CN115025122A - 自体脂肪干细胞在制备抗衰老和抗免疫低下的药物或制品中的应用 - Google Patents

自体脂肪干细胞在制备抗衰老和抗免疫低下的药物或制品中的应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了自体脂肪干细胞制备抗衰老和抗免疫低下的药物或制品中的应用。该自体脂肪干细胞的获得方法包括：分离Wistar大鼠的原代脂肪干细胞；传代培养所述原代脂肪干细胞，获得第3～5代传代脂肪干细胞；诱导培养所述传代脂肪干细胞，获得诱导细胞；其中，诱导细胞表面高表达趋化因子受体和粘附因子受体，表达抗原提呈细胞的共刺激分子和T淋巴细胞的共刺激分子，不表达免疫共抑制分子。本申请实施例提供的经过诱导培养后的ADSCs细胞冻存液不仅对具有抗衰老，恢复年轻态的功效，还能够改善免疫，为其作用制备抗衰老以及改善免疫力的药品或保健品的应用前景提供基础研究，为其实际应用提供了帮助。

Description

自体脂肪干细胞在制备抗衰老和抗免疫低下的药物或制品中 的应用
技术领域
本申请涉及自体脂肪干细胞技术领域，尤其涉及自体脂肪干细胞在制备抗衰老和抗免疫低下的药物或制品中的应用。
背景技术
脂肪干细胞(adipose derived stem cells ADSCs)是从脂肪组织中分离出的具有较强的自我复制能力及多向分化潜能的成体干细胞，来源广泛。在体外，来自中胚层的ADSCs不仅能够诱导分化为中胚层来源的脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞，还可以跨胚层分化为内胚层来源的肝细胞、胰岛p样细胞，外胚层来源的神经细胞、心肌细胞、表皮细胞、血管内皮细胞、心肌细胞、胰岛细胞、肝细胞等。体内试验发现，ADSC、在构建的肝损伤模型中可显著减轻肝细胞的炎性损伤，促进肝功能恢复。因此，脂肪干细胞具有广阔的临床应用前景，成为各领域研究的重点。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在于提供一种自体脂肪干细胞的新型研究方向或开发前景。
第一方面，本申请实施例公开了自体脂肪干细胞在制备抗衰老和抗免疫低下的药物或制品中的应用，其中，所述自体脂肪干细胞的获得方法包括：
分离Wistar大鼠的原代脂肪干细胞；
传代培养所述原代脂肪干细胞，获得第3～5代传代脂肪干细胞；
诱导培养所述传代脂肪干细胞，获得诱导细胞；
其中，所述诱导细胞表面高表达趋化因子受体和粘附因子受体，表达抗原提呈细胞的共刺激分子和T淋巴细胞的共刺激分子，不表达免疫共抑制分子。
在本申请实施例中，所述诱导培养步骤包括：
消化将第3代的所述传代干细胞，获得105个/mL的细胞悬浮液；
诱导培养所述细胞悬浮液，依次使用了包括第一培养液、第二培养液和第三培养液进行；
其中，所述第一培养液、所述第二培养液和所述第三培养液中均包含共轭亚油酸、α-亚麻酸和花生四烯酸中至少一种。
在本申请实施例中，所述第一培养液包含0.05v/v％共轭亚油酸，100U/mL青霉素，100g/mL链霉素和10mM脂肪细胞生长因子。
在本申请实施例中，所述第二培养液包含0.05v/v％α-亚麻酸、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素和10mM脂肪细胞生长因子。
在本申请实施例中，所述第二培养液包含0.025v/v％共轭亚油酸、0.025v/v％α-亚麻酸、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素和10mM脂肪细胞生长因子。
在本申请实施例中，所述第三培养液包含0.05v/v％花生四烯酸、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素和0.05mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
在本申请实施例中，所述第三培养液包含0.05v/v％花生四烯酸、0.025v/v％α-亚麻酸、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素和0.05mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
在本申请实施例中，所述诱导培养于37℃、3％O2氧气环境下培养。
在本申请实施例中，所述第一培养液、所述第二培养液和所述第三培养液以Ham’sF10培养液、EMEM培养液或TCM-199培养液为基础进行配制制得。
第二方面，本申请实施例还公开了一种细胞冻存液，包含第一方面中所述的获得方法获得自体脂肪干细胞、胎牛血清和二甲基亚砜；其中，所述自体脂肪干细胞的获得方法包括：
分离Wistar大鼠的原代脂肪干细胞；
传代培养所述原代脂肪干细胞，获得第3～5代传代脂肪干细胞；
诱导培养所述传代脂肪干细胞，获得诱导细胞；
其中，所述诱导细胞表面高表达趋化因子受体和粘附因子受体，表达抗原提呈细胞的共刺激分子和T淋巴细胞的共刺激分子，不表达免疫共抑制分子。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
本申请实施例经诱导培养后的ADSCs高表达趋化因子受体、高表达粘附分子受体、表达抗原提呈细胞的共刺激分子和T淋巴细胞的共刺激分子，不表达免疫共抑制分子，提高了细胞免疫刺激作用，降低了其免疫抑制作用，可能够对其发挥提升免疫力和抗衰老具有增强效果。
本申请实施例进一步通过动物实验证实了，经过诱导培养后的ADSCs细胞冻存液对衰老模型Wistar大鼠的皮肤代谢功能具有显著改善作用，起到了抗衰老、促使皮肤组织恢复年轻态的功效。
本申请还通过建立免疫低下Wistar模型大鼠，检测大鼠胸腺和脾脏器官指数、巨噬细胞的吞噬功能，淋巴细胞增殖功能，以及相关细胞因子的分泌情况发现，本申请实施例提供的ADSCs细胞冻存液对模型大鼠均具有显著作用。
由此表明，本申请实施例提供的经过诱导培养后的ADSCs细胞冻存液不仅对具有抗衰老，恢复年轻态的功效，还能够改善免疫，为其作用制备抗衰老以及改善免疫力的药品或保健品的应用前景提供基础研究，为其实际应用提供了帮助。
附图说明
图1为本申请实施例提供的ADSCs的原代细胞镜检图。
图2为本申请实施例提供的ADSCs的第3代细胞镜检图。
图3为本申请实施例提供的ADSCs的诱导培养后的细胞镜检图。
