CN101864396A - 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法 - Google Patents

一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101864396A
CN101864396A CN 201010178856 CN201010178856A CN101864396A CN 101864396 A CN101864396 A CN 101864396A CN 201010178856 CN201010178856 CN 201010178856 CN 201010178856 A CN201010178856 A CN 201010178856A CN 101864396 A CN101864396 A CN 101864396A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
megakaryoblast
mononuclearcell
hydroxyethylamyle
bleeding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN 201010178856
Other languages
English (en)
Other versions
CN101864396B (zh
Inventor
裴雪涛
陈琳
师伟
刘大庆
岳�文
吕洋
李艳华
谢小燕
主鸿鹄
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Original Assignee
Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences filed Critical Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority to CN 201010178856 priority Critical patent/CN101864396B/zh
Publication of CN101864396A publication Critical patent/CN101864396A/zh
Priority to PCT/CN2010/002181 priority patent/WO2011143802A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101864396B publication Critical patent/CN101864396B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0644—Platelets; Megakaryocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2303—Interleukin-3 (IL-3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2306—Interleukin-6 (IL-6)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法及其专用培养基。该专用培养基是含有50ng/mL SCF、50ng/mL TPO、20ng/mL IL-3和50ng/mL IL-6的
Figure 201010178856.X_AB_0
无血清培养基。该方法包括以下步骤：1)用常规的Ficoll密度梯度离心方法从脐血中分离单个核细胞，其中用浓度为6％的羟乙基淀粉沉降脐血中的红细胞；2)将单个核细胞用专用培养基在37℃、5％CO2条件下体外培养4-14天，得到巨核祖细胞和巨核细胞混合物。本发明提供了一个巨核祖细胞和巨核细胞的补充来源，并具有操作简单、成本低廉和分化效率高等优点。本发明将在医学领域发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中单个核细胞的体外诱导方法，特别是涉及一种将单个核细胞体外诱导分化为巨核祖细胞和巨核细胞的方法。
背景技术
肿瘤(Tumor)是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致细胞克隆性异常增生而形成的新生物。肿瘤可分为良性和恶性两大类。恶性肿瘤是目前严重危害人类健康的主要疾病之一，其常规的治疗手段仍然是手术治疗并结合放化疗。当患者在接受高剂量放化疗后，骨髓造血功能低下，常会出现血小板减少，严重时会造成患者出血死亡。临床上常采用输注血小板，但血小板来源有限，存活期短，体外易失活，且反复输注血小板易导致输注无效并增加输血传播疾病的危险。1997年，Bertolini等(Bertolini等，Megakaryocytic progenitors can be expanded ex vivo and safely administeredto autologous peripheral blood progenitor cell transplant recipients.Blood1997，89(8)：2679)从外周血中分离CD34+，体外诱导扩增巨核细胞7天，用于患者血小板恢复。