WO2011143802A1

WO2011143802A1 - 一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法

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Publication number: WO2011143802A1
Application number: PCT/CN2010/002181
Authority: WO
Inventors: 裴雪涛; 陈琳; 师伟; 刘大庆; 岳�文; 吕洋; 李艳华; 谢小燕; 主鸿鹄
Original assignee: 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所
Priority date: 2010-05-17
Filing date: 2010-12-28
Publication date: 2011-11-24
Also published as: CN101864396B; CN101864396A

Description

一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法技术领域

本发明涉及生物技术领域中单个核细胞的体外诱导方法，特别是涉及一种将单个核细胞体外诱导分化为巨核祖细胞和巨核细胞的方法。背景技术

肿瘤（Tumor)是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致细胞克隆性异常增生而形成的新生物。肿瘤可分为良性和恶性两大类。恶性肿瘤是目前严重危害人类健康的主要疾病之一，其常规的治疗手段仍然是手术治疗并结合放化疗。当患者在接受高剂量放化疗后，骨髓造血功能低下，常会出现血小板减少，严重时会造成患者出血死亡。临床上常采用输注血小板，但血小板来源有限，存活期短，体外易失活，且反复输注血小板易导致输注无效并增加输血传播疾病的危险。 1997年， Bertolini等（Bertolini等， Megakaryocytic progenitors can be expanded ex vivo and safely administered to autologous peripheral blood progenitor cell transplant recipients. Blood 1997, 89 ( 8 ) : 2679 ) 从外周血中分离 CD34+, 体外诱导扩增巨核细胞 7天，用于患者血小板恢复。结果显示，体外诱导的巨核细胞可替代血小板输入，或减少血小板输入次数。 2000年， Paquette等（Paquette等， Ex vivo expanded unselected peripheral blood： progenitor cel ls reduce posttransplantation neutropenia, thrombocytopenia, and anemia in patients with breast cancer. Blood, 2000, 96 (7) : 2385 ) 将体外动员的外周血细胞经体外诱导扩增巨核细胞 9天后，用于改善大剂量化疗的乳腺癌病人中性粒细胞减少、血小板减少和贫血症状。 Van den Oudemri jn等 (Van den Oudenrijn等 Differences in megakaryocyte expansion potent ial between CD34 (+) stem cells derived from cord blood, peripheral blood and bone marrow from adults and chi ldren. Exp Hematol , 2000, 28 (9) : 1054 ) 对外周血、骨髓、脐血来源的 CD34+细胞体外扩增进行比较，发现脐血来源的 CD34 ⁺具有更强的巨核细胞扩增能力。由于脐血来源广泛、免疫原性低、对供者无损害、污染少、无伦理道德问题，已成为临床关注的焦点。由于脐血造血干细胞移植后血小板的恢复较外周血、骨髓慢，因此采用体外诱导、扩增巨核祖细胞和巨核细胞，然后输注患者体内，进一步发育成血小板，缩短血小板的恢复期。文献报道种子细胞多为 CD34+细胞，而以单个核细胞为体外诱导扩增的种子细胞具有花费低，且操作简便，造血干细胞损失小等优点。

莫文健等人（莫文健等，无血清脐血巨核系祖细胞体外扩增的研究。中.国实验一血液学杂志， 2004; 12(2)： 133-137；莫文健等，两步法脐血巨核细胞体外扩增的研究。中国输血杂志， 2005; 18(5)： 381-383) 公幵了一种以单个核细胞进行体外诱导扩增的技术，其主要是用羟乙基淀粉从脐血中沉降红细胞（脐血与 6%羟乙基淀粉按 5:1比例混合），然后经 PBS洗涤， Ficoll分离单个核细胞。单个核细胞加入无血清培养液中孵育 2h去掉黏附细胞，再在含诱导因子的无血清培养基（含细胞因子终浓度为 50ng/ml TP0, 20ng/ml IL- 3、 50ng/ml SCF， 20ng/ml IL- 6的 StemSparTSFEM无血清培养基）中进行培养、诱导分化得到巨核细胞。然而该文献介绍的方法较为繁琐，且脐血单个核细胞扩增后 10天 CD41+细胞百分数 16.68±1.27 %, 14天 CD41+细胞表达量为 24.41±1.90%，显示表达量不高。发明内容

