CN109749993B - 一种脐带间充质干细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脐带间充质干细胞的培养方法。本发明研究发现：首先，蔗果五糖可以显著提高脐带间充质干细胞的体外增殖活性；其次，脐带间充质干细胞经蔗果五糖干预培养依然能维持其干细胞特性，细胞表型不会明显改变，依然保持多向分化能力。因此，蔗果五糖可以用于提高脐带间充质干细胞体外增殖活性，用于制备提高脐带间充质干细胞体外增殖活性的培养基。本领域技术人员知道，sirt2基因高表达可促进hUC‑MSCs增殖，延长细胞周期，并有效抑制hUC‑MSCs的衰老，蔗果五糖可能正是通过上调sirt2基因表达提高脐带间充质干细胞体外增殖活性。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，涉及干细胞培养，具体涉及一种脐带间充质干细胞的培养方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我更新复制和多向分化潜能的未分化细胞，可以诱导分化成多种组织类型的细胞，在促进生物体内成体器官组织的自我更新和损伤修复过程中扮演着不可替代的重要角色。在疾病与衰老状态下，生物体内的干细胞往往存在再生修复功能降低或数量不足的状况，需要通过输注经体外培养扩增的自体或异体干细胞加以改善。
间充质干细胞凭其自我更新能力与多向分化潜能，目前已被广泛应用于组织工程与再生医学领域，来源广泛，体外易于操作，造血支持和免疫调节作用明确，因此间充质干细胞治疗具有广阔前景，其中，人脐带来源间充质干细胞(human umbilical cordmesenchymal stem cells,hUC-MSCs)被认为是具备更高可塑性和更低免疫原性的原始间充质干细胞群，方便易取，在新兴转化医学中展现出广阔的应用前景。
作为种子细胞，首先要解决的是体外增殖活力，以快速扩增出大量的细胞，用于组织工程和医学领域。但是，hUC-MSCs在常规培养条件下，扩增速度还不能满足需求。
Sirt2是哺乳动物沉默信息调节因子家族成员之一，参与调控细胞周期、衰老等过程。马珊珊等(参考文献：sirt2基因高表达对人脐带间充质干细胞衰老的抑制作用，郑州大学学报，2016年1月第51卷第1期)发现sirt2基因高表达可促进hUC-MSCs增殖，延长细胞周期，并有效抑制hUC-MSCs的衰老。
发明内容
本发明目的是克服现有技术的不足，提供一种脐带间充质干细胞的培养方法，以提高脐带间充质干细胞的体外增殖活力，满足组织工程和医学领域需求。
本发明目的通过下述技术方案得以实现：
一种提高脐带间充质干细胞体外增殖活性的培养方法，在脐带间充质干细胞的培养过程中用蔗果五糖进行干预。根据OD490nm测定值可以计算出蔗果五糖干预培养24h可以将hUC-MSCs的增殖活性提高65.4％，干预培养48h可以将hUC-MSCs的增殖活性提高125.3％，干预培养72h可以将hUC-MSCs的增殖活性提高157.3％，增殖活性提高明显。
蔗果五糖在提高脐带间充质干细胞体外增殖活性方面的应用。
蔗果五糖在制备提高脐带间充质干细胞体外增殖活性的培养基方面的应用。
一种提高脐带间充质干细胞体外增殖活性的培养基，含有蔗果五糖。
有益效果：
本发明发现：首先，蔗果五糖可以显著提高脐带间充质干细胞的体外增殖活性；其次，脐带间充质干细胞经蔗果五糖干预培养依然能维持其干细胞特性，细胞表型不会明显改变，依然保持多向分化能力。因此，蔗果五糖可以用于提高脐带间充质干细胞体外增殖活性，用于制备提高脐带间充质干细胞体外增殖活性的培养基。本领域技术人员知道，sirt2基因高表达可促进hUC-MSCs增殖，延长细胞周期，并有效抑制hUC-MSCs的衰老，蔗果五糖可能正是通过上调sirt2基因表达提高脐带间充质干细胞体外增殖活性。
附图说明
图1为hUC-MSCs的流式检测图，从图中可以看出，CD73、CD90、CD105强阳性表达，CD19、CD34、CD45弱阴性表达，符合hUC-MSCs的生物学特点；
图2为各组hUC-MSCs培养24、48、72h后的490nm处吸光度值，从图中可以看出，与对照组相比，蔗果五糖干预培养24、48、72h后的490nm处吸光度值均显著升高，而蔗果六糖干预培养24、48、72h后的490nm处吸光度值均未见明显升高；
