CN101063110B - 成体干细胞的培养基和培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种成体干细胞的培养基，所述培养基包括GSK-3抑制剂和早期造血因子。所述培养基可提高成体干细胞的体外扩增能力，并维持其自我更新能力和分化潜能。本发明还提供了上述培养基在培养哺乳动物的成体干细胞中的应用和成体干细胞的培养方法。本发明具有操作简单，成本较低，易于控制的优点。

Description

成体干细胞的培养基和培养方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种成体干细胞的培养基和培养方法。

背景技术

近年来，造血干细胞移植(Haematopoietic stem cell transplantation，HSCT)已成为治疗血液系统恶性肿瘤、实体瘤、自身免疫系统疾病及某些基因缺陷疾病的重要手段，如白血病、系统性红斑狼疮、再生障碍性贫血、艾滋病等。异基因移植虽然相对来说疗效好，复发率低，但存在一定的供者来源限制，并易发生严重的移植物抗宿主病，死亡率高。虽然脐血干细胞移植具有来源丰富、抗原性弱、移植后并发症少等优点，但又存在数量不足的缺陷，造成了成人移植的限制。为得到治疗所需的细胞数量，许多科学家试图通过不同手段对HS/PCs进行规模化扩增。但是目前常用的方法扩增HS/PCs(Haematopoietic Stem/Progenitor Cells)的效率十分有限，而且HS/PCs在体外扩增的过程中自我更新能力下降并显示出分化的特征，导致其归巢和长期造血重建能力的降低，所以从根本上解决HSCT面临的供体严重短缺已成为亟待解决的问题。尽管人们已研究发现了很多扩增方法，如不同细胞因子的组合，基质滋养层支持等，可使细胞数量得到很大程度的扩增，但经历了数周甚至更长时间的液体扩增培养后，HS/PCs的临床应用价值尚值得商榷。

目前国内外采用不同细胞因子的组合方案所扩增的HS/PCs存在诸如扩增时间短、倍数低、扩增体系难于调控、扩增后细胞的自我更新能力及造血重建功能下降等问题，严重影响移植效果。如在使用FL(FMS-like tyrosine kinase 3 ligand，Flt3配体)、KL(Stem cell factor，c-KitLigand，干细胞因子)、TPO(Thrombopoietin，促血小板生成素)、IL-3(Interleukin-3，白细胞介素-3)、IL-6(Interleukin-6，白细胞介素-6)的组合对HS/PCs进行有效扩增的同时，随着液体培养时间的延长，尽管细胞数量得到了很大的扩增，但CD34⁺细胞所占的比例也逐渐的下降甚至消失，其自我更新能力会逐渐下降，HS/PCs也不可避免地发生了分化，最终也就丧失了其治疗效用。

从成本来看，细胞因子作为一种蛋白，它的诱导、表达、纯化均需耗费较大的精力和经济成本，且在储存过程中较易分解而失去活性。各种支持生长的滋养层细胞虽然不存在“降解”问题，但它们的获得相对较困难，且易发生交叉污染。所以寻找一种更经济、更简易、更安全的HS/PCs扩增方法是我们急需解决的问题。

不久前，美国洛克菲勒大学的科学家发现一种名为BIO(化学名为6-溴靛玉红-3′-肟)(Laurent Meijer，Alexios-Leandros Skaltsounis，Prokopios Magiatis，et al.GSK-3-selective inhibitors derived from Tyrian purple Indirubins.Chemistry & Biology.2003，10：1255-1266)的具有细胞通透性的小分子吲哚类化合物，它不仅能维持人与小鼠胚胎干细胞(human and mouse embryonic stem cells，HESCs和MESCs)的自我更新能力，而且维持了它们的分化潜能，即从形态和功能上都使胚胎干细胞保持了自身的“干细胞”特性(Noboru S，Laurent M，Leandros S.Maintenance of pluripotency in human and mouseembryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacologicalGSK-3-specific inhibitor.Nature medicine.2004，10(1)：55-63)。实验中人们发现，与阴性对照及MeBIO(BIO的对照药物，化学名为1-甲基-6-溴靛玉红-3′-肟)相比，2μM的BIO明显较好地保持了HESCs和MESCs的未分化形态，并使两者维持了向各个胚系分化的潜能，而且BIO上述作用的发挥是通过激活胚胎干细胞内的Wnt信号途径而实现的。Wnt信号是普遍存在于动物细胞内一条与生长发育及某些疾病的发生发展密切相关的信号途径。另外，根据文献报道，KL(c-Kit Ligand，stem cell factor，干细胞因子)联合Wnt重组蛋白(Wnt信号通路的胞外配体，可激活Wnt信号)可较好地促进小鼠骨髓HSCs的扩增，并且大部分细胞仍处于未分化状态(Willert K，Brown J D，Danenberg E，et al.Wnt proteins arelipid-modified and can act as stem cell growth factors.Nature.2003，423(6938)：448-452)。

但是，BIO对人HS/PCs的Wnt信号途径是否有作用，并进一步影响其自我更新能力和分化潜能，目前尚无报导。

发明内容

本发明的第一个目的是提供BIO在成体干细胞培养中的新用途。

本发明的第二个目的是提供一种成体干细胞的培养方法。

本发明的第三个目的是通过一种新的培养基配方和本发明培养基在培养哺乳动物的成体干细胞中的应用。

本发明的第一方面，提供一种成体干细胞的培养基，所述培养基包括GSK-3抑制剂和早期造血因子。优选的，上述培养基还包括DMEM、IMDM或X-VIVO；在一优选例中，上述培养基的基本培养基为15％FBS的DMEM/F-12。优选的，培养成体干细胞时，上述GSK-3抑制剂的浓度为0.01-2μM；更佳的，上述GSK-3抑制剂的浓度为0.02-0.8μM；在一优选例中，上述GSK-3抑制剂浓度为0.2μM。

优选的，上述GSK-3抑制剂为式I所示的化合物：

式I

其中，X为H或卤族元素；Y为H或C1-C6烷基。优选的，Y选自甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷或己烷。

较佳的，上述化合物中，X为Cl、Br、I或F；Y为H或CH₃。在优选例中，上述GSK-3抑制剂为6-溴靛玉红-3’-肟，6-溴靛玉红-3’-丙酮肟或6-溴靛玉红-3’-甲基肟。在一优选例中，上述GSK-3抑制剂为6-溴靛玉红-3’-肟，其化学式为：

式II。

优选的，上述早期造血因子为干细胞因子、FL(Flt3配体)，促血小板生成素(TPO)，白介素-6(IL-6)，白介素-11(IL-11)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、单巨噬细胞集落刺激因子、促红细胞生成素(EPO)、巨核细胞生长核发育因子或者能分泌各种细胞因子的基质细胞。较佳的，上述早期造血因子的浓度为1-30ng/ml；更佳的，上述早期造血因子的浓度为10-20ng/ml。在一优选例中，上述早期造血因子为干细胞因子。优选的，上述培养基还包括1-3种不同种的早期造血因子。在一优选例中，上述培养基还包括IL-6、人脐血基质细胞或人骨髓基质细胞等。

优选的，上述成体干细胞具有自我更新能力和分化潜能。

优选的，上述成体干细胞来源于人体。较佳的，上述成体干细胞为造血干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞或表皮干细胞。更佳的，上述成体干细胞为造血干细胞或骨髓间充质干细胞。

在一优选例中，上述成体干细胞来源于人体。

本发明的第二方面，提供了上述培养基在培养哺乳动物的成体干细胞中的应用。在一优选例中，上述哺乳动物为人。在一优选例中，上述成体干细胞为造血干细胞；在另一优选例中，上述成体干细胞为骨髓间充质干细胞。

