CN113025573A - 培养诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基及方法 - Google Patents

培养诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113025573A
CN113025573A CN202011610451.9A CN202011610451A CN113025573A CN 113025573 A CN113025573 A CN 113025573A CN 202011610451 A CN202011610451 A CN 202011610451A CN 113025573 A CN113025573 A CN 113025573A
Authority
CN
China
Prior art keywords
concentration
medium
culture
interleukin
optionally
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011610451.9A
Other languages
English (en)
Inventor
习佳飞
岳�文
裴雪涛
陈琳
李艳华
吕洋
范增
姚海雷
南雪
李雪
张博文
何丽娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Institute Of Biomedicine
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Original Assignee
South China Institute Of Biomedicine
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Institute Of Biomedicine, Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS filed Critical South China Institute Of Biomedicine
Priority to CN202011610451.9A priority Critical patent/CN113025573A/zh
Publication of CN113025573A publication Critical patent/CN113025573A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0644—Platelets; Megakaryocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/50—Soluble polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/06—Anti-neoplasic drugs, anti-retroviral drugs, e.g. azacytidine, cyclophosphamide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2303—Interleukin-3 (IL-3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2311—Interleukin-11 (IL-11)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提出了诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基及方法。所述培养基包括：基础培养基；血小板生成素；重组人干细胞因子；白介素‑3；白介素‑6；泊洛沙姆188；芳香烃受体拮抗剂；粒细胞巨噬细胞集落刺激生长因子；白介素‑11以及氨基酸。本发明的补液培养基可以更好地促进造血干细胞分化为巨核系细胞，提高分化效率、巨核系细胞的得率和活性，具有广泛地应用前景。

Description

培养诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基及方法
技术领域
本发明涉及生物工程领域。具体地，本发明涉及诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基及方法。
背景技术
血小板是由骨髓中成熟的巨核细胞胞浆发育产生，具有凝血、保护毛细血管的功能，血小板异常可导致出血性疾病。近年来肿瘤发病率逐年升高，放、化疗是肿瘤治疗的常用手段，常伴有血小板减少症状，临床上以输注血小板作为主要治疗手段，但供血紧张、或反复输注血小板无效等原因，促使人们探寻新的血小板来源。造血干细胞能够在体外分化为巨核祖细胞，并逐渐成熟生血小板，为人们提供新的思路。由于脐血易获得、对人体无害、免疫原性低而成为人们研究的首选材料。
