CN110592010B - 积雪草酸用于促进人脂肪间充质干细胞体外增殖并诱导其成软骨分化的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了积雪草酸用于促进人脂肪间充质干细胞体外增殖并诱导其成软骨分化的用途。研究发现，积雪草酸、2,3‑二羰基‑23‑羧基正丁酯‑乌苏烷‑12‑烯‑28‑羧酸乙酯、2,3‑二羰基‑23‑羧基异丁酯‑乌苏烷‑12‑烯‑28‑羧酸乙酯对人脂肪间充质干细胞的作用具有共性，又存在差异，三者都可显著促进人脂肪间充质干细胞体外增殖，但积雪草酸在促进人脂肪间充质干细胞体外增殖的同时可以促进其成软骨分化，适合于人脂肪间充质干细胞成软骨应用方面，而2,3‑二羰基‑23‑羧基正丁酯‑乌苏烷‑12‑烯‑28‑羧酸乙酯、2,3‑二羰基‑23‑羧基异丁酯‑乌苏烷‑12‑烯‑28‑羧酸乙酯可在促进人脂肪间充质干细胞体外增殖的同时维持其干细胞特性，适合于人脂肪间充质干细胞种子细胞的体外快速扩增。

Description

积雪草酸用于促进人脂肪间充质干细胞体外增殖并诱导其成 软骨分化的用途
技术领域
本发明属于生物领域，涉及脂肪间充质干细胞的体外培养扩增，具体涉及积雪草酸用于促进人脂肪间充质干细胞体外增殖并诱导其成软骨分化的用途。
背景技术
脂肪间充质干细胞(ADSCs)是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，其可以在特定的条件下诱导分化为脂肪、骨、软骨、胰岛β细胞和心肌等多种细胞。
近年来，ADSCs在组织修复和再生研究方面，每年显著增加。研究者们最关注的是在修复和再生中使用ADSCs的数量、临床试验评价疗效和安全性。根据美国临床试验(2015)报道，有121项研究注册使用ADSCs，这些研究包括治疗糖尿病、肝硬化、瘘、心血管疾病、肢体缺血、肌萎缩侧索硬化、脂肪代谢障碍、移植物抗宿主病、克罗恩病、动脉硬化、软组织填充和骨组织缺损等。基于合法性，ADSCs用于韩国和日本的整形美容的临床治疗不受限制，但所有进行的研究大多处于早期阶段。
但是，常规情况下，ADSCs的扩增速度还不够快，无法尽快提供大量种子细胞；ADSCs的诱导分化也还有待进一步研究，诱导分化剂的产品线有待进一步丰富。
公开号为CN107840867A、CN107652351A和CN107586313A的专利公开了三种积雪草酸的衍生物用于促进骨髓间充质干细胞成骨分化的用途，且根据说明书记载，积雪草酸不具有促进骨髓间充质干细胞成骨分化的作用。未见其它现有技术公开积雪草酸及其衍生物对不同间充质干细胞的增殖和分化的影响。
2,3-二羰基-23-羧基正丁酯-乌苏烷-12-烯-28-羧酸乙酯、2,3-二羰基-23-羧基异丁酯-乌苏烷-12-烯-28-羧酸乙酯为积雪草酸的两种衍生物，二者为同分异构体，化学结构式如下。
Figure BDA0002233324610000011
未见积雪草酸及2,3-二羰基-23-羧基正丁酯-乌苏烷-12-烯-28-羧酸乙酯、2,3-二羰基-23-羧基异丁酯-乌苏烷-12-烯-28-羧酸乙酯对ADSCs体外增殖和分化影响的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供积雪草酸用于促进人脂肪间充质干细胞体外增殖并诱导其成软骨分化的用途，以用于软骨组织工程。
本发明的上述目的通过如下技术方案实现：