优选的，上述成体干细胞具有自我更新能力和分化潜能。

在一优选例中，上述培养基中GSK-3抑制剂为6-溴靛玉红-3’-肟；早期造血因子为干细胞因子。

本发明的第三方面，提供培养哺乳动物的成体干细胞的培养方法，所述培养方法为在培养成体干细胞时，在适合于成体干细胞扩增的基本培养基中添加GSK-3抑制剂和早期造血因子。优选的，上述基本培养基为IMDM、X-VIVO或DMEM培养基。在一优选例中，上述培养基为15％FBS的DMEM/F-12。

优选的，上述GSK-3抑制剂为式I所示的化合物，其中，X为H或卤族元素；Y为H或C1-C6烷基。

较佳的，上述化合物中，X为Cl、Br、I或F；Y为H或CH₃。在优选例中，上述GSK-3抑制剂为6-溴靛玉红-3’-肟，6-溴靛玉红-3’-丙酮肟或6-溴靛玉红-3’-甲基肟。在一优选例中，上述GSK-3抑制剂为6-溴靛玉红-3’-肟。

优选的，上述早期造血因子为干细胞因子、FL，促血小板生成素，白介素-6，白介素-11，粒细胞集落刺激因子、单巨噬细胞集落刺激因子、促红细胞生成素、巨核细胞生长和发育因子或者能分泌各种细胞因子的基质细胞。较佳的，上述早期造血因子的浓度为1-30ng/ml；更佳的，上述早期造血因子的浓度为10-20ng/ml。在优选例中，上述早期造血因子为干细胞因子。

优选的，上述成体干细胞具有自我更新能力和分化潜能。

优选的，上述成体干细胞来源于人体。较佳的，上述成体干细胞为造血干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞或表皮干细胞。更佳的，上述成体干细胞为造血干细胞或骨髓间充质干细胞。

优选的，上述GSK-3抑制剂浓度为0.01-2μM；上述早期造血因子的浓度为1-30ng/ml。较佳的，上述GSK-3抑制剂浓度为0.02-2μM；上述早期造血因子的浓度为10-20ng/ml。更佳的，上述GSK-3抑制剂浓度为0.02-0.8μM。

在一优选例中，GSK-3抑制剂浓度为0.2μM；上述早期造血因子的浓度为10ng/ml。

在一优选例中，上述GSK-3抑制剂为6-溴靛玉红-3’-肟；上述早期造血因子为干细胞因子。

优选的，本领域技术人员可以根据成体干细胞的具体类型，在培养成体干细胞时，除了加入适当浓度的GSK-3抑制剂和KL外，还可以添加1-3种早期造血因子。

优选的，上述早期造血因子为干细胞因子、FL，促血小板生成素，白介素-6，白介素-11，粒细胞集落刺激因子、单巨噬细胞集落刺激因子、促红细胞生成素、巨核细胞生长和发育因子或者能分泌各种细胞因子的基质细胞。优选的，所述基质细胞为人脐血基质细胞或人骨髓基质细胞等。

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，它的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。根据其发育阶段，干细胞可分为胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell)和成体干细胞(Adult Stem Cell)。前者是最为原始的干细胞类型，也称全能干细胞，它可以无限增殖并分化成为个体的任意一种细胞类型，从而进一步形成任何组织或器官，最终发育成一个完整的个体。受精卵就是一个最初始的全能干细胞，它在发育过程中不断分化，在前几个阶段可以分化出许多全能干细胞，再经过进一步分化就可形成各种成体干细胞，即多能干细胞。这类细胞具有分化为某些特定组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。它们包括很多类型，如造血干细胞(Hematopoietic Stem Cells，HSCs)、神经干细胞(Neural Stem Cells，NSCs)、骨髓间充质干细胞(Mesen chymal Stem Cells，MSCs)，表皮干细胞(EPidexmis StemCells)等。

HSCs作为一种成体干细胞，它是最原始的造血细胞，具有自我更新能力及较强的分化发育和再生能力，可以产生各种类型血细胞的始祖细胞，并进一步分化为成熟血细胞以不断满足个体的血细胞需求，维持骨髓与外周的造血平衡。HSCs有两个重要特征：其一，高度的自我更新或自我复制能力；其二，可分化成所有类型的血细胞。它采用不对称的分裂方式：由一个细胞分裂为两个细胞。其中一个细胞仍然保持干细胞的一切生物特性，从而保持身体内干细胞数量相对稳定，这就是干细胞自我更新。而另一个则进一步增殖分化为各系血细胞的前体细胞，即造血祖细胞(Haematopoietic progenitor cells，HPCs)，根据发育的早晚又可分为早期和晚期祖细胞。此类细胞只能发育分化为某一特定血系的血细胞，如红系祖细胞只能发育为红细胞。各类祖细胞再定向增殖为各种成熟血细胞，如白细胞、血小板等，进而释放到外周血中，执行各自任务，直至衰老死亡，这一过程是不停地进行着的。

白细胞表面分化抗原CD34分子选择性地表达于HSCs和HPCs，但随着细胞分化程度的增高其表达逐渐降低，等到成熟时血细胞便不表达CD34。实际上，经通常的磁性分选得到的CD34⁺细胞中，90％以上是早期和晚期祖细胞，干细胞只是很小一部分，所以我们通常将分离得到的CD34⁺细胞统称为HS/PCs(造血干/祖细胞)，它实际上是一个混合细胞群。虽然有报道称CD133才是HSCs面特异性标志，甚至有研究人员称CD34-细胞才是真正最原始的HSCs，但这些理论都存在着争议。实际上，目前还没有一种公认的表面标志可以将干细胞和祖细胞明确地区分开来。临床上，治疗时所谓的造血干细胞移植主要还是以CD34作为分选标志的，换句话说，它实际上是造血干/祖细胞的移植。作为实验室研究时，分选的基本方法是先利用淋巴细胞分离液Ficoll从骨髓或脐血、外周血中得到单个核细胞(mono-nuclear cells，MNC)，再经过免疫磁珠法(miniMACS)将CD34⁺细胞分选出来。

发明人通过联合应用BIO和KL作为条件对人脐血CD34⁺造血干/祖细胞进行液体培养以达到促进其自我更新和分化潜能的目的。

本发明是通过以下技术方案进行的：

在HS/PCs体外培养体系(DMEM/F-12，15％FBS)中加入BIO和/或KL，在分别培养了1.5天、2.5天、4.5天、6.5天后，对细胞进行显微镜计数、集落培养、CD34⁺％及细胞周期的检测，比较不同组之间的结果差异。再选择一个扩增效果较好的浓度(BIO)和时间点进行长期液体培养，并以MeBIO作为对照药物进行进一步的检测以验证细胞经药物作用后分化潜能的维持状况。由检测结果可以得到，与对照药物和单加KL相比，BIO与KL联合作用明显使HS/PCs数量得到了扩增，且在除去药物后细胞的分化潜能也较高。

上述结果表明，本发明可有效扩增HS/PCs数量并维持其分化增殖的潜能，不仅方法简便易行，且成本相对较低，对于解决临床HSCT所面临的细胞数量不足问题具有重要的意义。

由上述公开的技术方案可见，本发明对于有效解决HSCT面临的问题具有十分重要的意义：

BIO作为一种小分子化合物，不但性质稳定，而且其化学合成及制剂的制备过程均较简单。

首先，BIO与KL的联合作用不仅使HS/PCs和脊髓间质干细胞数量得到了扩增，且使其分化潜能也有所提高，对于提高临床移植成功率意义重大；

其次，与以往的扩增方法相比，BIO作为一种小分子化合物，制备简单，稳定性好，“保质期”长；

再次，扩增体系简单易行，且成本相对较低。

从本发明可以看到，KL联合BIO对HS/PCs作用2.5天后，虽然细胞的扩增倍数不如以往的扩增方法，但是细胞自身的自我更新能力维持得较好，集落形成能力还很强，这在一定程度上为HS/PCs成为具有临床应用价值的再生药物开辟了新的天地。