图4为本申请实施例提供的ADSCs的诱导培养后的细胞油红O染色图。
图5为本申请实施例提供的抗衰老实验中正常组Wistar大鼠皮肤组织HE染色图。
图6为本申请实施例提供的抗衰老实验中模型组Wistar大鼠皮肤组织HE染色图。
图7为本申请实施例1提供的抗衰老实验中细胞冻存液给予模型Wistar大鼠后皮肤组织HE染色图。
图8为本申请对比例3提供的抗衰老实验中细胞冻存液给予模型Wistar大鼠后皮肤组织HE染色图。
图9为本申请对比例4提供的抗衰老实验中细胞冻存液给予模型Wistar大鼠后皮肤组织HE染色图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
自体脂肪干细胞的分离
1、材料与方法
来源：3～4周SPF级Wistar大鼠，体重15～23kg，广东省医学实验动物中心。
1.1、Wistar大鼠ADSCs的原代培养
(1)麻醉Wistar大鼠后处死，置于无菌手术台上打开腹腔，镊子取出性腺/附睾和腹股沟处的脂肪垫置于培养皿中，加入100mL 5％聚乙烯吡咯烷碘酮的HBSS(Hank's缓冲盐溶液，武汉普诺赛生命科技有限公司)中处理2～3min，用无菌剪刀将其剪碎后转移至离心管中，加入约相同体积的含0.1wt％I型胶原酶和1wt％牛血清白蛋白的溶液并混匀，于37℃水浴中60min，离心，50～100g，5min，处理2次后，分为油脂层、未消化层和清澈的细胞悬液层，吸取细胞悬液层，其中包含ADSCs；
(2)将清澈的细胞悬液吸出，加入等体积DMEM/F12完全培养基(赛默飞)终止消化，1000转离心10min，弃上清；用DMEM/F12完全培养基(赛默飞)重悬细胞沉淀；充分吹打，用200目的细胞筛过滤，过滤后调整细胞浓度，以1×106/mL接种至培养皿；放入37℃5％CO2的培养箱中培养；48小时后首次换液，以后每隔2天换一次液。
1.2、传代培养
将原代ADSCs长至90％左右融合时，吸取培养液，用PBS漂洗2遍，加入0.25％不含EDTA的胰酶溶液，消化约1min左右，镜下观察部分细胞变圆后立即吸出胰酶，肉眼观察细胞呈流沙样后，加入完全培养液，吹打，以1:2或1:3接种至新的培养皿，以后每隔2天换液一次，传代至第3～5代进行后续步骤。
1.3、诱导培养
一个具体的实施例1的实施过程如下：
(1)取上述传代培养后的第3代ADSCs，用0.25％的胰蛋白酶消化离心，沉淀重悬后获得2×105/mL的ADSCs细胞悬浮液；
(2)取1块六孔板，分为两组，按照每孔2mL第一培养液，100μL 2×105/mL细胞悬浮液，进行铺板，于37℃、3％O2氧气环境下(低氧培养箱，Eppendorf)培养24h；其中，第一培养液为包含0.05v/v％(体积比)的共轭亚油酸(LA，化夏化学北京公司)、100U/mL青霉素(PG，北京华美互利生物化工)、100g/mL链霉素(Strp，化夏化学北京公司)、10mM脂肪细胞生长因子(FCGF，Sciencell公司)和0.13mM谷氨酰胺(BDG，Sigma-Aldrich)的Ham’s F10培养液(维森特生物技术有限公司)；
(3)去除步骤(2)得到的细胞培养液中旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第二培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第二培养液为包含0.05v/v％(体积比)的α-亚麻酸(α-LA，北京百灵威科技有限公司)、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素、10mM FCGF和0.13mM BDG的EMEM培养液(尚恩生物)；
(4)去除步骤(3)得到的细胞培养液中旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第三培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第三培养液为包含0.05v/v％(体积比)的花生四烯酸(AA，北京百灵威科技有限公司)、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素(Strp)、0.13mM BDG和0.05mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，购自阿拉丁公司)的TCM-199培养液(Gibco公司)；
经过上述步骤(1)～(4)即可完成对ADSCs的诱导培养，得到诱导后的ADSCs。
一个具体的实施例2的实施过程如下：
其ADSCs的分离、原代培养和传代培养均与实施例1相同，其诱导培养的步骤如下：
(1)取传代的第3代ADSCs，用0.25％的胰蛋白酶消化离心，沉淀重悬后获得2×105/mL的ADSCs细胞悬浮液；
(2)于6孔板中，添加第一培养液2mL和100μL 2×105/mL细胞悬浮液，进行铺板，于37℃、3％O2氧气环境下培养24h，第一培养液为包含0.05v/v％LA、100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的Ham’s F10培养液；
(3)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第二培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第二培养液为包含0.05v/v％α-LA、100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的Ham’s F10培养液；
(4)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第三培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第三培养液为包含0.05v/v％AA、100U/mLPG、100g/mLStrp、0.13mM BDG和0.05mM IBMX的Ham’s F10培养液；即可得到诱导的ADSCs。
一个具体的实施例3的实施过程如下：
其ADSCs的分离、原代培养和传代培养均与实施例1相同，其诱导培养的步骤如下：
