆形形态的B-ALL细胞，且B-ALL细胞呈现增殖状态，成团聚集并粘附于OP9细胞表面。

在对照培养的条件下，B-ALL细胞7天后已几乎全部死亡，而与OP9共培养的B-ALL细胞则不断增殖，3周后平均可增殖6倍。与OP9共培养，可维持原代B-ALL细胞的存活率和增殖，并极大程度上缓解B-ALL细胞的分化和衰老。

作为优选，所述原代B-ALL细胞来源于B细胞急性淋系白血病病人，更优选的，来源于B细胞急性淋系白血病病人骨髓。

所述OP9细胞悬液种板长满即为OP9基质细胞培养板，所述OP9基质细胞培养板为将稀释至0.5-2×105/mL的OP9细胞在OP9培养基培养下在培养板长满；加入0.5-2×106/mL的B-ALL细胞悬液，使B-ALL细胞与OP9细胞充分接触。

共培养对培养基的耗费十分快，需要每两天进行半换液(如用500ul移液器沿培养液面轻轻吸出500ul培养基后，加入500ul新鲜培养基)；须根据OP9基质细胞的状态和密度更换新鲜OP9基质细胞培养板；每天需对培养细胞状态、密度和培养基颜色进行观察，以便及时对培养情况作出相应处理方法，密切观察更换新鲜的OP9基质细胞培养板。

现有的B-ALL细胞系一般为单克隆或已适应体外环境的克隆，与原代B-ALL细胞有着极大的差异，在发起癌症B-ALL、病灶转移和治疗逃逸中都无法真实反映原代B-ALL的特性；相对于现有技术中的B-ALL细胞系体外培养模型，本发明提供的原代B-ALL细胞体外培养方法长期培养充分体现了肿瘤细胞的异质性；且本发明所述B-ALL细胞系体外培养方法可真实反映肿瘤干细胞对免疫治疗、药物治疗等的适应突变和逃逸作用。

相对于现有技术中的其它原代B-ALL细胞的体外培养方法，本发明所述培养方法，有以下优点：

a)成功率更高，可达44％，更适应原代B-ALL细胞的培养；

b)培养时间更长，最长可达6个月；

c)培养效果更好，在培养过程中，原代B-ALL细胞数量可增殖6倍，且细胞状态良好；

d)本发明相对于现有技术的如细胞因子培养、病人骨髓间充质细胞共培养而言，操作更加简单方便、经济，利于本发明的应用推广。

术语与定义

肿瘤异质性：是指肿瘤在生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变，从而使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。

附图说明

图1为通过显徼镜观察到B-ALL在OP9组、对照组两种条件下，B-ALL的体外生长和增殖的情况。

图2为记录B-ALL细胞在OP9组、对照组两种培养条件下，每七天进行的B-ALL细胞计数结果。

图3为通过显徼镜观察到B-ALL细胞与OP9共培养后0天、7天、1个月、2个月、3个月的细胞状态图。

图4为与OP9共培养的B-ALL流式分析结果图。

具体实施方式

本发明公开了一种原代B细胞急性淋系白血病细胞的体外培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

需要说明的是，本专利中涉及到的原代B-ALL细胞来源于B细胞急性淋系白血病病人、优选来源于B细胞急性淋系白血病病人骨髓是通过中华骨髓库、血液库中获得的样本。

实施例1：

1.OP9细胞系的培养

OP9培养基：αMEM培养基(HyClone，Thermo Scientific，MA，USA)，20％胎牛血清(Gibco，Life Technologies，NY，USA)，2mM L-glutamine，100U/ml penicillin，and100ug/ml streptomycin。