图3为各组hUC-MSCs培养48h后Sirt2蛋白表达水平的western blot图，从图中可以看出，与对照组相比，蔗果五糖组hUC-MSCs中Sirt2蛋白表达水平显著上调，蔗果六糖组hUC-MSCs中Sirt2蛋白表达水平未见明显上调；
图4为hUC-MSCs经蔗果五糖干预培养72h后的流式检测图，从图中可以看出，CD73、CD90、CD105强阳性表达，CD19、CD34、CD45弱阴性表达，与图1基本一致，符合hUC-MSCs的生物学特点，说明蔗果五糖不会影响hUC-MSCs的干细胞表型；
图5为hUC-MSCs经蔗果五糖干预培养72h后的成脂、成骨诱导结果，从图中可以看出，蔗果五糖干预培养后的hUC-MSCs依然具有优异的成脂、成骨分化能力，说明蔗果五糖不会影响hUC-MSCs的多向分化活性。
具体实施方式
以下实施例仅用于具体介绍本发明的实质内容，但不以此限定本发明的保护范围。
一、实验材料
DMEM、DMEM/F12培养基和胎牛血清，GIBCO公司；蔗果五糖、蔗果六糖为实验室标准品库干燥保存；hUC-MSCs为实验室液氮中冻存，临用前取出复苏；兔抗人Sirt2抗体，Novus公司；鼠抗人β-Actin抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔或者羊抗鼠IgG，碧云天。
二、实验方法
1、hUC-MSCs的复苏
将hUC-MSCs冻存管从液氮中取出快速放入37℃水浴中完全解冻，然后将冻存管中的液体倒入离心管，加入DMEM培养基，充分吹打，1500r/min离心5min，倒掉上清液后用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度条件培养，待细胞长满瓶底80％-90％融合时用0.25％的胰酶消化、传代。
2、hUC-MSCs的表型鉴定
选择处于对数生长期的hUC-MSCs，加入胰酶消化，PBS洗涤、离心、重悬细胞，并分装于EP管中，分别加入5μL HLA-DR-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD19-FITC、CD34-FITC和CD45-PE单克隆抗体及同型对照，4℃孵育30min，PBS洗涤、离心、重悬细胞，上流式细胞仪检测。
3、MTT法检测hUC-MSCs的体外增殖活性
将对数期的hUC-MSCs消化重悬后按1×105/mL密度接种于96孔培养板中，随机分为对照组、蔗果五糖组和蔗果六糖组，每组6个孔。培养24h后，更换培养基继续培养：对照组更换为新鲜的含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，蔗果五糖组更换为含10％胎牛血清和20μM蔗果五糖的DMEM/F12培养基，蔗果六糖组更换为含10％胎牛血清和20μM蔗果六糖的DMEM/F12培养基。继续培养24、48、72h后取出1个培养板，每孔加入20μL 5mg/mLMTT溶液，继续培养4h后，弃上清液，每孔加入200mLDMSO，振荡5min，自动酶标仪系统上测定波长490nm处吸光度值。
4、western blot法检测hUC-MSCs的Sirt2蛋白表达
将对数期的hUC-MSCs消化重悬后按1×105/mL密度接种于24孔培养板中，随机分为对照组、蔗果五糖组和蔗果六糖组，培养24h后，更换培养基继续培养：对照组更换为新鲜的含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，蔗果五糖组更换为含10％胎牛血清和20μM蔗果五糖的DMEM/F12培养基，蔗果六糖组更换为含10％胎牛血清和20μM蔗果六糖的DMEM/F12培养基。继续培养48h后，收集细胞，裂解细胞，提取细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，在10％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中进行蛋白电泳分离，以β-Actin作为内参，蛋白上样量为25μg。90V恒压流转膜，将凝胶蛋白转至硝酸纤维素(NC)膜上。将NC膜放入含5％脱脂奶粉的磷酸盐吐温缓冲液(PBST)溶液中室温封闭2h。然后分别加入稀释的一抗溶液兔抗Sirt2和鼠抗β-Actin抗体4℃孵育过夜。PBST溶液洗膜3次，每次10min，加入稀释的二抗辣根过氧化物酶标记羊抗兔或者羊抗鼠IgG室温孵育2h。PBST溶液洗膜3次后加入ECL发光液进行显色，然后拍照、分析。
5、流式细胞仪检测hUC-MSCs的表型