(1)取传代的第3代ADSCs，用0.25％的胰蛋白酶消化离心，沉淀重悬后获得2×105/mL的ADSCs细胞悬浮液；
(2)于6孔板中，添加第一培养液2mL和100μL 2×105/mL细胞悬浮液，进行铺板，于37℃、3％O2氧气环境下培养24h，第一培养液为包含0.05v/v％LA、100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的EMEM培养液；
(3)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第二培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第二培养液为包含0.05v/v％α-LA、100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的EMEM培养液；
(4)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第三培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第三培养液为包含0.05v/v％AA、100U/mLPG、100g/mLStrp、0.13mM BDG和0.05mM IBMX的EMEM培养液；即可得到诱导的ADSCs。
一个具体的实施例4的实施过程如下：
其ADSCs的分离、原代培养和传代培养均与实施例1相同，其诱导培养的步骤如下：
(1)取传代的第3代ADSCs，用0.25％的胰蛋白酶消化离心，沉淀重悬后获得2×105/mL的ADSCs细胞悬浮液；
(2)于6孔板中，添加第一培养液2mL和100μL 2×105/mL细胞悬浮液，进行铺板，于37℃、3％O2氧气环境下培养24h，第一培养液为包含0.05v/v％LA、100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的TCM-199培养液；
(3)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第二培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第二培养液为包含0.05v/v％α-LA、100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的TCM-199培养液；
(4)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第三培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第三培养液为包含0.05v/v％AA、100U/mLPG、100g/mLStrp、0.13mM BDG和0.05mM IBMX的TCM-199培养液；即可得到诱导的ADSCs。
一个具体的实施例5的实施过程如下：
其ADSCs的分离、原代培养和传代培养均与实施例1相同，其诱导培养的步骤如下：
(1)取传代的第3代ADSCs，用0.25％的胰蛋白酶消化离心，沉淀重悬后获得2×105/mL的ADSCs细胞悬浮液；
(2)于6孔板中，添加第一培养液2mL和100μL 2×105/mL细胞悬浮液，进行铺板，于37℃、3％O2氧气环境下培养24h，第一培养液为包含0.05v/v％α-LA、100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的EMEM培养液；
(3)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第二培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第二培养液为包含0.05v/v％LA、100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的Ham’s F10培养液；
(4)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第三培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第三培养液为包含0.05v/v％AA、100U/mLPG、100g/mLStrp、0.13mM BDG和0.05mM IBMX的TCM-199培养液；即可得到诱导的ADSCs。
一个具体的实施例6的实施过程如下：
其ADSCs的分离、原代培养和传代培养均与实施例1相同，其诱导培养的步骤如下：
(1)取传代的第3代ADSCs，用0.25％的胰蛋白酶消化离心，沉淀重悬后获得2×105/mL的ADSCs细胞悬浮液；
(2)于6孔板中，添加第一培养液2mL和100μL 2×105/mL细胞悬浮液，进行铺板，于37℃、3％O2氧气环境下培养24h，第一培养液为包含0.05v/v％α-LA、100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的EMEM培养液；
(3)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第二培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第二培养液为包含0.05v/v％LA、100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的Ham’s F10培养液；
(4)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第三培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第三培养液为包含0.05v/v％AA、100U/mLPG、100g/mLStrp、0.13mM BDG和0.05mM IBMX的EMEM培养液；即可得到诱导的ADSCs。
一个具体的实施例7的实施过程如下：
其ADSCs的分离、原代培养和传代培养均与实施例1相同，其诱导培养的步骤如下：
(1)取传代的第3代ADSCs，用0.25％的胰蛋白酶消化离心，沉淀重悬后获得2×105/mL的ADSCs细胞悬浮液；