本发明提供了一种操作简便且可以提高表达量的体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法及其专用培养基。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：用于体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的专用培养基，命名为 st36无血清培养基，是在 StemSpan®无血清培养基中，加入细胞因子 TP0终浓度为 50ng/mL、 IL 3终浓度为 20ng/mL、 SCF终浓度为

50ng/mL、 IL- 6终浓度为 50ng/mL。

所述 StemSpan®为进口无血清培养基（生产商：加拿大 stemcell公司）。

本发明的第二个目的是提供一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法。

本发明所提供的体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法，可包括以下步骤：

1) 单个核细胞的分离：用常规的 Ficoll密度梯度离心方法从脐血中分离单个核细胞，其中，采用质量 /体积百分比浓度为 6%(g/100ml)的羟乙基淀粉（生产商：美国 B.BRAUN公司）沉降脐血中的红细胞；

2)细胞培养和诱导分化：将单个核细胞接种于 st36无血清培养基中，在 37°C、 5%∞₂条件下体外培养 4一 14天，取第 4-14天的细胞得到巨核祖细胞和巨核细胞混合物。优选体外培养 7- 14天。

在上述方法中，所述步骤 1) 中 6%(g/100ml)羟乙基淀粉与脐血的混合比例为 1： 2-1： 3 (羟乙基淀粉的终浓度为 1.5%— 2.0%) ，优选为 1:3 (羟乙基淀粉的终浓度为 1.5%) ；单个核细胞的分离方法具体为：用 6%的羟乙基淀粉按比例与脐血混合沉降红细胞 30min，吸取上清， 1800rpm离心 5min，将细胞悬于生理盐水中，再将细胞悬液缓慢加入等体积的人淋巴细胞分离液表面，22°C、2000rpm离心 25min，得到单个核细胞。

步骤 2 ) 中单个核细胞的接种量为 ^^细胞/!^ ; 在培养第 4、 7、 10天时进行原体积的 1/3量补液，加入新鲜培养基和细胞因子。

用上述方法获得的巨核祖细胞和巨核细胞也属于本发明的保护范围。其中，体外培养 7-10天得到的巨核祖细胞和巨核细胞形态和活性最优。

本发明主要提供了一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法及其专用培养基。在分离单个核细胞过程中，首先要沉降红细胞，采用羟乙基淀粉、明胶、甲基纤维素等均可获得较好的结果，但明胶、甲基纤维素不适用于临床应用，而本发明采用的羟乙基淀粉是红细胞沉降剂，它可加快红细胞的沉降效率，阻碍白细胞和内皮细胞的黏附，从而达到直接分离红细胞的目的；本发明还优化了羟乙基淀粉的使用浓度，提高了有核细胞的收率；本发明进而将沉降红细胞后的上清按体积比 1 : 1 缓慢加入人淋巴细胞分离液（FIC0LL ) 上，进行密度梯度离心，可得到纯度较高的单个核细胞。本发明中省去了分离的单个核细胞去黏附细胞的操作而直接进行诱导，从而简化了操作过程，减少了污染，缩短了时间。另一方面，本发明在细胞培养和诱导分化过程中，通过采用合适的培养基并合理配伍使用各种细胞因子（特别是调整了 IL-6的终浓度为 50n_g/mL) ，选择恰当的补液时机（在培养第 4、 7、 10天）和补液量（按原体积 1/3量补液）进行体外扩增巨核细胞，获得了最佳扩增效果和表达量。本发明将脐血单个核细胞高效诱导分化为巨核祖细胞和巨核细胞的方法，具有操作简单、成本低廉和分化效率高等优点，并提供了一个巨核祖细胞和巨核细胞的补充来源，将在医学领域发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。附图说明