细胞传代(贴壁)：

1)细胞培养和维持在T75培养皿中，首先用巴氏吸管吸出培养液，用2ml PBS清洗一遍；

2)加入2.0-3.0mL 0.25％(w/v)胰蛋白酶-0.53mM EDTA溶液孵育5-15分钟，直到显徼镜下观察到细胞层飘起分散；

注意：为了避免细胞成团，在等待细胞分离时，勿摇动烧瓶。细胞难以分离，可以放置在37℃，便于胰蛋白酶催化。

3)加入6.0-8.0mL培养基，用巴氏吸管轻轻吹散细胞；

4)用巴氏吸管将细胞悬液转移至15mL离心管，125xg离心5-10分钟，去除上清；

5)用新鲜培养基重悬细胞，加入适当的细胞悬液进入新的培养皿(传代比例为1∶4或1∶5)，加入新鲜培养基至适当体积；

6)置于37℃、湿度95％、5％CO₂培养箱中培养，每2-3天更换一次培养基。

注意：细胞密度对细胞的状态非常重要。如果细胞传代比率太低，细胞会长得很慢，甚至无法长满，状态会受到影响。另外，培养时间过长，细胞密度过大，会出现非常大的细胞，这些细胞的出现往往是一个警告标志“OP9细胞不利于作为支持造血细胞的基质”。所以，在OP9细胞必须在长满之前传代。

OP9细胞种板：

1)根据细胞传代步骤将OP9细胞用胰蛋白酶分离为单细胞悬液(细胞传代步骤5)后，加入适当培养基进行稀释后，细胞计数；

2)根据细胞计数结果，将OP9细胞悬液稀释至1×10⁵/mL，并将细胞种于24孔板中，每孔加入500ul细胞悬液；

3)种板后，轻轻将细胞摇匀，使其均匀铺于培养皿中；

4)置于37℃、湿度95％、5％CO₂培养箱中培养。

实施例2：B-ALL样本的处理

1)将B-ALL病人骨髓样本与生理盐水等比例混合；

2)在新的15mL离心管中加入稀释后血液体积二分之一的淋巴分离液(Lymphoprep，StemCell Technologies)；

3)将稀释后的血液沿离心管壁缓缓叠加于分层液面上，注意保持液面的清晰；

4)轻轻将骨髓样本混合物离心管放入离心机，800g/min离心20min；

5)轻轻取出离心管，骨髓样本混合物分层，用巴氏吸管小心吸取中间云雾层细胞置于新的15mL离心管；

6)用无血清αMEM培养基或PBS清洗两次，分离出的细胞用培养基重悬作为备用样本细胞；

实施例3：原代B-ALL共培养

B-ALL培养基：IMDM培养基(HyClone，Thermo Scientific，MA，USA)，10％胎牛血清(Gibco，Life Technologies，NY，USA)，2mM L-glutamine 100U/ml penicillin，and100ug/ml streptomycin；

1)在备用样本细胞稀释加入适当B-ALL培养基稀释后，进行细胞计数；

2)根据细胞计数结果将备用样本细胞稀释至1×10⁶/mL；

3)将种于24孔板的OP9细胞培养基吸出，用B-ALL培养基清洗一遍；

4)将2)中1×10⁶/mL的样本细胞加入3)的24孔板中，每孔加入500ul；

5)种板后，轻轻将细胞摇匀，使其均匀铺于OP9基质细胞上，与其充分接触；

6)置于37℃、湿度95％、5％CO₂培养箱中培养。

注意：共培养对培养基的耗费十分快，需要每两天进行半换液(用500ul移液器沿培养液面轻轻吸出500ul培养基后，加入500ul新鲜培养基)；须根据OP9基质细胞的状态和密度更换新鲜OP9基质细胞培养板；每天需对培养细胞状态、密度和培养基颜色进行观察，以便及时对培养情况作出相应处理方法。