然而，目前的促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的体系还存在增殖能力弱、诱导分化效率低等问题。因此，仍需要研究。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了一种诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基及方法，利用该补液培养基可以更好地促进造血干细胞分化为巨核系细胞，提高分化效率、巨核系细胞的得率和活性，具有广泛地应用前景。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基。根据本发明的实施例，所述补液培养基包括：基础培养基；血小板生成素；重组人干细胞因子；白介素-3；白介素-6；泊洛沙姆188；芳香烃受体拮抗剂；粒细胞巨噬细胞集落刺激生长因子；白介素-11；以及氨基酸。发明人发现，在培养过程中，添加有粒细胞巨噬细胞集落刺激生长因子(GM-CSF)、白介素-11(IL-11)和氨基酸的补液培养基可以更好地促进造血干细胞分化为巨核系细胞，提高巨核系细胞的得率。
根据本发明的实施例，所述血小板生成素的浓度为10～200ng/mL，优选80～120ng/mL。
根据本发明的实施例，所述重组人干细胞因子的浓度为10～200ng/mL，优选80～120ng/mL。
根据本发明的实施例，所述白介素-3的浓度为5～60ng/mL，优选10～50ng/mL。
根据本发明的实施例，所述白介素-6的浓度为10～200ng/mL，优选80～120ng/mL。
根据本发明的实施例，所述泊洛沙姆188的浓度为0.2～3mg/mL，优选0.5～1.5mg/mL。
根据本发明的实施例，所述芳香烃受体拮抗剂的浓度为0.2～10μM，优选0.5～1.5μM。
根据本发明的实施例，所述粒细胞集落刺激生物因子的浓度为10～60ng/mL，优选20～40ng/mL。
根据本发明的实施例，所述白介素-11的浓度为10～100ng/mL，优选40～60ng/mL。
根据本发明的实施例，所述基础培养基选自stemspan无血清培养基。
根据本发明的实施例，所述氨基酸选自半胱氨酸、天冬氨酸和丝氨酸中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述半胱氨酸的浓度为20～200μM，优选60～100μM。
根据本发明的实施例，所述天冬氨酸的浓度为50～500μM，优选200～400μM。
根据本发明的实施例，所述丝氨酸的浓度为100～1200μM，优选600～800μM。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将单个核细胞接种于第一培养基中进行第一培养，其中，所述第一培养基包括：基础培养基；血小板生成素；重组人干细胞因子；白介素-3；白介素-6；泊洛沙姆188和芳香烃受体拮抗剂；以及将所述第一培养获得的细胞接种于前面所述补液培养基中进行第二培养，以便得到巨核系细胞。利用根据本发明实施例的方法能够有效促进造血干细胞向巨核系细胞诱导分化，操作简单、成本低、增殖和/或诱导分化效率高，效果好。
根据本发明的实施例，在所述第一培养基中，所述血小板生成素的浓度为10～200ng/mL，优选30～70ng/mL；所述重组人干细胞因子的浓度为10～200ng/mL，优选30～70ng/mL；所述白介素-3的浓度为5～60ng/mL，优选10～30ng/mL；所述白介素-6的浓度为10～150ng/mL，优选30～70ng/mL；所述泊洛沙姆188的浓度为0.02～3mg/mL，优选0.5～1.5mg/mL；所述芳香烃受体拮抗剂的浓度为0.2～10μM，优选0.5～1.5μM。
根据本发明的实施例，所述第一培养是在35～39℃及3～7体积％CO2下进行5～9天。
根据本发明的实施例，所述第二培养是在35～39℃及3～7体积％CO2下进行5～14天，优选5～10天。
根据本发明的实施例，在所述第二培养开始时将所述第一培养所得培养液中的至少部分培养基更换为所述补液培养基，然后在开始所述第二培养后的第4～6天将至少部分培养基更换所述补液培养基。
根据本发明的实施例，在所述第二培养开始时采用的所述补液培养基中含有半胱氨酸。
根据本发明的实施例，在开始所述第二培养后的第4～6天更换的所述补液培养基中含有丝氨酸或天冬氨酸和丝氨酸。
根据本发明的实施例，所述单个核细胞选自脐带血单个核细胞。
根据本发明的实施例，所述脐带血单个核细胞是通过下列方式获得的：将脐带血与羟乙基淀粉混合，静置，收集上清液，将所述上清液离心，收集细胞沉淀；所述细胞沉淀重悬于生理盐水中，添加淋巴细胞分离液，离心，收集细胞沉淀，获得脐带血单个核细胞。
根据本发明的实施例，所述单个核细胞的接种量为1～10×105个/cm2。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1根据本发明一个实施例的体外诱导巨核系细胞不同时间细胞数变化示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的体外诱导巨核系细胞21天细胞瑞氏吉姆萨染色(×1000)示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的采用高压液相色谱法(HPLC)检测脐血单个核细胞诱导巨核系细胞0d、7d、12d、17d、21d培养基中氨基酸变化的含量图；
