CN116286638A - 促进cd34+细胞向cd16+巨噬细胞分化并向m2极化的方法 - Google Patents

促进cd34+细胞向cd16+巨噬细胞分化并向m2极化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种促进CD34+细胞向巨噬细胞分化并向M2极化的方法。该方法将人脑类器官来源的间充质干细胞N‑MSC和脐带血来源的CD34+细胞在培养基中共培养14～28d，得到由CD34+细胞分化的巨噬细胞。将巨噬细胞与n‑MSC按照数量比5：1在培养基内共培养3d后，以IL‑4刺激24h，得到M2型巨噬细胞。本方法操作简单，分化效率高。采用含有人种属性的细胞生长因子或不含任何体外细胞因子的培养环境，易于获得适用于临床应用的GMP级巨噬细胞。当脐带血与N‑MSC共移植时，通过巨噬细胞的极化可以降低移植炎症反应的发生，为临床免疫相关炎症反应疾病提供理论基础。

Description

促进CD34+细胞向CD16+巨噬细胞分化并向M2极化的方法
技术领域
本发明涉及细胞治疗技术领域，尤其涉及一种人脑类器官来源间充质干细胞促进脐带血来源的CD34+细胞向巨噬细胞诱导分化以及促进巨噬细胞向M2极化的方法。
技术背景
急性移植物抗宿主病(aGVHD)仍然是异基因造血干细胞移植的重要合并症。aGVHD通常被认为是一种免疫介导的疾病，具体地说，异体供者移植物中的T淋巴细胞，经受者发动的一系列“细胞因子风暴”刺激，大大增强了其对受者抗原的免疫反应，以受者靶细胞为目标发动细胞毒攻击，其中皮肤、肝及肠道是主要的靶目标，导致患者相关死亡率增高及医疗费用增高。糖皮质激素是目前aGVHD的一线治疗方案，但是仍有40-60％患者出现激素耐药，且现有二线治疗效果欠佳。因此，aGVHD发病机制的深入阐明及其新型治疗策略的建立是亟待解决的重要临床科学问题。
巨噬细胞
Figure SMS_1
是机体重要免疫细胞之一，由骨髓单核细胞分化成熟而来，具有极强的异质性。不仅是病原微生物、坏死组织的主要清理细胞，还具有抗原递呈和分泌多种细胞因子的功能，在特异性免疫反应的诱发和免疫调节过程中起关健作用。在欧洲多中心合作的临床研究中，已经开始在肾移植后使用供体来源的巨噬细胞，经过一年多的追踪随访，认为其在肾移植上的使用是安全及有效的(James A.Hutchinson,PalomaRiquelme,andEdwardK.Geissler.Human regulatory macrophages as a cell-basedmedicinalproduct.CurrOpin Organ Transplant2012；17:48-54)。因此在临床应用中，使用巨噬细胞将成为一种很有潜力的预防移植后免疫排斥的干预措施。
CD16是连接细胞免疫和体液免疫的桥梁，在巨噬细胞的ADCC(抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)作用中具有重要地位。在肝脏巨噬细胞中增强CD16表达可提高肝脏巨噬细胞通过ADCC对肝细胞肝癌的溶解作用(膜受体CD16在Kupffer细胞杀伤肝细胞肝癌中的作用及机制探讨，丁雄，2006)。外周血CD16+CD14+单核巨噬细胞比CD16-CD14+性的单核巨噬细胞具有更强的免疫抑制作用和吞噬活性(P.Vishnyakova，2021，The response of two polar monocyte subsets toinflammation；SuJeong Lee，2021，Activated Platelets Convert CD14+CD16-Into CD14+CD16+Monocytes With Enhanced FcgR-Mediated Phagocytosis and Skewed M2Polarization)。
巨噬细胞其功能发挥与周围微环境相关，微环境中的细胞因子、微生物等可以导致巨噬细胞极化成不同表型和功能的细胞亚群，主要包括经典激活型巨噬细胞(M1)和选择激活型巨噬细胞(M2)，两类巨噬细胞表型及功能迥异。M1/M2极化失衡参与了多种自身免疫学疾病、代谢性及炎症性疾病的发生。功能上，M1可高表达促炎因子，具有强大的抗微生物和抗肿瘤活性，并介导活性氧诱导的组织损伤，抑制组织再生及愈合；M2表达抗炎因子，具有强大的吞噬能力，可清除碎片及凋亡细胞，促进组织修复及愈合，并具有促血管生成和促纤维化的特性。在不同条件下，这两种极端可以相互转化。Nahrendor等发现在急性心肌梗死过程中巨噬细胞的M1/M2表型会转化。