(2)于6孔板中，添加第一培养液2mL和100μL 2×105/mL细胞悬浮液，进行铺板，于37℃、3％O2氧气环境下培养24h，第一培养液为包含0.05v/v％LA、100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的EMEM培养液；
(3)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第二培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第二培养液为包含0.025v/v％LA、0.025v/v％α-LA、100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的Ham’s F10培养液；
(4)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第三培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第三培养液为包含0.05v/v％AA、100U/mLPG、100g/mLStrp、0.13mM BDG和0.05mM IBMX的EMEM培养液；即可得到诱导的ADSCs。
一个具体的实施例8的实施过程如下：
其ADSCs的分离、原代培养和传代培养均与实施例1相同，其诱导培养的步骤如下：
(1)取传代的第3代ADSCs，用0.25％的胰蛋白酶消化离心，沉淀重悬后获得2×105/mL的ADSCs细胞悬浮液；
(2)于6孔板中，添加第一培养液2mL和100μL 2×105/mL细胞悬浮液，进行铺板，于37℃、3％O2氧气环境下培养24h，第一培养液为包含0.05v/v％LA、100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的EMEM培养液；
(3)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第二培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第二培养液为包含0.025v/v％LA、0.025v/v％α-LA、100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的Ham’s F10培养液；
(4)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第三培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第三培养液为包含0.05v/v％AA、0.025v/v％α-LA、100U/mLPG、100g/mL Strp、0.13mM BDG和0.05mM IBMX的EMEM培养液；即可得到诱导的ADSCs。
一个具体的对比例1的实施过程如下：
其ADSCs的分离、原代培养和传代培养均与实施例1相同，其诱导培养的步骤如下：
(1)取传代的第3代ADSCs，用0.25％的胰蛋白酶消化离心，沉淀重悬后获得2×105/mL的ADSCs细胞悬浮液；
(2)于6孔板中，添加第一培养液2mL和100μL 2×105/mL细胞悬浮液，进行铺板，于37℃、3％O2氧气环境下培养24h，第一培养液为包含100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的Ham’s F10培养液；
(3)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第二培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第二培养液为包含0.05v/v％α-LA、100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的EMEM培养液；
(4)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第三培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第三培养液为包含0.05v/v％AA、100U/mLPG、100g/mLStrp、0.13mM BDG和0.05mM IBMX的TCM-199培养液；即可得到诱导的ADSCs。
一个具体的对比例2的实施过程如下：
其ADSCs的分离、原代培养和传代培养均与实施例1相同，其诱导培养的步骤如下：
(1)取传代的第3代ADSCs，用0.25％的胰蛋白酶消化离心，沉淀重悬后获得2×105/mL的ADSCs细胞悬浮液；
(2)于6孔板中，添加第一培养液2mL和100μL 2×105/mL细胞悬浮液，进行铺板，于37℃、3％O2氧气环境下培养24h，第一培养液为包含100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的Ham’s F10培养液；
(3)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第二培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第二培养液为包含100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的EMEM培养液；
(4)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第三培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第三培养液为包含0.05v/v％AA、100U/mLPG、100g/mLStrp、0.13mM BDG和0.05mM IBMX的TCM-199培养液；即可得到诱导的ADSCs。
一个具体的对比例3的实施过程如下：
其ADSCs的分离、原代培养和传代培养均与实施例1相同，其诱导培养的步骤如下：
(1)取传代的第3代ADSCs，用0.25％的胰蛋白酶消化离心，沉淀重悬后获得2×105/mL的ADSCs细胞悬浮液；