图 1为不同浓度羟乙基淀粉沉降红细胞效果比较结果

图 2为含不同因子组合的国产无血清培养基体外诱导脐血单个核细胞 7d

CD41/CD61表达情况

图 3为含 st36 ( SCF、 TP0、 IL-3、 IL-6 ) 因子组合的进口无血清培养基体外诱导不同时间的细胞形态 ( X 200 )

图 4为脐血单个核细胞体外诱导后细胞瑞氏吉姆萨染色（X 1000)

图 5为脐血单个核细胞体外诱导不同时间半固体培养 CFU-MK集落数具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法， "％"表示的浓度为质量 / 体积 (W/V， g/100ml)百分比浓度或体积百分比浓度。

实施例 1 : 培养基中因子组合的确定

实验一、采用含不同细胞因子组合的国产无血清培养基诱导脐血单个核细胞，观察表达 CM1/CD61细胞数的变化

该实验中所用国产无血清培养基为购自北京博特纳科技有限公司的 BTN无血清 i¾*养基。

将单个核细胞（从脐血中获得，分离单个核细胞的过程参见实施例 2 ) 接种于 24孔板中，每孔 lml， 10^fi细胞 /ml。培养基分别为：

培养基 A: 国产无血清培养基，其中含 116t因子组合： 10ng/mL IL- 11、 10ng/mL IL_6、 lOOng/mL TP0。

培养基 B: 国产无血清培养基，其中含 st36因子组合： 50ng/mL SCF、 50ng/mL TP0、 20ng/mL IL-3、 50n_g/tnLIL 6。

培养基 C: 国产无血清培养基，其中含 pt36因子组合： 50ng/mL PDGF、 50ng/mL TP0、 20ng/mL IL- 3、 50ng/mL IL- 6。

培养基 D: 国产无血清培养基，其中含 pst36因子组合： 50ng/mL PDGF、 50ng/mL SCF、 50ng/mL TP0、 20ng/mL IL_3、 50ng/mL IL - 6。

培养条件： 37°C、 5%∞₂培养箱体外培养 7d。于第 4d进行 1/3量补液，加入新鲜培养基（含有与原培养基相同浓度的因子）。

采用含不同细胞因子组合的国产无血清培养基诱导脐血单个核细胞，观察表达 D41/CD61阳性细胞数的变化，结果培养基 B效果较好（图 2 ) ，确定本发明采用的因子组合为 st36因子组合。实验二、培养基 B与含 st36因子组合的进口无血清培养基（培养基 E ) 对脐血单个核细胞体外诱导分化影响

实验中所用进口无血清培养基为 StemSpan® SFEM无血清培养基，生产商为加拿大 stemcell公司。

与实验一类似，采用培养基 E，（含 st36因子组合，即 50ng/mL SCF、 50ng/mL TP0、 20ng/mL IL- 3、 50ng/mL IL- 6的 StemSpan®无血清培养基），体外诱导培养单个核细胞 4d、 7d、 10d、 14d，分别于第 4d、 7d、 lOd按原体积的 1/3量补液，加入新鲜培养液和相同浓度的因子。

结果表明，采用培养基 E体外诱导脐血单个核细胞表明，随着诱导时间延长，细胞数增加， CD41/CD6表达提高（表 1) 。在观察培养基 B与培养基 E对脐血单个核细胞诱导分化影响，发现随着诱导时间延长，脐血单个核细胞经培养基 B体外诱导培养（参见实验一）存活率降低，细胞状态不佳。而以培养基 E作为培养诱导体系，细胞存活时间延长，存活率提高。随着细胞培养诱导吋间延长，出现贴壁的基质细胞，以及呈卵圆形、圆形的悬浮细胞，大小不一，且细胞数逐渐增加，体积变大。表明，在贴壁生长的基质细胞作用下，悬浮的脐血干细胞向巨核祖细胞和巨核细胞分化，逐渐成熟，扩增。因此，确定采用培养基 E作为用于体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的专用培养基。

