CN112779211A - 一种优化的人脂肪间充质干细胞培养体系 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种优化的人脂肪间充质干细胞培养体系，属于生物干细胞培养技术领域。该方法包括：(1)将脂肪组织洗涤干净，剪碎后使用I型胶原酶消化后离心弃上清，细胞沉淀重悬于含1％双抗的完全培养基，100μm细胞滤网过滤后接种于T‑175培养瓶，培养72h后更换培养液。之后每隔3天换液，细胞融合度达80％后使用0.125％胰酶消化，1∶3比例传代。(2)取传代细胞接种于培养瓶培养24h后，更换为含油酸或亚麻酸的完全培养基继续培养48‑72h。(3)检测细胞数量及活率、细胞表面抗原、细胞成脂分化能力。本发明的有益效果：所述方法能够快速诱导细胞增殖且能提高细胞成脂分化能力，因此油酸和亚麻酸可以用作添加剂制备促进人脂肪间充质干细胞增殖的培养基。
Description
技术领域
本发明属于生物干细胞培养技术领域，具体涉及的是人脂肪间充质干细胞培养体系的优化方法。
背景技术
人脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是从脂肪组织中分离出的一种多潜能干细胞，能多向分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等多种类型的细胞。ADSCs是目前临床研究广泛使用的间充质干细胞，CDE受理的8个干细胞新药中就有2个脂肪干细胞，其应用价值主要表现在组织修复与重建。ADSCs可作为组织工程的种子细胞，适用于修复各种缺乏再生能力的组织，如软骨、肌肉、心肌、神经等。 ADSCs的首例临床应用是用于修复人颅骨缺损。ADSCs回植体内不会产生组织配型和免疫排斥反应，无肿瘤化倾向，可避免伦理法律问题。在美容整形方面，ADSCs可用于除皱、丰胸丰唇、乳腺切除术后乳房重塑、面部缺陷修复等。ADSCs阳性表达CD44、CD73、CD105、CD90，同时阴性表达CD14、CD34、CD45，这些特异性的细胞表面抗原可用于作为区别于其他类型细胞的特征性标志物。同时，在脂肪组织发育的过程中，ADSCs的成脂分化发挥着至关重要的作用。因此本发明通过检测ADSCs的表面抗原标记物及成脂分化能力来判断增殖培养后的ADSCs是否具备干细胞特性。
目前ADSCs常用的制备方法有抽脂、分离、培养三个主要步骤。先经过一系列洗涤、离心、酶处理消化组织后获得脂肪干细胞，再将细胞与含血清的培养基进行扩增培养。这种分离培养干细胞方法存在细胞增殖速率不够理想以及细胞表型会随着细胞代数的增加而明显变差等问题。本发明的目的是提供一种能促进ADSCs增殖又保证其干细胞特性的培养方法，用于快速获得稳定可靠的ADSCs。
脂肪酸是生物体的供能物质和生物膜的重要组成部分，是膳食中重要的能量来源物质。脂肪酸根据饱和程度的不同可分为饱和脂肪酸(Saturated fatty acid，SFA)和不饱和脂肪酸(Unsaturated fatty acid，UFA)，其中不饱和脂肪酸又分为单不饱和脂肪酸(Monounsaturated fatty acid，MUFA)及多不饱和脂肪酸 (Polyunsaturated fattyacid，PUFA)。脂肪酸及其代谢产物是细胞结构和功能的重要组成部分，因此可能影响干细胞的分化。2013年Kang JX等人在《Stem cells》上发表的综述中提到，n-6和n-3族多不饱和脂肪酸及其代谢产物与细胞结构及功能有关，它们可以通过多种作用机制，促进多种干细胞的增殖及分化，继而影响干细胞的命运。脂肪酸国内市场状况良好，产品较易从市场上购得且价格优惠，适合作为添加剂制备培养基用于细胞大规模培养与生产。不饱和脂肪酸对ADSCs的增殖和成脂分化的影响尚未完全阐明，本发明以MUFA中的油酸和PUFA中的亚麻酸为对象，研究其对ADSCs活力和成脂分化的影响，以期为 ADSCs提供更优化的细胞培养体系。
发明内容
本发明目的在于提供一种优化的人脂肪间充质干细胞培养体系，在提高细胞增殖率的同时，又能提高细胞的分化能力，从而快速获得更多稳定可靠的脂肪干细胞应用于各种基础研究及疾病治疗的临床试验。
本发明的上述目的是通过以下的技术方案得到实现：