(2)于6孔板中，添加第一培养液2mL和100μL 2×105/mL细胞悬浮液，进行铺板，于37℃、3％O2氧气环境下培养24h，第一培养液为包含100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的Ham’s F10培养液；
(3)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第二培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第二培养液为包含100U/mLPG、100g/mLStrp、10mM FCGF和0.13mM BDG的EMEM培养液；
(4)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第三培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第三培养液为包含100U/mLPG、100g/mL Strp、0.13mMBDG和0.05mM IBMX的TCM-199培养液；即可得到诱导的ADSCs。
一个具体的对比例4的实施过程如下：
其ADSCs的分离、原代培养和传代培养均与实施例1相同，其诱导培养的步骤如下：
(1)取传代的第3代ADSCs，用0.25％的胰蛋白酶消化离心，沉淀重悬后获得2×105/mL的ADSCs细胞悬浮液；
(2)于6孔板中，添加第一培养液2mL和100μL 2×105/mL细胞悬浮液，进行铺板，于37℃、5％CO2氧气环境下培养24h，第一培养液为包含0.05v/v％LA、100U/mL PG、100g/mLStrp和10mM FCGF的Ham’s F10培养液；
(3)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第二培养液2mL，于37℃、5％CO2氧气环境下继续培养72h；其中，第二培养液为包含0.05v/v％α-LA、100U/mLPG、100g/mLStrp和10mM FCGF的EMEM培养液；
(4)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第三培养液2mL，于37℃、5％CO2氧气环境下继续培养72h；其中，第三培养液为包含0.05v/v％AA、100U/mLPG、100g/mLStrp和0.05mM IBMX的TCM-199培养液；即可得到诱导的ADSCs。
一个具体的对比例5的实施过程如下：
其ADSCs的分离、原代培养和传代培养均与实施例1相同，其诱导培养的步骤如下：
(1)取传代的第3代ADSCs，用0.25％的胰蛋白酶消化离心，沉淀重悬后获得2×105/mL的ADSCs细胞悬浮液；
(2)于6孔板中，添加第一培养液2mL和100μL 2×105/mL细胞悬浮液，进行铺板，于37℃、3％O2氧气环境下培养24h，第一培养液为包含0.05v/v％LA、100U/mLPG、100g/mLStrp和10mM FCGF的Ham’s F10培养液；
(3)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第二培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第二培养液为包含0.05v/v％α-LA、100U/mLPG、100g/mLStrp和10mM FCGF的EMEM培养液；
(4)去除旧培养基，用PBS清洗细胞一遍，添加新鲜的第三培养液2mL，于37℃、3％O2氧气环境下继续培养72h；其中，第三培养液为包含0.05v/v％AA、100U/mLPG、100g/mLStrp和0.05mM IBMX的TCM-199培养液；即可得到诱导的ADSCs。
由此，将实施例1～8和对比例1-5上述步骤(1)～(4)对ADSCs的诱导培养过程中的相关条件统计列入表1。
1.4、细胞油红O染色
配置油红O工作液，用定性滤纸过滤后备用。取出己经长满细胞的六孔板，弃去培养基，加PBS清洗三遍；加入10％的中性甲醛固定40min；除去甲醛，加PBS清洗三遍，加入油红O工作液，放入室温避光40min；脱色，用75％的酒精漂洗，除去多余的染料；甘油明胶封片，显微镜下观察，并拍照。
1.4、细胞表型分析
取第4代贴壁细胞，胰酶消化成单个细胞，PBS洗涤。为鉴定贴壁细胞的免疫表型，依据2013国际细胞治疗协会(international society for cellular therapy，ISCT)制定的ADSCs标准，用抗CD29、CD44、CD90、CD45、CD10、CD13和CD49d荧光抗体及荧光标记同型对照进行染色。1.5、细胞表面标志物表达谱的检测
为明确ADSCs的表面标志表达谱，采用6种荧光(FITC、PE、PerCp、PE-Cy7、APC、APC-Cy7)标记的共86种抗体对上述实施例1-8和对比例1-5培养得到的细胞进行检测，荧光抗体购自BD公司或Biolegend公司。
采用荧光标记的同型对照进行染色，荧光标记同型对照IgGl K-PE、IgGl K-APC、IgGl K-PerCp、IgGlK-APC-Cy7(美国BD公司)，荧光标记的同型对照IgGl K-PE-Cy7、IgGlK-FITC(美国Biolegend公司)。根据试剂盒的说明，按照相应的步骤进行；4℃避光染色30min，PBS洗涤2次，离心，弃上清，加20μL 1％多聚甲醛固定，通过流式细胞仪(BD LSR II，USA)，用F1owJo软件进行分析。
2、结果
如图1-2所示，在倒置显微镜(10×)下观察ADSCs的形态特征，ADSCs聚集成束，以网状结构和长条性结构较多。实施例1中，经过步骤(1)～(4)诱导后的细胞形态如图3所示，细胞形态由长梭形逐渐变为不规则的多边形、三角形，最后变为不规则的钝圆形，实施例2-8也出现类似情形；而对比例4、5并未出现不规则的多边形或三角形的细胞形态，而对比例1-3中出现了部分钝圆形性的细胞形态，而大部分细胞仍然为网状和长条形态。由此说明，实施例1-8的细胞经过诱导后形态上发生了某种根本转变，而对比例4并未发生这种转变，而对比例1-3仅仅部分细胞发生此种转变。
如图4所示，经诱导的细胞被染成红色，细胞间及胞内出现了折光率较强的类似于脂滴样的物质，经油红O染色后，经诱导的细胞被染成红色。
表1细胞表面趋化因子受体表达热图的中位数
实施方式 CD192/CD194/CD195 CD182/CD183/CD184