表 1 体外培养诱导脐血单个核细胞

不同时间细胞数变化和 CD41/CD6表达（n=5)

时间细胞数（xlO⁵) CD41/CD61 (%)

4d 3.75±0.06 10.33±2.11

7d 10.62±2· 28 17.56±5.40

10d 19·56±6.05 20.53±1.65

14d 21.46 ±2.04 54.27±6.31 通过以上实验确定本发明用于体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的专用培养基

(即培养基 E，命名为 st36无血清培养基），是在进口无血清培养基（StemSpan® 无血清培养基）中，加入的细胞因子 TP0终浓度为 50ng/mL、 IL- 3终浓度为 20ng/mL、 SCF终浓度为 50ng/mL、 IL-6终浓度为 50ng/mL。实施例 2、体外诱导脐血单个核细胞分化为巨核祖细胞和巨核细胞及检测实验三、不同浓度的羟乙基淀粉（HES) 沉降脐血红细胞的沉降效果比较将 6%羟乙基淀粉与脐血按一定比例混合，使羟乙基淀粉终浓度分别为 2.0%、 1.5%、 1.2%、 1.0% ( "% " 含义为 "_g/100ml" )，室温沉降红细胞 30min, 比较沉降效果。然后，小心吸取上清， 1800rpm离心 5_min，细胞悬于生理盐水中，将细胞悬液缓慢加入等体积的人淋巴细胞分离液（FIC0LL, 中国医学科学院生物工程研究所灏洋生物）表面， 22°C、 2000rp_m离心 25min，收集单个核细胞层，生理盐水洗涤 2次，细胞计数。

比较 2.0%、 1.5%、 1.2%、 1.0%浓度的羟乙基淀粉沉降脐血红细胞的沉降效果，结果显示 2.0%或 1.5%羟乙基淀粉的沉降效果较好（6%羟乙基淀粉与脐血按 1:2或 1:3比例混合），其中 1.5%羟乙基淀粉的沉降效果最佳（图 1， 1〜4：羟乙基淀粉浓度分别为 2.0%、 1.5%、 1.2%, 1.0%) ，且回收的有核细胞量最多（表 1) 。表 2 不同浓度羟乙基淀粉沉降红细胞后获得有核细胞的量

HES浓度 HES:脐血 (体积比）有核细胞数（x】0⁶)

2.0% 1： 2 11.25±0.57 '

1.5% 1： 3 11.79±0.52

1.2% 1： 4 10.10±0.47*

1.0% 1： 5 10.32±0.87

n =4 与 1.5%的 HES相比， *: p<0.05, f: p<0

以下操作中使用 6%的羟乙基淀粉并使其终浓度为 1.5%。一、体外诱导脐血单个核细胞分化为巨核祖细胞和巨核细胞

用本发明的方法体外诱导脐血单个核细胞分化为巨核祖细胞和巨核细胞，具体包括以下步骤：

1) 单个核细胞的分离：用常规的 Ficoir密度梯度离心方法从脐血中分离单个核细胞，具体方法为：用 6%羟乙基淀粉与脐血按 1:3体积比混合（羟乙基淀粉的终浓度为 1.5%)沉降红细胞 30min，吸取上清， 1800rpni离心 5min，将细胞悬于生理盐水中，再将细胞悬液缓慢加入等体积的人淋巴细胞分离液上， 22°C、 2000rpm 离心 25ηύη，得到单个核细胞。