目前巨噬细胞的培养主要采用直接培养法或诱导培养法。直接培养法即直接分离巨噬细胞进行培养，此方法操作比较繁琐，巨噬细胞回收率不高，且分离到的细胞大多是成熟的巨噬细胞，在体外不再分裂增殖。诱导培养法则利用外源性细胞因子将干细胞、单核细胞等前体细胞诱导成巨噬细胞的培养方法，甚至一些研究小组已经成功地利用多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs；human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)制造巨噬细胞。诱导多能干细胞易于操作产生基因编辑的巨噬细胞，或直接分化为正常的巨噬细胞。但目前这些分化流程存在操作繁杂、耗时较长、采用动物源性成分的试剂、成本较高、并且产量受到限制等，所以分化巨噬细胞的方法需要进一步去探索。
脐血内含有丰富的造血干/祖细胞，目前在临床上广泛应用于白血病、再生障碍性贫血、遗传性疾病和肿瘤等多种疾病的治疗,取得理想效果并显示出良好前景。目前已有超过4万多例UCB移植被批准，在世界范围内，来自公共和私人细胞库的UCB正被尝试用于治疗神经、代谢、免疫和肿瘤等相关疾病。这取决于从脐血中获得的细胞来源广泛、无创伤性、并且免疫原性低等特点。因此，从脐血中分离造血干/祖细胞并诱导得到巨噬细胞，并确定纯度和功能，将大大有助于其在临床上的使用。但现有技术得到的巨噬细胞在纯度和数量，以及CD16表达强度等方面均需要提高。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种促进CD34+细胞向巨噬细胞分化的方法，该方法将人脑类器官来源的间充质干细胞N-MSC和脐带血来源的CD34+细胞在培养基中共培养14～21d，得到由所述CD34+细胞分化的巨噬细胞；所述CD34+细胞为造血干细胞或造血祖细胞。
优选的，根据所需的巨噬细胞特征，选择相应的培养基，具体为：
采用无任何细胞因子的基础培养基培养14～21d，获得CD34+细胞分化率在15～30％的临床级巨噬细胞；
或采用巨噬细胞诱导分化培养基培养14～28d，获得CD34+细胞分化率在80～99％的巨噬细胞；
所述巨噬细胞均表达CD45CD11bCD14标记，所述基础培养基为α-MEM培养基，所述诱导分化培养基为IMDM培养基。
优选的，所述α-MEM培养基中还添加有分别占α-MEM体积1％的NEAA、1％的L-Glu、1％的Anti-anti和20％的人AB血清；所述诱导分化培养基包括第一阶段培养基和第二阶段培养基，所述第一阶段培养基为IMDM中加入占IMDM体积10％的人AB血清，以及20ng/mlSCF、5ng/mlTPO、5ng/ml FLT-3、50ng/ml M-CSF，所述第二阶段培养基为IMDM中加入占IMDM体积10％的人AB血清以及50ng/ml M-CSF。
优选的，所述第一阶段培养基用于D0-D7培养，所述第一阶段培养基用于D8-D28培养。
优选的，所述间充质干细胞N-MSC和CD34+细胞以起始细胞数量比5：1共培养。
优选的，所述N-MSC和CD34+细胞在六孔板中共培养，所述CD34+细胞的接种数量为1×104～5×104个/孔，N-MSC的接种数量为1.0×105个/孔；当N-MSC细胞生长到95％融合度时，用15Gy X射线辐照处理，使N-MSC停止生长。
本发明还提供一种表面受体CD16高表达的巨噬细胞，其采用上述一种促进CD34+细胞向巨噬细胞分化的方法制备。所述高表达指，培养21～28天，CD16平均荧光强度相较一般脐带血来源巨噬细胞提高12-43倍。
本发明的目的之二在于提供一种促进采用上述方法制备得到的巨噬细胞向M2型极化的极化方法，具体为：将所述巨噬细胞与间充质干细胞N-MSC按照数量比5：1在培养基内共培养3d后，以IL-4刺激24h，得到M2型巨噬细胞。