附图说明

图1、培养后的总细胞数、CD34⁺细胞数和经集落培养的CFC(colony forming cell，集落形成细胞数)：

d0，d1.5，d2.5，d4.5，d6.5分别表示对照和细胞经1.5天，2.5天，4.5天，6.5天培养；组别：1为KL(20ng/mL)；2为KL+BIO(2μM)；3为KL+BIO(0.2μM)；4为KL+BIO(0.02μM)。KL的浓度相同。

*表示各组的细胞数与相应时间点的对照组相比有显著性差异，

**表示各组的细胞数与相应时间点的对照组相比有极其显著性差异。

图2、经培养后人脐血造血细胞总数，CD34⁺细胞数及集落数变化：

组别：1为◆，KL(20ng/mL)；2为■，KL+BIO(2μM)；3为▲，KL+BIO(0.2μM)；4为×，BIO(0.02μM)。

各组培养2天，4天，6天后除去药物，继续以四种细胞因子组合(KL+TPO+FL+IL-3，10ng/mL)加以扩增培养。

BIO和/或KL作用2天的总细胞数；

BIO和/或KL作用2天的CD34⁺干/祖细胞数；

BIO和/或KL作用4天的总细胞数；

BIO和/或KL作用4天的CD34⁺干/祖细胞数；

BIO和/或KL作用6天的总细胞数；

BIO和/或KL作用6天的CD34⁺干/祖细胞数；

BIO和/或KL作用2天的CFC数；

BIO和/或KL作用4天的CFC数；

BIO和/或KL作用6天的CFC数。

图3、经培养后人脐血造血细胞总数，CD34⁺细胞数及集落数变化：

组别：1为◆，KL(20ng/mL)；2为■，KL+BIO(0.2μM)；3为▲，KL+MeBIO(0.2μM)4为×，BIO(0.2μM)。

每组均在各自相应的条件下培养2.5天，然后继续以四种细胞因子组合(KL+TPO+FL+IL-3，浓度均为10ng/mL)加以扩增培养，期间进行各项指标的检测以验证经扩增培养后细胞的增殖分化潜能。

(A)各组培养2.5天后的总细胞数

(B)各组培养2.5天后的CFC数

(C)各组在KL+TPO+FL+IL-3(10ng/mL)条件下培养后的累积总细胞数

(D)各组在KL+TPO+FL+IL-3(10ng/mL)条件下培养后的累积CD34⁺干/祖细胞数

(E)各组在KL+TPO+FL+IL-3(10ng/mL)条件下培养后的累积CFC数

图4、BIO及MeBIO的合成过程

数字表示不同化合物：1为间溴苯胺；2为N-(肟基乙酰)间溴苯胺；3为6-溴吲哚满二酮；4为4-溴吲哚满二酮；5为6-溴靛玉红；6为6-溴靛玉红-3′-肟；7为6-溴-1-甲基吲哚满二酮；8为1-甲基-6-溴靛玉红；9为1-甲基-6-溴靛玉红-3′-肟。

小写英文字母表示不同的试剂和实验条件，具体内容见实施例1。

图5、集落培养中各个器皿的放置图示

上方的小培养皿为水盘，内加灭菌双蒸水，不加盖；下方二个小培养皿，内有集落培养细胞，加盖。三个小培养皿放在大培养皿中，加盖。

图6、CD34表达百分率变化

组别：1为◆，KL(20ng/mL)；2为■，KL+BIO(2μM)；3为▲，KL+BIO(0.2μM)；4为×，BIO(0.02μM)。

图7、正常小鼠骨髓MSCs在BIO作用后的状态

A、正常小鼠骨髓MSCs在1μM BIO作用3天后的状态(细胞生长状态尚可，但不如2μM)；

B、正常小鼠骨髓MSCs在2μM BIO作用3天后的状态(细胞生长较旺盛)；

C、正常小鼠骨髓MSCs在5μM BIO作用3天后的状态(高浓度明显产生毒性，细胞形态变小并不再贴壁)。

具体实施方式

本发明“干细胞”包括干细胞和祖细胞。本发明中造血干/祖细胞，HSCs，HPCs或HS/PCs是指能自我更新、有较强分化发育和再生能力、可以产生各种类型血细胞的始祖细胞。

本发明培养基可在各种干细胞培养基的基础上(本发明称为“基本培养基”)添加GSK-3抑制剂和早期造血因子。基本培养基为15％FBS的DMEM/F-12或者所有可以用于培养干细胞特别是成体干细胞的基础培养基，如IMDM和X-VIVO培养基。

所述GSK-3抑制剂为式I所示的化合物及其具有抑制GSK-3作用的式I所示的化合物的衍生物。如6-溴靛玉红-3’-肟，6-溴靛玉红-3’-丙酮肟或6-溴靛玉红-3’-甲基肟均作为本发明优选的化合物。BIO对GSK-3的选择性抑制在于其结构中1位氮(N)、6位的溴(Br)、3’位肟(＝N-OH)这几个关键位点与GSK-3的特异性结合。而这三个位点中，1位H如用CH3或其他烷基取代则会降低化合物的水溶性，从而导致其易从液体培养基(DMEM/F-12，水溶性)中析出而无法发挥作用。6位可利用氯(Cl)等其他卤族元素进行取代，如无取代(即为H)则化合物与GSK的结合作用有所降低。3’位(Z)肟基是非常关键的，如换为羰基(＝O)则作用大大降低。所以GSK-3抑制剂的关键母核结构如式I所示，其中X可为H或卤族元素，但卤素取代更好，Y可为H或C1-C6烷基。MeBIO虽然结构与BIO相似，但是由于1位H被CH3替代，其水溶性降低，因此易从液体培养基中析出而无法发挥作用。另一方面，从理论上分析，由于三个关键位点之一(1位H)被取代，与GSK-3的结合力也降低，选择性也随之降低。

所述早期造血因子为干细胞因子、FL(Flt3配体)，促血小板生成素，白介素-6，白介素-11，粒细胞集落刺激因子、单巨噬细胞集落刺激因子、促红细胞生成素、巨核细胞生长和发育因子或者能分泌各种细胞因子的基质细胞。较佳的，上述早期造血因子的浓度为1-30ng/ml；更佳的，上述早期造血因子的浓度为10-20ng/ml。在优选例中，上述早期造血因子为干细胞因子。为了提高扩增培养的效果，本领域技术人员还可以在本发明基础上添加1-3种上述早期造血因子或者骨髓基质细胞(如骨髓间充质干细胞或人脐血基质细胞)，或者增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸来促进成体干细胞的扩增。

KL，TPO，FL及G-CSF(Granulocyte colony-stimulating factor，粒细胞集落刺激因子)是促进HSCs增殖的重要细胞因子。前三者主要作用于原始的HSCs(Piacibello W，SanavioF，Garetto L，et al.Differentiai growth factor requirement of primitive cord bloodhematopoietic stem cell for self-renewal and amplication vs proliferation anddifferentiation[J].Leukemia.1998，12：718-727.Kanai M，Sato N，Fukazawa K，et al.Serum-free coculture system for ex vivo expansion of human cord blood primitiveprogenitors and SCID mouse-reconstituting cells using human bone marrow primarystromal[J].Exp Hematol.2001，29：174-182)，在无血清培养液中加入此组合，可实现脐血MNC CD34⁺CD38^-细胞选择性扩增，体外培养显示其仍具有多系分化潜能。也有在此基础上加IL-3+IL-6在有血清培养基条件下培养，移植入NOD-SCID(non obese diabetic-severecombined immunodeficient，非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)鼠后仍可维持其造血重建能力。