2) 细胞培养和诱导分化：将单个核细胞接种于 24孔板中，每孔 lml， 1(Τ细胞 /ml, 添加实施例 1确定的培养基 E中，在 37°C、 5%C0₂条件下体外培养，并在培养第 4、 7、 10天时进行原体积的 1/3量补液，加入新鲜培养基，取 4、 7、 10、 14 天得到的巨核祖细胞和巨核细胞混合物。

二、细胞形态观察

用倒置显微镜观察诱导的单个核细胞不同时间点细胞的大体形态变化。瑞氏吉姆萨染色，普通光学显微镜观察诱导分化的巨核祖细胞和巨核细胞。

单个核细胞接种培养基后于倒置显微镜下观察，可见细胞小，圆形。随着培养时间延长，细胞数增加，出现梭形贴壁细胞，圆形、卵圆形细胞，大小不一，且细胞体积逐渐变大。 7天后细胞增殖明显（图 3，（1)〜（5)：分别为体外诱导 0d、 4d、 7d、 10d、 14d的细胞形态）。瑞氏吉姆萨染色，可见有不同阶段巨核细胞存在。光学显微镜下观察显示有原巨核，幼巨核细胞（核大，紫红色，细胞边缘不规则，可有指状突起）和颗粒型巨核细胞（胞体巨大，胞质丰富，含细小紫红色颗粒，核互相聚集呈环状）存在， 10天后出现成熟的巨核细胞（参见图 4其中箭头所指细胞， ①②:诱导 10d巨核细胞 ③④:诱导 14d巨核细胞）。

三、流式细胞仪检测

诱导 4d、 7d、 10d、 14d获得的巨核祖细胞和巨核细胞分别用生理盐水洗涤，并将诱导不同时间的细胞均分成两管，各加入鼠抗人 CD41-PE、 CD61- FITC抗体和鼠的 IgGl - PE、 IgGl- FITC抗体（英国 peprotech公司）， 4°C、 30min孵育，流式细胞仪检测 CD41/CD61表达。数据参见表 3。

表 3 体外培养诱导脐血单个核细胞

不同时间细胞数变化和 CD41/CD6表达（n=5) 时间细胞数（xlO⁵) CD41/CD61 {%)

4d 3.75 ±0.06 10.33±2.11

7d 10.62±2.28 17.56±5.40

10d 19.56±6.05 20.53±1.65

14d 21.46±2.04 54.27±6.31 结果诱导 10d、 14d时， CD41/CD61表达分别达到 20%、 54%, 该数据与莫文健等人（莫文健等，无血清脐血巨核系祖细胞体外扩增的研究。中国实验血液学杂志， 2004； 12(2)： 133-137；莫文健等，两步法脐血巨核细胞体外扩增的研究。中国输血杂志， 2005; 18(5)： 381-383) 报道的结果（脐血单个核细胞扩增后 10天 CD41⁺ 细胞百分数 16.68±1.27%， 14天 CD41⁺细胞表达量为 24.41±1.90%) 相比，定向诱导巨核细胞的效果更佳。

本发明获得较好的表达量，与培养基中使用的因子浓度、诱导过程的补液的时机、补液方式有关，且单个核细胞接种后贴壁的基质细胞可能也有利于细胞诱导分化。

四、巨核祖细胞集落培养

采用含 0.9% (g/100ml) 甲基纤维素， 1% (g/100ml) BSA, 10— β-巯基乙醇， 200 g/mL人转铁蛋白， lOwg/mL重组人胰岛素， 2mM L-谷氨酰胺， lOng/mL rhlL- 6， 10ng/mL rhIL-3, 50ng/mL rhTPO的巨核祖细胞集落培养基对步骤 2) 获得的体外诱导培养 0、 7、 10、 14d的巨核祖细胞进行集落培养 10— 12天，倒置显微镜下计 CFU MK 集落数。