结果显示，体外诱导的巨核细胞可替代血小板输入，或减少血小板输入次数。2000年，Paquette等(Paquette等，Ex vivo expanded unselectedperipheral blood：progenitor cells reduce posttransplantation neutropenia，thrombocytopenia，and anemia in patients with breast cancer.Blood，2000，96(7)：2385)将体外动员的外周血细胞经体外诱导扩增巨核细胞9天后，用于改善大剂量化疗的乳腺癌病人中性粒细胞减少、血小板减少和贫血症状。Van denOudenrijn等(Van den Oudenrijn等Differences in megakaryocyte expansionpotential between CD34(+)stem cells derived from cord blood.peripheral bloodand bone marrow from adults and children.Exp Hematol，2000，28(9)：1054)对外周血、骨髓、脐血来源的CD34+细胞体外扩增进行比较，发现脐血来源的CD34+具有更强的巨核细胞扩增能力。由于脐血来源广泛、免疫原性低、对供者无损害、污染少、无伦理道德问题，已成为临床关注的焦点。由于脐血造血干细胞移植后血小板的恢复较外周血、骨髓慢，因此采用体外诱导、扩增巨核祖细胞和巨核细胞，然后输注患者体内，进一步发育成血小板，缩短血小板的恢复期。文献报道种子细胞多为CD34+细胞，而以单个核细胞为体外诱导扩增的种子细胞具有花费低，且操作简便，造血干细胞损失小等优点。
莫文健等人(莫文健等，无血清脐血巨核系祖细胞体外扩增的研究。中国实验血液学杂志，2004；12(2)：133-137；莫文健等，两步法脐血巨核细胞体外扩增的研究。中国输血杂志，2005；18(5)：381-383)公开了一种以单个核细胞进行体外诱导扩增的技术，其主要是用羟乙基淀粉从脐血中沉降红细胞(脐血与6％羟乙基淀粉按5∶1比例混合)，然后经PBS洗涤，Ficoll分离单个核细胞。单个核细胞加入无血清培养液中孵育2h去掉黏附细胞，再在含诱导因子的无血清培养基(含细胞因子终浓度为50ng/ml TPO，20ng/ml IL-3、50ng/ml SCF，20ng/ml IL-6的StemSpanTM SFEM无血清培养基)中进行培养、诱导分化得到巨核细胞。然而该文献介绍的方法较为繁琐，且脐血单个核细胞扩增后10天CD41+细胞百分数16.68±1.27％，14天CD41+细胞表达量为24.41±1.90％，显示表达量不高。
发明内容
本发明提供了一种操作简便且可以提高表达量的体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法及其专用培养基。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：用于体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的专用培养基，命名为st36无血清培养基，是在
Figure GSA00000126734200021
无血清培养基中，加入细胞因子TPO终浓度为50ng/mL、IL-3终浓度为20ng/mL、SCF终浓度为50ng/mL、IL-6终浓度为50ng/mL。
所述为进口无血清培养基(生产商：加拿大stemcell公司)。
本发明的第二个目的是提供一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法。
本发明所提供的体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法，可包括以下步骤：
1)单个核细胞的分离：用常规的Ficoll密度梯度离心方法从脐血中分离单个核细胞，其中，采用质量/体积百分比浓度为6％(g/100ml)的羟乙基淀粉(生产商：美国B.BRAUN公司)沉降脐血中的红细胞；
2)细胞培养和诱导分化：将单个核细胞接种于st36无血清培养基中，在37℃、5％C02条件下体外培养4-14天，取第4-14天的细胞得到巨核祖细胞和巨核细胞混合物。优选体外培养7-14天。
在上述方法中，所述步骤1)中6％羟乙基淀粉与脐血的混合比例为1∶2-1∶3(羟乙基淀粉的终浓度为1.5％-2.0％)，优选为1∶3(羟乙基淀粉的终浓度为1.5％)；单个核细胞的分离方法具体为：用6％的羟乙基淀粉按比例与脐血混合沉降红细胞30min，吸取上清，1800rpm离心5min，将细胞悬于生理盐水中，再将细胞悬液缓慢加入等体积的人淋巴细胞分离液表面，22℃、2000rpm离心25min，得到单个核细胞。
步骤2)中单个核细胞的接种量为106细胞/ml；在培养第4、7、10天时进行原体积的1/3量补液，加入新鲜培养基和细胞因子。
用上述方法获得的巨核祖细胞和巨核细胞也属于本发明的保护范围。其中，体外培养7-10天得到的巨核祖细胞和巨核细胞形态和活性最优。