实施例1 35.2％/31.3％/62.1％ 42.1％/72.1％/79.4％
实施例2 34.7％/26.8％/46.2％ 43.2％/74.2％/74.6％
实施例3 37.5％/29.7％/55.3％ 41.6％/76.2％/75.3％
实施例4 35.2％/31.3％/62.1％ 42.1％/72.1％/79.4％
实施例5 35.1％/33.2％/55.7％ 43.2％/68.5％/71.7％
实施例6 35.2％/31.3％/62.1％ 42.1％/72.1％/79.4％
实施例7 35.6％/32.4％/66.3％ 42.2％/68.3％/72.5％
实施例8 36.7％/34.2％/69.3％ 45.2％/76.7％/86.3％
对比例1 33.1％/27.7％/13.2％ 29.2％/36.3％/18.2％
对比例2 31.5％/16.7％/9.7％ 26.6％/27.2％/15.2％
对比例3 28.1％/15.5％/10.2％ 23.4％/21.0％/10.2％
对比例4 13.7％/16.2％/12.4％ 15.2％/8.2％/12.3％
对比例5 12.4％/13.1％/11.8％ 14.1％/6.9％/10.8％
本申请共检测了6种趋化因子受体，CD192为CCR2受体，CD194为CCR4受体，CD195为CCR5受体，CD182为CXCR2受体，CD183为CXCR3受体，CD184为CXCR4受体。结果如表1所示，实施例1-8将ADSCs培养得到的细胞表面6种趋化因子受体均高于对比例1-5，而且实施例8的表达最高。对比例5对应的6种趋化因子受体表达最低。由此说明，本申请实施例对ADSCs的培养方法得到的细胞能够高表达趋化因子受体。
表2细胞表面粘附分子受体表达热图的中位数
实施方式 CD54/CD56/CD226 CD205/CD206/CD209
实施例1 38.2％/17.2％/21.3％ 32.2％/21.2％/15.3％
实施例2 33.4％/15.6％/23.1％ 27.2％/19.4％/16.2％
实施例3 36.7％/14.8％/22.6％ 29.6％/20.5％/13.7％
实施例4 34.5％/16.3％/20.7％ 30.4％/20.9％/14.4％
实施例5 33.7％/19.1％/22.1％ 35.1％/19.4％/16.1％
实施例6 37.9％/15.8％/23.4％ 34.7％/20.6％/15.7％
实施例7 39.0％/15.7％/22.5％ 31.4％/26.1％/14.5％
实施例8 42.3％/18.9％/24.6％ 34.5％/25.4％/16.4％
对比例1 8.9％/15.1％/16.4％ 16.1％/12.1％/7.2％
对比例2 3.1％/6.7％/10.5％ 8.5％/7.4％/4.6％
对比例3 1.6％/2.3％/1.4％ 2.1％/4.6％/1.7％
对比例4 -/-/- -/1.3％/-
对比例5 -/-/- -/0.7％/-
本申请共检测了细胞表面6种粘附分子受体表达，CD54为ICAM-1受体，CD56为NCAM-1受体，CD226为DNAM-1受体，CD205为DEC-205受体，CD206为MMR受体，CD209为DC-SIGN受体。流式细胞仪的检测结果如表2所示，表2中“-”表示未检出表达量。实施例1-8将ADSCs培养得到的细胞表面6种粘附分子受体均高于对比例1-5，而且实施例8的表达最高；对比例5对应的6种粘附分子受体表达最低。由此说明，本申请实施例对ADSCs的培养方法得到的细胞能够高表达粘附分子受体。
表3细胞表面免疫共抑制分子和共刺激分子表达热图的中位数
Figure BDA0003713798870000171
Figure BDA0003713798870000181
本申请共检测了2种免疫共抑制分子Gal-9和TIM-3，以及3种免疫共抑制分子的受体，CD274为PD-L1受体，CD279为PD-1受体，CD152为CTLA-4受体；4种免疫共刺激分子，CD80和CD86为抗原提呈细胞的共刺激分子，CD28和CD40L为T淋巴细胞的共刺激分子。流式细胞仪的检测结果如表3所示，表3中“-”表示未检出表达量。
由表3可知，实施例1-8将ADSCs培养得到的细胞表面2种免疫共抑制分子Gal-9和TIM-3及三种受体均未检出，而对比例1-5均有检出表达。且实施例1-8将ADSCs培养得到的细胞表面抗原提呈细胞的共刺激分子和T淋巴细胞的共刺激分子表达有检出，且表达量高于对比例1-5。由此说明，本申请实施例对ADSCs的培养方法得到的细胞能够表达抗原提呈细胞的共刺激分子和T淋巴细胞的共刺激分子，不表达免疫共抑制分子，提高了细胞免疫刺激作用，降低了其免疫抑制作用，可能够对其发挥提升免疫力具有增强效果。
动物实验
为进一步验证本申请实施例提供的ADSCs经过诱导培养后是否能够发挥相关功能，本申请还进行了如下动物实验。
1、材料与方法
1.1、供试品
将经过上述实施例1-8和对比例1-5诱导培养后得到的细胞培养液，用各自实施过程中对应的第三培养液更换培养液，调整细胞浓度至106/mL左右，并加入胎牛血清(ThermoFisher Scientific)和DMSO制成冻存液，于4℃保存，以做为本申请动物实验的供试品。其中，细胞悬液、灭活血浆和DMSO的体积比为5:4:1。
1.2、建立衰老模型大鼠
实验动物选用5周龄雄性Wistar大鼠，购自京维通利华实验动物技术有限公司，Wistar大鼠健康状况良好，体重为200g左右，生长环境为20～25℃，通风良好。适应性饲养一周后，进行静脉注射125mg/kg·bw D-半乳糖，连续注射40天，检测大鼠血清MDA、SOD和CAT含量，以确认衰老模型建立成功。
1.3、细胞冻存液对衰老模型大鼠的影响
将建立衰老模型大鼠分为模型组和实验组。其中，实验组是将建立的衰老模型大鼠灌胃给予上述供试品。连续灌胃28天后，检测大鼠皮肤组织SOD、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、C反应蛋白(CRP)含量以及单胺氧化酶(monoamineoxidase、MAO)含量。未进行灌胃D-半乳糖的大鼠作为正常组。
分别采用SOD试剂盒(Abcam中国)、丙二醛试剂盒(莱尔生物)、过氧化氢酶试剂盒(Abcam中国)、谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒(Abcam中国)、C反应蛋白试剂盒(Abcam中国)和单胺氧化酶试剂盒(Abcam中国)进行测定。