图4显示了根据本发明一个实施例的体外诱导巨核系细胞不同时间氨基酸的消耗量变化图；
图5显示了根据本发明一个实施例的巨核系细胞诱导过程中添加天冬氨酸和半胱氨酸对诱导12天的巨核系细胞表面标志CD41表达的影响；
图6显示了根据本发明一个实施例的巨核系细胞诱导过程中添加天冬氨酸和丝氨酸对诱导17d巨核系细胞表面标志CD41表达的影响，其中，17d中，从左至右分别为control组、Asp+Ser+Cyss+Leu+Ile组、Cyss+Leu+Ile组、Asp+Ser组，control组的初始培养基为st36pSR1，补液培养基为st36pSR1+GM-CSF+IL-11；Asp+Ser+Cyss+Leu+Ile组的初始培养基为st36pSR1，补液培养基为st36pSR1+GM-CSF+IL-11+Asp+Ser+Cyss+Leu+Ile；Cyss+Leu+Ile组的初始培养基为st36pSR1，补液培养基为st36pSR1+GM-CSF+IL-11+Cyss+Leu+Ile；Asp+Ser组的初始培养基为st36pSR1，补液培养基为st36pSR1+GM-CSF+IL-11+Asp+Ser。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
本发明提出了诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基、诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的方法，下面将分别对其进行详细描述。
诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基
在本发明的一个方面，本发明提出一种诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基。根据本发明的实施例，该补液培养基包括：基础培养基；血小板生成素；重组人干细胞因子；白介素-3；白介素-6；泊洛沙姆188；芳香烃受体拮抗剂；粒细胞巨噬细胞集落刺激生长因子；白介素-11以及氨基酸。
发明人发现，在含有血小板生成素(TPO)、重组人干细胞因子(SCF)、白介素-3(IL-3)和白介素-6的基础培养基中添加芳香烃受体拮抗剂(SR1)和泊洛沙姆188(P188)可以促进造血干细胞扩增并对细胞活率和诱导分化具有增强的作用。上述组成可以作为初始培养基对造血干细胞进行培养，使其诱导分化为巨核系细胞。
进一步地，在诱导造血干细胞分化为巨核系细胞过程中，通过补液操作(即除去部分培养液，再补充一些新鲜培养液)，可以除去一些抑制细胞生长的代谢产物，补充新鲜成分，以供细胞更好地生长、分化。在对补液培养基的组成进行研究时发现，在补加基础培养基时，通过再添加粒细胞巨噬细胞集落刺激生长因子(GM-CSF)、白介素-11(IL-11)和氨基酸，细胞扩增倍数高、可获得更多的巨核系细胞。
根据本发明的实施例，血小板生成素的浓度为10～200ng/mL，优选80～120ng/mL。由此，有利于促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞。
根据本发明的实施例，重组人干细胞因子的浓度为10～200ng/mL，优选80～120ng/mL。由此，有利于促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞。
根据本发明的实施例，白介素-3的浓度为5～60ng/mL，优选10～50ng/mL。由此，有利于促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞。
根据本发明的实施例，白介素-6的浓度为10～200ng/mL，优选80～120ng/mL。由此，有利于促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞。
根据本发明的实施例，泊洛沙姆188的浓度为0.2～3mg/mL，优选0.5～1.5mg/mL。由此，有利于促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞。
根据本发明的实施例，芳香烃受体拮抗剂的浓度为0.2～10μM，优选0.5～1.5μM。由此，有利于促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞。
根据本发明的实施例，粒细胞集落刺激生物因子的浓度为10～60ng/mL，优选20～40ng/mL。由此，有利于促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞。
根据本发明的实施例，白介素-11的浓度为10～100ng/mL，优选40～60ng/mL。由此，有利于促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞。