本发明主要提供了一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法及其专用培养基。在分离单个核细胞过程中，首先要沉降红细胞，采用羟乙基淀粉、明胶、甲基纤维素等均可获得较好的结果，但明胶、甲基纤维素不适用于临床应用，而本发明采用的羟乙基淀粉是红细胞沉降剂，它可加快红细胞的沉降效率，阻碍白细胞和内皮细胞的黏附，从而达到直接分离红细胞的目的；本发明还优化了羟乙基淀粉的使用浓度，提高了有核细胞的收率；本发明进而将沉降红细胞后的上清按体积比1∶1缓慢加入人淋巴细胞分离液(FICOLL)上，进行密度梯度离心，可得到纯度较高的单个核细胞。本发明中省去了分离的单个核细胞去黏附细胞的操作而直接进行诱导，从而简化了操作过程，减少了污染，缩短了时间。另一方面，本发明在细胞培养和诱导分化过程中，通过采用合适的培养基并合理配伍使用各种细胞因子(特别是调整了IL-6的终浓度为50ng/mL)，选择恰当的补液时机(在培养第4、7、10天)和补液量(按原体积1/3量补液)进行体外扩增巨核细胞，获得了最佳扩增效果和表达量。本发明将脐血单个核细胞高效诱导分化为巨核祖细胞和巨核细胞的方法，具有操作简单、成本低廉和分化效率高等优点，并提供了一个巨核祖细胞和巨核细胞的补充来源，将在医学领域发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为不同浓度羟乙基淀粉沉降红细胞效果比较结果
图2为含不同因子组合的国产无血清培养基体外诱导脐血单个核细胞7dCD41/CD61表达情况
图3为含st36(SCF、TPO、IL-3、IL-6)因子组合的进口无血清培养基体外诱导不同时间的细胞形态(×200)
图4为脐血单个核细胞体外诱导后细胞瑞氏吉姆萨染色(×1000)
图5为脐血单个核细胞体外诱导不同时间半固体培养CFU-MK集落数
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所述百分比浓度均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。
实施例1：培养基中因子组合的确定
实验一、采用含不同细胞因子组合的国产无血清培养基诱导脐血单个核细胞，观察表达CD41/CD61细胞数的变化
该实验中所用国产无血清培养基为购自北京博特纳科技有限公司的BTN无血清培养基。
将单个核细胞(从脐血中获得，分离单个核细胞的过程参见实施例2)接种于24孔板中，每孔1ml，106细胞/ml。培养基分别为：
培养基A：国产无血清培养基，其中含116t因子组合：10ng/mL IL-11、10ng/mLIL-6、100ng/mL TPO。
培养基B：国产无血清培养基，其中含st36因子组合：50ng/mL SCF、50ng/mLTPO、20ng/mL IL-3、50ng/mLIL-6。
培养基C：国产无血清培养基，其中含pt36因子组合：50ng/mL PDGF、50ng/mLTPO、20ng/mL IL-3、50ng/mL IL-6。
培养基D：国产无血清培养基，其中含pst36因子组合：50ng/mL PDGF、50ng/mLSCF、50ng/mL TPO、20ng/mL IL-3、50ng/mL IL-6。
培养条件：37℃、5％CO2培养箱体外培养7d。于第4d进行1/3量补液，加入新鲜培养基(含有与原培养基相同浓度的因子)。
采用含不同细胞因子组合的国产无血清培养基诱导脐血单个核细胞，观察表达D41/CD61阳性细胞数的变化，结果培养基B效果较好(图2)，确定本发明采用的因子组合为st36因子组合。
实验二、培养基B与含st36因子组合的进口无血清培养基(培养基E)对脐血单个核细胞体外诱导分化影响
实验中所用进口无血清培养基为
Figure GSA00000126734200041
SFEM无血清培养基，生产商为加拿大stemcell公司。
与实验一类似，采用培养基E，(含st36因子组合，即50ng/mL SCF、50ng/mLTPO、20ng/mL IL-3、50ng/mL IL-6的
Figure GSA00000126734200042
无血清培养基)，体外诱导培养单个核细胞4d、7d、10d、14d，分别于第4d、7d、10d按原体积的1/3量补液，加入新鲜培养液和相同浓度的因子。
结果表明，采用培养基E体外诱导脐血单个核细胞表明，随着诱导时间延长，细胞数增加，CD41/CD6表达提高(表1)。在观察培养基B与培养基E对脐血单个核细胞诱导分化影响，发现随着诱导时间延长，脐血单个核细胞经培养基B体外诱导培养(参见实验一)存活率降低，细胞状态不佳。而以培养基E作为培养诱导体系，细胞存活时间延长，存活率提高。随着细胞培养诱导时间延长，出现贴壁的基质细胞，以及呈卵圆形、圆形的悬浮细胞，大小不一，且细胞数逐渐增加，体积变大。表明，在贴壁生长的基质细胞作用下，悬浮的脐血干细胞向巨核祖细胞和巨核细胞分化，逐渐成熟，扩增。因此，确定采用培养基E作为用于体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的专用培养基。
表1体外培养诱导脐血单个核细胞不同时间细胞数变化和CD41/CD6表达(n＝5)
Figure GSA00000126734200051
通过以上实验确定本发明用于体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的专用培养基(即培养基E，命名为st36无血清培养基)，是在进口无血清培养基(无血清培养基)中，加入的细胞因子TPO终浓度为50ng/mL、IL-3终浓度为20ng/mL、SCF终浓度为50ng/mL、IL-6终浓度为50ng/mL。
