发明内容
本发明提供了一种操作简便且可以提高表达量的体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法及其专用培养基。
为解决上述技术问题,本发明采取以下技术方案:用于体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的专用培养基,命名为st36无血清培养基,是在
无血清培养基中,加入细胞因子TPO终浓度为50ng/mL、IL-3终浓度为20ng/mL、SCF终浓度为50ng/mL、IL-6终浓度为50ng/mL。
所述
为进口无血清培养基(生产商:加拿大stemcell公司)。
本发明的第二个目的是提供一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法。
本发明所提供的体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法,可包括以下步骤:
1)单个核细胞的分离:用常规的Ficoll密度梯度离心方法从脐血中分离单个核细胞,其中,采用质量/体积百分比浓度为6%(g/100ml)的羟乙基淀粉(生产商:美国B.BRAUN公司)沉降脐血中的红细胞;
2)细胞培养和诱导分化:将单个核细胞接种于st36无血清培养基中,在37℃、5%C02条件下体外培养4-14天,取第4-14天的细胞得到巨核祖细胞和巨核细胞混合物。优选体外培养7-14天。
在上述方法中,所述步骤1)中6%羟乙基淀粉与脐血的混合比例为1∶2-1∶3(羟乙基淀粉的终浓度为1.5%-2.0%),优选为1∶3(羟乙基淀粉的终浓度为1.5%);单个核细胞的分离方法具体为:用6%的羟乙基淀粉按比例与脐血混合沉降红细胞30min,吸取上清,1800rpm离心5min,将细胞悬于生理盐水中,再将细胞悬液缓慢加入等体积的人淋巴细胞分离液表面,22℃、2000rpm离心25min,得到单个核细胞。
步骤2)中单个核细胞的接种量为106细胞/ml;在培养第4、7、10天时进行原体积的1/3量补液,加入新鲜培养基和细胞因子。
用上述方法获得的巨核祖细胞和巨核细胞也属于本发明的保护范围。其中,体外培养7-10天得到的巨核祖细胞和巨核细胞形态和活性最优。
本发明主要提供了一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法及其专用培养基。在分离单个核细胞过程中,首先要沉降红细胞,采用羟乙基淀粉、明胶、甲基纤维素等均可获得较好的结果,但明胶、甲基纤维素不适用于临床应用,而本发明采用的羟乙基淀粉是红细胞沉降剂,它可加快红细胞的沉降效率,阻碍白细胞和内皮细胞的黏附,从而达到直接分离红细胞的目的;本发明还优化了羟乙基淀粉的使用浓度,提高了有核细胞的收率;本发明进而将沉降红细胞后的上清按体积比1∶1缓慢加入人淋巴细胞分离液(FICOLL)上,进行密度梯度离心,可得到纯度较高的单个核细胞。本发明中省去了分离的单个核细胞去黏附细胞的操作而直接进行诱导,从而简化了操作过程,减少了污染,缩短了时间。另一方面,本发明在细胞培养和诱导分化过程中,通过采用合适的培养基并合理配伍使用各种细胞因子(特别是调整了IL-6的终浓度为50ng/mL),选择恰当的补液时机(在培养第4、7、10天)和补液量(按原体积1/3量补液)进行体外扩增巨核细胞,获得了最佳扩增效果和表达量。本发明将脐血单个核细胞高效诱导分化为巨核祖细胞和巨核细胞的方法,具有操作简单、成本低廉和分化效率高等优点,并提供了一个巨核祖细胞和巨核细胞的补充来源,将在医学领域发挥重要作用,应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所述百分比浓度均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
实施例1:培养基中因子组合的确定
实验一、采用含不同细胞因子组合的国产无血清培养基诱导脐血单个核细胞,观察表达CD41/CD61细胞数的变化
该实验中所用国产无血清培养基为购自北京博特纳科技有限公司的BTN无血清培养基。