根据本发明的实施例，基础培养基选自stemspan无血清培养基。
根据本发明的实施例，氨基酸选自半胱氨酸、天冬氨酸和丝氨酸中的至少一种。发明人在研究时发现，在造血干细胞培养向巨核系细胞分化过程中，培养液中半胱氨酸、天冬氨酸或者丝氨酸出现不同程度降低，因此，推断出上述氨基酸会被造血干细胞吸收利用，促进其生长、分化为巨核系细胞。进而，在补液培养基中添加上述氨基酸，有助于提高造血干细胞向巨核系细胞分化的效率，提高巨核系细胞的收率。
根据本发明的实施例，半胱氨酸的浓度为20～200μM，优选60～100μM。由此，有利于促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞。
根据本发明的实施例，天冬氨酸的浓度为50～500μM，优选200～400μM。由此，有利于促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞。
根据本发明的实施例，丝氨酸的浓度为100～1200μM，优选600～800μM。由此，有利于促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞。
诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的方法
在本发明的另一方面，本发明提出一种诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将单个核细胞接种于第一培养基中进行第一培养，其中，所述第一培养基包括：基础培养基；血小板生成素；重组人干细胞因子；白介素-3；白介素-6；泊洛沙姆188和芳香烃受体拮抗剂；以及将所述第一培养获得的细胞接种于前面所述补液培养基中进行第二培养，以便得到巨核系细胞。发明人发现，采用第一培养基对造血干细胞进行培养，使其诱导分化为巨核系细胞。进一步地，在诱导造血干细胞分化为巨核系细胞过程中，通过补液操作(即除去部分培养液，再补充一些新鲜培养液)，可以除去一些抑制细胞生长的代谢产物，补充新鲜成分，以供细胞更好地生长、分化。利用根据本发明实施例的方法，能够有效促进造血干细胞向巨核系细胞诱导分化，操作简单、成本低、增殖和/或诱导分化效率高，效果好。
根据本发明的实施例，在第一培养基中，血小板生成素的浓度为10～200ng/mL，优选30～70ng/mL；重组人干细胞因子的浓度为10～200ng/mL，优选30～70ng/mL；白介素-3的浓度为5～60ng/mL，优选10～30ng/mL；白介素-6的浓度为10～150ng/mL，优选30～70ng/mL；泊洛沙姆188的浓度为0.02～3mg/mL，优选0.5～1.5mg/mL；芳香烃受体拮抗剂的浓度为0.2～10μM，优选0.5～1.5μM。发明人发现，在含有血小板生成素、重组人干细胞因子、白介素-3和白介素-6的基础培养基中添加芳香烃受体拮抗剂和泊洛沙姆188可以促进造血干细胞扩增和巨核细胞的诱导分化。上述组成可以作为初始培养基对造血干细胞进行培养，使其诱导分化为巨核系细胞。
根据本发明的实施例，第一培养是在35～39℃及3～7体积％CO2下进行5～9天。由此，以便造血干细胞更好地增殖和分化。
根据本发明的实施例，第二培养是在35～39℃及3～7体积％CO2下进行5～14天，优选5～10天。由此，以便造血干细胞更好地增殖和分化。
根据本发明的实施例，在第二培养开始时将第一培养所得培养液中的至少部分培养基更换为补液培养基，然后在开始第二培养后的第4～6天将至少部分培养基更换补液培养基。发明人发现，更换补液培养基的时间会影响分化效果，当更换培养基后的第4～6天更换新鲜的补液培养基，可以更好地促进造血干细胞分化为巨核系细胞。
根据本发明的实施例，在第二培养开始时采用的所述补液培养基中含有半胱氨酸。发明人发现，在第二培养的早期加入半胱氨酸，可以提高巨核系细胞表面标志CD41的表达。
根据本发明的实施例，在开始所述第二培养后的第4～6天更换的所述补液培养基中含有丝氨酸或天冬氨酸和丝氨酸。发明人发现，在第二培养的中期加入丝氨酸或天冬氨酸和丝氨酸，可以提高巨核系细胞表面标志CD41的表达。
根据本发明的实施例，所述单个核细胞选自脐带血单个核细胞。
根据本发明的实施例，所述脐带血单个核细胞是通过下列方式获得的：将脐带血与羟乙基淀粉混合，静置，收集上清液，将所述上清液离心，收集细胞沉淀；所述细胞沉淀重悬于生理盐水中，添加淋巴细胞分离液，离心，收集细胞沉淀，获得脐带血单个核细胞。由此，所得到的脐带血单个核细胞得率高、纯度好、活性强。
根据本发明的实施例，所述单个核细胞的接种量为1～10×105个/cm2。由此，以便为单个核细胞提供充足的营养成分及生长环境，促进其增殖及分化。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对诱导造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的补液培养基所描述的特征和优点，同样适用于该诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的方法，在此不再赘述。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1