实施例2、体外诱导脐血单个核细胞分化为巨核祖细胞和巨核细胞及检测
实验三、不同浓度的羟乙基淀粉(HES)沉降脐血红细胞的沉降效果比较
将6％羟乙基淀粉与脐血按一定比例混合，使羟乙基淀粉终浓度分别为2.0％、1.5％、1.2％、1.0％(“％”含义为“g/100ml”)，室温沉降红细胞30min，比较沉降效果。然后，小心吸取上清，1800rpm离心5min，细胞悬于生理盐水中，将细胞悬液缓慢加入等体积的人淋巴细胞分离液(FICOLL，中国医学科学院生物工程研究所灏洋生物)表面，22℃、2000rpm离心25min，收集单个核细胞层，生理盐水洗涤2次，细胞计数。
比较2.0％、1.5％、1.2％、1.0％浓度的羟乙基淀粉沉降脐血红细胞的沉降效果，结果显示2.0％或1.5％羟乙基淀粉的沉降效果较好(6％羟乙基淀粉与脐血按1∶2或1∶3比例混合)，其中1.5％羟乙基淀粉的沉降效果最佳(图1，1～4：羟乙基淀粉浓度分别为2.0％、1.5％、1.2％、1.0％)，且回收的有核细胞量最多(表1)。
表2不同浓度羟乙基淀粉沉降红细胞后获得有核细胞的量
Figure GSA00000126734200061
n＝4与1.5％的HES相比，*：p＜0.05，f：p＜0.05
以下操作中使用6％的羟乙基淀粉并使其终浓度为1.5％。
一、体外诱导脐血单个核细胞分化为巨核祖细胞和巨核细胞
用本发明的方法体外诱导脐血单个核细胞分化为巨核祖细胞和巨核细胞，具体包括以下步骤：
1)单个核细胞的分离：用常规的Ficoll密度梯度离心方法从脐血中分离单个核细胞，具体方法为：用6％羟乙基淀粉与脐血按1∶3体积比混合(羟乙基淀粉的终浓度为1.5％)沉降红细胞30min，吸取上清，1800rpm离心5min，将细胞悬于生理盐水中，再将细胞悬液缓慢加入等体积的人淋巴细胞分离液上，22℃、2000rpm离心25min，得到单个核细胞。
2)细胞培养和诱导分化：将单个核细胞接种于24孔板中，每孔1ml，106细胞/ml，添加实施例1确定的培养基E中，在37℃、5％CO2条件下体外培养，并在培养第4、7、10天时进行原体积的1/3量补液，加入新鲜培养基，取4、7、10、14天得到的巨核祖细胞和巨核细胞混合物。
二、细胞形态观察
用倒置显微镜观察诱导的单个核细胞不同时间点细胞的大体形态变化。瑞氏吉姆萨染色，普通光学显微镜观察诱导分化的巨核祖细胞和巨核细胞。
单个核细胞接种培养基后于倒置显微镜下观察，可见细胞小，圆形。随着培养时间延长，细胞数增加，出现梭形贴壁细胞，圆形、卵圆形细胞，大小不一，且细胞体积逐渐变大。7天后细胞增殖明显(图3，(1)～(5)：分别为体外诱导0d、4d、7d、10d、14d的细胞形态)。瑞氏吉姆萨染色，可见有不同阶段巨核细胞存在。光学显微镜下观察显示有原巨核，幼巨核细胞(核大，紫红色，细胞边缘不规则，可有指状突起)和颗粒型巨核细胞(胞体巨大，胞质丰富，含细小紫红色颗粒，核互相聚集呈环状)存在，10天后出现成熟的巨核细胞(参见图4其中箭头所指细胞，①②：诱导10d巨核细胞③④：诱导14d巨核细胞)。
三、流式细胞仪检测
诱导4d、7d、10d、14d获得的巨核祖细胞和巨核细胞分别用生理盐水洗涤，并将诱导不同时间的细胞均分成两管，各加入鼠抗人CD41--PE、CD61-FITC抗体和鼠的IgG1-PE、IgG1-FITC抗体(英国peprotech公司)，4℃、30min孵育，流式细胞仪检测CD41/CD61表达。数据参见表3。
表3体外培养诱导脐血单个核细胞不同时间细胞数变化和CD41/CD6表达(n＝5)
Figure GSA00000126734200071
结果诱导10d、14d时，CD41/CD61表达分别达到20％、54％，该数据与莫文健等人(莫文健等，无血清脐血巨核系祖细胞体外扩增的研究。中国实验血液学杂志，2004；12(2)：133-137；莫文健等，两步法脐血巨核细胞体外扩增的研究。中国输血杂志，2005；18(5)：381-383)报道的结果(脐血单个核细胞扩增后10天CD41+细胞百分数16.68±1.27％，14天CD41+细胞表达量为24.41±1.90％)相比，定向诱导巨核细胞的效果更佳。
本发明获得较好的表达量，与培养基中使用的因子浓度、诱导过程的补液的时机、补液方式有关，且单个核细胞接种后贴壁的基质细胞可能也有利于细胞诱导分化。
四、巨核祖细胞集落培养
采用含0.9％甲基纤维素，1％BSA，10-4M β-巯基乙醇，200μg/mL人转铁蛋白，10μg/mL重组人胰岛素，2mM L-谷氨酰胺，10ng/mL rhIL-6，10ng/mL rhIL-3，50ng/mL rhTPO的巨核祖细胞集落培养基对步骤2)获得的体外诱导培养0、7、10、14d的巨核祖细胞进行集落培养10-12天，倒置显微镜下计CFU-MK集落数。
结果如图5所示，随着单个核细胞在培养基E中诱导时间的延长，CFU-MK集落数呈增加趋势。体外诱导7d、10d、14d的细胞，CFU-MK集落数均高于未诱导的单个核细胞，且差别非常显著(P＜0.01)。表明，增加体外诱导时间，可获得更多的巨核祖细胞。
实施例2确定了本发明较好的体外诱导脐血单个核细胞分化为巨核祖细胞和巨核细胞的方法，并且，取使用该方法体外诱导7d-14d的细胞表达量有明显提高，而从获得的细胞形态和活性看，7d-10d的细胞较好。