本发明提供优化的人脂肪间充质干细胞培养体系，包括如下步骤：
取志愿者皮下脂肪组织，使用2％双抗的生理盐水与脂肪组织充分混匀，400g离心7min后倒出脂肪组织，重复上述洗涤步骤数次，充分洗涤至无明显血液残留。按照1∶1体积比加入0.15％I型胶原酶溶液充分混匀后置于水浴锅中，37℃消化30min，期间每隔5min混匀一次。消化完后400g离心7min弃上层脂肪，细胞沉淀重悬于含1％双抗的完全培养基，100μm细胞滤网过滤后接种于T-175培养瓶，置于 37℃、5％CO2培养箱中培养72h后更换不含双抗的完全培养基除去未贴壁细胞，之后每隔3天换液，细胞融合度达80％后用0.125％胰酶消化2-3min，加入3倍体积的生理盐水稀释消化，以1∶3比例传代。
取传代细胞接种于含有完全培养基的培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，更换为含脂肪酸的完全培养基继续培养48-72h。
优选地，所述含脂肪酸的完全培养基含有20μmol·L-1油酸或20μmol·L-1亚麻酸。
优选地，所述完全培养基为含5％人血小板裂解液之胎牛血清替代物的MEM培养基。
作为优选，脂肪间充质干细胞的接种密度为4000-6000cell/cm2，接种前包括将细胞复苏的步骤。
作为优选，取脂肪干细胞的第3-5代的传代细胞用于诱导增殖。
本发明发现，油酸和亚麻酸可有效促进人脂肪干细胞的增殖，且不会影响其干细胞特性，增殖培养后的细胞具有较强的成脂诱导能力。因此油酸和亚麻酸可以用作添加剂制备促进人脂肪干细胞增殖的培养基。
附图说明
图1为实施例二不同浓度的油酸和亚麻酸对脂肪干细胞增殖状况的影响；
图2为实施例三不同浓度的油酸和亚麻酸对脂肪干细胞增殖状况的影响；
图3为实施例四20μmol·L-1油酸和亚麻酸培养脂肪干细胞的生长曲线；
图4为实施例四20μmol·L-1油酸和亚麻酸培养48h后脂肪干细胞生长形态；
图5为实施例五常规培养后的脂肪干细胞表面标志物的表达情况；
图6为实施例五油酸培养后的脂肪干细胞表面标志物的表达情况；
图7为实施例五亚麻酸培养后的脂肪干细胞表面标志物的表达情况；
图8为实施例六油酸和亚麻酸培养后的脂肪干细胞的成脂效果。
具体实施细则
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中所用试剂或仪器均可由市场购得。
实施例一：人脂肪间充质干细胞的分离培养方法
取志愿者皮下脂肪组织，加入等体积的含2％双抗的生理盐水与脂肪组织充分混匀，400g离心7min 后倒出脂肪组织，重复上述洗涤步骤4次，充分洗涤至无明显血液残留。按照1∶1体积比加入0.15％I型胶原酶溶液充分混匀后置于水浴锅中，37℃消化30min，期间每隔5min混匀一次。消化完后400g离心7 min弃上层脂肪，细胞沉淀重悬于含1％双抗的完全培养基，100μm细胞滤网过滤后接种于T-175培养瓶，置于37℃、5％CO2培养箱中培养72h后更换不含双抗的完全培养基除去未贴壁细胞，之后每隔3天换液，细胞融合度达80％后用0.125％胰酶消化2-3min，加入3倍体积的生理盐水稀释消化液，以1∶3比例传代。
实施例二：含不同浓度油酸和亚麻酸的完全培养基对脂肪干细胞增殖状况的影响
油酸及亚麻酸使用MEM完全培养基稀释成20、40、100、200、300μmol·L-1的浓度梯度。将P5 代人脂肪干细胞以5x104cell/孔的密度接种于六孔板，细胞过夜贴壁后将培养基换成2mL含不同浓度脂肪酸的完全培养基，以不加脂肪酸的完全培养基为空白对照组，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中继续培养48h吸弃旧培养液并用生理盐水清洗，加0.125％胰酶消化细胞，终止消化后，制备单细胞悬液，吹匀，取20μL细胞悬液与20μL 0.2％台盼蓝混匀后加样到细胞计数板，使用Counstar细胞计数仪检测细胞数量及细胞活率(每孔取三个视野计数后取平均值进行统计分析)。
结果如图1所示，当油酸和亚麻酸浓度为20μmol·L-1时，总细胞个数与对照组相比明显升高 (P＜0.05)，细胞活率无显著变化(P＞0.05)。当浓度达到40μmol·L-1时，总细胞个数有降低的趋势，而当浓度达到100μmol·L-1时，细胞活率明显降低(P＜0.05)。
