JP2022035914A - 高速かつ効率的にインビトロ増幅ヒト間葉系幹細胞的方法および使用 - Google Patents
高速かつ効率的にインビトロ増幅ヒト間葉系幹細胞的方法および使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
満期帝王切開により得られた健康で新鮮な胎盤から羊膜組織を剥離し、1%ペニシリン・ストレプトマイシン(最終濃度はペニシリン:100IU/mL、ストレプトマイシン:100IU/mL、使用直前に調製)を含むD-PBS溶液で残留血痕および粘液を繰り返し洗浄した。約1cm2のサイズで羊膜を切った後、50mL遠心管に分注し、羊膜組織体積の約2倍の0.02%EDTA-2Na含有0.05%トリプシン消化液を加え、37°C恒温水槽において185rpmで約30分間回転消化し、300メッシュのステンレス鋼濾過網で濾過し、上清を捨て、上記ステップを1回繰り返した。消化後の羊膜組織を1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むD-PBS液で1回洗浄し、等体積の0.05mg/mLのDNase Iを含む0.5mg/mLのII型コラゲナーゼ消化液を加え、37°C、190rpmで1~1.5時間回転消化することで羊膜破片を完全に綿状に消化し、300メッシュの篩網で濾過し、細胞濾液を収集し、1500rpmで10分間遠心分離し、上清を捨て、得られた細胞沈殿はヒト羊膜MSC(human amnion-derived mesenchymal stem cells,hA-MSC)であった。10%FBSを含む低糖DMEM完全培地で細胞を再懸濁し、T75細胞培養フラスコに接種し、37°C、5%CO2、85-100%空気、飽和湿度の条件下で恒温培養し、細胞コンフルエンスが80%以上に達した後、継代培養を行い、第3継代(P3)細胞を収集し、実験に用いた。また、組織ブロック付着法により新鮮なヒト臍帯組織からヒト臍帯MSCを分離し、密度勾配遠心分離法により新鮮なヒト臍帯血からヒト臍帯血MSCを分離した。得られたMSCは、CD90、CD105、CD73、CD44およびCD29などの間葉細胞表面分子を高発現し、CD34、CD11b、CD19、CD45およびHLA-DRなどの造血幹細胞マーカー並びにMHCクラスII細胞表面分子を発現しなかった(図1A)。免疫細胞化学染色法により検出した結果、この細胞は間葉細胞マーカーであるビメンチンを高発現し、上皮細胞マーカーであるケラチンCK19を発現せず(図1B)、典型的な間葉細胞の表現型を有する。
通常の身体検査を受けている人から新鮮な末梢血を採取し、等体積の滅菌D-PBSで希釈した。適量のHistopaque-1077を15mL遠心管に加え、管壁に沿って等体積の滅菌D-PBSで希釈した血液をゆっくりと加え、2000rpmで20分間遠心分離した。中間のバフィーコート層を吸い取り、等体積の滅菌D-PBSを加え、1500rpmで10分間遠心分離した。滅菌D-PBSで1回洗浄し、上清を捨て、細胞沈殿物を10%FBS含有低糖DMEM培地で懸濁させ、PBMC免疫細胞を得た。末梢血単球(PBM)がプラスチック細胞培養プレートに付着して接着成長しやすい特性を利用し、PBMおよび末梢血リンパ球(PBL)を分離されたPBMCから分離した。
対数増殖期にある第3継代のヒト羊膜MSCを取り、3×103/ウェルの密度で24ウェル細胞培養プレートに接種し、16時間後に新たに分離されたPBMCを加えた。ここで、PBMCの密度は、それぞれ3×103、3×104、3×105、6×105、9×105および1.2×106/ウェルであり、共培養されたPBMCとMSCの細胞比率は、それぞれ1:1、10:1、100:1、200:1、300:1および400:1であった。PBMCとMSCを48時間共培養した後、EDUによりMSCの増殖能力を測定した。結果を図2および表1に示す。