Claims (10)

1.用于体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的专用培养基，命名为st36无血清培养基，是含有终浓度50ng/mL SCF、50ng/mL TPO、20ng/mL IL-3和50ng/mL IL-6的st36因子组合的
Figure FSA00000126734100011
无血清培养基。
2.一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法，包括以下步骤：
1)单个核细胞的分离：用常规的Ficoll密度梯度离心方法从脐血中分离单个核细胞，其中，采用质量/体积(W/V)百分比浓度为6％的羟乙基淀粉沉降脐血中的红细胞；
2)细胞培养和诱导分化：将单个核细胞接种于用权利要求1所述专用培养基中，在37℃、5％CO2条件下体外培养4-14天，取4-14天的悬浮细胞得到巨核祖细胞和巨核细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中6％羟乙基淀粉与脐血的混合比例为1∶2-1∶3，使羟乙基淀粉的终浓度为1.5％-2.0％。
4.根据权利要求2或3所述的培养方法，其特征在于：所述步骤2)培养时间为7-14天。
5.根据权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于：所述步骤1)单个核细胞的分离过程为：用6％的羟乙基淀粉沉降按与脐血按比例混合沉降红细胞30min，吸取上清，1800rpm离心5min，将细胞悬于生理盐水中，再将细胞悬液缓慢加入等体积的人淋巴细胞分离液表面，22℃、2000rpm离心25min，得到单个核细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中6％羟乙基淀粉与脐血的混合比例为1∶3，使羟乙基淀粉的终浓度为1.5％。
7.根据权利要求2至6任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)得到的单个核细胞直接用于步骤2)的细胞培养和诱导分化中，无需增加去掉单个核细胞中的黏附细胞的过程。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)在培养第4、7、10天时进行原体积的1/3量补液，加入新鲜权利要求1所述专用培养基。
9.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中单个核细胞的接种量为106细胞/ml。
10.用权利要求2-9任一项所述方法获得的巨核祖细胞和巨核细胞混合物，优选步骤2)中体外培养7-10天得到的巨核祖细胞和巨核细胞混合物。
CN 201010178856 2010-05-17 2010-05-17 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法 Active CN101864396B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010178856 CN101864396B (zh) 2010-05-17 2010-05-17 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法
PCT/CN2010/002181 WO2011143802A1 (zh) 2010-05-17 2010-12-28 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010178856 CN101864396B (zh) 2010-05-17 2010-05-17 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101864396A true CN101864396A (zh) 2010-10-20
CN101864396B CN101864396B (zh) 2012-08-22