有报道证实(黄海雯，傅晋翔，李军，於葛华，陈萍，张学光.可溶性CD40L联合其他造血细胞生长因子体外扩增人脐血CD34⁺细胞.中华器官移植杂志.2005，26(6)，360-362)，sCD40L与KL、IL-3、EPO(Erythropoietin，促红细胞生成素)、GM-CSF(Granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor，粒单巨噬细胞集落刺激因子)联合应用，对人脐血HSCs的体外扩增更为有效。sCD40L能显著增强后者对脐血HSCs总数和CD34⁺细胞的扩增作用，并能促进造血集落，尤其是CFU-GM(colony forming unit granulocyte-macrophage，粒细胞-巨噬细胞集落形成单位)的形成。在KL+IL-3+IL-6+G-CSF+GM-CSF+EPO组合的条件下，总细胞、CD34⁺、CD38^-均有不同程度的扩增，而扩增后Th(T helper cell，辅助性T细胞)、Ts(T suppresser cell，辅助性T细胞)均有不同程度的下降，其中Th细胞下降幅度大于Ts细胞，这将进一步降低脐血的免疫活性，减少移植中GVHD(graft-versus-host disease，移植物抗宿主病)的发生。另外，也有在细胞因子组合中加入MGDF(megakaryocytes growthdevelopment factor，巨核细胞生长和发育因子)(Kobari L，Giarratana MC，Poloni A，etal.Flt 3 ligand，MGDF，Epo and G-CSF enhance ex vivo expansion of hematopoietic cellcompartments in the presence of SCF，IL-3 and IL-6.Bone Marrow Transplant.1998，21：759-767)，可获得较好的扩增效果。

影响HSCs扩增的主要因素除了细胞因子及培养基中有无血清外，还有其他很多因素，如基质细胞层、培养装置等。

脐血HSCT造血恢复延迟的原因除CD34⁺细胞绝对值较低以外，患者造血微环境的损伤也影响HSCs植入(Koc O N，Gerson S L，Cooper B W，et al.Rapid hematopoietic recoveryafter coinfusion of autologous blood stem cell and culture-expanded marrowmesenchymal stem cells in advanced breast cancer patient s receiving high-dosechemotherapy.J Clin Oncol.2000，18：307-316)。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcell，MSC)作为造血微环境主要细胞成分基质细胞的前体细胞，可以分泌与HSCs生长发育相关的黏附分子、细胞外基质和多种细胞因子，为HSCs体外扩增提供适宜的微环境，对造血干/祖细胞的增殖、归巢和凋亡起重要调控作用，与脐血共移植可能促进其早期植活，可以作为脐血HSCT的临床辅助治疗手段。

许多研究已经表明，在骨髓基质细胞支持下协同因子作用的培养体系比单用因子组合有更好的扩增造血干/祖细胞的效果，是比较理想的脐血祖细胞体外扩增体系。因为骨髓造血微环境是造血细胞生长、分化和发育的场所，骨髓基质细胞是其中的重要有形成分，造血微环境的造血调控作用是通过骨髓基质细胞和胞外基质成分与造血细胞的密切接触以及各类造血调控因子来实现的。骨髓基质细胞可合成分泌多种细胞黏附因子，包括胞间粘连分子(intercellular adhesion molecule，ICAM)、血管细胞粘连分子(vascular cell adhesionmolecule，VCAM)、血小板内皮细胞粘连分子(platelet endothelial cell adhesion molecule，PECAM)等。还可以稳定表达IL-1、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、G-CSF、GM-CSF等造血调控因子及多种趋化因子。  因此，对体内造血微环境的模拟对于探索体外扩增造血细胞的新方法尤为重要。有实验结果表明，在MSC和早期造血因子共同作用下，脐血有核细胞、CD34⁺和CD34⁺CD38^-细胞、CFU-GM、BFU-E(burst-forming units-erythroid，红系集落形成单位)和CFU-GEMM(colony-forming unit-granulocyte/erythroid/macrophage/megakaryocyte，混合集落形成单位)扩增倍数显著高于单纯用细胞因子扩增组，并且CD34⁺细胞表面与归巢和植入密切相关的黏附分子和淋巴细胞功能相关抗原-1(Lymphocyte function associatedantigen-1，LFA-1)的表达与扩增之前相比无显著改变。在扩增中随细胞数的增加CD34⁺细胞比例逐渐下降，但CD34⁺细胞群中CD38-和HLA-DR(human leukocyte antigen DR，人类白细胞DR抗原)-细胞比例却较扩增前增高，说明MSC不但可以促进HSC的快速增殖和成熟，还可能有助于维持HSC的自我更新和干细胞池的扩增。还有研究表明，采用MSC联合KL、TPO和FL三种细胞因子对脐血CD34⁺细胞进行短期体外扩增，有助于抑制HSC分化并保持其造血重建潜能和归巢能力。另外，hSCF+rhG-CSF+rhMDGF(monocyte/macrophage-derived growthfactor，巨噬细胞生长因子)+人骨髓间充质干细胞组合的共培养法显著提高了造血干/祖细胞的扩增倍数，并且有利于造血干/祖细胞的自我更新和提高细胞集落形成能力。

脐血MSCs具有类似于成体骨髓MSCs的特征，对HSCs增殖有明显的支持作用，不仅能扩增更原始的造血干/祖细胞，且能在短期内(12d)保持HSCs不耗竭，但对脐血CD34⁺细胞向定向祖细胞的扩增，主要为髓系及巨核系，而对其向淋巴系的扩增具有抑制作用。从脐血中培养出的纤维状贴壁细胞也具有骨髓间充质干细胞的特性，在适当的条件下可形成饲养层细胞，为造血干/祖细胞体外扩增提供支持基质细胞。HUCBSCs(human umbilical cord bloodstromal cells，人脐血基质细胞)具有体外支持造血作用，与细胞因子联合对促进脐血CD34⁺细胞扩增更加明显。另外，胚胎骨髓基质细胞联合外源性细胞因子不仅可以支持脐血MNC的有效扩增，而且扩增后与趋化作用和粘附作用相关的造血细胞亦较扩增前明显增加。

已有研究表明(Furukawa Y，Kikuchi J，Nakamura M，et al.Lineage-specificregulation of cell cycle cont rol gene expression during haematopoietic elldifferentiation.Br J Haematol.2000，110：663-673.Dombkowski D M，Zhang J L，Scadden D T.Ex vivo targeting of p21 Cip1/Waf1 permit s relative expansion of humanhematopoietic stem cells.Blood.2003，102：1260-1266)，HSCs增殖分化过程不但受控于细胞因子，同时与细胞周期调控因子密切相关。增殖细胞核抗原(Proliferating Cell nuclearAntigen，PCNA)是重要的细胞周期调控蛋白，是促进细胞从G1期进入S期的关键因素。实验表明(张冬清，吴映娥，罗丽莉，等.增殖细胞核抗原在脐血CD34⁺造血干/祖细胞中的表达及意义.广东医学.2004，25(9)：1014-1016)，新鲜分离的脐血CD34⁺细胞仅表达低水平的PCNA活性，使绝大多数的造血干/祖细胞处于G0/G1期。通过反义核酸技术调控PCNA在脐血CD34⁺细胞体外扩增中的表达，在脐血CD34⁺细胞体外扩增的同时，加入低浓度的PCNA-ASODN(PCNA Antisense oligodeoxynuclecotide，增殖细胞核抗原反义寡脱氧核苷酸)，减少了CD34⁺细胞在扩增过程中PCNA的表达，减缓了扩增过程中细胞的分化。另外，其他细胞周期调节蛋白，如CDK(cyclin-dependent kinase，细胞周期素依赖性激酶)-2、CDK-4、Cyclin(细胞周期蛋白)-D、Cyclin-A、hHus1、hRad9、p21等，也通过和PCNA相互作用而影响细胞周期的进程。