2.共培养观察

细胞状态观察：通过每天观察共培养的B-ALL细胞的大小、形态、增殖等情况。

细胞计数：共培养后每7天换新鲜OP9基质板的时候，将共培养的B-ALL细胞轻轻吹起，300g离心5分钟，加入适量培养基重悬，进行细胞计数。观察结果见图1-4。

图1为通过显徼镜观察到B-ALL在OP9组(与OP9共培养)、对照组(仅B-ALL培养基培养)两种条件下，B-ALL的体外生长和增殖的情况(图标为20uM)。由图1可知，B-ALL体外培养7天后，对照组中已基本没有存活或状态良好的B-ALL细胞，而OP9共培养组中，还有大量的状态良好(具有完整圆形形态)的B-ALL细胞，且B-ALL细胞呈现增殖状态(成团聚集并粘附于OP9细胞表面)。

图2为记录B-ALL细胞在OP9组(与OP9共培养)、对照组(仅B-ALL培养基培养)两种培养条件下，每七天进行的B-ALL细胞计数结果。由图可知，在对照组培养的条件下，B-ALL细胞7天后已几乎全部死亡，而与OP9共培养的B-ALL细胞则不断增殖，3周后平均可增殖6倍。

通过显徼镜观察到B-ALL细胞与OP9共培养后0天、7天、1个月、2个月、3个月的细胞状态图见图3(图标为20uM)。由图3可知，与OP9共培养的B-ALL细胞状态良好，且一直呈现增殖状态。

3.流式细胞分析：

流式细胞仪：FACSAria^TM II(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)

1)共培养每14天计数时，取1×10⁶B-ALL细胞于1.5mL，300xg离心5分钟；

2)PBS清洗一次，用100uL PBS重悬，加入1uL人CD45、1uL人CD34、1uL人CD38抗体(ebioscience，San Diego，USA)，置于4℃孵育30分钟；

(须同时准备四个对照补偿组：无孵育抗体组、单孵育人CD45组、单孵育人CD34组、单孵育人CD38组)

3)PBS清洗孵育细胞两次后，用300ul PBS重悬待分析；

结果见图4，流式细胞技术分析与OP9共培养0天、2周、4周、6周的B-ALL细胞的存活情况、CD34和CD38干细胞表面标志物的表达情况。由图4可知，与OP9共培养，可维持原代B-ALL细胞的存活率和增殖，并极大程度上缓解B-ALL细胞的分化和衰老。

实施例4：

获取的25例B-ALL病人的原代肿瘤样本，按照本发明所述体外培养方法分别与OP9细胞共培养的情况，结果见表1。

由表1可知，25例原代B-ALL样本中，有11例样本可在与OP9细胞共培养的条件下，进行体外长期培养，成功率达44％，平均培养时间为2.8个月，培养时间最长可达6个月。由于原代B-ALL样本存在个人机体差异、肿瘤突变位点差异、接受治疗程度差异等，导致B-ALL与OP9共培养结果的差异。本发明创造提供的方法相对于现有技术，在培养成功率、培养时长、细胞状态和分化衰老的缓解上都有巨大的改善。

表1

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种原代B细胞急性淋系白血病细胞的体外培养方法，其特征在于，将原代B-ALL细胞与OP9细胞共培养；

所述原代B-ALL细胞来源于B细胞急性淋系白血病病人骨髓；

所述共培养利用B-ALL培养基进行，所述B-ALL培养基成分包括：IMDM培养基、10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素。

2.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，OP9细胞悬液种板长满为OP9基质细胞培养板，加入0.5-2×10⁶/mL的B-ALL细胞悬液，使B-ALL细胞与OP9细胞充分接触。

3.根据权利要求1所述的体外培养方法，其特征在于，每两天进行半换液。

4.根据权利要求2或3所述的体外培养方法，其特征在于，密切观察更换新鲜的OP9基质细胞培养板。

5.根据权利要求2所述的体外培养方法，其特征在于，所述OP9基质细胞培养板为将稀释至0.5-2×10⁵/mL的OP9细胞在OP9培养基培养下在培养板长满，所述OP9培养基成分包括：αMEM培养基、20％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素。