将单个核细胞(从脐血中获得,分离单个核细胞的过程参见实施例2)接种于24孔板中,每孔1ml,106细胞/ml。培养基分别为:
培养基A:国产无血清培养基,其中含116t因子组合:10ng/mL IL-11、10ng/mLIL-6、100ng/mL TPO。
培养基B:国产无血清培养基,其中含st36因子组合:50ng/mL SCF、50ng/mLTPO、20ng/mL IL-3、50ng/mLIL-6。
培养基C:国产无血清培养基,其中含pt36因子组合:50ng/mL PDGF、50ng/mLTPO、20ng/mL IL-3、50ng/mL IL-6。
培养基D:国产无血清培养基,其中含pst36因子组合:50ng/mL PDGF、50ng/mLSCF、50ng/mL TPO、20ng/mL IL-3、50ng/mL IL-6。
培养条件:37℃、5%CO2培养箱体外培养7d。于第4d进行1/3量补液,加入新鲜培养基(含有与原培养基相同浓度的因子)。
采用含不同细胞因子组合的国产无血清培养基诱导脐血单个核细胞,观察表达D41/CD61阳性细胞数的变化,结果培养基B效果较好(图2),确定本发明采用的因子组合为st36因子组合。
实验二、培养基B与含st36因子组合的进口无血清培养基(培养基E)对脐血单个核细胞体外诱导分化影响
实验中所用进口无血清培养基为
SFEM无血清培养基,生产商为加拿大stemcell公司。
与实验一类似,采用培养基E,(含st36因子组合,即50ng/mL SCF、50ng/mLTPO、20ng/mL IL-3、50ng/mL IL-6的
无血清培养基),体外诱导培养单个核细胞4d、7d、10d、14d,分别于第4d、7d、10d按原体积的1/3量补液,加入新鲜培养液和相同浓度的因子。
结果表明,采用培养基E体外诱导脐血单个核细胞表明,随着诱导时间延长,细胞数增加,CD41/CD6表达提高(表1)。在观察培养基B与培养基E对脐血单个核细胞诱导分化影响,发现随着诱导时间延长,脐血单个核细胞经培养基B体外诱导培养(参见实验一)存活率降低,细胞状态不佳。而以培养基E作为培养诱导体系,细胞存活时间延长,存活率提高。随着细胞培养诱导时间延长,出现贴壁的基质细胞,以及呈卵圆形、圆形的悬浮细胞,大小不一,且细胞数逐渐增加,体积变大。表明,在贴壁生长的基质细胞作用下,悬浮的脐血干细胞向巨核祖细胞和巨核细胞分化,逐渐成熟,扩增。因此,确定采用培养基E作为用于体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的专用培养基。
表1体外培养诱导脐血单个核细胞不同时间细胞数变化和CD41/CD6表达(n=5)
通过以上实验确定本发明用于体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的专用培养基(即培养基E,命名为st36无血清培养基),是在进口无血清培养基(
无血清培养基)中,加入的细胞因子TPO终浓度为50ng/mL、IL-3终浓度为20ng/mL、SCF终浓度为50ng/mL、IL-6终浓度为50ng/mL。
实施例2、体外诱导脐血单个核细胞分化为巨核祖细胞和巨核细胞及检测
实验三、不同浓度的羟乙基淀粉(HES)沉降脐血红细胞的沉降效果比较
将6%羟乙基淀粉与脐血按一定比例混合,使羟乙基淀粉终浓度分别为2.0%、1.5%、1.2%、1.0%(“%”含义为“g/100ml”),室温沉降红细胞30min,比较沉降效果。然后,小心吸取上清,1800rpm离心5min,细胞悬于生理盐水中,将细胞悬液缓慢加入等体积的人淋巴细胞分离液(FICOLL,中国医学科学院生物工程研究所灏洋生物)表面,22℃、2000rpm离心25min,收集单个核细胞层,生理盐水洗涤2次,细胞计数。
比较2.0%、1.5%、1.2%、1.0%浓度的羟乙基淀粉沉降脐血红细胞的沉降效果,结果显示2.0%或1.5%羟乙基淀粉的沉降效果较好(6%羟乙基淀粉与脐血按1∶2或1∶3比例混合),其中1.5%羟乙基淀粉的沉降效果最佳(图1,1~4:羟乙基淀粉浓度分别为2.0%、1.5%、1.2%、1.0%),且回收的有核细胞量最多(表1)。