脐血干/祖细胞是个不均一的细胞群体，可以通过自分泌转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等负调控因子使绝大多数干/祖细胞处于静止期(G0期)。TGF-β可由祖细胞自分泌产生，能选择性作用于较原始的造血祖细胞，使绝大多数干/祖细胞处于G0期，而各种生长因子(如KL、IL-6、IL-3、G-CSF与EPO等)并不能阻断其抑制作用。以此为基础，在脐血祖细胞体外扩增过程中加入抗TGF-β抗体可促使CD34⁺细胞进入细胞增殖周期。Bartard等(B atard P，M onierMN，FortunelN，et al.TGF β(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycleand induces CD34 antigen up-modulation.J Cell Sci.2000，113：383-390)人的研究表明，在造血祖细胞体外培养中，阻断自体分泌的内源性TGF-β1，可激发未分化的高增殖潜能祖细胞进入细胞周期。Larsson等(L arsson J，B lank U，Helgadottir H，et al.TGF-betasignaling-deficient hematopoietic stem cells have normal self-renew al andregenerative ability in vivo desp ite increased p roliferative capacity in vitro.Blood.2003，102：3129-3135)通过对TGF-βI型受体基因敲除小鼠的研究指出，在体外环境中，其造血干细胞的增殖能力在低刺激条件下即得到了明显增强。这一结果相当于抗TGF-β抗体中和作用的结果，即抗TGF-β抗体可以促进造血干细胞增殖。

尽管应用抗TGF-β抗体力求扩增脐血CD34⁺细胞，但结果并不是太理想。赵声明等(赵声明，顾惜春，常乃柏，等.JA K转基因骨髓造血干/祖细胞体外长期扩增调控及定向分化的研究.中华血液学杂志.2004，25：65-69)利用基因调控表达技术，克隆构建了一个MSCV-based逆转录病毒载体，内含有酪氨酸激酶JAK2的功能信号区域和两个可以结合小分子二聚化化学诱导物(AP20187)而引起JAK2二聚化的结合位点蛋白(F36V)。通过加入或停止AP20187和KL来启动或关闭细胞的信号传导通路，控制细胞生长，实现了小鼠骨髓造血祖细胞的长期大量扩增，并且扩增的细胞具有定向分化的潜能。这一研究为CD34⁺细胞的扩增提供了新的方法，值得进一步研究。

另外，如Wnt家族、Notch家族(K..Ohishi，N.Katayama，H.Shiku，et al.Notchsignalling in hematopoiesis.Seminars in Cell & Developmental Biology.2003，14：143-150.Milner LA，Bigas A.Notch as a mediator of cell fate determination inhematopoiesis：evidence and speculation.Blood.1999，93：2431-2448)及编码转录因子的HOXB4(Tanaka H，Matsumura I，Itoh K，et al.HOX decoy peptide enhances the exvivo expansion of human umbilical cord blood CD34⁺ hematopoietic stemcells/hematopoietic progenitor cells.Stem Cells.2006，24(11)：2592-602)家族也对HSCs的自我更新起着非常重要的作用。

本发明以联合应用BIO和KL作为条件对人脐血CD34⁺HS/PCs进行液体培养以达到促进其自我更新和分化潜能的目的。

为得到治疗所需的细胞数量，许多科学家试图通过不同手段对HS/PCs进行规模化扩增，包括基质(细胞)的支持，其他非造血细胞的支持，一些特殊基因表达的调控，不同细胞因子组合，细胞培养设备或扩增体系的改进等等，或其他一些方法。

在Noboru的实验中，浓度为2μM的BIO单独作用7天后较好地维持了HESCs和MESCs的多能性，这种效应是通过高选择性地直接地抑制胞内GSK-3而实现的。而在我们的实验中，BIO在这样的作用条件下却抑制了HS/PCs的生长和表面抗原(包括CD34，CD11b和CD14)的表达，这可能是对细胞有毒性的一种表现。即使在与KL联合作用的条件下，2μM BIO的高浓度还是不能促进细胞的增殖。经过三轮独立实验，我们得到，相比ESCs的2μM和7天20ng/mL的KL联合较低的浓度(0.2μM)的BIO经过较短的作用时间(2.5天)对HS/PCs的生长和功能维持得较好。同样是干细胞，为什么BIO对胚胎干细胞和造血干细胞作用的条件会有如此大大的差异呢？这可能是由于细胞发育状态的不同引起的。ESCs属于最原始的干细胞类型，而HS/PCs属于相对较成熟的成体干细胞，其可塑性要略逊于前者，这就可能导致两类细胞间Wnt途径的信号传导或转换的敏感度存在着差异，也可能是两者的信号功能有所不同，比如与胞内其他信号途径(如KL介导的信号途径)的相互作用等。根据Noboru的实验分析结果，尽管由BIO激活Wnt途径使ESCs保持了未分化状态，但除去此化合物后，细胞正常的分化程序还是会完全恢复的，也就是说BIO对ESCs的作用是可逆的，这就突出显示了ESCs的保守性。而在我们的实验中，HS/PCs经过BIO作用后仍然保持了形成CFC的能力，也即分化潜能，这在一定程度上说明了ESCs与HS/PCs间的Wnt信号途径存在差异。

CDKs在细胞周期的调控中起了非常重要的作用，在细胞的分裂、增殖和凋亡等生命过程中扮演着关键的角色。而BIO与靛玉红/甲异靛一样，对CDKs也有一定的选择性阻断作用，这也成为高浓度BIO抑制HS/PCs生长的一个原因。根据我们的实验结果，在各个液体培养阶段，除了CFC的数据相差甚远外，BIO的0.02μM和0.2μM两个浓度组的总细胞数和CD34⁺细胞数量相差并不是特别大，这可能说明BIO作用浓度对细胞扩增数目影响不大，而对细胞分化潜能的维持来说是一个比较敏感和关键的因素。

从以上实验我们得到，对于造血干细胞，0.2μM BIO与20ng/mL KL培养2.5天对人脐血HS/PCs的自我更新具有较好的效果。过低的浓度或过短的作用时间不足以促进细胞的生长，过高的浓度(2μM以上)或过长的作用时间易对细胞产生毒性。。

与KL同属早期造血因子的FL，TPO，IL-6，IL-11，G-CSF以及能分泌各种细胞因子的基质细胞等，与BIO联合后也有同样的效应。

本发明是通过以下技术方案进行的：

在HS/PCs体外培养体系(DMEM/F-12，15％FBS)中加入BIO和/或KL，在分别培养了1.5天、2.5天、4.5天、6.5天后，对细胞进行显微镜计数、集落培养、CD34⁺％及细胞周期的检测，比较不同组之间的结果差异。再选择一个扩增效果较好的浓度(BIO)和时间点进行长期液体培养，并以MeBIO作为对照药物进行进一步的检测以验证细胞经药物作用后分化潜能的维持状况。由检测结果可以得到，与对照药物和单加KL相比，BIO与KL联合作用明显使HS/PCs数量得到了扩增，且在除去药物后细胞的分化潜能也较高。CFC形成率测定的意义：培养后的细胞中表达CD34的越多，就表示处于早期的细胞越多，就意味着干细胞越多(因能表达CD34的细胞有干细胞，早/晚期祖细胞等)，但后者就需要经过功能实验(即CFC形成率测定)来确定，能形成集落的才是真正的干细胞，所以CFC形成率越高就代表此组的细胞分化越少，就越达到我们想要的目的。

上述结果表明，本发明可有效扩增HS/PCs数量并维持其分化增殖的潜能，不仅方法简便易行，且成本相对较低，对于解决临床HSCT所面临的细胞数量不足问题具有重要的意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所用的试剂均可以在市场上购买到。

设备和试剂：

1、FACSCalibur(流式细胞仪)：美国Becton Dickinson(BD)公司

2、MiniMACSTM细胞分选器/MACS分选架：德国美天旎生物技术有限公司

3、脐血样品：上海市国际和平妇幼保健院，自愿者捐赠的健康足月分娩儿脐血，枸橼酸钠抗凝

4、Ficoll分离液：分离脐血，密度1.077±0.002g/mL，上海华精生物高科技有限公司

5、DMEM/F-12(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient F-12 Ham’s，1∶1Mixture)，SIGMA公司产品