材料和方法
1、主要材料
stemspanTMII无血清培养基为stemcell公司产品；
重组人血小板生成素注射液为沈阳三生制药有限公司；
SCF、IL-3、IL-6均为RD公司产品；
芳香烃受体拮抗剂(SR1)为stemcell公司产品；
P188为sigma公司产品；
CD41-APC、CD61a-FITC抗体均为ebiscience抗体；
脐带血来源于北京脐带血库；
VI-CELL细胞活力分析仪为BECKMAN公司产品；
G-Rex 10培养装置为美国Wilson Wolf Manufacturing公司产品；
瑞氏-吉姆萨染色为BASO公司产品。
高压液相色谱仪：日本岛津公司。
2、脐带血单个核细胞：将脐带血与6％羟乙基淀粉混合，沉降红细胞20-30min，取上清，离心，收集细胞沉淀，将细胞沉淀重悬于生理盐水中，加入人淋巴细胞分离液，离心，收集细胞沉淀，获得单个核细胞。
3、单个核细胞分化为巨核系细胞
将脐带血单个核细胞按5×105个/cm2接种G-Rex培养装置中，stemspan培养基中补加st36pSR1(TPO 50ng/mL、SCF 50ng/mL、IL-3 20ng/mL、IL-6 50ng/mL、P188 1mg/ml、SR11μM)，7d、12d、17d半量换液，并补加含st36pSR1和GM-CSF 15ng/ml、IL-11 25ng/mlstemspan培养基(TPO 100ng/mL、SCF 100ng/mL、IL-3 40ng/mL、IL-6 100ng/mL、P188 1mg/ml、SR1 1μM、GM-CSF 30ng/ml、IL-11 50ng/ml)，37℃、5％CO2培养箱中培养。
4、流式检测细胞表型：吸取5×105～5×106个细胞加入Ep管中，PBS洗涤，细胞悬于PB中，加入CD41和CD61抗体，同时设阴性对照管，4℃避光孵育30min，PBS洗涤细胞，流式细胞仪检测。
5、细胞瑞氏-吉姆萨染色：细胞甩片，滴加A液，染色1min。再滴加约为A液总量2～3倍的B液，洗耳球吹气或轻轻摇动载玻片使A、B染液充分混合，染色3～10min。水轻轻冲洗，垂直晾干，光学显微镜观察。
6、氨基酸检测：巨核系细胞诱导0d、7d、12d、17d、21d收集细胞培养上清，离心去除沉淀，采用高压液相色谱(HPLC)检测各时间点培养基上清中18种氨基酸含量的变化。
结果：
1、巨核系细胞诱导
结果显示，随之诱导时间延长，细胞数逐渐增加，诱导21天，细胞数达到最高，随后降低(图1)。诱导21天，细胞瑞氏吉姆萨染色，可见不同时期巨核细胞，细胞圆形或不规则形，核扭曲折叠、多核、胞质灰蓝色或暗红紫色，充满区域性或紫红色颗粒(见图2)。
2、细胞诱导过程中氨基酸的变化
图3a-图3e分别是诱导0d、7d、12d、17d、21d细胞培养上清中氨基酸含量的高压液相色谱图，图4是体外诱导巨核系细胞不同时间细胞培养上清中氨基酸含量的变化图，表1是诱导0d、7d、12d、17d、21d细胞培养上清中氨基酸含量的统计表格。结果显示，天冬氨酸(Asp)在诱导中期(12d)开始明显降低(降低了58.4％)、天冬氨酸(Asp)在21d降低了32.7％，但仍低于0d；半胱氨酸(Cyss)在诱导12d降低了52.7％；丝氨酸(Ser)在诱导后期(17d)降低了88.1％，非常显著；此外异亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu)在诱导17d分别降低了45.8％、48.8％。
表1诱导巨核系细胞不同时间细胞培养上清中氨基酸变化
Figure BDA0002872813970000081
注：Asp、Ser、Cyss为非必须氨基酸；Ile、Leu为必须氨基酸。
结论：
1、体外诱导脐带血单个核细胞可分化为巨核细胞，瑞氏吉姆萨染色可见不同阶段的巨核系细胞。
2、巨核诱导过程中Asp、Ser、Cyss、Ile、Leu变化明显，天冬氨酸(Asp)和半胱氨酸(Cyss)在巨核诱导中期开始明显降低，而亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(ILe)及丝氨酸(Ser)在巨核系细胞诱导后期降低明显，推测这些氨基酸可能在巨核系细胞诱导分化不同阶段发挥重要的作用。
实施例2氨基酸对脐带血单个核细胞向巨核系细胞诱导分化的影响
1、材料
本实施例使用的材料同实施例1，在此不再赘述。
氨基酸的配置：
天冬氨酸L-ASParagine(Asp)：1MHCl配置，母液浓度757mM，培养体系终浓度124μM；
L-半胱氨酸(Cyss)：H2O配置母液浓度206.3mM，培养体系终浓度44μM；
丝氨酸L-serine(Ser)：H2O配置母液浓度475.78mM，培养体系终浓度350μM。
2、脐血单个核细胞向巨核系细胞诱导分化