积雪草酸用于促进人脂肪间充质干细胞体外增殖的用途。
积雪草酸用于诱导人脂肪间充质干细胞成软骨分化的用途。
积雪草酸用于促进人脂肪间充质干细胞体外增殖并诱导其成软骨分化的用途。
积雪草酸用于制备促进人脂肪间充质干细胞体外增殖的培养基的用途。
积雪草酸用于制备诱导人脂肪间充质干细胞成软骨分化的培养基的用途。
积雪草酸用于制备促进人脂肪间充质干细胞体外增殖并诱导其成软骨分化的培养基。
有益效果：
本发明研究结果可知，积雪草酸、2,3-二羰基-23-羧基正丁酯-乌苏烷-12-烯-28-羧酸乙酯(衍生物A)、2,3-二羰基-23-羧基异丁酯-乌苏烷-12-烯-28-羧酸乙酯(衍生物B)对人脂肪间充质干细胞的作用具有共性，又存在差异，共性的是三者都可以显著促进人脂肪间充质干细胞体外增殖，差异是积雪草酸在促进人脂肪间充质干细胞体外增殖的同时可以促进其成软骨分化，适合于人脂肪间充质干细胞成软骨应用方面，而2,3-二羰基-23-羧基正丁酯-乌苏烷-12-烯-28-羧酸乙酯(衍生物A)、2,3-二羰基-23-羧基异丁酯-乌苏烷-12-烯-28-羧酸乙酯(衍生物B)可以在促进人脂肪间充质干细胞体外增殖的同时维持其干细胞特性，适合于人脂肪间充质干细胞种子细胞的体外快速扩增。
附图说明
图1为人脂肪干细胞表面标记物的流式鉴定结果；
图2为积雪草酸及其衍生物对人脂肪间充质干细胞的体外增殖作用曲线；
图3为积雪草酸对人脂肪间充质干细胞成软骨诱导分化的甲苯胺蓝染色结果；
图4为经积雪草酸衍生物孵育的人脂肪间充质干细胞成脂诱导分化的油红O染色结果和成骨诱导分化的茜素红染色结果。
具体实施方式
下面具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
一、实验材料
高糖DMEM培养基购于美国Gibco公司。
胎牛血清购于美国Gibco公司。
荧光标记单克隆抗体购于美国Bioscience公司。
积雪草酸、2,3-二羰基-23-羧基正丁酯-乌苏烷-12-烯-28-羧酸乙酯(衍生物A)、2,3-二羰基-23-羧基异丁酯-乌苏烷-12-烯-28-羧酸乙酯(衍生物B)购买或自制，纯度不低于98％。
甲苯胺蓝染料试剂盒购于Solarbio公司。
人脂肪间充质干细胞成脂诱导培养基购于赛业生物。
人脂肪间充质干细胞成骨诱导培养基购于赛业生物。
二、实验方法
1、人脂肪间充质干细胞的培养、传代及鉴定
取健康人腹部脂肪抽脂术中抽取的脂肪组织，按文献方法(血管内皮生长因子165基因促进人脂肪间充质干细胞的增殖，中国组织工程研究，2015年，第19卷第28期)进行脂肪间充质干细胞的培养及传代，具体步骤如下：
脂肪组织用PBS反复冲洗3次，再用体积分数0.25％Ⅰ型胶原酶于37℃水浴消化30min，期间反复震荡3次，使胶原酶溶液与脂肪组织充分混合接触。用与胶原酶消化后的混悬液等体积的完全培养液(高糖DMEM+体积分数10％胎牛血清+1％青链霉素)终止胶原酶的消化，200目滤网过滤混悬液，以去除未消化的纤维结缔组织，1200×g离心5min以去除悬浮的脂肪细胞和脂滴等，去上清。将细胞沉淀用1mL的完全培养基重悬后，加入6倍体积的红细胞裂解液，混匀后室温下解育6min，1200×g离心5min，去上清，显微镜下计数细胞数，再以适量完全培养基重悬沉淀，以1×106/皿的密度接种于直径为10cm的培养皿，再加入适量完全培养基培养。细胞每隔3d换1次培养基，每周以1:3的比例传代。传代时，吸走培养皿中的完全培养基，用PBS冲洗2次，加入适量胰酶溶液在显微镜下观察，待80％-90％的细胞变圆后，加入完全培养基以终止消化，用加样枪反复吹打培养皿的底部，使贴壁的细胞脱落，将细胞混悬液移入离心管中，1200×g离心5min，去上清，以适量完全培养基重悬沉淀，接种于培养皿，再加入适量完全培养基培养。取第3代脂肪间充质干细胞用于后续实验。