优选的，所述共培养采用6孔板transwell，其中在6孔板transwell的上层按1×105个/孔接种N-MSC，所述培养基为Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640Medium，所述RPMI中还加入有占RPMI体积10％的人AB血清。
优选的，所述IL-4的浓度为20ng/ml。
本发明的有益效果在于：
人脑类器官来源间充质干细胞N-MSCs是通过H1/hiPSCs培养人脑类器官，分离出的具有MSC特性的基质细胞，该基质细胞具有与脐带MSCs(umbilibal cord MSCs,UC-MSCs)具有相似的表型且高表达神经相关的基因，较PB-MSCs来说，nMSCs来源不受限制，且无伦理争议，制备过程适合大规模制备生产和质量控制。
本发明通过nMSCs与UCB的CD34+细胞共培养7天，并取全部细胞进行血细胞集落培养14天结果显示，无论是H1-MSCs还是iP-MSCs，与无MSCs组比较，都能够分化诱导出更多的M集落，且取集落进行流式染色分析，在H1-nMSCs、iPS-nMSCs中，CD45+CD14+细胞数量百分比为无MSCs组2倍，表明N-MSC具有较好的诱导UCB的CD34+向
Figure SMS_2
分化的能力。
本发明制备的巨噬细胞，表达CD45+CD11b+CD14+标记，且高表达CD16，使用无细胞因子分化培养基与N-MSC共培养21天，CD16的平均荧光强度高于无N-MSC组33～43倍，使用分化培养基培养28天，CD16的平均荧光强度高于无N-MSC组12～15倍，表明本发明制备的巨噬细胞在发挥ADCC功能上具有显著的优势。
现有的报道认为，UCB诱导的
Figure SMS_3
呈现出较差的抗原呈递能力和向M2型极化的能力。但本发明通过H1-nMSCs和iPS-nMSCs与UCB共培养获得的/>
Figure SMS_4
在IL-4刺激下，相对于无基质细胞，CD206+表达显著增加，且分泌大量IL-10，表明N-MSC具有促进巨噬细胞向M2型极化的能力。
本发明提供了一种将脐血造血干/祖细胞诱导分化为巨噬细胞的方法，即采用hPSC来源的nMSCs，与脐带血CD34+(UCB-CD34+)细胞共培养，在两种不同的培养环境中，与MSCs共培养的方式相比较，均能获取产量较多，纯度较高的巨噬细胞，且进一步能获得具有M2型的巨噬细胞。本诱导方法操作简单，成本低，分化效率高，采用含有人种属性的细胞生长因子或不含任何体外细胞因子的培养环境，易于获得足量或纯度较高的符合GMP级巨噬细胞，适用于临床应用。
同时，N-MSC促进脐带血来源CD34+细胞诱导分化的巨噬细胞向M2型高效极化，抑制氧化爆发和炎症，在IL-4刺激时，分泌大量抗炎细胞因子IL-10，故当UCB与nMSCs共移植时，可以降低移植炎症反应的发生，从而降低移植物抗宿主病GVHD，使得炎症反应好转，改善免疫效应细胞功能，对临床靶向治疗具有十分重要的意义。
附图说明
图1-5为实施例1中脐带血CD34+细胞与nMSCs共培养7天后集落培养计数结果，其中，
图1为UCB-CD34+细胞与H1-nMSCs、iPS-nMSCs共培养，及Without MSCs空白对照组示意图；
图2为共培养7天后，total细胞取出集落培养14天，皿内血细胞总集落数计数结果，P<0.05；
图3为巨噬细胞集落(M)计数结果；
图4为CD34+细胞与nMSCs共培养后血细胞M集落镜下观察(100um)及进行MGG染色结果观察(20um)；
图5为血细胞集落中CD45+CD11b+CD14+流式检测。
图6-9为实施例2中UCB-CD34+细胞与nMSCs在巨噬细胞诱导分化培养基中共培养28天后流式检测结果，其中，
图6为UCB-CD34+细胞向巨噬细胞诱导分化示意图；
图7为巨噬细胞诱导分化培养条件下，总细胞计数结果(图7A)、CD45+CD11b+CD14+细胞百分比(图7B)和计数结果(图7C)(P<0.01)；
图8为流式检测结果(P<0.01)；
图9为CD45+CD11b+CD14+细胞CD16平均荧光强度。
图10-13为实施例3中UCB-CD34+细胞与nMSCs在无细胞因子分化培养基中共培养21天后流式检测结果，其中，
图10为UCB-CD34+细胞在无细胞因子分化培养基中诱导分化示意图；
图11为无细胞因子分化培养基培养条件下，总细胞计数结果(图11A)、CD45+CD11b+CD14+细胞百分比(图11B)和计数结果(图11C)(P<0.01)；