将分离的脐血单个核细胞按5×105个/cm2接种于含巨核扩增培养液的G-Rex 24孔中。其中，巨核培养基：st36pSR1(TPO 50ng/mL、SCF 50ng/mL、IL-3 20ng/mL、IL-6 50ng/mL、P188 1mg/ml、SR1 1μM)的stemspan，37℃、5％CO2培养箱中静置培养。诱导7d、12d、17d半量换液，加入st36pSR1+GM-CSF+IL-11培养基(TPO 100ng/mL、SCF 100ng/mL、IL-340ng/mL、IL-6 100ng/mL、P188 1mg/ml、SR1 1μM、GM-CSF 30ng/ml和IL-11 50ng/ml)。
氨基酸加入时间见表2。
表2 G-Rex孔板各孔加入氨基酸的时间
Figure BDA0002872813970000091
细胞生物学检测：
诱导12d、17d时，收集，检测存活率、细胞数及流式检测巨核系细胞表达。
3、结果
脐血单个核细胞诱导培养第7天补液，补液培养基中加入天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸酸(Cyss)，第12天流式细胞仪检测，结果显示，加入Cyss组巨核系细胞表面标志CD41表达与其他3组相比具有显著差别(P<0.01)(见图5)。
诱导培养第12天补液，补液培养基中加入天冬氨酸(Asp)和丝氨酸(Ser)，第17天检测CD41表达，与其他3组相比差别显著(P<0.01)(见图6)。
以上内容表明：
1、在巨核系细胞诱导早期开始加入Cyss，能够提高巨核系细胞表面标志CD41的表达，但早期加入Asp或Cyss+Asp均无此作用。
2、在巨核诱导的中期开始加入Ser+Asp有助于提高CD41表达。
3、在巨核诱导过程中补加氨基酸组合Cyss+Leu+ILe或Cyss+ASP+ser+Leu+ILe，巨核系细胞表面标志CD41表达与对照组无差别，推测可能是Leu和Ile抑制了Cyss、ASP、Ser促巨核系细胞分化的作用。
综上所述，自开始诱导培养后的第7天时补液，补液培养基中加入半胱氨酸，再继续培养至第5天时补液，补液培养基中加入天冬氨酸和丝氨酸或仅添加丝氨酸，再继续培养5-9天。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (9)

1.一种诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基，其特征在于，包括：
基础培养基；
血小板生成素；
重组人干细胞因子；
白介素-3；
白介素-6；
泊洛沙姆188；
芳香烃受体拮抗剂；
粒细胞巨噬细胞集落刺激生长因子；
白介素-11；以及
氨基酸。
2.根据权利要求1所述的补液培养基，其特征在于，所述血小板生成素的浓度为10～200ng/mL，优选80～120ng/mL；
任选地，所述重组人干细胞因子的浓度为10～200ng/mL，优选80～120ng/mL；
任选地，所述白介素-3的浓度为5～60ng/mL，优选10～50ng/mL；
任选地，所述白介素-6的浓度为10～200ng/mL，优选80～120ng/mL；
任选地，所述泊洛沙姆188的浓度为0.2～3mg/mL，优选0.5～1.5mg/mL；
任选地，所述芳香烃受体拮抗剂的浓度为0.2～10μM，优选0.5～1.5μM；
任选地，所述粒细胞集落刺激生物因子的浓度为10～60ng/mL，优选20～40ng/mL；
任选地，所述白介素-11的浓度为10～100ng/mL，优选40～60ng/mL；
任选地，所述基础培养基选自stemspan无血清培养基。
3.根据权利要求1或2所述的补液培养基，其特征在于，所述氨基酸选自半胱氨酸、天冬氨酸和丝氨酸中的至少一种；
任选地，所述半胱氨酸的浓度为20～200μM，优选60～100μM；
任选地，所述天冬氨酸的浓度为50～500μM，优选200～400μM；
任选地，所述丝氨酸的浓度为100～1200μM，优选600～800μM。
4.一种诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的方法，其特征在于，包括：
将单个核细胞接种于第一培养基中进行第一培养，其中，所述第一培养基包括：基础培养基；血小板生成素；重组人干细胞因子；白介素-3；白介素-6；泊洛沙姆188和芳香烃受体拮抗剂；以及
将所述第一培养获得的细胞接种于权利要求1-3任一项所述补液培养基中进行第二培养，以便得到巨核系细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述第一培养基中，
所述血小板生成素的浓度为10～200ng/mL，优选30～70ng/mL；
所述重组人干细胞因子的浓度为10～200ng/mL，优选30～70ng/mL；
所述白介素-3的浓度为5～60ng/mL，优选10～30ng/mL；
所述白介素-6的浓度为10～150ng/mL，优选30～70ng/mL；
所述泊洛沙姆188的浓度为0.02～3mg/mL，优选0.5～1.5mg/mL；
所述芳香烃受体拮抗剂的浓度为0.2～10μM，优选0.5～1.5μM。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一培养是在35～39℃及3～7体积％CO2下进行5～9天；
任选地，所述第二培养是在35～39℃及3～7体积％CO2下进行5～14天；