实施例三：含不同浓度油酸和亚麻酸的完全培养基对脂肪干细胞增殖状况的影响
油酸及亚麻酸使用MEM完全培养基稀释成10、15、20、25、30μmol·L-1的浓度梯度。将P4代人脂肪干细胞以2x104cell/孔的密度接种于六孔板，细胞过夜贴壁后将培养基换成2mL含不同浓度脂肪酸的完全培养基，以不加脂肪酸的完全培养基为空白对照组，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中继续培养72h，吸弃旧培养液并用生理盐水清洗，加0.125％胰酶消化细胞，终止消化后，制备单细胞悬液，吹匀，取20μL 细胞悬液与20μL 0.2％台盼蓝混匀后加样到细胞计数板，使用Counstar细胞计数仪检测细胞数量及细胞活率(每孔取三个视野计数后取平均值进行统计分析)。
结果如图2所示，当油酸和亚麻酸浓度达到20μmol·L-1时，总细胞个数有明显的上升的趋势 (P＜0.01)，而当浓度达到25μmol·L-1时，细胞的活率出现下降的趋势。因此通过前期设计浓度梯度的实验结果选出油酸和亚麻酸诱导脂肪干细胞增殖的最佳浓度为20μmol·L-1。
实施例四：含20μmol·L-1油酸和亚麻酸的完全培养基对脂肪干细胞增殖状况的影响
油酸及亚麻酸使用MEM完全培养基稀释成20μmol·L-1的浓度。将P3代人脂肪干细胞以5x104cell/ 孔的密度接种于100mm的培养皿中，细胞过夜贴壁后将培养基换成10mL含20μmol·L-1油酸和亚麻酸的完全培养基，以不加脂肪酸的完全培养基为空白对照组，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，每隔24h每组随机选择3个皿，吸弃旧培养液并用生理盐水清洗，加1mL的0.125％胰酶消化细胞，终止消化后，制备单细胞悬液，吹匀，取20μL细胞悬液与20μL 0.2％台盼蓝混匀后加样到细胞计数板上，使用Counstar 细胞计数仪检测细胞数量及细胞活率(每孔取三个视野计数后取平均值进行统计分析)，以时间为横轴，总细胞个数为纵轴绘制细胞生长曲线。
结果如图3所示，细胞在加了油酸和亚麻酸的培养基中培养48h后生长速度快于常规培养基。使用亚麻酸培养48h后细胞数量多于空白对照组(P＜0.05)，使用油酸或亚麻酸培养72h后细胞数量显著多于对照组(P＜0.05)，培养96h后各组细胞进入生长平台期。细胞在添加了脂肪酸的培养体系培养72h，与未添加的培养体系比较，细胞数量增加了20％左右。各培养时间点细胞的活率与对照组相比无显著差异 (P＞0.05)，细胞的活率都大于95％。使用油酸或亚麻酸培养48h后细胞形态如图4所示，细胞呈长梭形，各组细胞的形态无明显差异。
实施例五油酸及亚麻酸对脂肪间充质干细胞表面标记物的影响
取P3代采用20μmol·L-1油酸和20μmol·L-1亚麻酸培养48h的脂肪间充质干细胞，消化后清洗3 次，制成细胞悬液，每个抗体检测的细胞数量为2.2×105个，加入抗体4℃冰箱避光孵育30min。孵育终止后，每管加入500μL PBS洗涤样品，3000rpm离心6min，小心弃上清；洗涤两次后加入200μL的PBS 重悬，转移到流式管中，流式细胞仪检测分析CD13、CD29、CD31、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105 的表达情况。结果如表1、图5(对照组)、图6(油酸组)、图7(亚麻酸组)所示。
流式细胞仪检测各组脂肪间充质干细胞的细胞表面抗原标记物
下表中对细胞表面抗原水平的标准规定是参照2006年国际细胞治疗协会(ISCT)制定的最低标准， Dominici M，Le Blanc K，Mueller I，et al.Minimal criteria fordefining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society forCellular Therapy position statement[J].Cytotherapy，2006，8(4)：315-317.