脏器指数及切片观察：大鼠脱颈椎处死后，解剖取出肝脏、脾脏、胸腺和大脑，生理盐水冲洗干净后称重，计算脾脏指数和胸腺指数。皮肤包氏固定液固定后做5μm切片，HE染色，光镜下观察、拍照。
1.4、建立免疫低下Wistar模型大鼠和给药供试品对免疫低下模型鼠的影响
将Wistar大鼠随机分为对照组、模型组和处理组。模型组和处理组大鼠于20～24℃的环境下饲养10d后，于第11～14天每天腹腔注射环磷酞胺70mg/kg体重，以建立免疫低下Wistar模型大鼠。第15～29天处理组大鼠每天灌胃100mgL/kg体重的上述供试品，模型组大鼠不做处理。空白组大鼠即为正常大鼠，不做处理。
1.5、巨噬细胞吞噬率、吞噬指数的测定
对免疫低下模型鼠的末次灌胃前3天，各随机抽取大鼠5只，腹腔注射1mL淀粉肉汤(60mg/mL)；末次灌胃后第2天，向大鼠腹腔注射1mL体积分数为0.50的鸡红细胞生理盐水悬液；半小时后处死大鼠，剪开腹部皮肤，吸取腹腔液滴于载玻片上，37℃孵育30min，用生理盐水漂洗，干燥，瑞吉染色，计数100个吞噬细胞，按下面公式计算巨噬细胞吞噬率及吞噬指数。
吞噬率＝(吞有鸡红细胞的巨噬细胞数/巨噬细胞总数)×100％
吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞数/巨噬细胞总数
1.6、免疫血清指标测定
器官指数测定：在每组剩余大鼠中随机抽取10只，称体质量后摘眼球取血，分离血清，采集脾脏、胸腺，用棉签吸去浮血并称质量，免疫器官指数按如下公式计算。脾脏指数(mg/g)＝脾脏质量/体质量；胸腺指数(mg/g)＝胸腺质量/体质量。
细胞因子含量测定：取血清，采用对应的试剂盒(Abcam中国)对大鼠血清白细胞介素2(IL-2)，白细胞介素6(IL-6)，肿瘤坏死因子(TNFα)和免疫球蛋白G(IgG)含量进行测定，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。
1.7、脾细胞悬液制备
每组剩余5只大鼠颈椎脱臼处死，乙醇(0.55g/mL)浸泡5min，分离大鼠脾脏。将脾脏放进装有RPMI 1640(Sigma-Aldrich)培养皿，将脾脏轻轻磨碎，过200目网筛。滤液在1000rpm下离心15min。沉淀物加入4mL红细胞溶解液，置于冰上10min。混合液在1000rpm下离心5min，弃上清，用RPMI 1640洗涤两次，然后加入5mL含有胎牛血清的RPMI 1640培养液(胎牛血清：RPMI 1640＝1:10，完全培养液)。最后调节细胞浓度为2×105/mL。
1.8、免疫测定
脾淋巴细胞增殖反应测定：将制备好的大鼠脾淋巴细胞悬液100μL接种于96孔板中，刺激孔加入5μL 5μg/mL刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA，上海源叶生物)，空白对照孔加入5μL完全培养液。将平板置于37℃5％CO2培养箱培养中48h，然后加入20μL(5mg/mL)MTT溶液再培养4h，弃上清，每孔加入150μL二甲基亚飒，震摇10min。用酶标仪在570nm处测量吸光度。用刺激指数(Stimulus index SI)表示增殖反应程度，SI＝刺激孔吸光度/对照孔吸光度。
NK细胞活性测定：以大鼠脾淋巴细胞悬液为效应细胞，以YAC1(4×104/mL)细胞(尚恩生物)为靶细胞。效靶细胞孔加入效应细胞和靶细胞各100μL；靶细胞孔加入靶细胞和完全培养液各100μL；效应细胞孔加入靶细胞和完全培养液各100μL，在37℃5％CO2下孵育48h后，加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)，再培养4h，上清液(各100μL)加入96孔板，每孔加DMSO50μL，震摇15min。用酶标仪在490nm处测量吸光度。按照下面公式计算NK细胞的杀伤活性：NK的杀伤活性＝[1－(效靶细胞吸光度－效应细胞吸光度)/靶细胞吸光度]×100％。
1.9、数据分析
实验数据采用Excel 2013和SPSS 22.0统计软件进行数据分析进行统计整理，每个数据均测量多次，并通过平均值与其标准偏差进行表示，并以SPSS 22.0分别进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和DunCan’s多重比较，并进行显著性差异标记。
2、结果
如图5所示，正常组大鼠皮肤厚度正常，表皮角质层完整，基底层细胞排列整齐。如图6所示，衰老模型组大鼠的皮肤厚度明显变薄，部分角质层脱落，基底层细胞嗜碱性降低，排列疏松紊乱；真皮弹力纤维增粗，堆积，排列不规则。
如图7所示，给药实施例1提供的细胞冻存液后，大鼠皮肤变厚，基底层细胞排列整齐，可见大量成纤维细胞，部分表皮角质层脱落，证明皮肤代谢加快，皮肤由衰老趋势转变为年轻趋势，具有年轻态。
如图8、9所示，为给药对比例3、4提供的细胞冻存液后，大鼠的皮肤仍然薄于正常组，和衰老模型组差距不大，基底层细胞少数出现空泡，整体排列仍较整齐，成纤维细胞数量适中。
表4
Figure BDA0003713798870000221
表5
Figure BDA0003713798870000231
由表4、5可知，模型组大鼠血清中MDA和CRP含量高于正常组，其他各指标均低于正常组，表面造模成功。实验组中，实施例1-8相对于模型组，其大鼠血清中MDA和CRP均有显著降低，而其他指标相对于模型组均由显著升高；而对比例1-4相对模型组，各支部未出现显著性变化。由此说明，本申请实施例提供的细胞冻存液给药模型大鼠后，其各血清指标得以改善，衰老情况得到缓解。
进一步的，本申请还建立了免疫低下Wistar模型大鼠，并对该模型鼠给予本申请实施例提供的细胞冻存液作为供试品，以探讨其对大鼠免疫改善情况。结果如下。
表6中，相对于正常组，模型组大鼠的胸腺指数和脾脏指数均显著降低，表明免疫低下Wistar模型大鼠建立成功。实验组中，实施例1-8提供的细胞冻存液给药模型大鼠后，其胸腺、脾脏指数均显著升高，而对比例1-5提供的细胞冻存液并未明显升高。由此说明，本申请实施例提供的ADSCs细胞冻存液对免疫低下Wistar模型大鼠的免疫器官具有保护作用。