6、甲基纤维素(Methyl Cellulose，MC)：美国SIGMA公司产品

7、IMDM(Iscove’s Modified Dulbcco’s Medium)：美国GIBCO公司产品

8、胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)：美国HyClone公司

9、细胞因子FL、TPO、IL-3、FcR-blocking Reagent、CD11b-PE、CD14-PE：美国eBioscience公司

10、EPO：益比奥重组人红细胞生成素注射液，10000U/瓶，沈阳三生制药股份有限公司

11、GM-CSF：特尔立注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，1×150μg，厦门特宝生物工程股份有限公司

12、抗体IgG-PE(阴性对照)、CD34-PE购自美国Caltag公司

13、PI(Propidium Iodicle，碘化丙锭)为Sino-American Biotec公司产品

14、Buffer1：PBS/2％FBS or 0.5％BSA(CD marker缓冲液/溶解细胞因子)

Buffer2：PBS/2％FBS/2μg/mL PI(CD marker染液)

Buffer3：PBS/0.5％BSA/2mM EDTA(磁性分选缓冲液)

15、双抗(加于培养基)：100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素

实施例1 BIO、MeBIO的合成

试剂及实验条件：(a)水合氯醛，Na2SO4，NH2OH·HCl，H2O，HCl；(b)H2SO4，60～80℃；(c)3-吲哚乙酸酯，对甲苯磺酸，EtOH，70℃(d)NH2OH·HCl，KOH，30％EtOH，reflux；(e)CH3I，NaH，DMF；(f)3-吲哚乙酸酯，Na2CO3，MeOH，25℃；(g)NH2OH·HCl，Py，120℃

N-(肟基乙酰)间溴苯胺(2)的合成

水合氯醛(3.73g，22.55mmol)和无水硫酸钠(25.52g，179.72mmol)加入水(56mL)，35℃搅拌至溶。另取间溴苯胺(1，3.50g，20.35mmol)，分别加入水(14.5mL)，浓盐酸(2.2mL)和盐酸羟胺(4.8g，20mL)水溶液，摇匀后将此混合物加至如上水合氯醛中，搅匀，80～90℃反应2h，冷至50℃，抽滤，滤饼用水洗涤，得白色固体2(4.566g，得率92.3％)，mp151～153℃，1HNMR(300Hz，DMSO，δppm)：12.22(1H，s，N-OH)，10.31(1H，s，N-H)，8.02(1H，s，H-2)，7.65(1H，m，H-4)，7.64(1H，s，CH＝N′)，7.30(1H，t，H-5)，7.28(1H，d，H-6)。

6-溴吲哚满二酮(3)和4-溴吲哚满二酮(4)的合成

86％硫酸(65mL)置于三颈瓶中，60℃加入2(7.50g，30.86mmol)，65℃下反应30min，升至80℃反应15min，冰浴冷却1h，倾入水(25mL)中，搅拌，析出黄色固体。抽滤，滤饼用水洗涤至滤液无色。滤液用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，合并乙酸乙酯层，浓缩，剩余物与前面得到的滤饼合并，减压干燥。

加入含氢氧化钠(60g)的水溶液(200mL)，60℃加入冰乙酸(130mL)。30min后冰浴冷却30min，析出黄色固体。抽滤，固体为4。滤液加入浓盐酸(150mL)，冰浴中酸化2h，析出黄色固体。抽滤，滤饼用水洗涤，得黄色针状结晶3(1.48g，得率21.2％)，mp265～268℃，1HNMR(300Hz，DMSO，δppm)：11.12(1H，s，N-H)，7.45(1H，d，H-4)，7.27(1H，dd，H-5)，7.08(1H，s，H-7)。

6-溴靛玉红(5)的合成

3(317mg，1.4mmol)、3-吲哚乙酸酯(264mg，1.5mmol)置于三颈瓶中，加入无水乙醇(60mL)，70℃加入对甲苯磺酸(56mg，0.33mmol)，室温反应3h，冰箱中静置过夜，抽滤，滤饼用无水乙醇洗涤，用水洗至滤液无色，干燥后得紫红色絮状固体5(327mg，得率68.4％)，mp＞300℃(吴克美，张曼云，方正，等.抗白血病药物靛玉红以及靛蓝和异靛蓝衍生物的合成[J].化学学报.1985，20(11)：821-826)，1HNMR(300Hz，DMSO，δppm)：11.06(1H，s，N-H)，11.00(1H，s，N′-H)，8.69(1H，d，H-4′)，7.67(1H，d，H-4)，7.59(1H，t，H-6)，7.42(1H，d，H-7′)，7.22(1H，dd，H-5′)，7.05(1H，t，H-5)，7.02(1H，s，H-7)。

6-溴靛玉红-3′-肟(6)的合成

5(205mg，0.6mmol)、盐酸羟胺(78mg，1.12mmol)、氢氧化钾(484mg，8.6mmol)置于三颈瓶中，加入30％乙醇(50mL)，搅拌回流2h，冷至室温，冰箱中静置过夜。抽滤，滤饼依次用水和环己烷洗涤至滤液无色，干燥得红色针状结晶1(155mg，得率72.5％)，mp＞300℃。1HNMR(300Hz，DMSO，δppm)：13.59(1H，s，N′-OH)，11.75(1H，s，N′-H)，10.84(1H，s，N-H)，8.56(1H，d，H-4)，8.23(1H，d，H-4′)，7.41(1H，t，H-6′)，7.11(1H，s，H-7′)，7.08(1H，dd，H-5)，7.06(1H，t，H-5′)，7.03(1H，d，H-7)(Polychronopoulos P，Magiatis M，Skaltsounis AL，et al.Structural basisfor the synthesis of indirubins as potent and selectiveinhibitors of glycogen synthasekinase-3 and cyclin-dependent kinases[J].J Med Chem.2004，47(4)：935-946)，即得到本发明使用的BIO。

6-溴-1-甲基吲哚满二酮(7)的合成

在氮气保护下，3(113mg，5.00mmol)溶于DMF(10mL)后，加入NaH，搅拌1h，滴加碘甲烷(36μL，0.58mmol)的DMF溶液(2mL)。室温搅拌4.5h，加入水(20mL)，用二氯甲烷萃取(10mL×3)，合并二氯甲烷层，无水硫酸镁干燥，加压浓缩，以环己烷∶乙酸乙酯(5∶1)为展开剂，硅胶柱层析得到7(0.71g)。得率为50.8％。

1-甲基-6-溴靛玉红(8)的合成

在氮气的保护下，甲醇(7mL)剧烈搅拌30min，加入7(41mg，0.17mmol)和3-吲哚乙酸酯(31mg，0.18mmol)，搅拌5min，加入无水碳酸钠(44mg，0.42mmol)，搅拌4.5h，过滤，滤饼用甲醇水溶液(1∶1，10mL)和水(10mL)得到8(32mg)。得率为52.8％。

1-甲基-6-溴靛玉红-3′-肟(9)的合成

8(30mg，0.085mmol)溶于吡啶(3mL)后，加入盐酸羟胺(58mg，0.835mmol)，回流3h，减压旋干吡啶，所得固体用环己烷洗涤得9(16mg，得率51.17％)，即本发明中使用的MeBIO。

实施例2BIO、MeBIO溶液的配制

BIO、MeBIO粉末溶于DMSO制备成10mM的储存液，保存于-20℃。使用前先冻融，再用培养基(DMEM/F-12)分别稀释100倍(100μM)，1000倍(10μM)，10000倍(1μM)，最后吸取20μL加入到培养细胞中(终体积1mL)，用于最终药物浓度分别是2μM，0.2μM和0.02μM。

实施例3脐血单个核细胞(mono-nuclear cells，MNC)的获取和CD34⁺细胞的分离纯化

脐血样品，用枸橼酸钠抗凝，采取Ficoll分离液分离脐血，获得脐血单个核细胞(许文荣，胡嘉波，顾可梁，等.脐血造血干/祖细胞的密度分离实验研究[J].临床检验杂志.2001，19(2)：73-76)。按300μL/10⁸细胞的量加入Buffer 3，重新悬浮细胞后待用。Buffer3：PBS/0.5％BSA/2mM EDTA(磁性分选缓冲液)