结果如图 5所示，随着单个核细胞在培养基 E中诱导时间的延长， CFU-MK集落数呈增加趋势。体外诱导 7d、 10d、 14d的细胞， CFU-MK集落数均高于未诱导的单个核细胞，且差别非常显著（P〈0.01) 。表明，增加体外诱导时间，可获得更多的巨核祖细胞。实施例 2确定了本发明较好的体外诱导脐血单个核细胞分化为巨核祖细胞和巨核细胞的方法，并且，取使用该方法体外诱导 7d-14d的细胞表达量有明显提高，而从获得的细胞形态和活性看， 7d- 10d的细胞较好。工业应用性

本发明提供了一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法及其专用培养基。在分离单个核细胞过程中采用羟乙基淀粉作为红细胞沉降剂，可直接分离红细胞，提高有核细胞的收率；用人淋巴细胞分离液（FIC0LL ) 进行密度梯度离心，可得到纯度较高的单个核细胞。本发明直接进行诱导，简化了操作过程，减少了污染，縮短了时间，具有操作简单、成本低廉和分化效率高等优点，并提供了一个巨核祖细胞和巨核细胞的补充来源，将在医学领域发挥重要作用，应用前景广阔。

Claims

权利要求

1、用于体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的专用培养基，命名为 st36无血清培养基，是含有终浓度 50ng/mL SCF、 50ng/mL TP0、 20ng/mL IL- 3和 50ng/mL IL - 6 的 st.36因子组合的 StemSpan®无血清培养基。

2、一种体外诱导巨核祖细胞和巨核细胞的方法，包括以下步骤：

1 ) 单个核细胞的分离：用常规的 Ficol l密度梯度离心方法从脐血中分离单个核细胞，其中，采用质量 /体积 (W/V)百分比浓度为 6%的羟乙基淀粉沉降脐血中的红细胞；

2 )细胞培养和诱导分化：将单个核细胞接种于用权利要求 1所述专用培养基中，在 37°C、 5 %C0₂条件下体外培养 4一 14天，取 4- 14天的悬浮细胞得到巨核祖细胞和巨核细胞。

3、根据权利要求 2所述的方法，其特征在于：所述步骤 1 ) 中 6%羟乙基淀粉与脐血的混合比例为 1 : 2-1： 3，使羟乙基淀粉的终浓度为 1. 5 %— 2. 0 %。

4、根据权利要求 2或 3所述的培养方法，其特征在于：所述步骤 2 ) 培养时间为 7 - 14天。

5、根据权利要求 2或 3或 4所述的方法，其特征在于：所述步骤 1 ) 单个核细胞的分离过程为：用 6%的羟乙基淀粉沉降按与脐血按比例混合沉降红细胞 30min，吸取上清， 1800rpm离心 5_min，将细胞悬于生理盐水中，再将细胞悬液缓慢加入等体积的人淋巴细胞分离液表面， 22°C、 2000rpm离心 25min，得到单个核细胞。

6、根据权利要求 5所述的方法，其特征在于：所述步骤 1 ) 中 6%羟乙基淀粉与脐血的混合比例为 1 : 3，使羟乙基淀粉的终浓度为 1. 5 %。

7、根据权利要求 2至 6任一所述的方法，其特征在于：所述步骤 1 ) 得到的单个核细胞直接用于步骤 2 ) 的细胞培养和诱导分化中，无需增加去掉单个核细胞中的黏附细胞的过程。

8、根据权利要求 1-7任一所述的方法，其特征在于：所述步骤 2 )在培养第 4、 7、 10天时进行原体积的 1Z3量补液，加入新鲜权利要求 1所述专用培养基。

9、根据权利要求 1-7任一所述的方法，其特征在于：所述步骤 2 ) 中单个核细胞的接种量为 10^fi细胞 /ml。

10、用权利要求 2— 9任一项所述方法获得的巨核祖细胞和巨核细胞混合物，优选步骤 2 ) 中体外培养 7-10天得到的巨核祖细胞和巨核细胞混合物。