表1
上述结果表明，本发明增殖培养的ADSCs与对照组中采用常规方法培养的ADSCs均表达CD13、 CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，不表达或低表达CD31及CD45，细胞表型无差异。
实施例六油酸和亚麻酸对人脂肪间充质干细胞成脂分化能力的影响
取P3代采用20μmol·L-1油酸和20μmol·L-1亚麻酸培养48h的脂肪间充质干细胞，消化后制成细胞悬液，将细胞接种到装有2mL MSC培养基的六孔板中，每孔接种4.5×105个细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。待细胞融合度达到90％时，换成2mL MSC成脂分化培养基A液(含10％FBS、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素、吲哚美辛)；3天后换为2mL培养基B液(含胰岛素及10％FBS)； 24h后换回A液。A液B液交替作用3-5次后(12-20天)，继续用B液维持培养4-7天直到脂滴变得足够大、圆。培养18-21天后用油红O染液进行染色。具体步骤为：将脂肪干细胞使用PBS漂洗后，加入1mL 4％多聚甲醛溶液，室温固定细胞30min。用2mL DPBS冲洗1-2次，每孔加入1mL油红O工作液染色 30min。吸走油红O染液，使用2mL 1X的DPBS冲洗2-3次，将培养板置于显微镜下观察成脂染色效果并进行拍照。
成脂诱导分化3-4周后，各组干细胞的油红O染色呈阳性，成脂效果如图8所示。与对照组相比，油酸和亚麻酸增殖培养后的ADSCs细胞内脂滴的大小和数量均呈现明显增加的趋势，说明油酸和亚麻酸均能提高脂肪间充质干细胞的成脂分化能力。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (5)
1.一种优化的人脂肪间充质干细胞培养体系，包括如下步骤
(1)人脂肪间充质干细胞分离和培养
取志愿者皮下脂肪组织，使用2％双抗的生理盐水与脂肪组织充分混匀，400g离心7min后倒出脂肪组织，重复上述洗涤步骤数次，充分洗涤至无明显血液残留。按照1∶1体积比加入0.15％I型胶原酶溶液充分混匀后置于水浴锅中，37℃消化30min，期间每隔5min混匀一次。消化完后400g离心7min弃上层脂肪，细胞沉淀重悬于含1％双抗的完全培养基，100μm细胞滤网过滤后接种于T-175培养瓶，置于37℃、5％CO2培养箱中培养72h后更换不含双抗的完全培养基除去未贴壁细胞。之后每隔3天换液，细胞融合度达80％后用0.125％胰酶消化2-3min，加入3倍体积的生理盐水稀释消化液，以1∶3比例传代。
(2)脂肪干细胞的增殖培养
取传代细胞接种于含有完全培养基的T-175培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，更换为含脂肪酸的完全培养基继续培养48-72h。其特征是在添加了脂肪酸的培养体系中培养间充质干细胞，与未添加的培养体系比较，细胞数量增加20％左右。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述含脂肪酸完全培养基是含有效浓度的油酸或亚麻酸，其最优浓度为20μmol·L-1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述完全培养基为含5％人血小板裂解液之胎牛血清替代物的MEM培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述脂肪干细胞的接种密度为4000-6000/cm2。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于取脂肪干细胞的第3-5代传代细胞用于诱导增殖。
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