Family

ID=42956322

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201010178856 Active CN101864396B (zh) 2010-05-17 2010-05-17 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN101864396B (zh)
WO (1) WO2011143802A1 (zh)

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011143802A1 (zh) * 2010-05-17 2011-11-24 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法
CN102517253A (zh) * 2011-12-19 2012-06-27 上海市血液中心 一种脐带血调节性t细胞体外扩增及低温保存方法
CN102533650A (zh) * 2011-12-30 2012-07-04 北京京蒙高科干细胞技术有限公司 一种细胞分离介质及细胞分离方法
CN104232582A (zh) * 2014-08-27 2014-12-24 军事医学科学院华南干细胞与再生医学研究中心 泊洛沙姆在诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化中的用途
CN104789530A (zh) * 2015-05-12 2015-07-22 广州市天河诺亚生物工程有限公司 一种增加脐带血巨核祖细胞定向分化数量的方法
CN105126083A (zh) * 2015-08-27 2015-12-09 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种巨核祖细胞制剂及其应用、制备方法
CN105420192A (zh) * 2015-10-12 2016-03-23 王泰华 外周血中分离富集造血干细胞的方法
CN106479976A (zh) * 2016-11-07 2017-03-08 浙江绿蔻生物技术有限公司 一种脐带血巨核祖细胞体外培养的方法
CN105296420B (zh) * 2015-11-27 2019-02-22 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种细胞培养液及其在培养巨核祖细胞中的应用
CN110055220A (zh) * 2019-01-29 2019-07-26 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 造血干细胞诱导分化为巨核细胞的方法
CN110055217A (zh) * 2019-01-29 2019-07-26 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 获得巨核细胞及血小板的方法
CN113025573A (zh) * 2020-12-30 2021-06-25 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 培养诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基及方法
JP7521738B2 (ja) 2020-05-18 2024-07-24 キヤノン株式会社 目的細胞の生産方法、目的細胞による生産物の生産方法、および無血清培地

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1556197A (zh) * 2003-12-30 2004-12-22 上海伯瑞生物技术发展有限公司 由脐血cd34+细胞体外诱导生成巨核细胞的方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008151386A1 (en) * 2007-06-15 2008-12-18 Australian Stem Cell Centre Ltd Megakaryocyte differentiation
CN101864396B (zh) * 2010-05-17 2012-08-22 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1556197A (zh) * 2003-12-30 2004-12-22 上海伯瑞生物技术发展有限公司 由脐血cd34+细胞体外诱导生成巨核细胞的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《中国实验血液学杂志》 20040430 莫文健等 无血清脐血巨核系祖细胞体外扩增的研究 第133-137页 1-10 第12卷, 第2期 *
《中国实验血液学杂志》 20040430 莫文健等 无血清脐血巨核系祖细胞体外扩增的研究 第133-137页 1-10 第12卷, 第2期 2 *
《中国输血杂志》 20040430 迟占有等 羟乙基淀粉沉降法分离脐血过程的深入分析及条件优化 第71-73页 3-9 第17卷, 第2期 *
《中国输血杂志》 20040430 迟占有等 羟乙基淀粉沉降法分离脐血过程的深入分析及条件优化 第71-73页 3-9 第17卷, 第2期 2 *