图12为流式检测结果；
图13为CD45+CD11b+CD14+细胞CD16平均荧光强度；
图14-16为实施例4中N-MSCs促进脐带血来源巨噬细胞向M2型极化的试验结果，其中，
图14为CD34+与不同nMSCs进行transwell共培养，获得的巨噬细胞(MФ)用IL-4刺激的示意图；
图15为H1-nMSCs、iPS-nMSCs中CD206+平均荧光强度；
图16为H1-nMSCs、iPS-nMSCs中IL-10表达量结果。
具体实施方式
为了便于理解，下面结合实施例对本发明的技术方案做出更为具体的说明，除非另有说明，本文中所使用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义。
各实施例中使用的主要细胞及因子来源如下：
人多能干细胞H1细胞系(购买于美国Wicell研究所)，人诱导性多能干细胞007细胞系(赛伊康生物公司赠送)，脐带血MSCs(UCB-MSCs)(赛伊康生物公司赠送)。脐带血(UCB)由赛伊康生物公司赠送，用GE公司淋巴细胞分离液获得脐带血单个核细胞，用stem cell公司CD34+磁珠分选试剂盒获得UCB-CD34+造血干祖细胞。
人干细胞因子(SCF)、人白细胞介素-3(IL-3)、人白细胞介素-6(IL-6)、人FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt-3)、人促血小板生成素(EPO)、人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、人血小板生长因子(TPO)均购于Peprotech公司。
主要试验材料和仪器来源如下：
基础培养基α-MEM培养基(Hyclone)，基础培养基IMDM培养基(Gibco)，人胚胎干细胞培养基mTeSR1，麦格氏-吉姆萨染液(May-Giemsa)(德国MERCK)，0.025％胰酶、α-MEM、IMDM、青霉素-链霉素(Pen-strep)、非必需氨基酸(NEAA)、L-谷氨酰胺、(美国Gibco)，人AB血清(美国Gemini)，基底膜基质Matrigel(美国Cornning)，流式抗体CD45-APCCY7、CD11b-APC、CD14-PEcy7、CD16(biolegend)。
CD34+细胞磁珠分选试剂盒(加拿大stem cell)，transwell 6孔板(美国Corning)，3D培养装置(生物反应器及生物反应设备，ZL201721202793.0)，光学显微镜(日本Olympus，CKX41)，辐照仪(美国Rad Source Technologies,RS2000)，
流式细胞仪BD,FACS CantoTMⅡ美国、流式抗体CD45-APCCY7、CD11b-APC、CD16-PE、CD14-PEcy7、CD206-APC、7-AAD均购于Biolegend。
实施例1
1实验方法
1.1N-MSC培养方法
将H1及hiPSCs-007细胞系诱导分化为nMSCs，分别命名为H1-nMSCs、iPS-nMSCs，参照下述方法获得的MSC作为P0代，直径为10cm皿长满后，0.05％胰酶消化，连续传代培养，培养基为80％DMEM、10％FBS、5％NEAA、5％Anti-anti及0.25mg bFGF；上述Anti-anti为抗生素的混合试剂，每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B。
将1个35mm皿中消化下来的人胚胎干细胞H1-hESCs或人诱导多能干细胞iPSCs团平均接种在超低黏附6孔板的2个孔中，此时计为0d，培养基为mTeS R1培养基(2mL/孔)。1d时把细胞团转移到靠磁力搅拌的3D培养装置中，悬浮培养。1～4d培养基简称“A+D”(总体积50mL:DMEM/F12 41mL、KOSR 7.5mL、NEAA 0.5mL、L-Glu 0.5mL、Pen-Strep 0.5mL、A83-0142.1μg、Dorsomorphin 39.9μg)，5～6d的培养基简称“C+S”(总体积50mL:DMEM/F1248.5mL、NEAA0.5mL、L-Glu 0.5mL、Pen-Strep 0.5mL、CHIR-99021 22.8μg和SB-43154219.2μg)。7d时将形成的神经球包埋在基质胶Matrigel中，培养基为“C+S”，继续在3D装置中培养。15d时用0.05％胰酶将神经球消化成单细胞，培养基为MSC培养基(DMEM 44mL、FBS5mL、NEAA 0.5mL、L-Glu 0.5mL、bFGF 25ng/ml)，此时细胞记为P0代，在光学显微镜下观察细胞长满后，用0.05％胰酶消化，连续传代培养即可获得N-MSC。