CD34⁺细胞的分选步骤：

(1)免疫磁珠标记

加入FcR-blocking Reagent(100μL/108细胞)，轻柔混匀，再加入抗CD34⁺磁珠(100μL/10⁸细胞)，轻柔充分混匀，4℃冰箱孵育30min，期间每隔10min取出，手动轻柔振荡使磁珠与细胞充分接触；

(2)MS+分离柱的准备

将MiniMACS磁铁用酒精消毒，连接到MiniMACS架子上，将MS+分离柱放入MiniMACS磁铁中，柱下接一15mL无菌离心管。分离细胞前在柱顶上加入500μL buffer3润洗柱子；

(3)MS+分离柱阳性分选

将标记好的细胞悬液加到柱上，收集的流出物为阴性成分，用buffer 3洗涤分离柱3次，每次500μL。加1mLbuffer 3于分离柱中，将其取下，置于一新的15mL无菌离心管上，用活塞将CD34⁺细胞洗脱；

(4)第二次过柱分选

为了提高CD34⁺细胞的纯度，可进行第二次过柱，重复实验步骤(3)；

(5)收集到的细胞用DMEM/F-12培养基(含15％FBS，双抗)，悬浮混匀，计数并离心(2000rpm，10min)；

(6)去除上清，加入一定量培养基重悬，取出一定量细胞用于纯度测定，其余按实验需要加入药物或细胞因子进行分组培养。

实施例4流式测定表面标志的表达(CD34)——样品处理

(1)按≥2×10⁴的量吸取一定体积的细胞悬液于1.5mL离心管，室温离心(2000rpm，10min)；

(2)吸去上清，100μL buffer 1重悬，加入2μL FcR-blocking Reagent，轻柔混匀；

(3)分别加入2μL IgG-PE Isotype Control、CD34-PE(即荧光抗体)；

(4)4℃避光孵育30min；

(5)取出，加入1mL buffer 1洗涤一遍(2000rpm，10min)；

(6)加入300μL buffer 1重悬细胞，移入流式管；

(7)4℃保存，当天进行检测。检测前加入200μL buffer 2孵育10min以上。

实施例5 BIO作用时间和浓度的初步选择

此次实验分为四组，对实施例3得到的CD34⁺细胞进行短期扩增培养。采用24孔培养板，每孔添加培养基15％FBS的DMEM/F-12，另外附加各种细胞因子或药物溶液，终体积为1mL，细胞密度为1×10⁵/mL。置37℃，5％CO₂培养箱，全湿条件下培养。第一轮分别培养1.5天、2.5天、4.5天、6.5天后，收集各孔细胞进行显微镜计数、集落培养、Δculture(即将扩增后的细胞继续进行长期的液体培养，维持约20天的时间，其间每隔7天左右将部分细胞取出，继续加以液体培养，其余细胞进行以上各项指标的检测。检测CD34表达百分率变化(CFC数)的目的是为了验证经扩增后的细胞的增殖分化潜能)及流式细胞仪检测CD34抗原表达等各项指标。四组分别是阴性对照和BIO的三个10倍浓度梯度实验组(实验组中KL浓度同对照，下同)：(1)阴性对照：KL(20ng/mL)，(2)KL+BIO(2μM)，(3)KL+BIO(0.2μM)，(4)KL+BIO(0.02μM)，选择了4个时间点进行检测，分别是1.5天，2.5天，4.5天和6.5天。

第0天所铺细胞数为6×10⁴/孔，每组3个孔，共有3×3×4＝36孔。

1.5天时，各组细胞吸出计数，结果如图1A，从图中可以看出，作用1.5天后，与对照组一样，实验组的细胞数均无明显变化，说明这个短暂的作用时间对细胞的生长是无明显影响的。

2.5天时，高浓度BIO组(2μM)细胞数有所下降，为对照组的0.84倍，并与其有显著性差异，中浓度组(0.2μM)细胞数无明显变化，为对照组的1.57倍，低浓度(0.02μM)细胞数为对照组的1.50倍，有极其显著性的增加。而图1B中三种BIO浓度下培养的CD34⁺细胞数及图1C中集落数分别为对照组的0.81倍和0.47倍，1.51倍和1.61倍，1.46倍和1.16倍。结合图6我们可初步得到，当BIO浓度为0.02μM，0.2μM时对细胞的生长有较好促进作用，通过1-6.5天培养，这两个浓度BIO的CD34⁺细胞百分比都达到60％以上。

随着培养时间的延长，各组细胞都有不同程度的扩增。4.5天后，除了高浓度组细胞数相对较低外，其他两组细胞继续增长。6.5天时，中浓度组总细胞数量达到最高，为对照组的1.46倍，并与对照组有显著性差异，CD34⁺细胞数及集落数分别为对照组的1.27倍和3.03倍，而高浓度和低浓度分别为对照组的0.32倍，0.05倍，0.02倍和1.18倍，1.08倍，1.08倍。在这些结果中，集落培养的结果尤其显示出了中浓度的优势，也进一步证实了以上两组数据的可靠性。这些数据初步说明了KL联合浓度为0.2μM的BIO对HS/PCs有较好的促进生长作用。

实施例6BIO作用时间和浓度的确定

经扩增的HS/PCs是否仍保持了继续分化增殖的潜能呢？这就需要将细胞在诱导分化细胞因子的作用下观察其扩增情况，故同样设定了四组，(1)阴性对照：KL(20ng/ml)，(2)KL+BIO(2μM)，(3)KL+BIO(0.2μM)，(4)KL+BIO(0.02μM)，选择了3个时间点进行检测，分别是2天，4天，6天，不同于第一次实验的是，在这三个时间点作用后，将药物洗去，继续以KL，TPO，FL，IL-3(浓度均为10ng/mL)进行长期液体培养，其间每隔7～10天将细胞吸取剂型计数、集落培养及CD34表达的检测。集落培养：第0天将磁柱分离后的CD34⁺细胞2×10³铺于MC培养基中，加入细胞因子KL(50ng/1.5mL MC)，IL-3(10ng/1.5mL MC)，GM-CSF(10ng/1.5mL MC)，EPO(3U/1.5mL MC)。37℃，5％CO₂，全湿条件下培养，14天后进行集落的计数。实验组在培养一定时间后也分别取一定数量的细胞进行培养计数。各个器皿的放置如图5。

由实验结果(见图2)可以看到，同样地，中浓度组的细胞在经过2.5天的药物培养后继续扩增的状况较好(图2A，B，G)，到第20天时，总细胞数、CD34⁺细胞数及集落数的扩增分别是对照组的3.19倍，2.83倍和8.19倍。这说明HS/PCs在KL+BIO(0.2μM)的组合下作用2.5天能较好地维持细胞的分化增殖潜能，这对最终的细胞移植来说是至关重要的，此次的实验分组又进一步证明了BIO的浓度为0.2μM时最适宜。

实施例7培养条件的进一步验证

KL和BIO对细胞的扩增作用是由于BIO的存在促进了KL的作用还是单独的BIO就具有以上的作用呢？与BIO类似的化合物作用又是如何呢？在基本确定了BIO的作用时间和浓度后，我们又加入了BIO的对照药物MeBIO及单独BIO作用的组，故共设定了四组：(1)KL(阴性对照组)，(2)KL+BIO(0.2μM)，(3)KL+MeBIO(0.2μM)，(4)BIO(0.2μM)，KL的浓度均为10ng/mL。每组3个孔，所铺细胞数为10⁵/孔，设定了一个时间点即2.5天，按照实施例4的方法都进行2.5天短期细胞培养后检测各项指标，并进入长期液体培养(潜力验证)阶段，即将药物洗去，并以KL，TPO，FL，IL-3(浓度均为10ng/mL)继续进行培养6天、7天、7天，各个时间点进行细胞计数、集落培养和CD34表达检测。

