CN110951681A - 一种间充质干细胞培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种间充质干细胞培养基。研究表明，过度的体外长期传代培养会造成干细胞老化，多向分化能力降低，对疾病的治疗效果也会大打折扣。本发明发现，普鲁兰糖可以降低人羊膜间充质干细胞的老化程度，但是并不明显影响人羊膜间充质干细胞的干细胞特性，不会影响其多向分化能力。因此，可以在人羊膜间充质干细胞培养基中添加有效浓度的普鲁兰糖制成抗人羊膜间充质干细胞老化的培养基。

Description

一种间充质干细胞培养基
技术领域
本发明属于生物领域，涉及干细胞培养，具体涉及一种间充质干细胞培养基。
背景技术
羊膜间充质干细胞是一类来源于羊膜的干细胞。与其他来源的干细胞相比，羊膜间充质干细胞具有低免疫原性和免疫抑制的特点，这使得羊膜间充质干细胞的移植副作用较小。羊膜间充质干细胞移植治疗一些炎症相关疾病，取得了较好的效果，相关临床试验在逐步开展。
使用羊膜间充质干细胞治疗疾病，就不可避免的涉及到体外短期或长期传代培养。但是，研究表明，过度的体外长期传代培养会造成干细胞老化，多向分化能力降低，对疾病的治疗效果也会大打折扣。
因此，体外抗老化传代培养研究是体外培养羊膜间充质干细胞的一个重要研究方向。
发明内容
本发明旨在提供一种普鲁兰糖体外抗人羊膜间充质干细胞老化和制备人羊膜间充质干细胞培养基方面的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种普鲁兰糖用于体外抗人间充质干细胞老化的用途。β-半乳糖苷酶染色法是一种基于衰老时SA-β-Gal活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的方法，从而在普通的光学显微镜下就可以观测到细胞或组织的衰老情况。β-半乳糖苷酶染色结果表明，在培养基中加入普鲁兰糖可以有效延缓人羊膜间充质干细胞的衰老。
进一步地，所述间充质干细胞为羊膜间充质干细胞。
一种普鲁兰糖在制备抗人间充质干细胞老化的培养基中的应用。
进一步地，所述间充质干细胞为羊膜间充质干细胞。
有益效果：
本发明发现，普鲁兰糖可以降低人羊膜间充质干细胞的老化程度，但是并不明显影响人羊膜间充质干细胞的干细胞特性，不会影响其多向分化能力。因此，可以在人羊膜间充质干细胞培养基中添加有效浓度的普鲁兰糖制成抗人羊膜间充质干细胞老化的培养基。
附图说明
图1为人羊膜间充质干细胞的流式细胞术结果；
图2为各组不同代次人羊膜间充质干细胞SA-β-Gal染色阳性率。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来介绍本发明的实质性内容，但不能以此限定本发明保护范围。
实施例1：普鲁兰糖抗人羊膜间充质干细胞老化的药效
一、实验材料
D-Hanks液购自广州沛瑜生物制品有限公司。
胰蛋白酶购自上海恒渡生物科技有限公司。
Ⅱ型胶原酶购自爱必信(上海)生物科技有限公司。
DMEM/F12培养基、FBS和青链霉素购自Gibco公司。
普鲁兰糖(CAS号9057-02-7)购自上海源叶生物科技有限公司，纯度≥99％。
流式鉴定使用到的荧光标记流式抗体为Beckman公司产品。
β-半乳糖苷酶染色试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司。
二、实验方法
1、细胞分离、培养和鉴定
无菌条件下剥离胎盘胎儿面羊膜，用4℃预冷的D-Hanks液反复冲洗至羊膜呈透明白色，剪成约1mm×1mm×1mm大小，加入约2.5倍羊膜体积的0.05％EDTA-胰蛋白酶消化2次，每次30～40min，D-Hanks液清洗后，加入约1倍羊膜体积的0.75g/LⅡ型胶原酶于37℃震荡消化1～2h，至裸眼观察不到羊膜碎片，300目滤网过滤，收集细胞滤液，1500r/min离心10min。弃上清，用含10％FBS、1×105U/L青霉素、1×105U/L链霉素的DMEM/F12培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶中，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件培养。每3d更换1次培养基，倒置相差显微镜观察细胞形态变化，待细胞融合率达到约80％时，加入0.25％胰酶于37℃消化1min，使贴壁细胞脱落、变圆，然后加入等体积DMEM/F12培养基终止消化，1500r/min离心5min，弃上清液，用含10％FBS、1×105U/L青霉素、1×105U/L链霉素的DMEM/F12培养基重悬细胞，以1.5×105个/mL细胞浓度种于75cm2培养瓶中，传至第3代进行试验。
流式鉴定：取融合率约85％的第3代人羊膜间充质干细胞，离心弃培养液，消化细胞，PBS洗涤2遍后，调整细胞浓度至2×106个/mL，装入流式管中，每管加入100μL细胞悬液，室温下避光分别加入鼠抗人单克隆抗体CD44-PE、CD90-FITC、CD105-PerCP-Cy、CD73-APC和阴性对照混合液CD34-PE、CD19-PE、CD45-PE、CD11b-PE、HLA-DR，室温避光孵育30min，每个流式管中均加入2mLPBS，充分震荡，1500r/min离心5min，弃去上清，加入250μL PBS重悬细胞后行流式细胞仪鉴定，计算细胞表面抗原阳性率。