1.2磁珠分选获得UCB-CD34+
用GE淋巴细胞分离液收集脐带血单个核细胞。按照107个细胞100μL细胞分选液重悬细胞。将细胞转移至聚苯乙烯流式管中，按照10μL抗体每100μL体积加入CD34抗体混合物(Stem cell公司CD34+细胞磁珠分选试剂盒)，轻柔混匀，室温静置10分钟。充分混匀试剂盒中的磁珠，并按照7.5μL磁珠每100μL体积加入磁珠，室温静置5分钟。向聚苯乙烯流式管中加分选液至2.5mL，轻柔混匀后将此流式管插入磁极中，室温静置3分钟，然后拿起磁极并将其中液体倒掉。拿出流式管，并沿壁加入2.5mL分选液，轻柔吹打几次，放入磁极，室温静置3分钟后倒掉其中液体。重复此步骤3次。即可得到UCB-CD34+细胞。
1.3 UCB-CD34+与基质细胞共培养
UCB-CD34+细胞与H1-nMSCs、iPS-nMSCs贴壁培养，三种不同来源MSC(4×103个/孔)接种至96孔板中，细胞融合至90％时，15Gy剂量辐照10min,辐照完静置1h后，将CD34+细胞(1×103个/孔)接种至不同MSC96孔板中共培养，另以等量CD34+细胞接种至低黏96孔板中作为空白对照。
在无血清培养基SFEM+SCF(50ng/ml)+FLT-3(50ng/ml)+TPO(50ng/ml)中培养7天，取总细胞的1/4进行集落培养。
1.4集落培养
血细胞集落形成实验用来评估不同细胞的造血潜能。将每孔1/4细胞用400μLIMDM重悬，混匀后加入配好的集落半固体培养基中(4mL)，用涡旋混合器将两者充分混匀。静置20分钟以充分排出气泡。将2mL注射器的针头替换为18G针头，反复吸打出半固体培养基3次以排出注射器中空气。吸取1.1mL半固体培养基种于35mm细菌培养皿(Petri dish)中并轻柔摇匀(注：4mL半固体培养基只能种3皿集落)。取35mm培养皿并在其中加入适量的无菌双蒸水，与另2皿含细胞的半固体培养基共同放入10cm培养皿中，静置于37℃，5％CO2培养箱。14天后对CFU-E，BFU-E，G/M/GM和GEMM集落分别进行计数。
2实验结果
2.1血细胞集落形成及计数
如图1所示，UCB-CD34+细胞分别与H1-nMSCs、iPS-nMSCs共培养7天后，取每孔1/4细胞进行集落培养14天，分别计数血细胞集落。
分别统计代表早期红系祖细胞的红系爆发式集落形成单位BFU-E(burst-formingunit-erythroid,BFU-E)、代表晚期红系祖细胞的红系集落形成单位CFU-E(colonyforming unit-erythroid,CFU-E)、代表粒细胞和巨噬细胞的混合集落的粒系/巨噬细胞集落形成单位GM、代表粒细胞的粒系细胞集落形成单位G、原始的具有分化潜能祖细胞的混合系祖细胞集落形成单位Mix、代表巨噬细胞的巨噬细胞集落形成单位M的数量。
Without MSCs组、H1-nMSCs组、iPS-nMSCs组皿内血细胞总集落数计数结果如图2所示。可以看出，UCB-CD34+细胞与iPS-nMSCs共培养获得的细胞集落数量最多。
如图3所示，与对照组比较，无论是H1-MSCs还是hiPSC-MSCs，都能够诱导分化出更多的M集落。挑选M集落细胞进行MGG染色，并进行流式检测，检测CD45、CD11b、CD14等表面标记分子。染色结果如图4所示，可以看出巨噬细胞较大，细胞核较小，且细胞质里面含有较多空泡。集落培养所得的细胞如图5所示，与N-MSC共培养组获得的CD45+CD11b+CD14+细胞比例均高与对照组。
实施例2
1.1 UCB-CD34+细胞向巨噬细胞诱导分化方法
所述间充质干细胞N-MSC和CD34+细胞以起始细胞数量比1:(1～3)5：1共培养。当N-MSC细胞生长到95％左右的汇合度，用15Gy X射线辐照处理,使N-MSC停止生长。六孔板中共培养时，CD34+造血干/祖细胞与N-MSC的接种数量分别为2.5×104个/孔～1.0×105个/孔。