流式鉴定：胰酶消化收集第3代细胞，取适量于流式管中，PBS洗涤，将荧光标记单克隆抗体CD29、CD73、CD90、CD105和CD34、CD45、HLA-DR加入到流式管中，设置同型对照，轻轻混匀，4℃避光孵育30min，流式细胞仪检测细胞表面抗原标记。
2、分组和给药
积雪草酸组：给予含5μM积雪草酸的完全培养基培养；
衍生物A组：给予含5μM 2,3-二羰基-23-羧基正丁酯-乌苏烷-12-烯-28-羧酸乙酯的完全培养基培养；
衍生物B组：给予含5μM 2,3-二羰基-23-羧基异丁酯-乌苏烷-12-烯-28-羧酸乙酯的完全培养基培养；
空白对照组：仅给予完全培养基培养。
3、人脂肪间充质干细胞增殖情况检测
取对数期的第3代细胞，胰酶消化，用完全培养基制成2×104/mL细胞悬液，接种于5块96孔培养板上，培养24h待脂肪间充质干细胞贴壁后，积雪草酸组、衍生物A组、衍生物B组和空白对照组更换成对应的培养基继续培养24、48、72、96、120h后，加入MTT溶液继续培养4h，弃上清，加入DMSO振荡溶解，于490nm处测定溶液吸光度值，绘制增殖曲线。每板设5个复孔，各组平行操作，每时间点取一块板检测。
4、流式测定积雪草酸及其衍生物对人脂肪间充质干细胞干性的影响检测
取对数期的第3代细胞，胰酶消化，用完全培养基制成2×104/mL细胞悬液，接种于细胞培养瓶中，培养24h待脂肪间充质干细胞贴壁后，积雪草酸组、衍生物A组、衍生物B组和空白对照组更换成对应的培养基继续培养96h，收集细胞取适量于流式管中，PBS洗涤，将荧光标记单克隆抗体CD29、CD73、CD90、CD105加入到流式管中，设置同型对照，轻轻混匀，4℃避光孵育30min，流式细胞仪检测。
6、积雪草酸对人脂肪间充质干细胞的成软骨诱导分化
取对数期的第3代细胞，胰酶消化，用完全培养基制成细胞悬液，按1×107/皿接种于10cm细胞培养皿中，培养24h待脂肪间充质干细胞贴壁后，积雪草酸组和空白对照组更换成对应的培养基继续培养，每2-3d半量更换培养基，14、21d后根据甲苯胺蓝染料试剂盒使用说明书对诱导培养的细胞进行染色观察。
7、积雪草酸衍生物培养对人脂肪间充质干细胞多向分化能力的维持作用检测
收集实验方法“4、流式测定积雪草酸及其衍生物对人脂肪间充质干细胞干性的影响检测”中衍生物A、衍生物B培养96h的脂肪间充质干细胞进行成脂、成骨诱导分化实验。
(1)成脂诱导分化：收集细胞，胰液消化，用完全培养基制成细胞悬液，接种到置有盖玻片的6孔培养板上，每孔1×105个细胞，培养24h待脂肪间充质干细胞贴壁后，将培养基更换为成脂诱导培养基，2-3d换液一次，以完全培养基作为阴性对照，14d后油红O染色。
(2)成骨诱导分化：收集细胞，胰液消化，用完全培养基制成细胞悬液，接种到置有盖玻片的6孔培养板上，每孔1×105个个细胞，培养24h待脂肪间充质干细胞贴壁后，将培养基更换为成骨诱导培养基，2-3d换液一次，以完全培养基作为阴性对照，14d后茜素红染色。
8、数据分析