通常の方法により培養された正常対照MSC群(以下、「MSC群」と略す)のEDU陽性細胞率は(19.93±0.63)%であり、PBMC:MSC=1:1または10:1である場合、MSCの増殖能力は顕著に増強せず、PBMC:MSC=100:1である場合、MSCにおけるEDU陽性細胞率は(19.93±0.63)%から(26.55±0.37)%に増加し、PBMC:MSC=300:1である場合、EDU陽性細胞率は(30.01±1.67)%の最大値に達したが、細胞比率が増加し続けると、MSCの増殖能力は低下し始めた。例えば、PBMC:MSC=400:1である場合、そのEDU陽性細胞率は(26.89±0.97)%であった。したがって、PBMCとMSCの共培養では、細胞比率が100:1-400:1である場合、MSCの増殖能力が顕著に向上し、そのうち、共培養細胞比率が300:1である場合、ヒトMSCの増殖能力が最も高く、増殖促進効果が最も高かった。
対数増殖期にある第3継代のヒト羊膜MSCを取り、103/ウェルの密度でTranswell(Corning,3470)上室に接種し、下室または上室にそれぞれ105個の新たに分離されたPBMCを加え、MSCと共培養し、48時間後に上室を取り出し、EDUによりMSC増殖能力を測定した。結果を図3に示す。正常対照MSC群のEDU陽性細胞率は(12.43±1.02)%であり、PBMCとMSCの接触および非接触共培養は、いずれもMSCの増殖能力を顕著に向上できるが、接触共培養の方は効果がより高く、接触共培養によるEDU陽性細胞率は(26.97±1.22)%に達した(表2)。
対数増殖期にある第3継代のヒト羊膜MSCを3×103/ウェルの密度で24ウェル細胞培養プレートに接種し、16時間後に異なる年齢帯のドナーから新たに分離されたPBMCを加えた。MSCとPBMCを48時間共培養した後、EDUによりMSCの増殖能力を測定した。結果から分かるように(図4)、正常対照MSC群のEDU陽性細胞率は(19.82±3.58)%であり、MSC群に比べ、異なる年齢帯のドナーに由来のPBMCはいずれもMSCの増殖能力を顕著に増強でき、そのEDU陽性細胞率の平均値は、(25.54±3.08)%から(26.89±5.48)%であり(表3)、MSC増殖に対する異なる年齢帯のドナーに由来のPBMCの促進効果は、群間で統計的な差異が認められなかった。
密度勾配遠心分離法により正常ヒト末梢血からPBMCを分離し、3×105/ウェルの密度で24ウェル細胞培養プレートに接種し、2時間後、PBMがプラスチック細胞培養プレートに付着して接着成長しやすい特性を利用し、PBMとPBLをPBMCから分離した。対数増殖期にある第3継代のヒト羊膜MSCを取り、3×103/ウェルの密度でそれぞれPBMC、PBMおよびPBLを含む24ウェル細胞培養プレートに接種し、48時間共培養した後、顕微鏡でMSCの形態的特徴を観察し、EDUによりPBMC、PBMおよびPBLのMSC増殖能力に対する影響を測定した。結果から分かるように、PBMC、PBM、PBLとMSCを共培養した後、MSCは長紡錘形で渦状に成長し、細胞密度はPBL>PBMC>PBMであった(図5A)。EDU実験から分かるように、正常対照MSC群は(18.31±2.01)%であり、PBMC、PBMおよびPBLとMSCとの共培養は、いずれもEDU陽性細胞率を異なる程度で向上でき、(21.31±1.04)%から(35.21±0.51)%の範囲内であり(表4)、増殖能力の促進は順にPBL>PBMC>PBMであり、PBLは最適であった(図5B)。
組織ブロック付着法により新鮮な臍帯組織からヒト臍帯間葉系幹細胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSC)を分離し、別途に密度勾配遠心分離法により新線あ臍帯血からヒト臍帯血間葉系幹細胞(human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,hUCB-MSC)を分離し、いずれもパンクレアチンを用いて継代培養により純粋化し、第3継代細胞を収集して実験に用いた。対数増殖期にある第3継代のhUC-MSCおよびhUCB-MSCを取り、3×103/ウェルの密度で24ウェル細胞培養プレートに接種し、16時間後に、新たに分離されたPBLを加え、48時間共培養した後、EDUによりhUC-MSCおよびhUCB-MSCの増殖能力を測定した。