任选地，在所述第二培养开始时将所述第一培养所得培养液中的至少部分培养基更换为所述补液培养基，然后在开始所述第二培养后的第4～6天将至少部分培养基更换所述补液培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述第二培养开始时采用的所述补液培养基中含有半胱氨酸；
任选地，在开始所述第二培养后的第4～6天更换的所述补液培养基中含有丝氨酸或天冬氨酸和丝氨酸。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述单个核细胞选自脐带血单个核细胞；
任选地，所述脐带血单个核细胞是通过下列方式获得的：
将脐带血与羟乙基淀粉混合，静置，收集上清液，将所述上清液离心，收集细胞沉淀；
所述细胞沉淀重悬于生理盐水中，添加淋巴细胞分离液，离心，收集细胞沉淀，获得脐带血单个核细胞。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述单个核细胞的接种量为1～10×105个/cm2。
CN202011610451.9A 2020-12-30 2020-12-30 培养诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基及方法 Pending CN113025573A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011610451.9A CN113025573A (zh) 2020-12-30 2020-12-30 培养诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011610451.9A CN113025573A (zh) 2020-12-30 2020-12-30 培养诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113025573A true CN113025573A (zh) 2021-06-25

Family

ID=76460427

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011610451.9A Pending CN113025573A (zh) 2020-12-30 2020-12-30 培养诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113025573A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005014785A2 (en) * 2003-06-18 2005-02-17 The George Washington University Conditionally-immortalized hematopoietic progenitor cell lines
CN101864396A (zh) * 2010-05-17 2010-10-20 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法
CN104232582A (zh) * 2014-08-27 2014-12-24 军事医学科学院华南干细胞与再生医学研究中心 泊洛沙姆在诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化中的用途
CN105368775A (zh) * 2014-08-13 2016-03-02 苏州方舟基因药业有限公司 利用人造血干细胞制备巨核细胞及血小板的方法和体系
CN110093313A (zh) * 2018-01-29 2019-08-06 华南生物医药研究院 促进造血干/祖细胞分化为红系细胞的诱导培养基及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005014785A2 (en) * 2003-06-18 2005-02-17 The George Washington University Conditionally-immortalized hematopoietic progenitor cell lines
CN101864396A (zh) * 2010-05-17 2010-10-20 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法
CN105368775A (zh) * 2014-08-13 2016-03-02 苏州方舟基因药业有限公司 利用人造血干细胞制备巨核细胞及血小板的方法和体系
CN104232582A (zh) * 2014-08-27 2014-12-24 军事医学科学院华南干细胞与再生医学研究中心 泊洛沙姆在诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化中的用途
CN110093313A (zh) * 2018-01-29 2019-08-06 华南生物医药研究院 促进造血干/祖细胞分化为红系细胞的诱导培养基及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