采用SPSS软件进行数据分析，以平均值±标准偏差表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有显著性意义。
三、实验结果
1、人脂肪干细胞表面标记物的鉴定结果
流式细胞仪检测结果如图1所示，细胞阳性表达CD73、CD90、CD105和CD29(表达率均在98％以上)，阴性表达HLA-DR、造血干细胞表面标志CD34和CD45(表达率均不足2％)，符合人脂肪干细胞表面标记物特点。
2、积雪草酸及其衍生物对人脂肪间充质干细胞体外增殖活力的影响
积雪草酸及其衍生物对人脂肪间充质干细胞的体外增殖作用曲线如图2所示，由图2可见，积雪草酸及其衍生物2,3-二羰基-23-羧基正丁酯-乌苏烷-12-烯-28-羧酸乙酯、2,3-二羰基-23-羧基异丁酯-乌苏烷-12-烯-28-羧酸乙酯对人脂肪间充质干细胞的体外增殖具有显著的促进作用，且呈明显的时间依赖性。
3、积雪草酸及其衍生物对人脂肪间充质干细胞干性的影响
各组人脂肪间充质干细胞特异性标记物的表达率如表1所示，与空白对照组相比，积雪草酸组四种人脂肪间充质干细胞特异性标记物的表达率均显著降低，干细胞特性显著降低；与空白对照组相比，衍生物A组、衍生物B组四种人脂肪间充质干细胞特异性标记物的表达率未见明显降低，说明衍生物A、衍生物B在促进人脂肪间充质干细胞增殖的同时不会明显造成人脂肪间充质干细胞的分化从而维持其干细胞特性。
表1各组人脂肪间充质干细胞特异性标记物的表达率
Figure BDA0002233324610000051
4、积雪草酸对人脂肪间充质干细胞的成软骨诱导分化作用
结果如图3所示，积雪草酸组出现了明显的成软骨分化，空白对照组无明显的成软骨分化。该结果说明，积雪草酸培养后之所以导致人脂肪间充质干细胞干性降低甚至消失，是因为积雪草酸在促进人脂肪间充质干细胞增殖的同时诱导其成软骨分化。
5、积雪草酸衍生物培养对人脂肪间充质干细胞多向分化能力的维持作用
结果如图4所示，可见积雪草酸衍生物作用96h的人脂肪间充质干细胞仍然维持多向分化能力，在成脂诱导培养基或成骨诱导培养基的诱导培养下可以很好地成脂、成骨分化。
本发明研究结果可知，积雪草酸、2,3-二羰基-23-羧基正丁酯-乌苏烷-12-烯-28-羧酸乙酯(衍生物A)、2,3-二羰基-23-羧基异丁酯-乌苏烷-12-烯-28-羧酸乙酯(衍生物B)对人脂肪间充质干细胞的作用具有共性，又存在差异，共性的是三者都可以显著促进人脂肪间充质干细胞体外增殖，差异是积雪草酸在促进人脂肪间充质干细胞体外增殖的同时可以促进其成软骨分化，适合于人脂肪间充质干细胞成软骨应用方面，而2,3-二羰基-23-羧基正丁酯-乌苏烷-12-烯-28-羧酸乙酯(衍生物A)、2,3-二羰基-23-羧基异丁酯-乌苏烷-12-烯-28-羧酸乙酯(衍生物B)可以在促进人脂肪间充质干细胞体外增殖的同时维持其干细胞特性，适合于人脂肪间充质干细胞种子细胞的体外快速扩增。
上述实施例用于具体介绍本发明实质性内容，不应将本发明保护范围局限于具体实施例。

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1.积雪草酸用于促进人脂肪间充质干细胞体外增殖的用途。
2.积雪草酸用于制备促进人脂肪间充质干细胞体外增殖的培养基的用途。
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