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011143802A1 (zh) * 2010-05-17 2011-11-24 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法
CN102517253A (zh) * 2011-12-19 2012-06-27 上海市血液中心 一种脐带血调节性t细胞体外扩增及低温保存方法
CN102517253B (zh) * 2011-12-19 2014-04-02 上海市血液中心 一种脐带血调节性t细胞体外扩增及低温保存方法
CN102533650A (zh) * 2011-12-30 2012-07-04 北京京蒙高科干细胞技术有限公司 一种细胞分离介质及细胞分离方法
CN102533650B (zh) * 2011-12-30 2014-05-21 北京京蒙高科干细胞技术有限公司 一种细胞分离介质及细胞分离方法
CN104232582A (zh) * 2014-08-27 2014-12-24 军事医学科学院华南干细胞与再生医学研究中心 泊洛沙姆在诱导造血干祖细胞增殖和/或巨核分化中的用途
CN104789530B (zh) * 2015-05-12 2017-10-13 广州市天河诺亚生物工程有限公司 一种增加脐带血巨核祖细胞定向分化数量的方法
CN104789530A (zh) * 2015-05-12 2015-07-22 广州市天河诺亚生物工程有限公司 一种增加脐带血巨核祖细胞定向分化数量的方法
CN105126083A (zh) * 2015-08-27 2015-12-09 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种巨核祖细胞制剂及其应用、制备方法
CN105126083B (zh) * 2015-08-27 2019-02-19 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种巨核祖细胞制剂及其应用、制备方法
CN105420192A (zh) * 2015-10-12 2016-03-23 王泰华 外周血中分离富集造血干细胞的方法
CN105296420B (zh) * 2015-11-27 2019-02-22 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种细胞培养液及其在培养巨核祖细胞中的应用
CN106479976A (zh) * 2016-11-07 2017-03-08 浙江绿蔻生物技术有限公司 一种脐带血巨核祖细胞体外培养的方法
CN110055220A (zh) * 2019-01-29 2019-07-26 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 造血干细胞诱导分化为巨核细胞的方法
CN110055217A (zh) * 2019-01-29 2019-07-26 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 获得巨核细胞及血小板的方法
CN110055220B (zh) * 2019-01-29 2021-03-30 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 造血干细胞诱导分化为巨核细胞的方法
JP7521738B2 (ja) 2020-05-18 2024-07-24 キヤノン株式会社 目的細胞の生産方法、目的細胞による生産物の生産方法、および無血清培地
CN113025573A (zh) * 2020-12-30 2021-06-25 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 培养诱导造血干细胞分化为巨核系细胞的补液培养基及方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN101864396B (zh) 2012-08-22
WO2011143802A1 (zh) 2011-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101864396B (zh) 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法
Nielsen Bioreactors for hematopoietic cell culture
Sandstrom et al. Effects of CD34+ cell selection and perfusion on ex vivo expansion of peripheral blood mononuclear cells
Bari et al. Expansion and homing of umbilical cord blood hematopoietic stem and progenitor cells for clinical transplantation
JP5577472B2 (ja) 単球増殖剤、単球増殖用培地、単球の製造方法、樹状細胞の製造方法、及び樹状細胞ワクチンの製造方法
CN107460167A (zh) 一种无滋养细胞的nk细胞的扩增方法
CN102994449A (zh) 一种体外扩增nk细胞的方法
JP2022121446A (ja) 幹細胞移植のための方法および組成物
CN101597594A (zh) 一种造血干祖细胞的培养方法
WO2008056963A1 (en) Method for proliferating stem cells with leptin
CN104711225A (zh) Nk细胞的体外制备方法
CN1286970C (zh) 由脐血cd34+细胞体外诱导生成巨核细胞的方法
CN103740644A (zh) 一种基于3d培养体系的扩增造血干细胞的方法
JP6112462B2 (ja) 造血幹細胞及び前駆細胞のエクスビボ増殖のための方法
CN112608896A (zh) 一种nk细胞的培养方法及其应用
CN115039763A (zh) 一种免疫细胞冻存液
Li et al. Effects of flt-3 ligand in combination with TPO on the expansion of megakaryocytic progenitors
CN110607276A (zh) 高效扩增脐带血nk细胞的无血清培养方法
CN109370988A (zh) 干细胞体外扩增培养体系及其方法
KR20050042046A (ko) 조혈 줄기세포의 증식방법
Mukhopadhyay et al. Hematopoietic stem cells: clinical requirements and developments in ex-vivo culture
EP1743024B1 (en) Method of expanding cord blood cells
WO2023072813A1 (en) Methods for expanding natural killer cells (nk cells)
CN104195107A (zh) 微囊泡在诱导干细胞巨核分化中的用途
JPH08205860A (ja) 造血細胞の膨大化および移植方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20101020

Assignee: SOUTH CHINA CENTER FOR STEM CELL BIOLOGY AND REGENERATIVE MEDICINE OF ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES

Assignor: Inst. of Field Blood Transfusion, Academy of Military Medical Sciences, PLA

Contract record no.: 2015990000123

Denomination of invention: Method for inducing megakaryoblast and megakaryocyte in vitro

Granted publication date: 20120822

License type: Exclusive License

Record date: 20150324

LICC Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model