裴雪涛等: "CD_(34)~+造血祖细胞的定向诱导分化研究", 《中华血液学杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103597072B (zh) 单核细胞增殖剂、单核细胞增殖用培养基、单核细胞的制造方法、树突状细胞的制造方法、及树突状细胞疫苗的制造方法
Sandstrom et al. Effects of CD34+ cell selection and perfusion on ex vivo expansion of peripheral blood mononuclear cells
CN105713879B (zh) 一种用于脐带血造血干细胞扩增的培养体系及其应用
EP4095240A1 (en) Serum-free medium and culturing method suited for culturing blood cells such as human hematopoietic stem cells
CN104711225B (zh) Nk细胞的体外制备方法
CN110628718A (zh) 干细胞扩增培养基及干细胞培养方法
CN101864396A (zh) 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法
WO2018082316A1 (zh) 千金藤碱的应用以及一种扩增造血干细胞的培养基和方法
CN104845934A (zh) 脐血cd34+造血干细胞来源树突状细胞的大批量制备方法
CN111500535A (zh) 用于体外培养人自然杀伤细胞的方法和培养基
CN112608896A (zh) 一种nk细胞的培养方法及其应用
Li et al. Effects of flt-3 ligand in combination with TPO on the expansion of megakaryocytic progenitors
CN107201338B (zh) 诱导造血干祖细胞增殖和红系分化的方法及其应用
Majka, Monika Baj-Krzyworzeka, Jacek Kijowski, Ryan Reca, Janina Ratajczak, Mariusz Z. Ratajczak In vitro expansion of human megakaryocytes as a tool for studying megakaryocytic development and function
KR20050042046A (ko) 조혈 줄기세포의 증식방법
CN111172110B (zh) 一种脐带血cik细胞的培养方法
CN110551688B (zh) 一种诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞且促进造血干/祖细胞体外扩增的组合物及其应用
CN113025573A (zh) 培养诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基及方法
CN112300992B (zh) 一种nk细胞培养液及多级激活nk细胞的培养方法
TW202242096A (zh) 用於擴增並維持ＨＳＣｓ自我更新能力和分化潛能的培養基組合物及其應用
Mellado-Damas et al. Ex-vivo expansion and maturation of CD34-positive hematopoietic progenitors optimization of culture conditions
CN113502267A (zh) 一种用于外周血中nk细胞扩增的培养基及方法
CN113046310B (zh) 摇动培养促进造血干细胞诱导分化为巨核系细胞的培养基及方法
Bojko et al. Flt3 ligand and thrombopoietin serum levels during peripheral blood stem cell mobilization with chemotherapy and recombinant human glycosylated granulocyte colony-stimulating factor (rhu-G-CSF, lenograstim) and after high-dose chemotherapy
Hillman et al. Expansion of activated lymphocytes obtained from renal cell carcinoma in an automated hollow fiber bioreactor

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210625

RJ01 Rejection of invention patent application after publication