2、分组和传代培养
试验分为对照组和普鲁兰糖组。取融合率约85％的第3代人羊膜间充质干细胞，离心弃培养液，加入0.25％胰酶于37℃消化1min，使贴壁细胞脱落、变圆，然后加入等体积DMEM/F12培养基终止消化，1500r/min离心5min，弃上清液，用含10％FBS、1×105U/L青霉素、1×105U/L链霉素的DMEM/F12培养基重悬细胞，以1.5×105个/mL细胞浓度种于25cm2培养瓶中，对照组和普鲁兰糖组各3瓶，普鲁兰糖组立即加入终浓度为100ng/mL的普鲁兰糖，对照组不添加任何其他物质，培养至融合率约85％时，普鲁兰糖组使用含100ng/mL普鲁兰糖、10％FBS、1×105U/L青霉素、1×105U/L链霉素的DMEM/F12培养基传代培养，对照组使用常规的含10％FBS、1×105U/L青霉素、1×105U/L链霉素的DMEM/F12培养基培养，取第15、20、25代人羊膜间充质干细胞用于检测。
3、β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)检测人羊膜间充质干细胞衰老程度
分别取对照组和普鲁兰糖组第15、20、25代消化计数后的细胞，以1×105个细胞/孔接种于6孔板上，融合率约90％时，弃培养液，PBS洗涤3次，用4％甲醛室温固定5min，再用PBS洗涤3次，按照染色试剂盒说明书，各孔添加X-Gal染液，37℃孵育20h，在倒置显微镜下观察，随机取5个视野，统计视野中蓝色的β-半乳糖苷酶染色细胞和总细胞，按照如下公式计算阳性率。阳性率(％)＝蓝色细胞数/总细胞数×100％。
4、流式法测定人羊膜间充质干细胞培养后的干细胞特性
分别取普鲁兰糖组第15、20、25代消化计数后的细胞，按前述方法装入流式管中并于室温下避光分别加入鼠抗人单克隆抗体CD44-PE、CD73-APC、CD90-FITC、CD105-PerCP-Cy和阴性对照混合液CD11b-PE、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR，室温避光孵育30min，每个流式管中均加入2mLPBS，充分震荡，1500r/min离心5min，弃去上清，加入250μL PBS重悬细胞后行流式细胞仪鉴定，计算细胞表面抗原阳性率。
5、统计学方法
采用SPSS 19.0分析数据，计量资料以均值±SD表示，组间两两比较用LSD-t检验，以P＜0.05代表差异有统计学意义。
三、实验结果
1、人羊膜间充质干细胞的鉴定结果
流式细胞术结果如图1所示，CD44、CD73、CD90、CD105阳性，CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阴性，符合人羊膜间充质干细胞的表型特征。
2、第15、20、25代人羊膜间充质干细胞老化程度
SA-β-Gal染色结果如表1和图2所示，随着传代次数的增加，对照组和普鲁兰糖组人羊膜间充质干细胞的老化程度均增加，但是普鲁兰糖组老化程度明显弱于对照组。
表1各组不同代次人羊膜间充质干细胞SA-β-Gal染色阳性率
Figure BDA0002340110740000041
β-半乳糖苷酶染色法是一种基于衰老时SA-β-Gal活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的方法，从而在普通的光学显微镜下就可以观测到细胞或组织的衰老情况。该结果表明，在培养基中加入普鲁兰糖可以有效延缓人羊膜间充质干细胞的衰老。
3、普鲁兰糖对人羊膜间充质干细胞干细胞特性的影响
普鲁兰糖组第15、20、25代人羊膜间充质干细胞的表型结果如表2所示，CD44、CD73、CD90、CD105阳性率均在95％以上，CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阳性率在1％以内，说明在培养基中添加普鲁兰糖并不会明显改变人羊膜间充质干细胞的干细胞特性。
表3普鲁兰糖组第15、20、25代人羊膜间充质干细胞的表型结果
Figure BDA0002340110740000042
上述试验结果表明，普鲁兰糖可以降低人羊膜间充质干细胞的老化程度，但是并不明显影响人羊膜间充质干细胞的干细胞特性，不会影响其多向分化能力。因此，可以在人羊膜间充质干细胞培养基中添加有效浓度的普鲁兰糖制成抗人羊膜间充质干细胞老化的培养基。
实施例2：人羊膜间充质干细胞培养基
一种延缓人羊膜间充质干细胞老化的细胞培养基，通过在DMEM/F12培养基中添加有效浓度的普鲁兰糖制备而成。
上述实施例用来介绍本发明的实质性内容，但不能以此限定本发明保护范围。

Claims (4)

1.一种普鲁兰糖用于体外抗人间充质干细胞老化的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述间充质干细胞为羊膜间充质干细胞。
3.一种普鲁兰糖在制备抗人间充质干细胞老化的培养基中的应用。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述间充质干细胞为羊膜间充质干细胞。
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