所述巨噬细胞诱导分化培养基第一阶段(D1-7)为IMDM中加入占IMDM原始体积10％的人AB血清，以及20ng/m SCF、5ng/ml TPO、5ng/ml FLT-3、50ng/ml M-CSF；第二阶段(D8-D28)为IMDM中加入占IMDM原始体积10％的人AB血清以及50ng/ml M-CSF。培养第14、21、28天分别用流式检测CD45、CD11b和CD14细胞表面分子表达情况。
1.2试验方法及结果
UCB-CD34+细胞与nMSCs共培养，培养基分别使用巨噬细胞诱导分化培养基，培养路径参见图6，28天后流式检测巨噬细胞表面标记分子，结果如图7和图8所示。可以看出，使用巨噬细胞诱导分化培养基，H1-nMSCs组和iPS-nMSCs组中CD45+CD11b+CD14+细胞百分比和细胞数均多于无基质细胞组和UC-MSC共培养组；共培养第28天时，H1-nMSCs组和iPS-nMSCs组中表达CD45+CD11b+CD14+的细胞即巨噬细胞百分比高达95％以上。
如图9所示，UCB-CD34+与分别与H1-nMSCs组和iPS-nMSCs组所得的CD45+CD11b+CD14+巨噬细胞CD16的平均荧光强度均高于对照。N-MSC共培养组获得的巨噬细胞CD16平均荧光强度(MFI)提高12-15倍。
实施例3
1.1 UCB-CD34+细胞无细胞因子诱导分化方法
所述间充质干细胞N-MSC和CD34+细胞以起始细胞数量比1:(1～3)5：1共培养。当N-MSC细胞生长到95％左右的汇合度，用15Gy X射线辐照处理,使N-MSC停止生长。六孔板中共培养时，CD34+造血干/祖细胞与N-MSC的接种数量分别为2.52×104个/孔--5.01.0×105个/孔。
所述无细胞因子培养基为α-MEM培养基，α-MEM培养基中还添加有占α-MEM体积1％的NEAA、1％L-Glu、1％Anti-anti和20％人AB血清。
1.2试验方法及结果
UCB-CD34+细胞与nMSCs共培养，培养基分别使用巨噬细胞诱导分化培养基，培养路径参见图10，21天后流式检测巨噬细胞表面标记分子，结果如图11和图12所示。可以看出，使用无细胞因子分化培养基，H1-nMSCs组和iPS-nMSCs组中CD45+CD11b+CD14+细胞百分比和细胞数均多于无基质细胞组和UC-MSC共培养组；共培养第21天时，H1-nMSCs组和iPS-nMSCs组中表达CD45+CD11b+CD14+的细胞即巨噬细胞百分比高达20％以上。
如图13所示，UCB-CD34+与分别与H1-nMSCs组和iPS-nMSCs组所得的CD45+CD11b+CD14+巨噬细胞CD16的平均荧光强度均高于对照；nMSCs共培养组获得的巨噬细胞CD16平均荧光强度(MFI)提高33-43倍。
实施例4
1.1巨噬细胞诱导分化
所述巨噬细胞诱导分化培养基第一阶段(D1-7)为IMDM中加入占IMDM原始体积10％的人AB血清，以及20ng/m SCF、5ng/ml TPO、5ng/ml FLT-3、50ng/ml M-CSF；第二阶段(D8-D28)为IMDM中加入占IMDM原始体积10％的人AB血清以及50ng/ml M-CSF。将磁珠分选出来的CD34+细胞悬浮培养于第一阶段培MΦ诱导分化液中，2～4天换液。培养7天后，改为第二阶段MΦ诱导分化液继续培养28天后，收样。收集到的细胞进行贴壁纯化。纯化后细胞进行功能刺激实验。
所述的方法制备得到的巨噬细胞向M2型极化的极化方法，其特征在于，
Figure SMS_5
与MSC在上下层通透的transwell中按照数量比5:1共培养，在6孔板transwell的上层分别接种UCMSC、N-MSC各1×105个/孔，下层接种/>
Figure SMS_6
个/孔作为对照组，在培养基内(RPMI1640+10％人AB血清)培养3天。以20ng/mL的IL-4刺激24h，所得细胞做流式检测。
1.2实验结果