结果如图3，可以看到，经过2.5天的培养后，KL+BIO(0.2μM)组的总细胞数(图3A)和集落数(图3B)均达到了组内最高，分别是阴性对照组的1.31和1.79倍，并与其有显著性差异。而KL+MeBIO(0.2μM)组和BIO(0.2μM)组分别为对照组的0.84倍和0.83倍，0.61倍和0.55倍。在除去药物进行继续培养的20天时间里，各组细胞都有不同程度的增长，但还是KL+BIO(0.2μM)组速度较快，到第15.5天时，总细胞数(图3C)、CD34⁺细胞数(图3D)和集落数(图3E)分别达到对照组的1.98倍、3.08倍和4.44倍，而KL+MeBIO(0.2μM)组和BIO(0.2μM)组分别为对照组的1.91倍，1.66倍，1.95倍和1.74倍，1.64倍，0.77倍。

实施例8BIO对小鼠骨髓MSCs的作用

将正常成年小鼠(C57)断颈处死，于75％酒精浸泡消毒(约15min)后取出其全部股骨和胫骨，用PBS将骨髓细胞冲出，离心后去上清，5mL DMEM-/F-12(15％FBS)重悬，计数，再添加培养基调整细胞密度为1×10⁵/mL。(24孔板)设3个孔，吸取1mL细胞悬液于培养板中。24h后小心吸去上层培养液(去除红细胞等悬浮细胞，MSCs为贴壁细胞)，补加1mL新鲜培养基，然后于三个孔中依次加入10μL、20μL、50μL BIO溶液(浓度为100μM)，即三组的BIO终浓度分别为1μM、2μM、5μM。将其于5％CO₂，37℃，全湿条件下培养3天后，进行拍照结果见图7。

图7A中细胞生长状态尚可，但不如2μM；图7B中细胞生长较旺盛；图7C中细胞形态变小并不再贴壁，可见高浓度明显产生毒性，抑制了干细胞的生长。

实施例9BIO+KL组合物对小鼠骨髓MSCs的作用

按照实施例8的方法，(24孔板)设4个孔，在四个孔中加入BIO溶液和KL，使BIO的终浓度为2μM(对照，不加KL)、0.2μM(+KL)、1μM(+KL)、2μM(+KL)；KL的终浓度为10ng/mL，将其于5％CO2，37℃，全湿条件下培养1天、3天和5天后，分别进行拍照，结果显示对BIO+KL组合物对小鼠骨髓MSCs的扩增有明显的促进作用。

实施例10  培养基1的配制

基本培养基：牛血清白蛋白溶液，10mg/ml；胰岛素溶液，8μg/ml；纯化人转铁蛋白溶液，15μg/ml；胆固醇溶液，30μg/ml；过氧化氢酶溶液，25μg/ml。

用上述基本培养基培养神经干细胞，并添加BIO和KL，BIO的浓度为0.7μM，KL的浓度为8ng/ml。

实施例11  培养基2的配制

DMEM和F12按照1∶1的比例混合，最终体积为100ml；加入BIO，浓度为1.6μM；加入KL，浓度为16ng/ml。该培养基可用于培养人骨髓间质干细胞。

实施例12培养基3的配制

IMDM+胎牛血清+6-溴靛玉红-3’-甲基肟(1.2μM)+KL(5ng/ml)+白介素-6(10ng/ml)+EPO(12ng/ml)，培养小鼠骨髓MSCs。

实施例13  人脐血干细胞的培养1

按照实施例2的方法将BIO配制成浓度为1mM的储存液；培养人脐血干细胞时在基本培养基DMEM-/F-12(15％FBS)中加入6-溴靛玉红-3’-丙酮肟，使其浓度为1.8μM，并加入KL、TPO和FL，使KL、TPO和FL的浓度分别为12ng/ml、10ng/ml、8ng/ml。

实施例14  人脐血干细胞的培养2

24孔板设3个孔，每孔加入1ml人脐血干细胞(1×10⁵/mL)，加入DMEM-/F-12培养，然后于三个孔中依次加入10μL、20μL、40μL BIO溶液(浓度为40μM)，即三组的BIO终浓度分别为0.4μM、0.8μM、1.6μM，每孔依次加入KL，使培养基中KL的浓度为8ng/ml、12ng/ml、16ng/ml；每孔依次加入人骨髓基质细胞(来自上海市儿童医学中心自愿捐赠全骨髓，经24h贴壁培养后吸去悬浮细胞得到)、人脐血基质细胞(来自上海市国际和平妇幼保健院自愿捐赠脐血，经24h贴壁培养后吸去悬浮细胞得到)和人骨髓基质细胞1×10⁵个/mL。将其于5％CO₂，37℃，全湿条件下培养，3天后观察细胞形态，结果细胞生长较旺盛，加入0.4μM、0.8μMBIO的细胞生长情况比1.6μM组稍好。

由上述实验结果可见，本发明对于有效解决干细胞面临的问题具有十分重要的意义：

首先，BIO与KL的联合作用不仅使成体干细胞的数量得到了扩增，且使其分化潜能也有所提高，对于提高临床移植成功率意义重大；

其次，与以往的扩增方法相比，BIO作为一种小分子化合物，制备简单，稳定性好，“保质期”长；

再次，扩增体系简单易行，且成本相对较低。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (18)

1.一种成体干细胞的培养基，其特征在于，所述培养基包括GSk-3抑制剂和早期造血因子，所述GSK-3抑制剂浓度为0.02-0.8μM，所述GSK-3抑制剂为6-溴靛玉红-3’-肟，其化学式为：

2.权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述GSK-3抑制剂浓度为0.2μM。

3.权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述早期造血因子的浓度为1-30ng/ml。

4.权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述早期造血因子的浓度为10-20ng/ml。

5.权利要求1、2或4所述的任意一种培养基，其特征在于，所述成体干细胞具有自我更新能力和分化潜能。

6.权利要求1、3或4所述的任意一种培养基，其特征在于，所述早期造血因子为干细胞因子、FL、促血小板生成素、白介素-6、白介素-11、粒细胞集落刺激因子、单巨噬细胞集落刺激因子、促红细胞生成素、巨核细胞生长和发育因子或者能分泌各种细胞因子的基质细胞。

7.权利要求6所述的培养基，其特征在于，所述早期造血因子为干细胞因子。

8.权利要求7所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括FL、促血小板生成素、白介素-6、白介素-11、粒细胞集落刺激因子、单巨噬细胞集落刺激因子、促红细胞生成素、巨核细胞生长和发育因子或者能分泌各种细胞因子的基质细胞中的1-3种早期造血因子。

9.权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述成体干细胞来源于人体。

10.权利要求1或9所述的培养基，其特征在于，所述成体干细胞为造血干细胞或骨髓间充质干细胞。

11.权利要求1所述的培养基在培养哺乳动物的成体干细胞中的应用。

12.权利要求11所述的应用，其特征在于，所述成体干细胞为造血干细胞或骨髓间充质干细胞。

13.权利要求12所述的应用，其特征在于，所述成体干细胞具有自我更新能力和分化潜能。

14.权利要求13所述的应用，其特征在于，所述培养基中早期造血因子为干细胞因子。

15.一种培养哺乳动物的成体干细胞的培养方法，其特征在于，在培养成体干细胞时，在适合于成体干细胞扩增的基本培养基中添加GSK-3抑制剂和早期造血因子，所述GSK-3抑制剂浓度为0.01-2μM，所述早期造血因子的浓度为1-30ng/ml，所述GSK-3抑制剂为6-溴靛玉红-3’-肟。

16.权利要求15所述的培养方法，其特征在于，所述早期造血因子为干细胞因子。

17.权利要求15所述的培养方法，其特征在于，所述成体干细胞为造血干细胞或骨髓间充质干细胞。

18.权利要求15所述的培养方法，其特征在于，所述适合于成体干细胞扩增的基本培养基为IMDM、X-VIVO或DMEM培养基。

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