表6中，模型组Wistar大鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数、脾NK细胞活性均显著低于正常组。实验组中，实施例1-8提供的细胞冻存液给药模型大鼠后，其腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数、脾NK细胞活性均显著升高至正常组相当；而对比例1-5提供的细胞冻存液给予模型大鼠后，其对应的制备并未出现升高现象。由此说明，本申请实施例提供的ADSCs细胞冻存液可显著提高免疫抑制大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能及NK细胞活性。
表6
Figure BDA0003713798870000241
表7可知，模型组大鼠SI值显著低于正常组，表明模型组大鼠脾淋巴细胞增殖受到了抑制，造模成功。实验组中，实施例1-8大鼠SI值均显著高于模型组，与正常组相当，而对比例1-5大鼠SI值与模型组相当。由此说明，本申请实施例提供的ADSCs细胞冻存液可免疫低下Wistar模型大鼠促进脾淋巴细胞增殖。
表7中，模型组大鼠血清中IL-2、IL-6、TNFα和IgG均显著低于正常组，表明造模成功。实验组中，实施例1-8提供的ADSCs细胞冻存液给予模型大鼠后，其上述四个细胞因子均有显著升高，与正常组相当，而对比例1-4提供的ADSCs细胞冻存液给药对模型大鼠的细胞因子无显著影响。由此说明，本申请实施例提供的ADSCs细胞冻存液可促进免疫低下Wistar模型大鼠血清细胞因子的分泌，提供其免疫能力。
表7
Figure BDA0003713798870000251
综上所示，本申请实施例通过对ADSCs进行诱导培养，得促使其细胞发生了根本转变，并对诱导培养的细胞表面趋化因子受体、粘附分子受体、免疫共抑制分子和共刺激分子表达进行分析。结果发现，本申请实施例经诱导培养后的ADSCs高表达趋化因子受体、高表达粘附分子受体、表达抗原提呈细胞的共刺激分子和T淋巴细胞的共刺激分子，不表达免疫共抑制分子，提高了细胞免疫刺激作用，降低了其免疫抑制作用，可能够对其发挥提升免疫力和抗衰老具有增强效果。
本申请实施例进一步通过动物实验证实了，经过诱导培养后的ADSCs细胞冻存液对衰老模型Wistar大鼠的皮肤代谢功能具有显著改善作用，起到了抗衰老、促使皮肤组织恢复年轻态的功效。
本申请还通过建立免疫低下Wistar模型大鼠，检测大鼠胸腺和脾脏器官指数、巨噬细胞的吞噬功能，淋巴细胞增殖功能，以及相关细胞因子的分泌情况发现，本申请实施例提供的ADSCs细胞冻存液对模型大鼠均具有显著作用。
由此表明，本申请实施例提供的经过诱导培养后的ADSCs细胞冻存液不仅对具有抗衰老，恢复年轻态的功效，还能够改善免疫，为其作用制备抗衰老以及改善免疫力的药品或保健品的应用前景提供基础研究，为其实际应用提供了帮助。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.自体脂肪干细胞在制备抗衰老和抗免疫低下的药物或制品中的应用，其中，所述自体脂肪干细胞的获得方法包括：
分离Wistar大鼠的原代脂肪干细胞；
传代培养所述原代脂肪干细胞，获得第3～5代传代脂肪干细胞；
诱导培养所述传代脂肪干细胞，获得诱导细胞；
其中，所述诱导细胞表面高表达趋化因子受体和粘附因子受体，表达抗原提呈细胞的共刺激分子和T淋巴细胞的共刺激分子，不表达免疫共抑制分子。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诱导培养步骤包括：
消化将第3代的所述传代干细胞，获得105个/mL的细胞悬浮液；
诱导培养所述细胞悬浮液，依次使用了包括第一培养液、第二培养液和第三培养液进行；
其中，所述第一培养液、所述第二培养液和所述第三培养液中均包含共轭亚油酸、α-亚麻酸和花生四烯酸中至少一种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述第一培养液包含0.05v/v％共轭亚油酸，100U/mL青霉素，100g/mL链霉素和10mM脂肪细胞生长因子。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述第二培养液包含0.05v/v％α-亚麻酸、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素和10mM脂肪细胞生长因子。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述第二培养液包含0.025v/v％共轭亚油酸、0.025v/v％α-亚麻酸、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素和10mM脂肪细胞生长因子。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述第三培养液包含0.05v/v％花生四烯酸、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素和0.05mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述第三培养液包含0.05v/v％花生四烯酸、0.025v/v％α-亚麻酸、100U/mL青霉素、100g/mL链霉素和0.05mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述诱导培养于37℃、3％O2氧气环境下培养。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一培养液、所述第二培养液和所述第三培养液以Ham’s F10培养液、EMEM培养液或TCM-199培养液为基础进行配制制得。
10.一种细胞冻存液，包含自体脂肪干细胞、胎牛血清和二甲基亚砜；其中，所述自体脂肪干细胞的获得方法包括：
分离Wistar大鼠的原代脂肪干细胞；
传代培养所述原代脂肪干细胞，获得第3～5代传代脂肪干细胞；
诱导培养所述传代脂肪干细胞，获得诱导细胞；
其中，所述诱导细胞表面高表达趋化因子受体和粘附因子受体，表达抗原提呈细胞的共刺激分子和T淋巴细胞的共刺激分子，不表达免疫共抑制分子。
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