如图14所示，CD34+与不同nMSCs进行transwell共培养，获得的巨噬细胞(MФ)用IL-4刺激，结果如图15所示，可以看出，H1-nMSCs、iPS-nMSCs中CD206+平均荧光强度增强5倍以上，MФ+IL-4组、MФ+IL-4+UC-MSC、MФ+IL-4+H1-nMSC、M+IL-4+iPS-nMSC组中CD206平均荧光强度分别为：33.3、90.81、89.1、170.4，CD206是炎症抑制性巨噬细胞即M2型巨噬细胞的功能标记，试验结果表明H1-nMSCs、iPS-nMSCs更能促进
Figure SMS_7
向M2型极化。如图16所示，上清测序检测IL-10，H1-nMSCs、iPS-nMSCs中IL-10表达量也同样高于Without MSCs组，IL-10表达量提高5倍以上。
以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案，而并非对本发明的限制；尽管参照前述实施方式对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：凡在本发明创造的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种促进CD34+细胞向巨噬细胞分化的方法，其特征在于，将人脑类器官来源的间充质干细胞N-MSC和脐带血来源的CD34+细胞在培养基中共培养14～28d，得到由所述CD34+细胞分化的巨噬细胞；所述CD34+细胞为造血干细胞或造血祖细胞。
2.如权利要求1所述的一种促进CD34+细胞向巨噬细胞分化的方法，其特征在于，根据所需的巨噬细胞特征，选择相应的培养基，具体为：
采用无任何细胞因子的基础培养基培养14～21d，获得CD34+细胞分化率在15～30％的巨噬细胞；
或采用巨噬细胞诱导分化培养基培养14～28d，获得CD34+细胞分化率在80～99％的巨噬细胞；
所述巨噬细胞均表达CD45CD11bCD14标记，所述基础培养基为α-MEM培养基，所述诱导分化培养基为IMDM培养基。
3.如权利要求2所述的一种促进CD34+细胞向巨噬细胞分化的方法，其特征在于，所述α-MEM培养基中还分别添加有占α-MEM体积1％的NEAA、1％的L-Glu、1％的Anti-anti和20％的人AB血清；所述诱导分化培养基包括第一阶段培养基和第二阶段培养基，所述第一阶段培养基为IMDM中加入占IMDM体积10％的人AB血清，以及20ng/ml SCF、5ng/mlTPO、5ng/mlFLT-3、50ng/ml M-CSF，所述第二阶段培养基为IMDM中加入占IMDM体积10％的人AB血清以及50ng/ml M-CSF。
4.如权利要求3所述的一种促进CD34+细胞向巨噬细胞分化的方法，其特征在于，所述第一阶段培养基用于D0-D7培养，所述第一阶段培养基用于D8-D28培养。
5.如权利要求1所述的一种促进CD34+细胞向巨噬细胞分化的方法，其特征在于，所述间充质干细胞N-MSC和CD34+细胞以起始细胞数量比5：1共培养。
6.如权利要求1所述的一种促进CD34+细胞向巨噬细胞分化的方法，其特征在于，所述间充质干细胞N-MSC和CD34+细胞在六孔板中共培养，所述CD34+细胞的接种数量为1×104～5×104个/孔，N-MSC的接种数量为1.0×105个/孔；当N-MSC细胞生长到95％融合度时，用15GyX射线辐照处理，使N-MSC停止生长。
7.一种表面受体CD16高表达的巨噬细胞，其采用如权利要求1所述的方法制备；所述高表达是指，培养21～28天，CD16平均荧光强度相较一般脐带血来源巨噬细胞提高12-43倍。
8.一种促进如权利要求1所述的方法制备得到的巨噬细胞向M2型极化的极化方法，其特征在于，将所述巨噬细胞与间充质干细胞N-MSC按照数量比5：1在培养基内共培养3d后，以IL-4刺激24h，得到M2型巨噬细胞。
9.一种促进如权利要求8所述的极化方法，其特征在于，所述共培养采用6孔板transwell，其中在6孔板transwell的上层按1×105个/孔接种N-MSC。
10.一种促进如权利要求8所述的极化方法，其特征在于，所述培养基为RPMI 1640培养基，所述RPMI中还加入有占RPMI体积10％的人AB血清。
11.一种促进如权利要求8所述的极化方法，其特征在于，所述IL-4的浓度为20ng/ml。
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