表2不同浓度羟乙基淀粉沉降红细胞后获得有核细胞的量
n=4与1.5%的HES相比,*:p<0.05,f:p<0.05
以下操作中使用6%的羟乙基淀粉并使其终浓度为1.5%。
一、体外诱导脐血单个核细胞分化为巨核祖细胞和巨核细胞
用本发明的方法体外诱导脐血单个核细胞分化为巨核祖细胞和巨核细胞,具体包括以下步骤:
1)单个核细胞的分离:用常规的Ficoll密度梯度离心方法从脐血中分离单个核细胞,具体方法为:用6%羟乙基淀粉与脐血按1∶3体积比混合(羟乙基淀粉的终浓度为1.5%)沉降红细胞30min,吸取上清,1800rpm离心5min,将细胞悬于生理盐水中,再将细胞悬液缓慢加入等体积的人淋巴细胞分离液上,22℃、2000rpm离心25min,得到单个核细胞。
2)细胞培养和诱导分化:将单个核细胞接种于24孔板中,每孔1ml,106细胞/ml,添加实施例1确定的培养基E中,在37℃、5%CO2条件下体外培养,并在培养第4、7、10天时进行原体积的1/3量补液,加入新鲜培养基,取4、7、10、14天得到的巨核祖细胞和巨核细胞混合物。
二、细胞形态观察
用倒置显微镜观察诱导的单个核细胞不同时间点细胞的大体形态变化。瑞氏吉姆萨染色,普通光学显微镜观察诱导分化的巨核祖细胞和巨核细胞。
单个核细胞接种培养基后于倒置显微镜下观察,可见细胞小,圆形。随着培养时间延长,细胞数增加,出现梭形贴壁细胞,圆形、卵圆形细胞,大小不一,且细胞体积逐渐变大。7天后细胞增殖明显(图3,(1)~(5):分别为体外诱导0d、4d、7d、10d、14d的细胞形态)。瑞氏吉姆萨染色,可见有不同阶段巨核细胞存在。光学显微镜下观察显示有原巨核,幼巨核细胞(核大,紫红色,细胞边缘不规则,可有指状突起)和颗粒型巨核细胞(胞体巨大,胞质丰富,含细小紫红色颗粒,核互相聚集呈环状)存在,10天后出现成熟的巨核细胞(参见图4其中箭头所指细胞,①②:诱导10d巨核细胞③④:诱导14d巨核细胞)。
三、流式细胞仪检测
诱导4d、7d、10d、14d获得的巨核祖细胞和巨核细胞分别用生理盐水洗涤,并将诱导不同时间的细胞均分成两管,各加入鼠抗人CD41--PE、CD61-FITC抗体和鼠的IgG1-PE、IgG1-FITC抗体(英国peprotech公司),4℃、30min孵育,流式细胞仪检测CD41/CD61表达。数据参见表3。
表3体外培养诱导脐血单个核细胞不同时间细胞数变化和CD41/CD6表达(n=5)
结果诱导10d、14d时,CD41/CD61表达分别达到20%、54%,该数据与莫文健等人(莫文健等,无血清脐血巨核系祖细胞体外扩增的研究。中国实验血液学杂志,2004;12(2):133-137;莫文健等,两步法脐血巨核细胞体外扩增的研究。中国输血杂志,2005;18(5):381-383)报道的结果(脐血单个核细胞扩增后10天CD41+细胞百分数16.68±1.27%,14天CD41+细胞表达量为24.41±1.90%)相比,定向诱导巨核细胞的效果更佳。
本发明获得较好的表达量,与培养基中使用的因子浓度、诱导过程的补液的时机、补液方式有关,且单个核细胞接种后贴壁的基质细胞可能也有利于细胞诱导分化。
四、巨核祖细胞集落培养
采用含0.9%甲基纤维素,1%BSA,10-4M β-巯基乙醇,200μg/mL人转铁蛋白,10μg/mL重组人胰岛素,2mM L-谷氨酰胺,10ng/mL rhIL-6,10ng/mL rhIL-3,50ng/mL rhTPO的巨核祖细胞集落培养基对步骤2)获得的体外诱导培养0、7、10、14d的巨核祖细胞进行集落培养10-12天,倒置显微镜下计CFU-MK集落数。
结果如图5所示,随着单个核细胞在培养基E中诱导时间的延长,CFU-MK集落数呈增加趋势。体外诱导7d、10d、14d的细胞,CFU-MK集落数均高于未诱导的单个核细胞,且差别非常显著(P<0.01)。表明,增加体外诱导时间,可获得更多的巨核祖细胞。
实施例2确定了本发明较好的体外诱导脐血单个核细胞分化为巨核祖细胞和巨核细胞的方法,并且,取使用该方法体外诱导7d-14d的细胞表达量有明显提高,而从获得的细胞形态和活性看,7d-10d的细胞较好。