結果から分かるように、PBLとヒト羊膜組織に由来のhA-MSCとの共培養(図5)と同様に、PBLとhUCMSCとの接触共培養は、hUC-MSC増殖を顕著に促進することができる(図6)。同様に、PBLとhUCB-MSCとの接触共培養は、hUCB-MSCの増殖も顕著に促進することができる(図7)。したがって、接触共培養によりMSCの増殖能力を増強させるヒト末梢血免疫細胞PBLの作用は、MSCが由来する組織に制限されず、臍帯組織および血液由来のMSCのいずれもに対して顕著な増殖促進効果を奏することができる。以下、主にhA-MSCを例として他の生物学的特性および機能に対するPBLとの共培養の影響を評価した。
対数増殖期にある第3継代のヒト羊膜MSCを取り、104/皿の密度で直径10cmの細胞培養皿に接種し、16時間後、新たに分離したPBLを加え、それぞれ共培養の3日、6日、9日および12日目にクリスタルバイオレットで染色し、撮影して記録した。共培養の6日、9日および12日目にパンクレアチンで消化した後、遠心分離して細胞を収集し、細胞計数盤で細胞を計数した。共培養の12日目に細胞総タンパク質を抽出し、Western blottingにより増殖細胞核抗原PCNAおよび幹細胞性転写因子Oct4の発現レベルを測定した。結果から分かるように、単独したMSC増幅に比べ、PBLとMSCとの接触共培養により3日間増幅したときに、MSC細胞数は顕著に増加し始め、6日目に約4倍増加し、9日目に7倍以上増加し、12日目に細胞数は10倍以上増加した(表5、図8A、B)。また、PBLとMSCを12時間共培養したときに、MSC中の増殖細胞核抗原PCNAおよび幹細胞性転写因子Oct4の発現レベルが顕著に増加した(図8C、D)。
対数増殖期にある第3継代のヒト羊膜MSCを取り、2×105の密度で直径10cmの細胞培養皿に接種し、16時間後、新たに分離されたPBLを加え、48時間共培養した後、細胞総タンパク質を抽出し、western blottingにより増殖細胞核抗原PCNAおよび幹細胞性転写因子Oct4の発現状況を分析した。結果から分かるように、MSCとPBLを接触共培養した後、MSC増殖細胞核抗原PCNAおよび幹細胞性転写因子Oct4の発現レベルが顕著に向上した(図9)。
対数増殖期にある第3継代のヒト羊膜MSCを取り、100細胞/ウェルの密度で6ウェル細胞培養プレートに接種し、16時間後、新たに分離されたPBLを加え、9日間共培養した後、クリスタルバイオレットで染色し、細胞コロニーの形成を観察し、撮影して記録した。結果から分かるように、MSCとPBLを9日間接触共培養した後、MSCのコロニー形成率は33.3%であり、一般的に培養された対照群(3.3%)よりも10倍以上増加した(図10)。
対数増殖期にある第3継代のヒト羊膜MSCを取り、2×104/ウェルの密度で6ウェル細胞培養プレートに接種し、16時間後、新たに分離されたPBLを加え、48時間共培養し、細胞コンフルエンスが80%に達したときに、それぞれ骨分化、脂肪生成分化および軟骨分化培地に交換した。誘導分化過程において、21日目まで3日ごとに液体を交換し、トルイジンブルーで染色し、軟骨形成分化細胞外マトリックスグリコサミノグリカンの生成を検出し、アリザリンレッドS染色法により骨形成分化石灰化結節の生成を検出し、オイルレッドO染色により脂肪生成分化脂肪滴の形成を検出した。結果から分かるように、PBLとMSCの接触共培養により得られたMSCは、通常培養により得られたMSCに比べ、軟骨マトリックスグリコサミノグリカン生成能力、石灰化結節形成能力および脂肪滴生成能力のいずれもより高かった(図11)。これは、PBLとMSCの接触共培養がMSC骨形成分化、脂肪生成分化および軟骨形成分化を増強できることを示している。
対数増殖期にある第3継代のヒト羊膜MSCを取り、5×104/ウェルの密度で6ウェル細胞培養プレートに接種し、16時間後、新たに分離されたPBLを加え、細胞コンフルエンスが100%に達するまで共培養した後、200μLの滅菌ピペットチップで培養プレート上を均一にスクラッチを作製した後、滅菌PBSで洗浄して細胞破片を除去し、37℃、飽和湿度の5%CO2インキュベータに入れ、それぞれ共培養の0、6、12、24および36時間目に同じスクラッチ位置を撮影して記録した。結果から分かるように、PBLとMSCの接触共培養はMSCの遊走能力を顕著に増強できる(図12)。