将对数期的hUC-MSCs消化重悬后按1×105/mL密度接种于24孔培养板中，培养24h后，更换为含10％胎牛血清和20μM蔗果五糖的DMEM/F12培养基。继续培养72h后，收集细胞，PBS洗涤、离心、重悬细胞，并分装于EP管中，分别加入5μL HLA-DR-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD19-FITC、CD34-FITC和CD45-PE单克隆抗体及同型对照，4℃孵育30min，PBS洗涤、离心、重悬细胞，上流式细胞仪检测。
6、测定hUC-MSCs的多向分化活性
将对数期的hUC-MSCs消化重悬后按1×105/mL密度接种于24孔培养板中，随机分为对照组和蔗果五糖组。培养24h后，更换培养基继续培养：对照组更换为新鲜的含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，蔗果五糖组更换为含10％胎牛血清和20μM蔗果五糖的DMEM/F12培养基。继续培养72h后，收集细胞，PBS洗涤，重悬接种到24孔板中，分为诱导组(采用前述对照组、蔗果五糖组细胞进行诱导培养)、非诱导组(采用前述对照组细胞进行常规培养)，贴壁后，向诱导组加入相应的分化培养液：成骨分化培养基中含0.1μmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸盐和50μmol/L抗坏血酸，成脂分化培养基中含1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L IBMX、60μmol/L吲哚美辛和5U/mL胰岛素。每3～4d换液1次，14d后，用4％多聚甲醛固定，分别用茜素红和油红O染色，于显微镜下观察、拍照。
三、实验结果
1、hUC-MSCs的表型鉴定结果
流式检测结果如图1所示，CD73、CD90、CD105强阳性表达，CD19、CD34、CD45弱阴性表达，符合hUC-MSCs的生物学特点。
2、蔗果五糖对hUC-MSCs体外增殖活性的影响
各组hUC-MSCs培养24、48、72h后的490nm处吸光度值测定结果如表1和图2所示。与对照组相比，蔗果五糖干预培养24、48、72h后的490nm处吸光度值均显著升高，而蔗果六糖干预培养24、48、72h后的490nm处吸光度值均未见明显升高。
表1各组hUC-MSCs培养24、48、72h后的490nm处吸光度值
根据OD490nm测定值可以计算出蔗果五糖干预培养24h可以将hUC-MSCs的增殖活性提高65.4％，干预培养48h可以将hUC-MSCs的增殖活性提高125.3％，干预培养72h可以将hUC-MSCs的增殖活性提高157.3％。
3、蔗果五糖对hUC-MSCs中Sirt2蛋白表达的影响
Western blot检测结果如图3所示，与对照组相比，蔗果五糖组hUC-MSCs中Sirt2蛋白表达水平显著上调，蔗果六糖组hUC-MSCs中Sirt2蛋白表达水平未见明显上调。
4、蔗果五糖对hUC-MSCs干细胞表型的影响
蔗果五糖干预培养后的流式检测结果如图4所示，CD73、CD90、CD105强阳性表达，CD19、CD34、CD45弱阴性表达，与图1基本一致，符合hUC-MSCs的生物学特点，说明蔗果五糖不会影响hUC-MSCs的干细胞表型。
5、蔗果五糖对hUC-MSCs多向分化活性的影响
成脂、成骨诱导结果如图5所示，蔗果五糖干预培养后的hUC-MSCs依然具有优异的成脂、成骨分化能力，说明蔗果五糖不会影响hUC-MSCs的多向分化活性。
上述实验结果表明：首先，蔗果五糖可以显著提高脐带间充质干细胞的体外增殖活性；其次，脐带间充质干细胞经蔗果五糖干预培养依然能维持其干细胞特性，细胞表型不会明显改变，依然保持多向分化能力。因此，蔗果五糖可以用于提高脐带间充质干细胞体外增殖活性，用于制备提高脐带间充质干细胞体外增殖活性的培养基。本领域技术人员知道，sirt2基因高表达可促进hUC-MSCs增殖，延长细胞周期，并有效抑制hUC-MSCs的衰老，蔗果五糖可能正是通过上调sirt2基因表达提高脐带间充质干细胞体外增殖活性。
Claims (1)
1.一种提高脐带间充质干细胞体外增殖活性的培养方法，其特征在于：以含10%胎牛血清和20μM蔗果五糖的DMEM/F12培养基作为培养基。
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