3%DSSを自由飲食させることにより潰瘍性結腸炎マウスモデルを構築し、40匹のC57マウス(5~7週齢)を10匹/群でランダムにNormal、DSS、DSS+MSC、DSS+PBL+MSCの4群に分けた。DSS+MSC群およびDSS+PBL+MSC群では、DSSを食べさせ始めた時にそれぞれP4およびリンパ球で48時間処理した後のP4 MSC(1×107/匹)を腹腔内注射した。NormalおよびDSS群のマウスに同時に等体積の滅菌PBSを注射した。観察期間で、毎日定時で体重を秤り、死亡状況を記録し、下痢便、血便などの現象があるか否かを観察した。マウス体重、下痢、便血および死亡状況に基づいて疾患活動性指標(DAI)を算出した。ヒト羊膜MSC注射の10日後、マウスを安楽死させ、結腸を取り、4%パラホルムアルデヒドを用いて室温で一晩固定し、パラフィン包埋し、4mの切片に切り出し、HE染色した。顕微鏡で結腸組織の炎性細胞浸潤および陰窩と杯状細胞の構造を観察し、従来の方法にしたがって組織病理学的スコアを行った。結果から分かるように、DSSを食べさせた5日目に、マウスは、体重減少、下痢便、血便などを含む炎症性結腸炎の重篤な症状が現れ始め、7日目に死亡し始めた(図13)。組織学的分析により、DSSを食べさせることによりマウスの結腸粘膜が重度の炎症と損傷が発生したことが示された(図13C、D)。PBLとP3 MSCを共培養して得られたP4 MSCを静脈注射した後、免疫細胞で処理されていないP4 MSCを静脈注射した場合と同様に、免疫拒絶反応が発生せず、DSS誘導の体重減少、血便、結腸炎症および損傷を顕著に軽減でき、結腸炎マウスの死亡を効果的に阻止することができ(図13)、PBLとMSCの接触共培養により増幅して得られたMSCを用いた疾患モデルの治療は安全で効果的であることを示している。
Claims (10)
- ヒト末梢血中の免疫細胞とヒト間葉系幹細胞とを共培養する、ことを特徴とするヒト間葉系幹細胞を高速かつ効率的にインビトロ増幅する方法。
- 前記ヒト末梢血免疫細胞は、ヒト末梢血単核細胞、ヒト末梢血単球、およびヒト末梢血リンパ球を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ヒト末梢血免疫細胞は、ヒト末梢血リンパ球である、ことを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記ヒト末梢血免疫細胞とヒト間葉系幹細胞の共培養方法は、接触共培養および非接触共培養を含む、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ヒト末梢血免疫細胞とヒト間葉系幹細胞の共培養方法は、接触共培養である、ことを特徴とする請求項4に記載の方法。
- ヒト末梢血免疫細胞は、ドナーの年齢により制限されない、ことを特徴とする請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- ヒト末梢血免疫細胞とヒト間葉系幹細胞とを共培養するときの細胞数の比率は1:1-400:1である、ことを特徴とする請求項4に記載の方法。
- ヒト末梢血免疫細胞とヒト間葉系幹細胞とを共培養するときの細胞数の比率は300:1である、ことを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 前記ヒト末梢血免疫細胞は、ヒト間葉系幹細胞の生物学的特性を維持し、幹細胞マーカーおよび増殖細胞核抗原の発現を促進し、その遊走能力、増殖能力、自己更新および分化能力を顕著に増強させることができる、ことを特徴とする請求項1から8に記載の方法。
- 被験体の末梢血免疫細胞とヒト間葉系幹細胞との共培養に適用可能であり、得られるヒト間葉系幹細胞は、臨床上で自己に使用されることを特徴とする、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法の使用。
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